CN1017452B - 庆大霉素的发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

一种利用绛红小单孢菌合成庆大霉素的方法。采用不含酵母粉类和鱼粉的培养基设置：繁殖培养的中间补料工艺，和发酵培养中二次补加培养基料、二次补水料的四次中间补料工艺。通过设置中转罐，实现向处于发酵中期的培养液内补入菌龄小，生命力强的菌种液。通过倒种的方式向处于发酵后期的培养液内补入菌龄小、生命力强的菌种液。以“双种法”加大发酵培养的接种量。本发明的方法可以提高庆大霉素的合成量，其发酵单位最高可达2385r/ml。

Description

本发明是关于抗生素的发酵生产方法，特别是庆大霉素的发酵生产。

庆大霉素是由绛红小单孢菌（Mrcromonspora Purpurea）发酵代谢而产生的一族氨基糖甙抗生素。它主要由庆大霉素C₁和C₂C_1a三种成份组成。美国专利US-3，091，572首次公开了实验室小量制取庆大霉素的方法：“以牛肉膏0.3%、色氨酸盐0.5%、右旋糖0.1%、可溶性淀粉2.4%、酵母膏0.5%为种子培养基，在37℃、280rPm，培养5天，进而以酵母膏1%、右旋糖1%和碳酸钙0.1%为发酵培养基，在26℃、培养5天，最后进行化学提纯”。此后，经多年的生产实践逐步形成现有的庆大霉素发酵与化学提纯的工业生产工艺，其中发酵生产工艺流程为：

砂土孢子→母瓶孢子 (37℃)/(9～10天) →子瓶孢子 (37℃)/(9～10天) →种子（罐）培养 (35℃)/(36小时左右) →繁殖（罐）培养 (34℃)/(25～30小时) →发酵（罐）培养 (32～34℃)/(132小时左右) →放罐→化学提纯。

庆大霉素是一种副作用小，杀菌力强的广谱抗生素，然而现有发酵生产所能合成的庆大产量低，我国的发酵单位一般在1000r/ml左右，无法满足需求。分析其原因是由于现有发酵生产工艺落后，存在不利于菌种正常生长的因素，主要体现在种子培养、繁殖培养及发酵培养等工序中，表现于如下二个方面：

一、种子、繁殖、发酵培养三道工序的基础培养基组成不合理：

1、由于现有的种子、繁殖和发酵培养的培养基中含有鱼粉、酵母粉，这两种成份内含有不利（甚至可抑制）菌种正常生长的某些氨基酸，以至菌种在培养中易老化，生长能力衰退。

2、在发酵培养中，蛋白胨和黄豆饼粉对菌种的发酵代谢起着积极的作用，它们可使庆大霉素合成量增加，同时可促进微生物的N-CH₃化，使有效组分增加，但是现有的发酵培养的基础培养基中这两种成份含量却偏少。

二、种子、繁殖、发酵培养三道工序中的工艺不合理：

由于现有的工艺采取“单种法”，即将一个种子罐内，经培养后的种子培养液全部移入一个繁殖罐内培养后，再全部移种入一个发酵罐内，经发酵培养至放罐。这种采用一罐移入一罐的工艺流程很容易引起菌种老化，最终将导致如下后果：

1、现有的繁殖培养是将种子罐内经种子培养后的种子培养液全部移入装有繁殖培养基础培养基的繁殖罐内，进行25～30小时的繁殖培养。经12～14小时的繁殖培养后，培养液内菌种的浓度相应增加，通入的空气又不断将水份带走，培养液不断浓缩，营养成份为断减少，溶解氧的速率不断下降，菌种生长环境不断恶化，使菌种正常、持续的繁殖和生长受影响。

2、现有发酵培养工艺中，长达132小时左右的发酵培养始终处于一个发酵罐内进行，这样就出现以下三种不利情况：

（1）、当发酵培养至一定的时候（一般为发酵至75～95小时），培养液中庆大霉素的合成量增加至一定量时即产生“反馈抑制”，使菌种合成庆大霉素受抑制。

（2）、庆大霉素合成中大量的消耗养份，通入的空气带走水份，在发酵培养的后期、培养液的浓度、粘度相应增加，物理状况产生变化，溶解氧的速率不断下降，至使合成抗生素的酶的活力降低。

（3）、庆大霉素合成的高峰期一般处于发酵培养至36～76小时之间，此后，由于菌龄过大，菌丝衰退化，产抗生素（即庆大霉素）的能力降低。

以上（1）～（3）的情况造成的发酵培养的中、后期，庆大霉素的合成量低，特别是在发酵培养至72小时之后到132小时放罐的这段约60小时的时间内，庆大霉素的合成基本处于停滞。

3、现有工艺中所采用的“单种法”，其中发酵培养的接种量多少由一个繁殖罐内培养液多少来决定，接种量少，菌种的发芽率低（一般仅为15～25%），直接影响菌种的数量，以至产抗生素的量也低。

为此，本发明的任务在于对现有庆大霉素的发酵生产工艺进行改进，以除去影响菌种生长的不利因素，提高庆大霉素发酵生产的产量（即庆大霉素合成量）。并通过：其一，设计种子、繁殖、发酵培养的基础培养基及中间补料培养基;其二，改进并设计种子、繁殖、发酵培养的工艺、实现完成本发明的任务。

在实验和生产实践的基础上，本发明提出如下的技术解决方案：

一、本发明所设计的各种培养基配方：

根据蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉、鱼粉及其它组成的菌种所生长培养中所起的作用，以及各工艺的需要，采取如下措施：在各种培养基中不使用鱼粉与酵母粉类成份，适当的增加发酵培养的基础培养基、发酵培养第一、二次中间补料培养基中蛋白胨、黄豆饼粉的用量，适当的增加繁殖培养的基础培养基中玉米淀粉的用量，并为新设的繁殖培养中间补料工艺设计相应的繁殖培养中间补料培养基。所以，在本发明所设计的种子、繁殖、发酵培养的基础培养基和繁殖培养中间补料培养基，以及发酵培养的第一、二次中间补料培养基均不含酵母粉类和鱼粉成份，这些培养基的组成分别为：

1、种子培养（罐）的基础培养基[基础配方Ⅰ]：

玉米淀粉1.0～1.5%、玉米粉1.5～2.0%、

蛋白胨0.2～0.4%、黄豆饼粉1.0～1.5%、

碳酸钙0.6～0.8%、硝酸钾0.05%、

氯化钴1～2r/ml、葡萄糖0.1～0.2%

2、繁殖培养（罐）的基础培养基[基础配方Ⅱ]：

玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、

蛋白胨0.2～0.4%、黄豆饼粉2.0%、

碳酸钙0.5～0.8%、氯化钴8～10r/ml

葡萄糖0.3～0.5%

3、发酵培养（罐）的基础培养基[基础配方Ⅲ]：

玉米淀粉5.5～6.5%、玉米粉1.0～1.5%、

蛋白胨0.2～0.5%、黄豆饼粉2.0～5.0%、

碳酸钙0.50～0.80%、氯化钴8～12r/ml、

硝酸钾0.01～0.02%、硫酸铵0.1～0.2%

4、繁殖培养（罐）的中间补料培养基[补料配方Ⅰ]：

玉米淀粉2.0～2.5%、玉米粉1.0～1.5%、

蛋白胨0.3～0.4%、黄豆饼粉2.0～3.0%、

碳酸钙0.60～0.65%、硝酸钾0.01%、

氯化钴8～10r/ml、硫酸铵0.10～0.15%、

葡萄糖0.2～0.3%

二、本发明所设计的发酵生产工艺：

发酵生产工艺由前期工艺和后期工艺组成。

1、前期工艺：采用以麸皮1.6%、可溶性淀粉0.75%、硫酸镁0.05%、硝酸钾0.1%、磷酸二氢钾0.03%、天门冬素0.002%、氯化钠0.05%、碳酸钙0.1%、琼脂1.6～2.5%为培养基进行砂土孢子、母瓶孢子和子瓶孢子的培养，随后为后期提供合格的孢子液的现有技术。

2、后期工艺：是采取如下措施。

其一，设置一套具有：二个或二个以上的种子罐、二个或二个以上的繁殖罐、一个或一个以上的发酵罐和一个或一个以上的中转罐的设备。这些罐均为采用发酵工业生产中常用的带有搅拌、通气装置的发酵用罐。

其二、采取“双种法”，即将二个繁殖罐内的繁殖培养液接种入同一个发酵罐内，以加大发酵培养的接种量，使一个发酵罐内菌种的发芽率提高（约为30～50%）的方法。

其三，在繁殖培养工序中，于繁殖培养至12～14小时，采取中间补料工艺，以改善菌种的生长环境。

其四，为使菌种能够向着正常代谢合成抗生素的方向顺利发展，在发酵培养工序中采取：

（1）、在发酵培养过程中实行四次中间补料工艺，第一次与第二次为补加培养基料，第三次与第四次为补加无菌水。

（2）对处于发酵中期的发酵液（罐）进行发酵中期强化处理：对所设置的中转罐进行备料消毒后备用，在繁殖罐移种时，将少量的繁殖培养液移入备用的中转罐内进行38～54小时的培养，随后适用将中转罐内的培养液全部移入盛有正处于发酵中期发酵液的中期发酵罐内（该罐已预先进行过发酵后期强化的倒种处理），实现向该中期发酵罐内补入菌龄相对小而生命力强的菌种。

（3）、对处于发酵后期的发酵液（罐）进行发酵后期强化处理：从正处于发酵中期的中期发酵罐内取出少量的发酵培养液倒入相对于该中期发酵罐而言的后期发酵罐内，实现将正处于发酵中期的、菌龄相对小而生命力强的菌种补入以上正处于发酵后期的、菌龄大、生命力弱的菌种中去的发酵后期强化处理工艺：

后期工艺所采取的措施详述如下：

（1）、中间补料工艺：

繁殖培养工序的中间补料：当繁殖罐内菌种繁 殖生长至12～14小时，以[补料配方Ⅰ]向繁殖罐内补加，其补料量为繁殖罐内培养液体积的30～50%。

发酵培养工序的中间补料：第一次中间补料是当发酵培养至12～24小时，以[以基础配方Ⅲ]向发酵罐内补加，补料量为此时发酵罐内培养液体积的40～50%;第二次中间补料是当发酵培养至30～36小时，以[基础配方Ⅲ]向发酵罐内补加，补料量为此时发酵罐内培养液体积的25～35%;第三次中间补料是当发酵培养至56～78小时，向发酵罐内补加消毒后的无菌水，补加量为此时发酵罐内培养液体积的20～30%;第四次中间补料是当发酵培养至80～94小时，向发酵罐内补加消毒后的无菌水，补加量为此时发酵罐内培养液体积的10～20%。

（2）发酵培养工序中的发酵中期、后期强化处理工艺：

发酵中期强化处理：首先按[基础配方Ⅲ]对每个中转罐进行备料消毒后备用。将经过繁殖培养后的一个繁殖罐内的培养液移出15～25%（体积比）至备用的中转罐内，并将繁殖罐内剩余的培养液全部接种入发酵罐内，分别进行培养。将经38～54小时培养后的中转罐内的培养液作为此时已发酵运行56～78小时（即：此时菌种在发酵罐内培养的时间与在中转罐内培养的时间相差24小时）的中期发酵罐经倒种后的中期强化补充液补入罐内，补液量为中期发酵罐内培养液体积的10～15%，补入时该中期发酵罐应是已进行过倒出小部份培养液作发酵后期强化处理液的发酵罐。

发酵后期强化处理：该工艺是一个倒种过程，将已发酵运行57～69小时的中期发酵罐内的中期发酵液倒种入已发酵运行82～100小时的后期发酵罐内，实行对处于发酵后期的发酵液中补入正处于发酵中期的发酵液的后期强化工艺，倒种量控制在后期发酵罐内发酵液体积的8～12%。

发酵中期-后期强化处理工艺：这部份是将上述两强化处理联合起来：先进行后期强化倒种处理，倒出种后的中期发酵罐内经1～9小时的继续发酵运行后，再将中转罐内给培养后的培养液移种入该中期发酵罐内进行中期强化处理。这样可以一罐连一罐的进行发酵中期、后期强化处理。

本发明由于改进了庆大霉素的发酵生产的各种培养基和生产工艺，克服了现有技术所存在的问题，使菌种在全部的培养过程中均处于良好的环境，使得菌种产抗活力强，能够旺盛的合成抗生素（即庆大霉素）。改变了过去在长达60小时左右的发酵后期庆大霉素的合成处于停滞的情况。来用本发明的方法，具有很高的效益，庆大霉素的发酵单位和发酵指数完全超过我国医药总局颁布的“七·五”庆大霉素攻关指标：发酵单位1700r/ml、发酵指数0.090总亿/吨·小时的指标，最高已达发酵单位：2385r/ml、发酵指数0.1090总亿/吨·小时以上。

图1是本发明的工艺流程示意图，图中“→”所指为工艺流程的方向。

图2是本发明实施例工艺图（包括发酵中、后期强化处理工艺过程）。图中：[102-1]、[102-2]、[103-1]、[103-2][104-1]、[104-2]等为种子罐，[202-1]、[202-2]、[203-1]、[203-2]、[204-1]、[204-2]等为繁殖罐，[301]、[302]、[303]、[304]、[305]、等为发酵罐，[401]、[402]、[403]、[404]、等为中转罐。图中“→”表示主要接种（或移种）及放罐的方向，图中“→”表示少量移种入中转罐培养后再送入中期发酵罐进行中期强化处理的方向，“-→”表示从中期发酵罐内取少量中期发酵液倒种入后期发酵罐内进行后期强化处理的方向。

实施例1：

取2个1000立升的种子罐[103-1]、[103-2]进行种子培养，采用含：玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黄豆饼粉1.0%、碳酸钙0.6%、硝酸钾0.05%、氯化钴1r/ml、葡萄糖0.1%的种子培养的基础培养基，每个种子罐分别投入料300立升，每个种子罐的接菌量为360ml的孢子悬浮液（含约孢子量数2760～3660亿个），培养温度33℃，通气量1∶2.4～2.8，搅拌速度280转/分。培养28小时后，于种子罐[103-1]、[103-2]得培养液各250立升。将两种子罐[103-1]、[103-2]内的培养液分别全部接种入繁殖罐[203-1]、[203-2]内，两个繁殖罐[203-1]、[203-2]均采用含：玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.5%、氯化钴8r/ml、葡萄糖0.3%的繁殖培养的基础培养基，每个繁殖罐均为5000立升的工业发酵罐设备，并分别投料为2000立升。繁殖培养 温度34℃，通气量1∶2.0～2.5，搅拌速度200转/分，繁殖培养至14小时，采用含：玉米淀粉2.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.3%、黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.6%、硝酸钾0.01%、氯化钴8r/ml、硫酸铵0.10%、葡萄糖0.3%的繁殖培养的中间补料培养基，两繁殖罐[203-1]、[203-2]分别补料800立升的900立升。继续繁殖培养至25小时，将繁殖罐[203-1]内的培养液取出500立升接种入中转罐[402]中培养备用，随后将罐[203-1]内剩余的2000立升的培养液与繁殖罐[203-2]内2600立升的培养液一同全部移种入发酵罐[303]内，发酵罐[303]采用含：玉米淀粉5.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.4%、黄豆饼粉3.5%、碳酸钙0.65%、氯化钴10r/ml、硝酸钾0.01%、硫酸铵0.1%的发酵培养的基础培养基，培养基投料7000立升，采用20000立升的工业发酵罐设备。发酵培养温度33～35℃，通气量1∶1.5～1.8搅拌速度140转/分。当发酵培养至16小时，进行第一次中间补料，采用本例以上的发酵基础培养基为补料培养基，补料量为4000立升。当发酵培养至35小时，进行第二次中间补料，并采用与第一次中间补料相同的培养基，补料量为3000立升。当发酵培养至60小时，补加2000立升无菌水。当发酵培养至70小时，压出2000立升的培养液倒种入后期（相对于发酵[303]而言）发酵[302]，实现对发酵罐[302]进行后期强化处理。当发酵培养至71小时，将中转罐[403]中经培养后的全部约2000立升的培养液移种入本发酵罐[303]内，实现对本罐[303]的中期强化处理。当发酵运行至85小时，补加无菌水1500立升。继续培养至97小时，将中期（相对本罐[303]而言）发酵罐[304]内取出2000立升培养液倒种入本发酵罐[303]，实现对本发酵罐的后期强化处理。随后继续发酵培养至131小时，进行放罐送往化学提纯，测得庆大霉素的发酵单位为2092r/ml，发酵指数为0.1072总亿/吨·小时，全部培养液为13000立升。

实施例2：

取2个1000立升的工业发酵罐作种子罐[102-1]、[102-2]进行种子培养，两种子罐[102-1]、[102-2]经种子培养均得约有250立升的培养液分别全部送入繁殖罐[202-1]、[202-2]内进行繁殖培养，当繁殖培养至14小时，进行补料，每罐均补料800立升，继续繁殖培养至29小时，两罐都得约2400立升的培养液，将繁殖罐[202-1]内取出400立升培养液送入中转罐[401]内培养备用，将繁殖罐[202-1]剩余的培养液与繁殖罐[202-1]内的2400立升培养液一同送入发酵罐[302]内进行发酵培养。当发酵培养至20小时进行第一次中间补料，补料量为4000立升。当发酵培养至34小时进行第二次中间补料，补料量为3000立升。当发酵培养至68小时，压出约2000立升的培养液送往发酵罐[301]。当发酵培养至69小时，将中转罐[402]经培养后全部约2000立升的培养液补入本发酵罐[302]内。继续发酵培养至70小时，补加1000立升的无菌水。当发酵培养至92小时，将发酵罐[303]中的培养液取出2000立升补入本发酵罐[302]内。当发酵培养至93小时，补加2700立升无菌水。继续发酵培养至133小时，放罐送往化学提纯，此时得发酵培养液14100立升，测含庆大霉素发酵单位为1785r/ml，发酵指数为0.0934总亿/吨·小时。

实施例3：

将在种子罐[104-1]、[104-2]中经种子培养后的培养液分别全部送入两个繁殖罐[204-1]、[204-2]内进行繁殖培养，当繁殖培养至14小时，于两繁殖罐[204-1]、[204-2]分别补料各700立升。继续繁殖培养至26小时，将繁殖罐[204-1]内的培养液取出500立升送入中转罐[403]内进行培养后备用，再将剩余的约1900立升的培养液同繁殖罐[204-2]内的2400立升的培养液送入发酵罐[304]内进行发酵培养。当发酵培养至12小时进行第一次中间补料，补料量为4000立升。当发酵培养至35小时进行第二次中间补料，补料量为3000立升。当发酵培养至59小时，补加1500立升无菌水。当发酵培养至62小时，压出2000立升的培养液送入发酵罐[303]。发酵培养至63小时，将中转罐[404]内约2000立升的培养液全部移入本发酵罐[304]内，发酵培养至82小时，从发酵罐[305]内取出约2000立升的培养液送入本发酵罐[304]内。发酵培养至83小时，补加2000立升无菌水，继续培养至129小时，得约14000立升培养液，放罐送往化学提纯。测得培养液中含庆大霉素的发酵单位1827r/ml，发酵指数0.1090总亿/吨·小时。

注：以上“实施例2”和“实施例3”中未说明部份均按“实施例1”实施。中转罐[401]、[402]、[403]、[404]等全部是采用“实施例1”中的发酵培养的基础培养基，投料量均为2000立升，其中;中转罐[402]培养49小时，中转罐[403]培养47小时，中转罐[404]培养40小时，中转罐[401]培养45小时。各实施例中各阶段培养过程中数据见“表1～表3”。

Claims (5)

1、一种利用绛红小单孢菌经、砂土孢子、母瓶孢子、子瓶孢子、种子、繁殖和发酵等培养工艺合成庆大霉素的方法，本发明的特征在于：

1、1、采取将二个繁殖罐的繁殖培养液接种入同一个发酵罐内进行发酵培养，以加大发酵培养的接种量的方法，

1、2、在繁殖培养液接种入发酵罐的同时，将其中一个繁殖罐内约15～25%的繁殖培养液移种入备用的中转罐内进行38～54小时的培养后，适时再将该中转罐内全部的培养液移种入已经进行过发酵后期强化处理倒过种的并且罐内还盛有正处于发酵培养中期的中期发酵罐内，实现向该中期发酵罐内补入菌龄相对小、生命力强的菌种的发酵中期强化处理，

1、3、从正处于发酵中期的中期发酵罐内取出少量的中期发酵培养液倒种入相对于该中期发酵罐而言的后期发酵罐内，倒种量应控制在后期发酵罐内发酵培养液体积的8～12%，实现将正处于发酵中的、菌龄相对小、生命力强的菌种补入正处于发酵后期、菌龄小、生命力弱的菌种中去的发酵后期强化处理，

1、4、于繁殖培养至12～14小时，按[补料配方Ⅰ]进行繁殖培养工序的中间补料，补料量为繁殖罐内培养液体积的30～50%，

1、5、在发酵培养工序中设计了四次中间补料工艺：在发酵12～24小时进行第一次补料，补料40～50%，于发酵30～36小时进行第二次补料，补料25～35%，于发酵56～78小时进行第三次补料，补加无菌水20～30%，于发酵80～94小时进行第四次补料，补加无菌水10～20%，第一、第二次补料为采用[基础配方Ⅲ]，四次补料的量为当时发酵罐内培养液体积比，

1、6、为实现本发明工艺相应的设置一套具有：二个或二个以上的种子罐、二个或二个以上的繁殖罐、一个或一个以上的发酵罐和一个或一个以上的中转罐的设备，这些罐均采用发酵工业生产中常用的带有搅拌、通气装置的发酵用罐，

1、7、设计了种子、繁殖、发酵培养的基础培养基，与繁殖培养中的中间补料和发酵培养中的第一次、第二次中间补料培养基，这些培养基均为不含酵母粉、鱼粉成份，所设计的各种培养基分别为：

种子培养的基础培养基：玉米淀粉1.0～1.5%、玉米粉1.5～2.0%、蛋白胨0.2～0.4%、黄豆饼粉1.0～1.5%、碳酸钙0.6～0.8%、硝酸钾0.05%、氯化钴1～2r/ml、葡萄糖0.1～0.2%。

繁殖培养的基础培养基：玉米淀粉1.5%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2～0.4%、黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.5～0.8%氯化钴8～10r/ml、葡萄糖0.3～0.5%。

发酵培养的基础培养基及第一次、第二次中间补料培养基：玉米淀粉5.5～6.5%、玉米粉1.0～1.5%、蛋白胨0.2～0.5%、黄豆饼粉2.0～5.0%、碳酸钙0.50～0.80%、氯化钴8～12r/ml、硝酸钾0.01～0.02%、硫酸铵0.1～0.2%。

繁殖培养的中间补料培养基：玉米淀粉2.0～2.5%、玉米粉1.0～1.5%、蛋白胨0.3～0.4%、黄豆饼粉2.0～3.0%、碳酸钙0.60～0.65%、硝酸钾0.01%、氯化钴8～10r/ml、硫酸铵0.10～0.15%、葡萄糖0.2～0.3%。

2、根据权利要求1所述的种子培养的基础培养基，其特征在于含有玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黄豆饼粉1.0%、碳酸钙0.6%、硝酸钾0.05%、氯化钴1r/ml、葡萄糖0.1%。

3、根据权利要求1所述的繁殖培养的基础培养基，其特征在于含有玉米淀粉1.0%、玉米粉1.5%、蛋白胨0.2%、黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.5%、氯化钴8r/ml、葡萄糖0.3%。

4、根据权利要求1所述的繁殖培养的中间补料培养基，其特征在于含有玉米淀粉2.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.3%、黄豆饼粉2.0%、碳酸钙0.6%、硝酸钾0.01%、氯化钴8r/ml、硫酸铵0.10%、葡萄糖0.3%。

5、根据权利要求1所述的发酵培养的基础培养基及第一次和第二次中间补料培养基，其特征在于均含有玉米淀粉5.5%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.4%、黄豆饼粉3.5%、碳酸钙0.65%、氯化钴10r/ml、硝酸钾0.01%、硫酸铵0.1%。

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