CN101742904A - 使用人器官和/或组织验证物质测试的离体方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使用来自人的组织和/或器官，特别是不适合移植的组织和/或器官对测试物质的评估结果进行验证的方法，该方法包括评估所述器官和/或组织对物质测试的适宜性以及器官间变异性和外源和/或内源对照的使用。

Description

使用人器官和/或组织验证物质测试的离体方法
背景技术
本发明涉及在使用包含物质(诸如化学物质，特别是药物和候选药物)的相容性灌注液溶液对来自人的离体(ex vivo)器官和/或组织进行灌注时，对此物质的性质、结局(fate)和作用以及与其接触的器官和/或组织的定性和定量评估结果进行验证的方法，所述性质、结局和作用例如物质的吸收、转运、代谢、清除、功效和/或毒性。本发明的方法允许使用来自人的器官和/或组织，特别是不适合移植的人器官在器官或组织基础上对所述评估结果进行验证。
可用于评估物质以及受其影响的人器官和/或组织的方法跨越了从体内研究到分离器官或组织、组织切片、培养的细胞类型、亚细胞颗粒、多酶复合体和分子相互作用的研究的多个哺乳动物组织水平。实际上，这些复杂的方法常导致在很多领域中相当多的时间、精力和资源的浪费，特别是在药物开发中，其中可能对候选药物的安全性和功效进行多轮检测，而随后的检测或市场体验发现其具有不良影响，这有时会带来惨痛后果。例如，已经批准用于人，但随后由于毒性事件而被取消的药物包括COX-2抑制剂、非索非那定(phexophenadine)和沙立度胺(thalidomide)。
在早期临床试验中，不利的效益/风险比常导致在其他方面前景良好的药理活性物质被否决。此类事件带来惨重损失，并且对药物开发、卫生保健和工业稳定性产生重大影响。此前，旨在排除效益/风险比不能被接受的物质的尝试依赖于使用如啮齿动物的数种物种进行的非人动物的体内研究。然而，比较而言，与药物开发中使用的近交系动物不同，目标物种(即人)在形体和功能上相差很多。因此，诸如候选药物和药物的物质的定量和定性性质、结局和作用也相差很多。
在非人物种中进行毒性研究的局限性早已得到制药业广泛公认，且目前仍旧如此，但由于人体内毒性研究的缺乏，而使其没有可行的替代方案。由于使用人进行探索性毒性试验是违反人道主义的，选择使用多种非人动物物种进行体内试验和/或使用人的生物样品进行体外试验。曾尝试使用包括亚细胞颗粒(例如微粒体)的组织制品、初代细胞和培养细胞(如肝细胞)和组织切片来填补非人试验的结果和在人体中作用之间的差距。尽管这些体外组织制备物产生了非常有用的数据，但是很多候选药物仍由于不利的风险问题而在临床试验中失败。现有文献有充足的证据表明这至少部分是由于组织制备物与完整生物体之间的关系越远，出现假阳性和假阴性的几率越大的事实造成的。例如，在单独施用或与其他药物共同施用治疗剂量的测试物质以评估检测物质是否具有毒性时，可能出现假阳性或假阴性。认为，当药物化合物由临床前实验转入临床实验，其安全性和功效的可信度提高。然而，也认为，不可预测的有害结果的风险也随之增大。不能简单地保证在体外正常人组织中测定的药代动力学/毒理学关系与在病人组织中的体内测定相同。
即便并非不可能，通常也难以从活的人供体获得用于药物开发目的的样品。令人遗憾的是，来自死亡供体的样品由于可能与供体死亡相关或不相关的疾病和/或损伤，和/或由于捐献后不同水平的降解(degradation)而使变异性的潜在和实际水平提高。因此，一直难以对基于此类人样品的数据进行可信地概括，特别是在药物开发所需的水平上进行概括。此外，人样品比来自近交系测试动物的样品具有更高的变异性。
美国专利第5,338,662号公开了测定测试物质对离体器官的作用的方法。然而，这些方法依赖于与同时灌注的对照器官的比较。尽管此类方法可能适合于具有均一性质和质量的器官，例如来自近交系测试动物的器官，但是这些方法并不能解决在使用人样品时的内在变异性，特别是来自濒死供体(pre-deceased donor)的人样品。
因此，需要能够填补非人动物体内试验和人体施用之间的差距的改进方法用于评价和验证物质评估结果。需要对用于测试物质(例如候选药物)的器官和组织进行标准化验证测试。此外，药物开发工业需要对研发过程早期潜在候选药物的评价结果进行验证的新型改进方法，以为药物开发公司提供可靠的评价结果。
发明内容
本发明的实施方式完全满足了使用经灌注的组织或器官，优选来自人的组织或器官，更优选经灌注的人器官和器官组(organ set)对物质(如候选药物)的性质、结局和作用以及与其接触的器官和/或组织的评估结果进行验证的需要，所述性质、结局和作用例如物质的吸收、转运、代谢、清除、功效和/或毒性和其他测试。本发明的方法提供了获得信息和物质/作用相互关系的改良手段。
本发明的实施方式包括用于评估器官或组织对物质测试(substancetesting)的适宜性的方法，所述器官或组织优选人器官或组织，更优选人器官，并且最优选不适合移植的人器官，包括患病或其他缺陷的器官，或者由于特别是长期热缺血、疾病、损伤和/或长期贮存等而使成功移植的可能性低于可接受水平的器官(可在捐献和/或贮存前后进行测定)。
本发明的实施方式包括在获取、冷藏和常温灌注后评估器官或组织生理学的方法。在实施方案中，本发明提供了评估器官或组织的适宜性的方法，其包括：
a)使用不包含测试物质的医用液体灌注至少一种组织或器官；和
b)评估所述器官或组织对物质测试的适宜性。
优选所述器官或组织是人器官或组织。
优选在生理温度、压力、氧合作用、渗透压、电解质平衡和pH下灌注所述器官或组织。
在实施方式中，通过评估灌注液、排泄/分泌液和/或组织样品，从而基于生理学、缺血损伤和/或再灌注损伤来评估适宜性。
在实施方式中，为了获取器官或组织变异性和/或评价测试物质的性质、结局和作用，本发明还提供了离体方法，其包括：
c)在至少一种测试物质存在下使用医用液体灌注至少一种器官或组织；和
d)评估所述器官或组织的目标性质或作用，例如变异性和/或测试物质在所述器官或组织的吸收、转运、代谢、清除、功效和/或毒性，其中可以通过在整个灌注过程中定量监测内源组分来评估变异性。也可以或者可选地在添加测试物质之前、期间和/或之后添加外源对照，以进行此类评估。
本发明提供的方法有利地避免了在使用非人动物模型模拟人体内活性和行为时遇到的，测试物质的吸收、转运、代谢、清除、功效、毒性、组织易感性和其他性质和/或作用方面的物种固有差别。此外，可使潜在高度变异的经灌注人器官或组织在生理条件下和所述器官或组织中所有细胞类型的临床相关浓度下接触物质诸如药物或候选药物及其代谢物，从而提供更为可信、准确和一致的结果。
可通过在添加候选药物之前、期间和/或之后添加并监测外源对照，和/或通过在整个灌注过程中监测内源组分，来将用于离体评估对物质测试的适宜性的人器官和组织充当其自身对照。这样，可以将产生的关于物质(例如候选药物)在来自不同供体的相应器官或组织中的性质、结局和作用的数据标准化，而不是反映个体变异性。
本发明的实施方式可用于评估物质的方法中，所述方法包括使待评价的物质通过具有代谢活性的人器官或组织，收集来自所述器官或组织的数据，和使用所收集的数据评价所述物质。
在实施方式中，所述评价是政府和/或监管批准程序的一部分；通过评价包含所述物质并且流出所述器官或组织的灌注液，或者通过评价采自于所述器官或组织的活检物来收集数据。
在本发明的实施方式中，所述评价方法包括使第二物质在所述第一物质之后通过所述器官或组织，和收集有关所述第一物质和第二物质相互作用的数据。
在本发明的实施方式中，所述评价方法包括先使用不含所述物质的第一液体，随后使用包含所述物质的第二液体灌注所述器官或组织。
本发明的应用的实施方式包括在收集作为政府监管批准程序一部分的数据的方法中的应用，所述方法包括：提供具有代谢活性的分离人器官或组织，使包含待评估的测试物质的灌注液灌注通过所述器官或组织，收集来自所述灌注液和器官或组织的数据，和使用所收集的作为提交给政府监管组织的呈递书的一部分的数据。
在本发明的实施方式中，方法包括使用作为程序的一部分的所述数据以解析物种之间相矛盾的数据、评估化合物的毒性、确定代谢物的存在和/或评价化合物的生物利用度、吸收、治疗作用和/或物质-物质间相互作用。
本发明的实施方式可用于开发药物产品的方法中，所述方法包括使候选药物通过具有代谢活性的离体人器官或组织；收集来自器官或组织数据；和使用所收集的数据作为评估的一部分以决定是否继续将候选药物开发成药品。所述数据用于评估候选药物的至少一个参数，所述参数选自由以下组成的组：吸收、毒性、药物-药物相互作用、治疗作用、代谢物的存在和肝清除。例如，所述数据可用于选自由以下阶段组成的组的至少一种药物开发阶段：发现期、临床前期、I期、II期、III期和IV期。
本发明的实施方式可用于产生收益的方法中，所述方法包括向第三方收取对候选药物实施评估过程的费用；使候选药物通过具有代谢活性的离体人器官或组织；收集来自所述器官或组织的数据；和向所述第三方提供所述数据。
在产生收益的方法中，可以提供原始形式的数据，或者在将其提供给第三方之前对其进行评价。所述数据可被用作政府和/或监管呈递书的一部分。所述数据可由进行评价的一方占有，或者由要求进行该评价的一方占有。第三方可在选自由以下阶段组成的组的至少一种药物开发阶段使用这些数据：发现期、临床前期、I期、II期、III期和IV期。所述费用可一次付清或者是所得药物销售额的百分数。
本发明的实施方式可用于减少开发药品的费用的方法中，所述方法包括通过使化合物通过具有代谢活性的离体人器官或组织的至少一部分来筛选化合物，和确定是否继续所述化合物的药品开发。这样，降低成本的方法可包括至少部分地根据通过使化合物通过器官或组织产生的数据而不再进行药品开发和/或根据筛选过程产生的数据对潜在的药品进行分级。
本发明的实施方式可用于开发普药(generic pharmaceuticals)的方法中，所述方法包括通过使药品通过具有代谢活性的离体人器官或组织产生用于并入到普药批准程序的呈递书中的数据。
本发明的实施方式提供了信息产品。此类信息产品可包含至少部分通过将药品通过具有代谢活性的离体人器官或组织而产生的与药物产品相关的数据。在本发明的实施方案中，所述信息产品以计算机可读的形式提供。
本发明的实施方式提供了销售信息产品的方法，包括向第三方提供所述信息产品对第三方的药物开发的至少一种经济效果的评价。
在销售方法的实施方式中，可以基于设想评价信息产品的经济效果，其中所述评价可包括所述信息产品对在测试物质和/或包含此类物质的产品的开发过程中遇到的问题的经济效果。所述经济效果可包括所述信息产品的总价值，其可根据实现所述总价值的可能性而调整。所述信息产品的总价值可以包括通过销售作为药品的所述物质或产品而获得的额外利润，例如如果缺少所述信息产品，所述药品将不能投放市场的情况下。信息产品的总价值还可以包括因所述信息产品而缩短了所述物质或产品的开发时间，从而带来所述物质或产品的额外高峰销售额。用于开发所述物质或产品而减少的时间可包括至少部分用于解决开发期间遇到的问题的时间。此外，信息产品的总价值可包括因所述信息产品而减少的用于开发所述物质或产品的费用。费用的减少可能至少部分是由于通过所述信息产品而避免的测试。
本发明的实施方式可用在评价物质的方法中，包括：提供待评估的物质，和分析通过使所述物质通过具有代谢活性的离体人器官或组织而收集的数据。
在物质的评价方法的实施方式中，所述物质可以是药品。所述数据可用作向政府和/或监管组织提交的呈递书的一部分，作为程序的一部分以解析物种之间相矛盾的数据，或评估代谢物的存在或化合物的生物利用度、吸收、治疗作用、药物-药物间相互作用和/或肝清除。此外，所述数据可用于选择适合在临床试验中测试所述物质的患者和/或选择应在临床试验中使用的物质的制剂。
本发明的其他特征和优点在下文详细阐述的具体实施方式中描述，并通过该详细阐述的具体实施方式而变得清楚。
具体实施方式
本发明的实施方式包括使用器官或组织，优选人器官或组织，更优选人器官，进行以下评估、测试和/或验证的方法：(1)评估器官或组织对物质测试的适宜性；(2)评估器官或组织在离体物质测试中的变异性；(3)测定化合物或物质，优选化学化合物，更优选药物或候选药物的性质、结局和作用，例如吸收、转运、代谢、清除、功效和/或毒性；和/或(4)以(1)和/或(3)为基础验证物质测试的结果。
优选的器官和组织包括，但不限于肝脏、肺、肾脏、肠、心脏、胰腺、脾脏、睾丸、胎盘、胸腺、甲状腺、肾上腺、动脉、静脉、淋巴结、骨、骨骼肌、外分泌腺/内分泌腺，或雄性或雌性生殖组织和器官。或者，也可以使用器官和/或组织的受控组合，由此使从一个器官和/或组织流出的灌注液形成流入不同器官和/或组织的灌注液，或者由此通过公用灌注液平行灌注多个器官和/或组织。优选的器官或组织是已经从其来源永久去除的具有代谢活性的人器官或组织，源自分离的和/或培养的人细胞的工程化器官或组织(除非另有说明，本文将其统称为“人器官或组织”)。所述分离的和/或培养的人细胞可包括干细胞。
应理解，本文所用术语“吸收”、“转运”、“代谢”和“清除”应用于所使用的任何器官或组织，但与基于灌注的测试中所使用的某些器官和组织特别相关。例如，吸收与肠和肺特别相关，而转运(例如血浆清除)和代谢尽管也与肠和肺相关，但与肝脏、肾脏和心脏特别相关。清除与肠、肝脏、肾脏和肺特别相关。
本文所用术语“毒性”涵盖对器官或组织的物理、化学、生化和生物损伤，包括细胞水平的损伤。毒性涉及对组织和器官的有害作用，包括但不限于细胞死亡、凋亡、基因突变、基因表达变化、生化抑制、代谢下降、诱导、抑制和氧化损伤，以及因药物-药物间相互作用而导致的有害作用。如本文所述，本发明的实施方式包括这样的方法，所述方法涉及检测由测试化合物(例如药物或候选药物)导致的急性或慢性毒性的器官或组织特异性标记物。
术语“功效”涵盖测试物质(例如药物或候选药物)对组织或器官(优选人组织或器官)的积极、内环境稳定或促进健康的作用的测量。此类测量包括，但不限于检验疾病特异性生物标记物的减少或消除，优选使用患病的器官或受病原体感染的器官。在某些实施方式中，所述生物标记物是来自病原体或细胞的与病原相关的标记物，该标记物的减少或消除表明所述测试化合物作为抗病原剂可能是有效的。与此相反，在实施方式中，所述生物标记物可以是断裂产物或具有抗病原作用的其他指示物，其中所述生物标记物的增加证明所述测试化合物作为抗病原剂的功效。因此，使用测试化合物对不同组织或器官的评价可提供该化合物的功效和/或有益作用的证据。
除非另有指明，术语“物质”、“测试物质”、“测试化合物”和“化合物”可相互替代，并且如在同时提交另案在审的美国专利申请第11/802,059号(卷号130361，其全文通过引用并入本文)中所述，其包括但不限于药物或药品相关的物质，例如候选药物和药品，以及与药物或药品无关的物质，例如环境物质，如烟尘和其他工业排出物；农业产品和副产品；建筑材料；工业制品和副产品；食物，例如加工食品和副产品、食品和食品添加剂；烟草制品，例如香烟、雪茄或卷烟，或嚼烟提取物及其组分；清洁产品，例如洗涤剂、漂白剂、肥皂、洗发剂和调理剂(conditioner)；化妆品，例如用于皮肤、头发和指甲的化妆品等。
本文所用“常温条件(nonmothermic conditions)”是指37±3℃的温度范围。
通常对用于临床移植的器官进行灌注保存，其中在低温停循环(hypothermic arrest)(约4℃-约8℃)下进行灌注是优选的保存方法。与此相反，尽管得到充分研究，但是在临床上还没有在包括正常体温(常温)在内的生理条件下保存用于移植的器官，这是因为在实际应用中难以将器官维持在正常体温。对移植器官的高要求，具体而言，为要求移植器官的功能最大化且炎症最小化，使常温的应用受到一定程度的限制。因为本发明的离体方法降低或消除了对移植的要求，其克服了常温的很多局限性。具体地，可以通过血型匹配的血细胞向常温的离体器官或组织供氧而无需考虑免疫原性问题，并且在常温灌注期间的离体器官出现功能性下降也是可以接受的，所述功能性下降例如由于在正常情况下由其他器官或组织清除的毒素的累积，以及由于在正常情况下由其他器官或组织产生的底物和因子的耗尽所导致。但是所述器官和组织应该是并且仍然适合用于实施此方法的目的。
测定适宜性的实施方式包括在获取、冷藏和常温灌注后评价器官或组织的生理学的方法。在实施方式中，本发明提供了利用测试物质的测定方法，其包括：
a)使用不包含测试物质的医用液体灌注至少一种器官或组织；和
b)评价所述器官或组织对物质测试的适宜性。
在本发明的实施方式中，在生理的温度、压力、氧合作用、渗透压、电解质平衡和pH下灌注所述器官或组织。优选灌注液包含于生理可接受的医用液体中的匹配人红细胞。有利地，所述医用液体进一步包含约2％-约6％的人血清白蛋白、N-乙酰半胱氨酸、腺苷单磷酸(AMP)和超氧化物岐化酶。在诸如心脏、肠和肝脏的某些器官中，还可在灌注过程中提供神经刺激。在本发明的实施方式中，例如当所述器官为肝脏时，所述医用液体可包含内源激素和胆汁酸。在本发明的实施方式中，例如当所述器官为肾脏时，所述医用液体可包含必需和非必需氨基酸的混合物。在本发明的实施方式中，例如当所述器官为肠时，所述医用液体可包含地塞米松或去甲肾上腺素。
在本发明的实施方式中，通过评估灌注液、排泄液和/或组织样品，从而基于生理功能、缺血损伤和/或再灌注损伤进行适宜性的评价。优选所述灌注流出物是依赖于所述器官的功能性流出物，例如来自肾脏的尿、来自肝脏的胆汁或来自肺的粘液，或者是包含胰腺的外分泌消化酶的流出物。在本发明的实施方式中，可通过静脉从离开所述器官的源来收集流出物，例如来自胰腺的胰岛素或胰高血糖素，来自肝脏的白蛋白或葡萄糖，来自肺的氧或二氧化碳，或来自肾脏的肌酸酐，随后对其进行分析。在心脏和肠中，验证可涉及评价运动反应(motor response)，例如分别为心脏搏动和肠蠕动。此外，对任何器官的验证可涉及血管阻力，并且在肺中，涉及包括顺应性、阻力、呼吸容量和气道峰压在内的呼吸功能的变化。
为了获取器官变异性和/或评价测试物质的性质、结局和作用，本发明的实施方式还提供了离体方法，其包括：
c)使用包含至少一种测试物质的医用液体灌注至少一种器官或组织；和
d)评价所述器官或组织的变异性和/或测试物质的作用和结局，例如测试物质在所述器官或组织的吸收、转运、代谢、清除、功效和/或毒性。可通过在整个灌注过程中定量监测内源组分来评价适宜性。或者，也可以或选择地在添加测试物质之前、期间和/或之后添加外源对照，以进行此类评价。
如上所述，本发明的方法的实施方式包括在低温(hypothermic)条件下保存来自目标物种(例如人)的一种或多种器官或组织的保存阶段，从而期望使所述器官或组织在回到生理温度后具有恢复并维持基本正常的代谢活性和功能的能力。本文所用术语“代谢活性”是指证明存活生物体特征性的生化活性水平。
在功能阶段，可使用常温的血液、基于血液的灌注液或合成灌注液来灌注器官或组织以稳定所述器官或组织的生理机能。优选使所述器官或组织的生理机能和生化机能与体内器官或组织的生理机能和生化机能保持基本一致，这样使得所述测试产生的数据基本上是明确、可重复和相关的。例如，在完整器官中，细胞保持其表型，血液和组织中的所有细胞类型均处于其正常的比例和定位，并且化合物的递送与其在体内的递送相似。
可以使用阳性和/或阴性对照来量化受试器官或组织的功能状态。可在添加所述测试物质之前、期间或之后添加对照，或者在收集到分析所述测试物质的性质、结局和作用所需的几乎所有必需样品后添加对照。可在使用包含所述测试物质的液体灌注所述器官或组织之前和/或之后使不包含所述测试物质的液体或灌注液通过所述器官。这样，所述器官或组织可充当其本身的对照。所使用的阳性和/或阴性的内源和/或外源对照依赖于各研究的主要目的。
可以在“正常”、“患病”或“受损“的器官或组织(包括受灌注损伤的器官或组织，或在捐献前患病和/或损伤的器官或组织)中实施此方法的实施方式，其中尽量使各器官或组织的生理机能和生化机能与特定疾病或病症的体内特征和性质保持相近。此方法的实施方式可包括多种医用装置、溶液和方案的使用，包括溯源、获取、保存和评估所研究的器官和/或组织。
使离体器官和组织保持体内特性涉及评价被认为是“正常”的器官或组织特征，这样与物质(例如候选药物)相关的信息是基于器官或组织，而非器官或组织的来源。例如，可以通过其本身作为对照来评估器官在离体测试中对物质测试的适宜性，其中，可根据所测试的具体作用，例如吸收、转运、代谢、功效和/或安全性/毒性，在添加测试物质之前、期间和/或之后添加外源或内源对照，和/或在灌注之前、期间和/或之后定量监测内源组分。这样，可以将产生的有关物质在来自不同供体的相同类型的器官的性质、结局和作用的数据标准化，而不是反映单个来源的变异性。
可在一个或多个阶段进行各器官或组织对物质测试适宜性的评估。例如，可在获取、冷藏和/或常温再灌注器官或组织之后，但在施用测试物质之前测定所述器官或组织的适宜性。或者，也可以或可选择地在测试所述物质之前、期间或之后测定适宜性。在此测试中，可在利用测试物质灌注之前、期间和/或之后，添加至少一种外源对照和/或定量监测至少一种内源功能或组分。这样，可保证测试中施用的器官或组织的适宜性。此外，可以针对由来源产生的变异性，对所产生的有关测试物质在来自不同供体的相同器官或组织的结局和作用的数据进行的标准化。
可以评估各器官或组织对测试的适宜性。可在其生理功能方面进行评估，其中通过评价例如灌注液流动、血管阻力、气体交换、电解质平衡和器官功能(例如，运动性(肠)、胆汁分泌(肝)、尿液产生(肾)、呼吸顺应性/呼吸阻力(肺)和心脏收缩力(心脏))，来测定一种或多种内源功能。
此外，可以通过例如对灌注液、排泄液和/或器官或组织实施外源方法(如拉曼光谱或Maldi质谱)来评估每种器官或组织的缺陷和/或再灌注损伤。
对于相同的器官或组织，可根据所研究的具体作用(例如，吸收、转运、代谢、功效或安全性/毒性等)改变选择的对照(也被称作“标准对照”、“验证标准品”和“验证对照品”)。关键因素是标准品在评估条件下不干扰测试物质性质、结局和作用的评估。下表列出了示例性的验证标准品和方法。
Figure G2008800248476D00111
Figure G2008800248476D00121
Figure G2008800248476D00131
在验证阶段中，在施用测试物质之前、期间和/或之后评估器官或组织对检测测试物质的一种或多种参数的适宜性。优选使用带有至少一种对照物质的相同灌注液，其中所述对照物质对测试物质的评估参数具有已知的定性或定量作用，并且评估对照物质的该同一参数。如果对照物质与测试物质存在竞争，通常优选，但不一定必须，在测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后，使对照物质灌注通过所述器官或组织。这样，可以测定器官或组织是否仍具有其作用，或者测定器官或组织是否受到与认为是该测试物质的同一参数相关的物质的影响。例如，对于主动或被动吸收，甚至可以使用竞争性对照测定吸收过程仍然在器官或组织中发生。使用潜在的竞争性对照物质还能够提供关于测试物质所涉及的机制的信息。例如，所列出的用于上述主动吸收的不同对照物质利用了不同的机制。因此，实际竞争的存在与否可用于鉴定所涉及的机制。
当对照物质不与测试物质竞争时，无论对照物质在测试物质之前、期间还是之后灌注通过所述器官或组织其具有较小的影响。然而，通常优选在使用测试物质灌注期间和/或之后进行对照物质的灌注，以保证所测量的参数在使用测试物质测试期间没有受到某些外部变化的不当影响。
此外，例如通过比较对照物质在器官或组织的已知吸收速率，可以确定测试物质的此吸收速率与该已知对照物质的已知吸收速率的比值。可对器官间的此类比值进行标准化。例如，即便是曾经受不同程度的损伤、疾病或其他降解的不同器官，通常也应该具有在给定测试物质和给定标准对照或标准物质组之间的相同吸收比。因此，如果在使用多个器官的测试中没有发现(在合理范围内)的比值，则认定一个或多个器官曾经历此类降解，而使其结果不可用。在这种情况下，通常需要使用对于所测试的参数具有已知但显著不同的数值的多个对照物质。使用此类对照，可能对测试物质相对于对照的作用进行定量评估，而与进行测试的具体器官的状态无关，除非与要检测参数相关的所述器官的所有功能都不再存在。
在另一个测试主动吸收的实例中，通过使用没有或几乎没有正常主动吸收的对照物质和基本具有正常主动吸收的第二对照物质可以显示所得的测试物质的主动吸收值是否可靠。例如，如果测试物质被吸收，但正常不会被吸收的对照物质也被吸收，则所观察到的吸收可能是被动吸收，而与所检测的正常主动吸收无关。类似地，如果正常时主动吸收量高的对照物质没有被吸收，则明显表明器官的主动吸收机制已被破坏到这样的程度，即无论测试物质是否被吸收，都知道此结果不可能是有效的。
按照本文公开的方法使物质接触具有代谢活性的离体器官或组织可产生数据和信息。此类数据和信息可以存储在任何计算机可读介质中和/或以任何其他适合的形式存储。此类数据和信息可被看作可传输的信息产品。
在某些方面，本文公开的方法可产生与物质有关的数据和信息。本文所用的物质可包括任何产品及其组分。特别地，所述物质可包括产品(例如药品)开发中的目标化合物。关于此物质的数据或信息可包括此物质本身、其衍生物、代谢物和/或其他相关物质的特征。
所获得的关于此物质的数据或信息可包括此物质对离体器官或组织的作用、离体器官或组织对该物质的作用，以及此物质对与该离体器官或组织接触的其他物质的作用。关于物质及其作用的信息可包括，但不限于器官或组织的吸收、转运、代谢、诱导、抑制、清除、药代动力学和生物利用度、毒性、功效、代谢物、代谢物的药代动力学、代谢物的毒性、代谢物的功效，与其他物质的相互作用，以及用于评估此物质或其代谢物或衍生物的有效性或其他性质的其他反应以及这些反应的产物。
本发明的实施方式包括使用本发明的特征以改进药物开发、减低成本和/或产生收益的商业方法和模式。例如，此方法可包括使第三方获得包括进行作为药物开发计划一部分的测试在内的服务。本发明的实施方式包括使第三方以信息产品的形式获得由所述测试产生的所得数据和/或信息。第三方可通过缴费的方式获得所述服务和产品。应理解，所述费用可包括固定金额，一次付清基于变量(例如产品销售利润的百分比)的总额，或者任何其他适合的报酬、补偿或偿付形式。因此，按照本文公开的方法进行测试，并由此公开方法产生数据和信息的实体(在本文中称为提供商)可以通过交易并向第三方销售本文所述的服务和产品而产生收益。
另一方面，本文公开的方法可产生有关与所述物质接触的离体器官或组织的数据和信息。应用本文公开的方法时，其测试结果可提供有关化合物分类、受体、生化途径、生理和病理机制、生物标记物和与存活生物体相关的其他现象的数据和信息。通过积累实施本文公开方法所产生的数据和信息可创建具有统计学显著性和科学有效性的信息库。各种形式的数据和信息均构成可传输的信息产品。
在本发明的实施方式中，向第三方提供的信息产品可包括由实施本文公开方法产生的原始数据。此外，向第三方提供的信息产品也可以或可选择地包含对原始数据进行的多个水平的可用和/或可信形式的解释或评估。提供商可保留原始数据的所有权，而第三方仅能获得作为信息产品的来自所述原始数据的信息。因此，除了按照本文公开的方法进行测试和产生原始数据的服务之外，提供商还可以向第三方进行数据解释。
可以以很多方式使用通过实施本文公开的至少一种方法而获得的有关物质的数据或信息，从而赋予该信息产品价值。例如，数据或信息可用于测定此物质是否具有潜在的有益应用，此物质是否具有用于特定目标的前景，或者此物质具有的用于特定目标的前景的程度。例如，根据本文公开的方法从与物质接触的具有代谢活性的离体组织或器官收集的数据可被用于测定是否应该对此物质进行进一步的测试以测定其作为药品的有效性。由此，可利用所述数据和信息从物质群、物质库或物质组中排除无效的物质。应理解，例如确定物质不能用于特定候选应用，对于将资源分配到经鉴定为具有潜在有效性的物质的进一步开发而言具有重要意义。
信息产品可由第三方使用，例如产品(例如药品)开发中涉及的药物开发者。药物开发者可向提供商提供用于测试的一种或多种物质。供给提供商的物质可以是在药物开发任何阶段(包括药物已被开发后)经鉴定的物质。药物开发过程通常包括与不同水平的测试相关的一系列步骤、时期或阶段。所述阶段可包括发现阶段、临床前阶段、临床阶段、批准后阶段和上市后阶段。在开发过程中的各个阶段，药物开发者都会为将每种物质的开发推进到下一个阶段而投入巨资。药物开发者的成本包括与进行测试相关的直接开支。例如，当物质通过测试的临床前阶段时，已经在此物质上花费了大量的资金。到IIb期，药物开发者通常已经在临床试验中花费3年以上的时间，并且通常花费约4千万美元在人中测试此化合物。
此外，还有与延迟将有益化合物推入市场相关的间接成本。例如数据冲突、结果不确定的问题和以及意外问题都需要额外的测试，而在这期间本来可能出现药物的销售，包括销售高峰。还有与产量下降相关的来自未开发化合物的销售利润的间接成本。也就是说，对于每种未开发的安全有效药物，对于药物未上市的每一天，对于必须对化合物进行的每个额外试验，药物开发者都要投入成本。
本文公开的方法的信息产品可提供用于解决在研发的各个阶段发生的问题的确定的、相关的、器官特异性的、物种特异性的数据。本文公开的方法的信息产品可指导候选药物的选择、促进问题的解决(例如从其他类型测试获得的数据或信息的不一致)，并且可在整个开发和规范过程(developmentand compliance processes)中加速监管部门的批准和对规章的遵守。
信息产品可通过至少4种途径在药物研发过程中产生价值和功效。首先，信息产品可通过在研发过程的早期可能提供更多且更好的数据，从而提高可作为药品使用和销售的物质的数量。第二，信息产品可通过潜在地缩短将产品推向市场所需的时间，从而增加销售高峰的天数。第三，信息产品可通过避免由于在之后过程中的未知问题而返回较早阶段，从而减少开发费用，并且潜在地缩短上市所需的总时间。第四，信息产品可有助于在开发过程的物质临床测试过程中和上市物质的使用过程中保护人免受物质毒性副作用的影响。
在发现阶段，合成并纯化物质以进行亚细胞和细胞水平的筛选和测试，从而鉴定具有潜在有益作用的物质。发现阶段中的筛选方法可包括使用组合化学的高通量测试以生成并检测大量不同的分子。其他筛选方法可包括化学基因组学和生物信息学。化学基因组学可以快速地表征针对目标细胞或组织的大量小分子库。生物信息学(或计算生物学，in silico biology)用于集合来自不同生命形式的基因和蛋白序列数据，以通过计算机分析比较潜在的治疗、已知的基因功能和生物活性结合位点，从而确定相似性或模式。本发明的信息产品可在研发过程中的发现阶段显著地增大可能有用的化合物的库。在发现阶段，信息产品可解决例如由高通量试验(可能差地预测功效)获得的矛盾数据的问题。此外，通过对目标化合物提供比现有的计算模型(in silico model)更少的推断和更全面的筛选的前景，信息产品和由此产生的计算模型可允许药物开发者在发现的早期阶段更为准确地选定目标化合物。
在发现阶段合成、纯化和经过潜在有效性预筛的可能有用的化合物可进入临床前阶段。临床前阶段通常包括使用细胞和组织切片在体外模型中和在动物中对物质进行测试，以测定有关物质及其作用的信息。
本文公开的方法的信息产品使药物开发者能够确定最有前景的化合物，并使从不同类型的测试中获得的数据或信息相一致或解决不一致性。在药物开发的临床前阶段使用的动物模型可以是显示物质实际上如何发挥作用以及物质如何在人体内发挥作用的不完善模型。通过用于常见治疗领域(例如肿瘤学和神经学)的物质在临床阶段的高淘汰率所证明，对于这些治疗领域，动物模型尤其不能代表人。由于动物和体外试验通常不能代表人，研发过程常常不能在开发的早期阶段从化合物家族中鉴定出最先导的化合物。
本文公开的方法的信息产品可通过使药物开发中的延迟最小化和缩短药物上市所需的时间，由此增加所开发药物销售高峰的天数，从而为药物开发者提供价值。由此，通过本文公开的方法进行早期鉴定降低了在市场上被竞争对手挫败的风险，并且为药物提供了更长的专利保护期限，产生额外的销售高峰。例如，如果最终年销售峰值为5.8亿美元的药物由于未知的问题(例如，在临床前动物研究中不能预知但在人临床试验中出现的未知代谢物)而必须返回到临床前测试，那么药物开发者将为延期的每一个月付出重大代价。因此，信息产品使与由动物向人的失败推导所导致的不确定性相关的延迟最小化或消除，并且使药物的销售高峰最大化。
此外，动物试验通常产生物种之间相矛盾的数据。实际上，在药物开发的临床前阶段，常见问题包括假阴性和假阳性，在动物物种之间相矛盾的吸收、毒性或功效数据，以及化合物家族之间等级顺序的不确定性。
本文公开的方法的信息产品可提供无法从其他类型的测试获得的关于物质及其作用的数据或信息，并且在某些情况下消除了对其他类型测试的需要。信息产品可提高临床前阶段所得数据与药物开发临床阶段所得数据之间的相关性。因此，在临床前阶段，信息产品可最小化和/或解决物种之间矛盾的吸收和摄取数据，物种之间矛盾的毒性数据，有关吸收和摄取等级顺序的不确定性，有关功效等级顺序的不确定性，有关PK-毒性关系等级顺序的不确定性，有关特定药物的药物-药物相互作用和等级顺序的不确定性，以及物种之间矛盾的功效数据。应理解，在此阶段或过程中的较早阶段区分前景差的化合物与前景更好的化合物为药物开发者节省了用于进一步检测前景很差的测试化合物的时间和成本。这可以使药物开发者将更多的资源配置给前景更好的化合物，以更有效地将这些化合物推进到开发过程的后期阶段，并且即便不能避免，也能使进入临床试验的毒性化合物最少化。信息产品还可以根据测试物质的参数、对测试物质的敏感性或者任何其它合适的因素，选择适合临床试验的患者。此外，信息产品还可用于选择包含相同或不同化合物的一组不同制剂中的哪些应在临床试验中使用。
发现在多种动物模型中均具有理想的安全性和功效的可能有用的物质可进入到药物开发的人体临床阶段。临床阶段包括至少4期：I期、IIa期、IIb期和III期。I期测试包括将所述可能有用的物质首次引入接受临床测试的人受试者中。I期测试用于测定物质在人体内的特性，例如其代谢、构效关系、作用机制，和其他药代动力学和药理学数据。此外，I期测试还提供所述物质在人体内的代谢和药理作用，以及副作用。I期研究可进一步测定所述物质是否可被用作研究生物现象或疾病过程的研究工具，或者进一步确定将在II期进行的测试。在I期临床试验中，常见问题包括由于低吸收和/或高代谢而出现与生物利用度相关的不利代谢物和不利问题。此类问题说明在临床前测试中进行的动物研究不足以代表人的情况，从而不能充分预测在人中遇到的问题。因此，本文公开的方法的信息产品为药物开发者提供了一种工具，以在更能代表人情况的环境中进一步检测所述化合物，而不会对临床测试受试者的生命或健康产生进一步的危害。此外，可在信息产品中量化单个器官对物质结局和作用的影响。
将信息产品用于解决物质在前景好的治疗领域中的临床前阶段和I期中遇到的问题尤其有效，并且具有根本性地改进药物研发过程的潜力。因此，本文公开的方法的信息产品在药物开发早期阶段(例如开发的临床前阶段和I期临床阶段)产生了巨大的价值。本文公开的方法的信息产品可以被专门设计，从而用于解决在临床前阶段和I期中出现的问题，包括动物物种间矛盾的吸收、毒性和/或功效数据，化合物家族中有关吸收、功效和PK-毒性关系等级顺序的不确定性，和临床前阶段中有关药物-药物相互关系的不确定性，以及与I期或其后阶段意外代谢物的生物利用度和不确定性相关的未知问题。
进行II期测试的临床测试受试者群比I期测试大，以产生有关用于特定的一种或多种适应症的药物对于患有此类疾病或病症的个体的有效性的初步数据。此外，II期测试能够提供有关此物质的短期毒性和副作用的信息。在II期临床测试中的一般性问题包括估计到测试受试者的数量因而治疗作用的广度(magnitude)的不确定性，以及基于药物-药物相互作用的正确采纳/排除标准的不确定性。如果物质在II期研究的基础上显示出有利的特征，例如具有极小或可耐受的副作用的有效性，那么此物质可进入到III期人体临床测试。III期临床测试使药物开发者能够扩展药物功效和毒性的数据，从而足以评价药物在人体中使用的风险-效益关系。III期还提供了一个基础，以将接触此化合物的相对少量测试受试者的数据和发现外推到可由使用此物质而获益的大量受试者。在这些晚期临床阶段的各阶段，药物开发者都可以，例如进一步使用信息产品以解决与功效、未知副作用、毒性以及不确定的药物间相互作用相关的任何问题。即便在药物已经可为公众所获得之后(通常称作IV期)，也可能还需要长期的随访测试以确定药物的持续有用性、长期毒性或者用于生产线的拓展开发，这些都可以通过使用所述信息产品得到解决。可参考规章规定进行这些深入测试。
物质在后期被淘汰在很大程度上是因为现有方法(例如在临床前阶段的动物测试)在最终预测人体内功效和毒性方面的能力有限。实际上，物质的大量淘汰出现在药物开发的临床阶段后期，主要是IIb期和III期，表明未能更早地鉴定出此物质在人体内缺乏功效(III期)和具有不能接受的毒性水平(II期)。到IIb期，药物开发者通常已经在临床试验中花费3年以上的时间，并且花费约4千万美元在人体内检测此化合物，这对任何规模的药物开发者都是重大的损失。药物开发者在这些物质上的研究常常以放弃对其他物质的研究为代价。
此外，投资商和分析者常常追捧处于开发过程后期的物质。更具体地，分析者几乎仅对处于监管审查下、准备向监管部门提交或进入III期的那些物质进行药物研发评估。所以，小型或大型制药公司均可使用本文公开的方法的信息产品来降低与由于选择错误的物质而错过开发有前景的药物的机会相关的风险，并且尽早鉴定正确的物质从而使药物开发者获得额外的销售高峰。能够进行在其他情况下不能进行的物质的开发对于无法将资源循环利用并测试多个备选物质的小型制药公司特别重要。此外，大型和小型公司都能受益于通过本文公开方法的信息产品而产生的时间节约所带来的额外销售高峰利润。因此，通过提高鉴定出大量有用物质的可能性，以及通过限制后期淘汰的数量以及未知的后期(特别是在III期)延迟，信息产品为药物开发者提供了除预期的研发生产率提升之外的重要无形收益，例如强化公众信任、投资信用以及股市行情。
除了降低成本、防止在不合格药物中的进一步投资以及解决直接影响药物开发成本的矛盾或不确定的数据之外，本文公开方法的信息产品还有助于鉴定有用的产品及其组分。在其他情况下将被放弃而由于本文公开方法的信息产品而能够继续开发过程的物质的预期价值可能是重要的。信息产品的应用所带来的导致物质被批准的预期价值可能是基于所述物质的利润，由批准时间缩短带来的额外销售高峰，以及通过减少在整个开发过程中产生的试验数量和重复试验而节省的成本。
除了将本文公开的方法的信息产品应用于药物开发特定阶段的具体问题之外，还可以将所述信息产品应用于药物开发的具体治疗领域。本文公开方法的信息产品可影响这些治疗领域，在该治疗领域中现有的工具，例如动物和体外模型的预测性特别差和/或预期上市药物可产生高销售额。本文公开的方法的信息产品对具体治疗领域的预期影响可以基于，例如从I期到药物上市的淘汰率、表明此治疗领域未来前景的预期销售增长、以及说明前景好的药物占领治疗领域比例的每份前景好的药物的平均销售额。在药物开发的临床阶段的淘汰率反映了由于动物和体外试验对人体的代表性差，从而使治疗领域在药物开发的临床前阶段从化合物家族选出错误化合物的可能性。
本文公开的方法的信息产品对于趋于器官特异性的“概念证明(proof ofconcept)”研究和治疗与测试都为器官特异性的治疗领域的功效研究可具有特别的潜在相关性和价值。除了例如肌肉骨骼、炎症、胃肠、中枢神经系统和疫苗的治疗领域之外，器官特异性的治疗领域还可包括，例如呼吸、传染病、糖尿病/代谢、肿瘤和心血管领域。例如，本文公开的方法可应用于体外的癌症模型通常不能充分模拟真实肿瘤的结构和细胞复杂性的肿瘤领域的药物开发。实际上，通常90％的使肿瘤药物上市的尝试都以失败告终。另外，尽管肿瘤学中前景好的药物的数量小于与其相当的治疗领域，但是从药物销售前景来看，肿瘤学的吸引力正在不断提高。因此，将本文公开的方法的信息产品应用于现有工具预测性特别差但预期上市药物的销售额高的治疗领域中，会产生重大价值。
信息产品可用于满足符合，例如在批准程序中或在物质已经被批准用于特定应用之后的规章(例如政府规章)的要求。在药物开发过程的各个阶段中，政府或其他监管部门可能需要有关物质信息的呈递书。例如，在美国，食品和药品管理局(FDA)对公司所进行的实验室动物试验和人体临床试验的结果进行检查，以确定期望上市的产品是否安全有效。例如，在临床前阶段，监管部门可能以向FDA提交新药试验申请的形式对可能有用的物质进行安全性检查。根据使物质作为药物上市的规章和要求，一旦从物质的III期临床研究获得充足的数据，此研究可用于向FDA提交新药申请。即便在单个药物通过鉴定且上市之后，仍然可能需要上市后的临床和非临床研究以及上市后的监测。所以，可检查医学、化学、药理学、毒理学和/或统计学数据以及其他相关信息，从而确定是否应当对此物质进行深入开发。因此，本文公开的方法的信息产品可组成第三方遵守规章所需的信息，并可向第三方收取费用。
除加强药物开发过程以及向第三方提供价值之外，提供商能够以通过公开信息产生的累计数据和信息为基础，创建信息源。这些数据和信息可包括，但不限于有关化合物分类、受体、生化途径、生理机制和其他科学验证的结论的信息。此信息可被用于加强对与药物开发相关或不同领域的理解。第三方可以通过付费的形式获得信息产品的信息源。此类信息可以用于比较在各种器官和组织中的作用，从而确定可对这些作用进行预测的模式和模型。信息产品可用于比较有关所述物质及其在不同器官和组织中、在不同物种中以及在不同条件的器官和组织(例如正常、异常、患病或受损器官和组织)中的作用的信息。
可进一步利用信息产品，根据使用本文公开的方法进行的重复试验累积的统计学显著和科学有效的数据和信息来构建模型。特别地，信息产品可用于创建测试化合物有效性的计算机模型(in silico model)。
目前，使用先进的计算机方法，可以在药物开发的早期阶段(例如在药物发现期)通过将化合物的物理/化学性质与多种生物事件进行匹配，从而在计算机上模拟(“生物模拟”)药物和候选药物的效力。然而，由于大多数计算机模型是由体外数据构建的，而生化分析的实质通常不能反映出完整人器官或生物体的复杂性，这些现有方法存在局限性。例如，基于体外的模型可模拟化合物与一个或两个通路的相互作用，而在实际上，此化合物还利用多个其他通路，而这些通路在仅获悉体外所得数据的建模程序中并未考虑。结果，这些计算机模型在预测力方面具有与传统体外测试相同的局限性。
本发明的实施方式提供了用于产生信息产品的方法，所述信息产品使物质的结构、物理和/或化学特性和性质与其结局和/或对吸收、转运、代谢的作用和/或物质的清除或其毒性相关联。由于与体外或非人动物数据相比，这些数据与体内环境(更优选人体内环境)更加匹配，所以这些数据是有利的，并且是对更为传统的基于体外的方法的改进。因此，本文提供的方法可产生更精确的计算机模型，减少目前制约现有模型效力的限制。例如，对从试验结果向预期的体内作用的外推的需要显著减少。此外，本发明的方法可用于评估基于体外的计算机模型的命中靶标，随后可根据生理和药代动力学性质筛选所述命中靶标。本发明方法此方面的实施方式可在发现的最早阶段更为准确地选择有前景的候选药品以进行进一步的筛选和开发。此外，本文提供的使用完整的人器官的离体方法提供了基因组和蛋白质组学的分析筛选方法，以鉴定人疾病、毒性和其他生理活性的生物标记物，以及灌注液分泌物中酶和蛋白质(蛋白质组学)随时间的变化和来自在生理条件下具有代谢活性的分离的灌注人器官或组织的活检物随时间的变化。
因此，信息产品可包括确定计算机模型所需的数据，并可向第三方收费。或者，信息产品可包括由提供商开发的计算机模型，并可向第三方收费。
应用本文公开的方法产生信息产品时可根据公司的个体需要而进行适应性改进。所以，可对药物开发者(例如制药公司)正在开发的药物进行评估。所述评估可进一步包括信息产品可能对第三方的药物开发过程的作用。由此，所述评估可以是前瞻性的评估。此外，所述评估还可以或选择性地包括信息产品对第三方的药物开发过程的作用。由此，所述评估可以是回顾性的评估。可在药物开发过程中的任何适合阶段或药物的市场期中进行评估，以确定信息产品对药物开发和使用的作用或潜在作用。
可进行评估以将信息产品推向市场。由此，提供商可向第三方提供包括信息产品对药物开发过程的经济作用的评估结果。或者，出于其他任何适合的目的而进行评估。可进行收费评估，所述费用在本文讨论的任何费用或其组合之内，或者额外计费。
更特别地，评估可包括确定药物开发者可能在何处以及何种情况下通过采用本文公开方法的信息产品获得最大的价值。评估本文公开的方法对研发过程中各个阶段的具体问题的影响有助于进行上述确定。此外，根据其研发过程和资源的差异，对大型和小型公司的不同情况和假想的比较分析可提示其彼此价值潜在来源的差异。此类评估可考虑公司在预期本文公开方法的信息产品可产生有意功效数据的治疗领域中的临床前研究方案的百分比。此外，评估可以揭示在何处存在有效发挥本文公开方法的信息产品解决矛盾的物质数据的机会，以将其作为增加新药试验申请数量或逆转所述数量减少趋势的方法。评估还可以确定可为公司提供最大收益的研究的数量和类型。此评估可基于每年从临床前阶段进入I期的化合物的平均数量。此外，根据在I期停留的时间长于行业平均值的I期化合物的数量，所述评估可揭示本文公开方法的信息产品可解决的与生物利用度和毒性相关的未知问题。
评估可评价成功应用本文公开方法的信息产品的总价值。信息产品的最大总价值可包括与产量、时间和成本相关的价值。例如，可以通过没有所述信息产品将不能发现和推出的上市或全面开发的增量化合物的利润来计算产量。可以由通过利用所述信息产品更快地解决问题或状况而获得的额外销售高峰来计算时间。成本可能涉及与试验数量(例如试验的数量和/或重复试验的数量)的减少相关的费用减少。因此，可将产量、时间和成本的价值相加以确定所述信息产品的最大总价值。预期价值考虑了与所述信息产品的最大总价值的实现可能性相关的概率。
所述评价可评估成功应用本文公开方法的信息产品解决一系列常见问题(例如，与药物开发的各个阶段相关的问题)的总价值。所述问题可包括在发现阶段由高通量试验产生的矛盾数据；功效等级顺序的不确定性，物种间矛盾的吸收和摄取数据，物种间矛盾的毒性数据，物种间矛盾的功效数据，PK-毒性关系等级顺序的不确定性，药物-药物间相互作用等级顺序的不确定性，以及在临床前阶段吸收和摄取等级顺序的不确定性；由于低吸收和/或高代谢而产生的与生物利用度相关的未知问题，和在I期出现未知代谢物的不确定性；由于物种差异、健康志愿者和患病患者的差异、难以征集到足以进行试验的受试者、估计到样本数量因而治疗作用的广度的不确定性和II期中正确的采纳/排除标准的不确定性而产生的与PKIPD(药代动力学/药效动力学)相关的未知问题；和III期中正确的采纳/排除标准的不确定性。在药物开发中遇到的各种情况或问题中，所述信息产品的预期价值可产生在其他情况下不会被研究的额外化合物，由于所需试验数量减少而节省了时间和公司成本而获得的额外利润。期望预测信息产品的预期价值来自这些来源或其他来源中的至少一个。
可以针对开发过程中产生的各种情况和问题，确定信息产品解决所述问题的作用的最大总价值和估测的预期价值。例如，如果在药物开发中产生的问题需要药物开发者暂时搁置化合物以解决所述问题，那么用以解决所述问题的延迟将导致，例如销售高峰的损失。最大总价值包括信息产品通过解决所述问题为药物开发者带来的价值。可以使用与信息产品获得最大总价值的可能性相偶联的发生问题的可能性来确定总价值。可将预期价值与最大总价值的这种关系应用于各种情况或问题中。
计算信息产品在具体情况下的预期价值的方法可包括为应用所述信息产品的每种情况或问题确定适合的价值方程式。所述价值方程式可包括所述信息产品的最大总价值。
确定信息产品的预期价值也可包括对不同基本事件假设(base-caseassumption)进行量化以确定产量、时间和成本的值。所述评估可设定参数的数值，例如开发阶段的产量、各开发阶段的持续时间、开发阶段的直接成本、从阶段末期预期上市年代、每年的平均销售高峰和销售高峰的年数。评估还可包括各上市产品(例如药物)和/或计划上市的产品的年销售高峰的数值。评估还包括估测的合理贴现率。可基于来自学术文献、网络资源、工业概况或任何其他可靠信息源的市场数据确定所述假设。
信息产品的评估方法可包括为开发过程或部分开发过程中遇到的各种问题或情况构建通用的决策树(generic decision tree)。对于每种情况，可生成描绘使用所述信息产品的可能途径的独特决策树(unique decision tree)。例如，可生成解决通常在药物开发的临床前阶段遇到的物种间矛盾的毒性数据的决策树。此决策树可包括表明可能在尝试解决所述情况中产生的结果的潜在转变的任意数量的分枝。此决策树可包括，例如额外的动物试验是否能解决矛盾的毒性数据的分枝。如果动物试验不能解决所述问题，决策分枝可包括本文公开的方法的信息产品是否能解决所述问题。如果信息产品解决了所述问题，决策分枝可包括信息产品是否包括基于化合物的固有性质的有利结果，例如可接受的毒性水平。如果信息产品包括所述有利结果，所述决策树可进一步包括是否存在由于可能阻止化合物在开发过程中的进展而必须被解决的任何剩余问题的分枝。
信息产品的评估方法还可以包括测定和分配决策树各分支中可能发生的各种可能结果的可能性。决策树分支的可能性可以基于来自学术文献、网络资源、工业概况或由本文公开的方法产生的或验证的累积数据以及任何其他可靠的信息源。例如，可假定额外动物实验解决物种间矛盾的毒性数据的可能性仅为50％，而如果应用本文公开的方法的信息产品，则解决矛盾数据的可能性提高到80％。可进一步假定使用本文公开方法的测试获得具有有利特性(例如可接受的毒性水平)的化合物的可能性是40％，并且假定不再需要进行其他测试即可推进此化合物的开发进程的可能性为20％。
可以通过计算各种情况或树在产量、时间和成本方面的最大总价值，从而导出信息产品带来的预期价值。可以根据通过应用信息产品解决问题而获得的成功产品(例如药物上市)的可能性计算预期价值。回到上述实例，如果应用信息产品解决矛盾的毒性数据所带来的基于产量、时间和成本价值的最大总价值是3.05亿美元，那么考虑到与解决问题中的每种可能结果相关的可能性，此信息产品的预期价值可计算为每种化合物为970万美元(3.05亿x50％x80％x40％x20％)。因此，信息产品在解决与可被开发和上市的特定化合物相关的问题中为药物开发者带来价值。本文公开方法的信息产品提供了预防与重新测试化合物相关的延期的潜在资源。此类信息产品的应用可以创造出更低地避免产品最大总价值损失的机会。
灌注实例
优选调整灌注液的性质以适应具体的待测组织、器官或其组合，或适应测试化合物的化学或其他特征。本领域技术人员能够选择适合的方案。然而，在本发明中优选在整个适宜性测试、物质测试和/或对照施用以及监测过程中使用单个基本灌注液，以控制由灌注液产生的潜在变化。
对常温条件下的灌注，灌注液优选包含：水、钠、钾、钙、镁、氯、缓冲成分(例如包含碳酸氢根离子和TES、MOPS或BES)、葡萄糖、甘油、胆碱、氨基酸成分(例如，谷氨酸(glutamate)、天冬氨酸(aspartate)和/或谷氨酰胺)，辅酶(例如硫胺脱羧辅酶)、维生素样成分(例如肉碱)和蛋白质(例如人白蛋白和胰岛素)。或者，也可以使用人血浆。
在常温条件下使用的优选灌注液，例如RS1(
Figure G2008800248476D00261
英国伦敦)或OPB-1或OPB-2(Organ Recovery Systems，Inc.，Des Plaines，IL)，pH范围为约7.13-约7.41，渗透浓度为约286mOsm，并且包含以下组分：
  OPB-1组分   OPB-1浓度(mM)
  有机酸   5
  氯   116.4
  钠   135
  钙(离子化)   1.2
  钾   5
  碳酸氢根离子   25
  葡萄糖   10
  TPP(脱羧辅酶)   0.04
  镁(离子化)   0.45
  谷氨酰胺   0.4
  谷氨酸   0.3
  甘油   0.11
  肉碱   0.05
  无菌水   n/a
  天冬氨酸   0.02
  胆碱   0.01
  蛋白质(胰岛素)   0.002(25.00mIU)
  牛血清白蛋白   6％
  缓冲液(BES)   n/a
此外，如下表中的示例性描述所述，可改良灌注液以用于某些器官。
Figure G2008800248476D00271
灌注研究报告
如果将灌注研究结果的报告提供给第三方或仅将其保留，那么所述报告可以为草稿或终稿形式，并且包含但不限于以下研究信息和数据中的一些或全部：试验过程的描述，包括例如灌注方法和制备物(制备)的细节；在灌注研究开始和结束时器官或组织的重量；质量平衡数据，例如灌注液、血浆、组织或器官中和/或适合使用的体液(例如胆汁)中的放射性同位素的质量平衡数据；血浆和/或器官或组织的清除；标准品(也称作“对照”)，对照方法学和物质；结合或未结合的标准品或任何适合的结合物的排泄；标准品的代谢物的形成速率以及标准品的代谢谱的其他方面；对标准品的描述，包括例如代谢谱；如果适用，在各个收集时间点的生理流速，例如胆汁、动脉等；器官供体的详细情况和就医记录(按照许可)；测试物质的数据表；测试物质的接收和使用记录；给药记录；样品收集记录；样品重量记录；样品贮存和运输记录；研究部位的定位；在研究期间进行的或与研究相关的任何其他测量和/或分析；和/或由合同实验方(contract facility)提供的任何报告和/或数据。
下文阐述利用本发明的方法实施方式的示例性试验。本文的公开是一般性质的，下文的非限定性方法提供该一般性公开的实施方式。
灌注肠的方法实施例
例如在药物开发中，特别是在临床试验前，产生关于物质在人肠中吸收的明确数据的能力对于可能被吸收的物质的使用的确定是重要的。可使用分离的肠段产生这些数据，这是因为：(a)所述物质如同在体内一样通过肠腔呈递；(b)在肠腔和血液之间存在完整的屏障；和(c)灌注液的组成和流动特征模仿其在体内的情况。
灌注条件
每次分析使用约3L灌注液。所述灌注液优选包含悬浮在包含4-6％人血清白蛋白且pH优选为约7.4的缓冲液中的匹配人红细胞(优选预先清洗过)(约15％-约20％，v/v)。
优选使所述灌注液通过输血过滤器，随后通过白细胞清除过滤器，添加肝素并调节pH，如果必要优选将pH调至约7.4。所述灌注液在添加到灌注装置前优选在室温下贮存。可将剩余灌注液的试样(aliquot)离心(在约4℃下以约1,500g离心约10分钟)以分离血浆。随后，可将血浆在约-20℃或更低的温度冷冻以在分析中作为空白对照使用。
肠样品和灌注
优选取出低温贮存的分离人肠段(约30cm-约45cm)，例如紧邻胆管入口下方的肠段，以用于各个分析。
将完整的肠样品称重并在约4-8℃、pH约7.4和压力约60-80mmHg下，用冷缓冲液通过肠系膜动脉(或其分支)冲洗约10-约15分钟。该动脉缓冲液冲洗通常使用约0.5L缓冲液。
在动脉缓冲液冲洗之后是平衡阶段，其中使约0.5L的氧饱和室温灌注液以约20mL/分钟的速率通过肠。可将约0.5L的灌注流出物废弃，随后将灌注切换到使用0.75L氧饱和灌注液的重循环模式。优选随时间将灌注速率提高到约90mL/分钟-约100mL/分钟的目标，但不超过最大压力限。使灌注液重循环直至肠核心温度大于约35℃并可观察到肠蠕动。首次通过和首次重循环通常总计持续长达约60分钟。
在平衡阶段结束时，将灌注液从所述装置排出，并在重循环模式下替换成约1L的约37℃新鲜氧饱和灌注液。此阶段为稳定阶段，持续约10-约15分钟。随后，在满足灌注和生理参数(例如耗氧量，核心温度高于约35℃，流速约90mL/分钟，压力为约60-约80mmHg)的条件下，取出灌注液试样。
施用和样品收集
为了确保肠适合用于此测试，优选在此阶段检查其适宜性。即便在低温贮存前已经确认了该器官的适宜性，这一步骤仍能避免时间和精力的浪费。具体而言，可以避免在进一步的测试中使用在贮存或灌注中受到不当损伤的器官或组织，或者可以建立基线性质。在施用测试物质前对人肠进行常温灌注的优选接受标准为：
Figure G2008800248476D00291
在同一制剂(最大体积约15ml)中向分离肠的肠腔中施用(优选以脉冲剂量)优选标记(例如放射标记)的测试物质(约10mg，约100μCi)和优选3-5个标记的内标，所述测试物质和内标以不同的速率通过被动扩散吸收。将此时记为“计时起点”。
随后，以重循环模式灌注肠，优选灌注约2小时，并且优选在至少两个下列优选时间点取出灌注液试样(约3mL-约5mL)：给药前以及给药后5、10、15、30、45、60、90、105和120分钟。将每份样品的大约一半在约-70℃冷冻，并将每份样品的剩余部分离心，取出血浆并在约-70℃冷冻。或者，在5毫升的样品中，例如，将约1毫升作为完整灌注液保留，将剩余的约4毫升离心，并将上层血浆分成大致相等的4份试样以进行单独分析。
在灌注结束时，将肠段称重，收集肠腔内容物并称重，使用约100毫升水冲洗肠腔并加入到肠内容物中，记录总质量。将此混合物在最少量的水中均浆，并且如果需要以大致相等的试样(例如约40毫升的试样)冷冻以用于后续分析。此外，优选使用盐水、水和/或醇清洗灌注装置。可将各洗液样品保存以用于后续分析(例如，质量平衡)。
灌注方法的实施方式允许向同一肠的连续肠段进行多次(单次或组合)施用。在此类实施方式中，如上所述灌注整个肠段，但在平衡后，将肠(肠系膜和肠腔)分成3段，优选其长度大致相等，这样尽管灌注液仍循环通过每段且随后混合，但所述3段肠腔彼此完全分离。随后，向一段施用测试物质和标准品，并在施用后以达约1小时至约2小时的时间间隔取出灌注液试样。随后，通过例如烧灼术(cauterization)将此段从接近肠系膜处去除，保持肠系膜完整且密封。随后，使1L新鲜灌注液冲洗通过剩余两段，并收集首次通过的洗脱液。随后，加入新鲜灌注液(约1L-约1.5L)，并以比用于3段的流速小1/3的流速重循环。随后，向第二段施用，并重复整个过程直至所有3段均被施用，针对每个计时起点以在给药后达约1小时-约2小时的时间间隔收集灌注液试样。
活检(biopsy)
优选在施用前和灌注结束时进行活检，并在匀浆之前的收集点将其快速冷冻在液氮中。可对活组织进行组织病理学检测，并对标记物酶和其他蛋白质进行表型检测。
对照
优选的对照包括但不限于施用前收集的灌注液和血浆试样。对照优选在约-80℃贮存。
分析
通过分析测试物质从肠腔到重循环灌注液中随时间的吸收速率，并将该速率与内标的吸收速率进行比较来测定所述测试物质的吸收。原始数据通常以皮摩尔/ml、总皮摩尔和/或百分剂量表示，并且包括所有吸收的化合物的百分数比例，以及标记的测试物质在灌注液、血浆、肠内容物和肠壁中的质量平衡。如果使用放射标记的化合物和标准品，则可以测量总放射性，并且如果需要，可以对标记的测试物进行HPLC图谱分析。
在灌注期间监测生理参数，例如动脉压和动脉流速、器官核心温度、血液pH、积极蠕动以及动脉和静脉的PO2和PCO2；血液生化参数，例如电解质平衡，包括但不限于钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(碱性磷酸酶)(U/l)、ALT(丙氨酸转氨酶)(U/l)、淀粉酶(U/l)、AST(天冬氨酸转氨酶)(U/l)、GGT(γ-谷氨酰转移酶)(U/l)、Cal(mg/dl)和BUN(血尿素氮)(mg/dl)的浓度；生物标记物，例如葡萄糖(mg/dl)的利用和乳酸(lactate)(mM)的生成；内标的吸收，例如3H-甘露醇(目标浓度约100μCi；目标剂量约20μM)；安替比林(目标剂量约20μM)；特布他林(目标剂量约20μM)；葡聚糖(约10kD-约70kD)和/或其他标记或未标记的标准品；以及测试化合物和/或代谢物的存在和特征。
经灌注的肠模型在药物开发中的应用
灌注研究可用在药物开发的数个阶段。例如，吸收研究可用于评估候选药物的单脉冲给药和/或重复给药、恒速输注、盒式给药(cassette dosing)、制剂的影响、区域差异(regional difference)、食品的影响、饱和动力学和药物-药物相互作用等。代谢研究可用于评估，例如代谢物的鉴定、代谢物的量化、饱和动力学和区域差异。分布研究可用于评估，例如共价结合。
灌注肝脏的方法
在过去50年中，已经详细记载了药物代谢中的种属、品系和性别差异。在很多情况下，这些差异是由于细胞内酶和辅助因子，特别是肝脏中的细胞内酶和辅助因子的浓度变化而造成的。在药物开发中，新代谢物的出现或与候选药物的最初研究中的发现截然不同的特定代谢物的浓度都会导致相当大量的额外来源和时间浪费。
目前使用来自体外制备物(即组织切片、分离的肝细胞、S9部分或微粒体)的数据尝试对人肝脏代谢进行预测。尽管这些研究很重要，但是它们有时：(a)不能模拟完整肝脏中的代谢；(b)鉴定的是可能的代谢而非实际的代谢；和(c)没有测量代谢物在血液和胆汁之间的后续分配，并由此没有测量肝外器官和组织与肝脏代谢的副产物的接触。
在分离的血管灌注人肝脏研究中，可以避免这些缺陷。作为代替，可以通过基于匹配血液的灌注液以生理流速向具有正常胆汁分泌机制的稳定存活肝组织或器官递送测试物质和标准品。因此，此模型非常适合用于测定人肝脏中药物摄取的性质和程度、药物代谢和药物清除，以及胆汁清除、质量平衡以及代谢物在血液和胆汁之间后续分配的测量。此外，可在单独的实验中表征具体的代谢物。
示例性灌注条件
每次分析使用约5L-6L灌注液。新鲜灌注液包含人红细胞(预先清洗并离心)，其悬浮在包含6％人血清白蛋白的缓冲液中(在约室温，v/v为约15％-约20％，pH约7.4)。如果已知此测试化合物与α-1-糖蛋白结合，则使用4％人血清白蛋白+2％的α-1-糖蛋白代替6％人血清白蛋白。随后，使灌注液通过Pall 40微米的输血过滤器，随后通过“白细胞清除”过滤器，添加约15N.I.H.单位/mL的肝素并调节pH，如果必要，将pH调至约7.4。所述灌注液在添加到灌注装置前优选在室温贮存。可将例如约50mL的剩余灌注液的试样离心(在约4℃下以约1,500g离心约10分钟)以分离血浆和血细胞。可将血浆在约-20℃或更低的温度冷冻以在分析中作为空白对照使用。
在灌注过程中记录门静脉和肝动脉中的流速、压力和温度。以约15分钟的间隔测量通过肝动脉和门静脉的入口以及通过腔静脉的出口的PO2/PCO2。各肝脏的平衡阶段可以为约45分钟-约60分钟，并将胆汁收集到预先称重的容器中。只向在灌注液流速和压力以及胆汁流速方面符合要求的制备物施用测试物质。
开始向灌注液中补充添加胆汁盐，随后在整个灌注阶段进行添加。胆汁盐包括但不限于溶于25％羟丙基-β-环糊精(HPβCD)中的约1g甘氨胆酸钠水合物(Sigma G7132)、约0.5g甘氨脱氧胆酸钠(Sigma G9910)和甘氨鹅脱氧胆酸钠(Sigma G0795)，其中HPβCD溶液中的总胆汁盐质量为20g。优选开始时在每升灌注液中添加约1g胆汁盐HPβCD溶液，随后在第1、2、3、4和5小时向此灌注液中添加约1g溶液。由此，灌注液将由悬浮在补充有胆汁盐的人血浆中的经清洗的匹配人红细胞组成。
灌注的肝脏样品
取出低温贮存的分离人肝脏，并且如果可能，进行肝动脉、门静脉和腔静脉插管。随后，在约室温下使用约1L-约2L冷缓冲液(例如，Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液，pH约7.4)在重力下作用冲洗肝脏约10-约15分钟，以除去转运/贮存介质。
如上所述，将约1.5L包含悬浮于含有4％或6％人血清白蛋白的缓冲液中的人红细胞(经预先清洗)(在约室温下，v/v约15％-约20％，pH约7.4)的新鲜灌注液随后以约20mL/分钟泵入到肝动脉和门静脉中，并在平衡阶段重循环约45-约60分钟。
在将约1L灌注液废弃后，在灌注装置中重循环约2L的新鲜灌注液。在约10-约15分钟的稳定阶段，将灌注液的温度提高到约37℃，并将灌注流速提高到目标流速，例如以约200ml/分钟-约300ml/分钟通过肝动脉，约400-约800ml/分钟(优选约600ml/分钟)通过门静脉。
施用和样品收集
优选在如上所述的灌注研究之前确定测试化合物的溶解性和稳定性。一旦灌注制备物的灌注流速和压力稳定，则向重循环灌注液中添加测试物质。施用测试物质前对人肝脏进行常温灌注的优选接受标准为：
施用载体优选为含水的，或者在化合物水溶性差的情况下，所述施用载体为在灌注液中终浓度为约0.1％v/v的DMSO。优选的施用方案包括：在一段时间(Tmax中值＝约1小时)内向灌注液中添加包含约50mg优选标记(如放射标记)的测试化合物，或未标记和标记(如放射标记)的测试化合物的混合物的DMSO作为输注物(infusion)。如果使用放射标记物，目标放射剂量优选为约100μCi/肝脏。
优选将每份施用溶液放入预先称重的连有套管的注射器中，并将此注射器重新称重。以脉冲剂量将此注射器的内容物排至灌注液中。在指定的“计时起点”添加测试化合物，并将肝脏灌注约240分钟。在约240分钟结束时添加标准品，例如tetra-BSP(约20μM)，并再将肝脏灌注约120分钟。在给药后，将肝脏灌注共计约6小时。例如，在灌注期间的至少两个下列时间点收集灌注液样品(每份样品约10mL)：给药前以及给药后5、10、15、30、45、75、105、135、165、195、225和239分钟。
此外，在灌注过程中连续收集胆汁，例如在至少两个下列时间点进行收集：给药前以及给药后30、60、90、120、150、180、210和240分钟。
在“计时起点”后约4小时向肝脏施用至少一种阳性对照，并且在至少两个下列时间点收集灌注液样品：计时起点后245、150、255、270、285、300、330和360分钟。
对于每份约10毫升的样品，将约1毫升作为完整灌注液保留，将剩余的约9毫升离心，并将上层血浆分成大致相等的4份试样以进行单独分析。可将上清液和胆汁样品在约-80℃贮存直到用于分析所施用的测试和对照化合物以及任何代谢物。在收集每份约10mL试样样品后，将约10mL的对照灌注液(不含测试物质的灌注液)添加到灌注系统中以保持恒定的体积。
如果需要，在灌注结束时收集所有剩余的灌注液和装置清洗液以进行质量平衡分析和/或代谢物谱(灌注液/血浆中)分析。在对测试化合物和/或一个或多个对照进行放射标记的情况下，如果在灌注前没有将胆囊从肝脏摘除，则可以将胆囊匀浆并分析总放射性。
在收集到组织后，优选用盐水清洗灌注装置，并且在灌注结束时用水和醇清洗。优选将每份清洗样品保留以进行分析。此外，在施用后将施用注射器和套管重新称重，并用水和甲醇清洗。如果适当，则分析注射器/套管洗液的放射性，或者其他适合的标记物。通过从例如加入注射器/套管中的放射性总量减去注射器洗液的放射性计算所施用的测试化合物的剂量。
活检
优选在给药前和给药360分钟后进行活检，并在收集点将其快速冷冻在液氮中。在灌注结束时，将剩余的肝脏均浆。可对活组织进行组织病理学检测，并对标记物酶和其他蛋白质进行表型检测。
对照
优选的对照样品包括但不限于给药前收集的胆汁、灌注液和血浆试样，并且如果可能，也可以是从单个器官收集的肝脏匀浆物。优选将所有样品在约-80℃贮存。
分析
如果使用放射标记的化合物和标准品，则可以测量总放射性，并且如果需要，可以提取标记的化合物、标准品和/或代谢物并进行HPLC图谱分析。此外，可对代谢物进行可能的结构鉴定，并且可以提取并分析血浆和胆汁中的标准品(例如tetra-BSP)及其谷胱甘肽结合物。
可在灌注期间监测生理参数，例如动脉压和流动、器官核心温度、血液pH、以及动脉和静脉的PO2和PCO2；血液生化参数，例如电解质，包括但不限于钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(U/l)、ALT(U/l)、淀粉酶(U/l)、AST(U/l)、GGT(U/l)、Cal(mg/dl)、胆红素(U/l)和BUN(mg/dl)的浓度；生物标记物，例如葡萄糖(mg/dl)的利用和乳酸(lactate)(mM)的生成；标准品的吸收，所述标准品例如3H-甘露醇、安替比林、普萘洛尔(propanalol)、阿替洛尔、四溴酚酞磺酸钠(bromosulphophthalein，tetra-BSP)、1-萘酚、7-乙氧基香豆素、特布他林和/或其他标记或未标记的标准品；以及胆汁、灌注液和肝脏中测试化合物和/或代谢物的存在和特征。
经灌注的肝脏模型在药物开发中的应用
灌注研究可用在药物开发的数个阶段。例如，可以使用首过清除和/或血浆清除研究来评估测试化合物的半衰期、单脉冲给药、重复脉冲给药、血浆稳态和盒式给药。胆汁排泄可用于，例如量化母体药物(所测试的物质)或评估饱和动力学。代谢研究可用于评估，例如代谢物的鉴定、代谢物的量化、代谢物在血浆和胆汁之间的分配，以及饱和动力学。分布研究可用于评估，例如组织清除、药物-药物相互作用和共价结合。肝脏摄取、分布、组织累积(药物在组织中的累积)代谢和/或排泄研究可用于研究肝脏疾病。
灌注肾脏的方法
在临床试验前定性和定量地测定候选药物在人肾脏的结局和作用的能力在药物开发中是重要的。与药物开发特别相关的过程包括，但不限于：(a)肾清除、血浆清除和肾小球滤过率-尿液是物质排出的主要途径，且肾脏是药物-药物相互作用的主要部位；(b)代谢-肾脏具有显著的I相和II相药物代谢活性，例如测定肾小管重吸收或主动分泌的百分比；和(c)分配-肾脏中形成的代谢物在血液和尿液间的分配能够表明其他器官与药理活性或毒性代谢物的后续接触。
与所有人器官一样，为经灌注的分离人肾脏(IPHK)设计验证方法，以用于在将肾脏从供体切除后的低温保存灌注和用于药物研发的常温生理灌注。
优选地，在使用IPHK进行测试之前，尽可能多了解用于测试的每个肾脏的历史记录，更重要的是将其目前的状况与成功移植的数百个肾脏和没有成功移植的数百个肾脏的数据库进行比较。这是接受肾脏进行药物研究的机制，并记录每个决定的基本原理。然而，使用本发明的公开，肾脏不需要处于移植所需的相同条件下。因此，例如可以使用比适于移植者年长的供体(例如，年长56岁)的器官或来自无心跳供体的器官，以及患病或受伤的器官。
灌注条件
在收到捐献的肾脏后将其尽快转入低温贮存，并在约6℃-约8℃使用如
Figure G2008800248476D00371
缓冲液(Organ Recovery Systems，Inc.，Des Plaines，IL)的缓冲液灌注至少约4小时。
随后，使用约1L新鲜灌注液冲洗肾脏，并使灌注流出物的温度升高到约37℃。当肾脏的灌注压力和流速以及尿液形成稳定时，用约1.5L新鲜灌注液替换第一灌注液。
在本发明的实施方式中，用于肾脏灌注的灌注液来自肝脏灌注试验，在该试验中测试化合物已经灌注通过人肝脏。这样能够了解肾脏对测试物质和标准品的肝脏代谢物的处理和/或进一步的代谢。
施用和样品收集
在施用测试物质前对人肾脏进行常温灌注的优选接受标准为：
Figure G2008800248476D00372
直接向灌注液中加入测试物质和内标，并在约2小时内每15分钟采集灌注液试样(约3ml-约5ml)，大约每15分钟分批收集尿液。将各灌注液样品再细分成大致相等的4份试样。将2份试样保留以进行分析，将其他2份离心，取出血浆并在约-70℃冷冻保存以用于可能需要的其他分析。将尿样收集到油管(tarred tube)中，称重，并在约-70℃冷冻以用于后续分析，例如分析测试化合物、标准品和代谢物。
在向IPHK施用测试化合物足够长的时间后，例如约60分钟后，可向循环灌注液中添加外源的阳性对照以确认这些关键过程没有被内源化合物(即内标)掩蔽(covered)。这些额外(优选标记的)的对照包括但不限于对氨基马尿酸(用于评估肾小管分泌)和谷胱甘肽结合物(用于评估硫醇尿酸途径的完整性)。
在施用阳性对照后的约2小时内，再以每隔约30分钟收集灌注液和尿样，并将其保留以用于分析，所述分析包括但不限于测量生理参数；测量血液化学参数，例如钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、葡萄糖(mg/dl)、乳酸(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(U/l)、ALT(U/l)、淀粉酶(U/l)、VAG(U/l)、AST(U/l)、γ-GST(谷光甘肽S-转移酶)(U/l)、肌酸酐(mg/dl)和尿排泄物(urinary excretion，U/l)；测量尿液、灌注液和肾脏中的测试化合物、标准品和/或代谢物；并测量尿液的生化参数，例如N-乙酰氨基葡糖苷酶、谷光甘肽S-转移酶以及蛋白质和肽。
经灌注肾脏模型在药物开发中的应用
灌注研究可用于药物开发的数个阶段。例如，可使用血浆清除研究评估单脉冲给药、重复脉冲给药、单个化合物给药、血浆稳态、盒式给药和饱和动力学。肾脏排泄可用于评估，例如GFR、测试化合物重吸收百分数、测试化合物分泌百分数、饱和动力学和药物-药物相互作用。代谢研究可用于评估，例如代谢物的鉴定、代谢物的量化、代谢物在血浆和尿液之间的分配，以及饱和动力学。分布研究可用于评估，例如区域分布和共价结合。
灌注人肺的方法
经灌注的分离人肺制备物(IPHLung)是用于研究肺特异性药物相关活性的通用系统，所述肺特异性药物相关作用包括但不限于评估例如通过测量肺通气功能评估吸入药物的性能、药物制剂的稳定性、经气管的药物吸收、从血液摄取药物、药物代谢、清除和保持、水肿的程度、药理作用、药物功效、药物毒性和药物-药物相互作用，以及通过使用喷雾递送组胺/沙丁胺醇或其他内标诱导支气管狭窄/扩张，从而评估肺的生理功能和药理响应。可靠地量化这些活性中的一种或多种可以为候选药物选择和/或测试化合物上市后问题解决(如果需要的话)中的关键决策提供基础。
此外，灌注研究克服了体外肺研究的很多问题，包括但不限于可对肺中40种以上的细胞类型进行研究，在这些细胞类型中，很多不能被分离，还有很多在培养时表型发生改变。
灌注条件
优选在约6℃-约8℃使用约2L缓冲液(例如Krebs-Ringer缓冲液)以约12ml/分钟-约18ml/分钟冲洗成对的呼吸肺，使其不含供体的血液。随后，在小于约18mmHg的压力下使用新鲜灌注液通过肺动脉灌注肺，并连续记录流速。可将来自肺静脉的流出物重循环(除首次通过的情况之外)。灌注研究中使用约2L灌注液。
优选的生物标记物为酶标记物，包括但不限于血管紧张肽转换酶。优选的内标包括，但不限于约1mg/ml沙丁胺醇或其他支气管扩张剂(剂量约150μg)，约1mg/ml异丙托品(剂量约150μg)和多胺。
施用和样品收集
在施用测试物质前对人肺进行常温灌注的优选接受标准为：
Figure G2008800248476D00391
在施用前和其他采样时间收集灌注液样品，并从例如pH、pCO2、乳酸和无机离子方面对血液化学进行评估。此外，在相同时间点采集样品以评估血管紧张肽转换酶和其他酶的释放。
在以约0.3mg/ml-约1.0mg/ml(剂量约45μg-约150μg)的浓度施用测试化合物或化合物组(cassette of compounds)(使用喷雾器经气道或添加至灌注液中)后＝(称作“计时起点”)，在施用前以及例如在吸收研究施用后的至少两个下列时间点取出灌注液试样(优选约3ml-约5ml)：5、10、15、30、45、60、90和120分钟。每份试样保留约1ml用于血液化学/生化测量以及血细胞比容测量。留出部分剩余试样(约1ml的完整灌注液)，并将其他部分离心，将所得的不含细胞的上清液进一步分成等份试样，并将其在收集点时快速冷冻在液氮中。
在施用后约120分钟后，将此灌注液替换成新鲜灌注液，并循环约30分钟。例如在新鲜灌注液循环开始后5、10、15和30分钟采集灌注液样品(约3ml-约5ml的试样)。每份试样保留约1mL用于血液化学/生化测量以及血细胞比容测量。留出部分剩余试样(约1mL的完整灌注液)，并将其他部分离心，将所得的不含细胞的上清液进一步分成等份试样，并将其在收集点时快速冷冻在液氮中。
在30分钟结束时，向灌注液中添加代谢标记物，并在添加代谢标记物后例如5、15、30和60分钟(如果可行，到灌注结束时和/或在其他时间点)再次采集灌注液样品，为约3ml-约5ml的试样，随后将其冷冻以用于此后对测试化合物和代谢物的分析。还在添加用于多胺摄取测定的代谢标记物后的例如5、15、30和60分钟(以及可行的其他时间点)，采集约1ml的血浆样品。所述标记物包括但不限于添加到灌注液中的探针、剂量为约20μM的乙氧基香豆素(CYP1A)以及剂量为约10μM的1-萘酚(葡糖醛酸化和硫酸化)。
在计时起点起约3小时30分钟，向灌注液中添加浓度为约10-5 M-约10-6M的组胺或其他支气管收缩剂或血管扩张剂以进行药理评估。约10分钟后，评估支气管收缩情况。如果未发现支气管收缩，则再添加组胺，但将浓度分别提高到约10-6M-约10-5M。每10分钟向灌注液中添加浓度提高的组胺直到出现支气管收缩的症状，此时开始吸入来自1mg/ml储液的剂量为2x150μg的对照，例如沙丁胺醇。优选使用带有150μl盘的ProDose设备进行给药。在约15分钟内检测是否出现支气管收缩。随后，可以向灌注液中添加浓度约10-7M的罂粟碱或其他血管扩张剂，并检测支气管舒张的程度。
活检
可以使用例如充满中性缓冲福尔马林的容器(例如500ml的塑料螺旋盖容器)对各个肺进行组织学研究。取出带有全长支气管的肺叶，避免损伤实质组织。将结扎线松松地绕过支气管放置。可使用镊子夹持支气管，并使用注射器将福尔马林缓慢地注入整个肺叶。在肺叶膨胀75％后停止注入。将支气管结扎并将肺叶放置在福尔马林中。记录最初固定的日期和时间。
经灌注的肺模型在药物开发中的应用
可将灌注研究用于药物开发的数个阶段。例如，(通过气道的)吸收研究可用于评估测试化合物的制剂，例如液体、干粉或喷雾，以及给药方案，例如单次给药、重复给药或盒式给药。血浆清除研究可用于评估例如单脉冲给药、重复脉冲给药、单个化合物给药、盒式给药和恒速输注给药。代谢研究可用于评估，例如代谢物的鉴定、代谢物的量化、挥发性代谢物和饱和动力学。分布研究可用于评估，例如测试化合物在组织中的积累，存留时间和通行时间。
如共有专利美国专利第6,673,594号和美国公开专利申请第2004/0224298号(均通过引用全文并入本文)所述，在实施本发明的方法时，可以使用用于灌注移植器官的设备和装置。然而，本领域技术人员将认识到，根据本发明的方法使用组织和器官的方式不同于通过灌注保持用于器官移植的组织和器官的方式。
如同在本申请中明确记载其全文一样，本文引用的所有专利、专利申请、科技文献和其他原始资料和参考文献均通过引用将其全文并入本文。
应理解上述公开重点描述了本发明的某些具体实施方式，与这些实施方式相等同的改变或替换也在本发明的精神和范围之内。

Claims (48)

1.使用至少一种人器官或组织验证物质测试结果的方法，所述人器官或组织选自由已经从其来源永久去除的具有代谢活性的人器官或组织和源自分离的和/或培养的人细胞的工程化器官或组织组成的组，所述方法包括：
(a)在施用测试物质之前评估所述人器官或组织对测试的适宜性；
(b)使用包含所述测试物质的灌注液灌注所述器官或组织；
(c)评估与所述测试物质相关的参数；和
(d)在施用所述测试物质期间和/或之后评估所述器官或组织对测试与所述测试物质相关的所述参数的适宜性。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括使用额外包含至少一种对照物质的相同灌注液灌注所述器官或组织，其中所述对照物质具有关于所述参数的已知的定性或定量作用，和评估至少一种所述对照物质的该同一参数。
3.如权利要求2所述的方法，其中关于所述参数，所述对照物质与所述测试物质具有竞争关系，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述对照物质灌注通过所述器官或组织。
4.如权利要求2所述的方法，其中关于所述参数，所述对照物质与所述测试物质具有竞争关系，并且所述对照物质与所述测试物质同时灌注通过所述器官或组织。
5.如权利要求2所述的方法，其中关于所述参数，所述对照物质与所述测试物质不具有竞争关系，并且所述对照物质与所述测试物质同时灌注通过所述器官或组织。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一种对照物质是唯一的一种对照物质。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括使用额外包含至少两种对照物质的相同灌注液灌注所述器官或组织，其中所述对照物质具有关于所述参数的已知的定性或定量作用，和评估至少两种所述对照物质的该同一参数。
8.如权利要求7所述的方法，其中之前已确定第一种所述对照物质的所述参数的值显著不同于第二种所述对照物质的所述参数的值。
9.如权利要求8所述的方法，其中之前已确定第一种所述对照物质的所述参数的值为0或接近0，并且之前已确定第二种所述对照物质的所述参数的值与0具有实质性的不同。
10.如权利要求2所述的方法，还包括确定所述测试物质的所述参数的第一值与所述对照物质的所述参数的第二值之间的比值。
11.如权利要求10所述的方法，包括对多个相同类型的器官实施所述方法，确定所述比值的标准范围，和忽略比值落到所述比值标准范围之外的测试结果。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是所测试类型的器官对物质的被动吸收。
13.如权利要求12所述的方法，其中所测试类型的器官是肠，并且所述至少一种对照物质是选自由安替比林、特布他林、甘露醇和标记的葡聚糖组成的组的至少一个成员。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是所测试类型的器官对物质的主动吸收，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述至少一种对照物质灌注通过所述器官或组织。
15.如权利要求14所述的方法，其中所测试类型的器官是肠，并且所述至少一种对照物质是选自由头孢氨苄和精氨酸组成的组的至少一个成员。
16.如权利要求14所述的方法，其中所测试类型的器官是肺，并且所述至少一种对照物质是沙丁胺醇和异丙托品。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是所测试类型的器官对物质的I相代谢。
18.如权利要求17所述的方法，其中所测试类型的器官是肠或肾脏，并且所述至少一种对照物质是选自由非那西汀、甲苯磺丁脲、s-methenyltoin、右美沙芬、氯唑沙宗和美沙酮组成的组的至少一个成员。
19.如权利要求17所述的方法，其中所测试类型的器官是肝脏，并且所述至少一种对照物质是选自由非那西汀、甲苯磺丁脲、s-methenyltoin、右美沙芬、氯唑沙宗、美沙酮、卡马西平和7-硝基安定组成的组的至少一个成员。
20.如权利要求17所述的方法，其中所测试类型的器官是肺，并且所述至少一种对照物质是选自由非那西汀、甲苯磺丁脲、s-methenyltoin、右美沙芬、氯唑沙宗、美沙酮和卡马西平组成的组的至少一个成员。
21.如权利要求17所述的方法，包括根据疑似随所述测试物质而出现的酶代谢类型的功能选择所述对照物质。
22.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是所测试类型的器官对物质的II相代谢。
23.如权利要求22所述的方法，其中所测试类型的器官选自由肠、肝脏、肺和肾脏组成的组，并且所述至少一种对照物质是选自由哈尔酚和萘酚组成的组的至少一个成员。
24.如权利要求8所述的方法，其中所述参数是肝脏对物质的血浆清除，并且所述至少两种对照物质是心得安和阿替洛尔。
25.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肝脏对物质的胆汁排泄，所述至少一种对照物质是选自四溴磺酞、二溴磺酞、靛青绿和胆盐组成的组的至少一个成员，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述至少一种对照物质灌注通过所述器官或组织。
26.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肝脏对物质的受体介导的内吞，并且所述至少一种对照物质是选自由去唾液酸糖蛋白组成的组的至少一个成员。
27.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肺对物质的主动摄取，并且所述至少一种对照物质是选自腐胺、精胺和亚精胺组成的组的至少一个成员，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述至少一种对照物质灌注通过所述器官或组织。
28.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肾脏对物质的肾小球滤过，并且所述至少一种对照物质是选自由菊粉和肌酸酐组成的组的至少一个成员。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述对照物质是放射性标记的菊粉。
30.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肾脏对物质的主动分泌，所述至少一种对照物质是对氨基马尿酸，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述至少一种对照物质灌注通过所述器官或组织。
31.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肾脏对物质的主动重吸收，所述至少一种对照物质是四乙基乙酸铵、钠和葡萄糖，并且在所述测试物质已经灌注通过所述器官或组织之后使所述至少一种对照物质灌注通过所述器官或组织。
32.如权利要求2所述的方法，其中所述参数是肾脏对物质的III相代谢，并且所述至少一种对照物质是选自由硫醇和谷胱甘肽结合物组成的组的至少一个成员。
33.如权利要求8所述的方法，其中所述参数是心脏对物质的摄取，并且所述至少一种对照物质是多巴和多巴胺。
34.如权利要求2所述的方法，其中所述对照物质是内源物质。
35.如权利要求2所述的方法，其中所述对照物质是外源物质。
36.如权利要求2所述的方法，其中所述灌注步骤在常温条件下进行。
37.如权利要求1所述的方法，其中所述器官或组织在步骤(a)之前已进行低温贮存。
38.如权利要求1所述的方法，其中所述器官或组织在步骤(a)之前已患病或损伤。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述患病或损伤发生在获取所述器官或组织前。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述患病或损伤发生在获取所述器官或组织后。
41.如权利要求1所述的方法，其中所述器官或组织在步骤(a)之前已损伤，并且所述损伤是长期热缺血导致的。
42.如权利要求1所述的方法，其中所述器官或组织在步骤(a)之前已损伤，并且所述损伤是低温贮存导致的。
43.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种器官或组织是不适合移植的器官或组织。
44.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种器官或组织是器官的组合。
45.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种器官或组织是从死人获取的器官或组织。
46.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种器官或组织是工程化器官或组织。
47.如权利要求1所述的方法，其中在选自由灌注液样品、来自所述至少一种器官或组织的活检物和所述至少一种器官或组织的流出物组成的组的至少一个成员中评估所述参数。
48.产生收益的方法，包括：
向第三方收取用于收集与测试物质在施用于器官或组织时的作用、性质和/或结局相关的数据的费用；
实施权利要求1所述的方法；和
向所述第三方提供步骤(d)中的评估结果以及所述物质测试的结果。
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