CN101743472B - 检测器官系统干扰的离体方法 - Google Patents

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Abstract

通过测定在用包含测试物质的液体常温灌注下所述物质在具有代谢活性的离体人器官或组织中的性质、结局和作用，可以确定物质的性质，例如毒性。此数据可用作，例如提交给政府监管组织的呈递书的一部分。优选的方法使用灌注的内分泌腺器官或组织来评估由物质导致的激素或其他身体化学物质干扰，和使用在捐献前患病或受损的器官或组织。

Description

检测器官系统干扰的离体方法
背景技术
本发明涉及使用来自人的经灌注器官和/或组织，例如腺器官和/或组织，来评价由物质对激素或其他身体化学物质造成的干扰(disruption)。本发明的方法可以使用人器官和/或组织，特别是不适合用于移植的器官，在器官或组织的基础上评估此类物质。
可用于评估物质在人体内的性质、结局(fate)和作用的方法跨越了从体内研究到对分离器官或组织、组织切片、培养细胞类型、亚细胞颗粒、多酶复合体和分子相互作用研究的多个哺乳动物组织水平。在实际中，这些复杂的方法常导致在很多领域中相当多的时间、精力和资源的浪费，其中在这些领域中对物质可能进行多轮试验，但却仅在后面的试验中或凭市场体验发现其在人体内具有不良影响，从而常常造成惨痛的结局。
此前，旨在去除效益/风险比不能被接受的物质的尝试依赖于使用如啮齿动物的几种物种进行的非人动物的体内研究。在非人物种中进行毒性研究的局限性早已得到广泛公认，且目前仍旧如此，但由于体内对人进行毒性研究的缺乏，使其没有可行的替代方案。曾尝试使用包括亚细胞颗粒(例如微粒体)、初代细胞和培养细胞(如肝细胞)和组织切片在内的组织制备物来填补非人试验和人体作用之间的差距。尽管这些体外组织制备物产生了许多有用的数据，但组织制备物与完整生物体间的差距越大，产生假阳性和假阴性的风险就越大。例如，在评估测试物质单独施用或与其他物质共同施用时是否具有毒性的时候，可能出现假阳性或假阴性。此外，不能保证在体外正常人组织中测定的药代动力学/毒性关系与体内正常人组织或患病人组织中的关系相同。
由于使用人进行探索性毒性试验是不人道的，选择使用多种非人动物物种进行体内试验和/或使用人的生物样品进行体外试验。例如，在本申请的受让人已公开的PCT申请第WO 2005/074681号和美国专利申请第10/768,167号(其全文通过引用整体并入本文)中公开了使用离体人器官的药物试验，其中指出可将不适于移植的器官用于此类试验。
研究表明人的生殖健康可能与具有雌激素潜能、雄激素潜能或相关潜能的环境物质相关。现已从人流行病学研究得到大量观察结果，包括可能由环境物质造成的男性精子数量减少、受精能力下降、睾丸癌发病率增加和先天性新生儿缺陷，以及女性乳腺癌发病率增加。现已报道在多种野生物种中出现大体先天畸形(gross birth deformities)、行为异常以及雌性化/雄性化。显然，存在此类物质可能对人生殖健康和人健康其他方面产生不利影响的多种担忧。参见，例如Draft Detailed Review Paper：Appraisal of Test Methodsfor Sex-Hormone Disrupting Chemicals，来自theSeries on Testing and Assessment，OECD Environmental Health and Safety Publications，EnvironmentDirectorate，Organisation for Economic Co-operation and Development，Paris，France(1997)。
发明内容
如上所述，目前的试验方法虽然有利，但尚不能完全胜任于鉴定在人体内具有毒性或其他不利影响的化合物。本发明提供了用于评价物质对人的作用的改进方法，以弥补由非人动物体内试验获得的作用与人体内实际作用之间的差距。本发明还提供了低成本的标准筛选试验，以评估物质对人体激素的干扰和对其他身体化学物质的干扰潜能，例如激素或其他身体化学物质水平的提高、降低或者其它改变，或者影响激素的产生或摄取。本发明还提供了对包括药物和候选药物在内的物质进行比此类测试的已知“模式”更为直接的测试。例如，与使用可以经修饰或处理的健康器官来提供患病或损伤“模型”不同，本发明提供了使用捐献前患有疾病(pre-donation disease)或损伤的真实器官和组织来检测物质的作用(包括与此类器官或组织相关的物质的功效和/或安全性)的方法。
本文公开的方法降低了与特定物质相关的意外的人发病率和死亡率的机率。与来自缺少供血和整体细胞类型的完整补充的体外系统或来自非人动物体内模型的数据相比，显示物质在经灌注的人器官和/或组织中的结局和作用的所得数据更加可靠且临床相关度更高。本发明的实施方式包括使用包含至少一种待评估物质的灌注液离体灌注人器官和/或组织，更优选人器官，最优选不适于移植的人器官，包括患病或损伤的器官或者由于特别是长期热缺血、疾病、损伤和/或长期贮存等而使具有低于成功移植可接受的可能性的器官(可在捐献和/或贮存前后进行测定)，本发明的实施方式还包括用于鉴定所述物质生理作用的方法。优选所述器官或组织是人器官或组织，包括腺器官或组织，例如肝脏、肺、肾脏、肠、心脏、胰脏、脾脏、睾丸、胎盘、胸腺、动脉、静脉、淋巴结、骨或骨骼肌、男性或女性生殖器官，或内分泌腺/外分泌腺，包括例如肾上腺。
所述器官或组织可以是已经从其来源永久取出的具有代谢活性的人器官或组织，或者是源自分离和/或培养的人细胞的工程化器官或组织，其中所述分离和/或培养的人细胞可包括干细胞(除非另有说明，本文将其统称为“人器官或组织”)。
本发明的实施方式提供了在来自人的经离体灌注器官和/或组织中测定物质(如化合物)的结局和作用的方法，例如测定所述物质的吸收、转运、代谢、消除、功效和/或毒性，且更具体地测定物质吸收的速率和程度、提取、代谢物的鉴定、器官对血浆中所述物质和/或代谢物浓度的控制、组织结合和积累，以及组织的清除和消除。
在本发明的实施方式中，可使用经灌注的人器官或组织，特别是腺器官或组织将方法用于检测物质，以评估该物质对激素或其他身体化学物质造成的干扰。所述物质包括，但不限于候选药物、药品(pharmaceuticals)，以及与药物或药品无关的物质。
在本发明的实施方式中提供了用于确定测试物质在至少一种人器官或组织中的结局和作用的方法，该方法包括：
a)使用医用液体灌注至少一种人器官或组织，以在至少一种测试物质存在和不存在下保存所述器官或组织；和
b)分析所述器官、组织、灌注液和/或下游器官和/或组织，从而检测该测试物质在所述器官或组织中的结局和作用。
在本发明的实施方式中，所述分析包括在所述测试物质存在和不存在下对所述器官或组织进行比较。
在本发明的实施方式中，可以通过分析活检(biopsy)样品并检测其中的变化或损伤从而在形态学或组织化学(优选在免疫组织化学)上检测该测试物质的结局和作用。
在本发明的实施方式中，可以通过检测作为所述测试物质作用(尤其是毒性)指标的毒性代谢物或终产物或释放到灌注液中的细胞内分子(例如酶，如乳酸脱氢酶)，从而在生物化学上检测所述测试物质的结局和作用。
在本发明的实施方式中，可根据包含在所述灌注器官或组织中的细胞内的基因表达变化检测所述测试物质的结局和作用，例如通过使用与所述器官或组织表达的至少一种mRNA编码基因特异杂交的探针进行原位杂交。可以进行细胞死亡分析，特别是进行代表将来毒性作用的凋亡和坏死分析。
在本发明的实施方式中，可以通过分析来自灌注器官或组织的流出物检测所测试物质的结局和作用。优选所述灌注流出物是依赖于所述器官或组织的功能性流出物，例如来自肾脏的尿液、来自肝脏的胆汁或来自肺的粘液，或者是包含胰腺的外分泌消化酶的流出物。可分析分泌产物(例如释放到灌注流出物中的激素)和/或其作用或下游目标组织或细胞。在本发明的实施方式中，所述流出物可在其离开所述器官或组织通过静脉回收后对其进行分析，所述流出物为，例如来自胰腺的胰岛素和胰高血糖素、来自肝脏的白蛋白和葡萄糖、来自肺的氧和二氧化碳或来自肾脏的肌酸酐。可以通过运动反应(motor response)例如心跳和蠕动来检测测试物质在心脏和肠中的作用，特别是毒性作用。此外，可以通过血管阻力变化检测在任何器官或组织中的吸收、转运、代谢、消除、功效和/或毒性，特别是通过呼吸系统顺应性的变化检测在肺中的毒性。
或者，所述分析也可以(或可选地)包括电生理学检测、医学诊断成像、光谱检测、微透析、固态组织探针检测(solid state tissue probe testing)或其组合。
优选在生理的温度、压力、氧合作用、渗透压、电解质平衡和pH下灌注所述器官或组织。在本发明的实施方式中，灌注液包含于生理可接受的医用液体中的匹配人红细胞。有利地，所述医用液体进一步包含约2％-约6％的人血清白蛋白、N-乙酰半胱氨酸、腺苷单磷酸(AMP)和/或超氧化物岐化酶。在如心脏和肝脏的某些器官中，还可在灌注时提供神经刺激。在本发明的实施方式中，当所述器官为肝脏时，所述医用液体可包含胰泌素或胆汁酸。在本发明的实施方式中，当所述器官为肾脏时，所述医用液体可包含必需氨基酸和非必需氨基酸的混合物。在本发明的实施方式中，当所述器官为肠时，所述医用液体可包含地塞米松或去甲肾上腺素。
在本发明的实施方式中，首先使用不包含测试物质的第一医用液体灌注所述器官或组织，随后使用包含测试物质的第二医用液体进行灌注。所述医用液体可相同(除了是否存在测试物质之外)或不同，或者经过改进以适合鉴定测试物质的结局和作用。
本发明提供的方法有利地避免了在使用非人动物模型模拟人体内活性和行为时出现的测试物质的固有物种差别。此外，可在生理条件下且以与器官或组织中所有细胞类型相关的浓度使经灌注的所述人器官或组织接触所述物质，或者甚至在整个或部分器官体系中使经灌注的所述人器官或组织接触所述物质，从而提供更为可信、准确和一致的结果。在离体测试中，血液和组织的所有细胞类型均处于其正常的比例和定位中。因此，测试物质可按照其在体内那样被递送，其中所有细胞类型均保持其在完整器官或组织中的表型。
这样，因为信息得自于使用来自人的灌注器官或组织的离体试验而非得自于体外试验或非人动物的体内研究，本发明的方法提供了获取信息与物质/作用相互关系的改进方法。此外，如在同时提交共同在审的美国专利申请第11/802,064号(卷号130016，其全文通过引用并入本文)中所述，可以通过评估所述器官或组织对物质测试的适宜性进一步验证所得信息。
本发明的实施方式包括用于评价物质的方法，所述方法包括使待评价的物质通过具有代谢活性的离体人器官或组织，收集来自所述器官或组织、灌注液和/或流出物、和/或下游器官和/或组织的数据，和使用所收集的数据评估所述物质在所述器官或组织中的结局和作用。
在本发明的实施方式中，所述评价方法包括使第二物质在所述第一物质之前、同时或之后通过所述器官或组织，和收集有关所述第一物质和第二物质相互作用的数据。
在本发明的实施方式中，所述评价方法包括先使用不含所述物质的第一液体，随后使用包含所述物质的第二液体灌注所述器官或组织。优选所述第二液体在其他方面与第一液体相同。
本发明的实施方式包括收集作为政府监管批准程序一部分的数据的方法，所述方法包括：提供具有代谢活性的分离的离体人器官或组织，使包含待评估的测试物质的灌注液灌注通过所述器官或组织，收集来自所述灌注液、流出物和/或器官或组织的数据，和使用所收集的数据作为呈递书的一部分提交给政府监管组织。
本发明的实施方式包括产生收益的方法，所述方法包括向第三方收取进行用于评估物质的结局和作用的试验的费用，和在按本文所述收集到数据后，将所述数据提供给第三方。
在所述产生收益的方法中，可以提供原始形式的数据，或者对数据进行分析然后提供给第三方。所述数据可被用作政府和/或监管呈递书的一部分。所述数据可由进行该测试并任选地进行分析的一方占有，或者由要求进行该评估的一方占有。所述费用可一次付清或者以其他方式交付。
在本发明的实施方式中，收集数据的方法可包括使用所述数据作为程序的一部分以解析物种之间相矛盾的数据，评估物质的毒性，确定代谢物的存在，评价物质的生物利用度、吸收、治疗作用和/或药物或其他化学物质相互作用，和/或评价物质对人激素的干扰和/或对其他身体化学物质的干扰潜能，例如使激素和/或其他身体化学物质的水平发生提高、降低或者其它改变。
本发明的实施方案提供了信息产品。此类信息产品可包含与至少部分通过使物质灌注通过具有代谢活性的离体人器官或组织而产生的数据相关的数据。在本发明的实施方案中，以计算机可读形式提供所述信息产品。
本发明的其他特征和优点描述并体现于下文对实施方式的详细描述中。
具体实施方式
本发明的实施方式包括使用器官和/或组织确定物质在所述器官和/或组织的结局和作用的方法，其中优选使用来自人的器官和/或组织，更优选人器官。优选所述器官或组织是人的器官或组织，例如肝脏、肺、肾脏、肠、心脏、胰脏、脾脏、睾丸、胎盘、胸腺、动脉、静脉、淋巴结、骨或骨骼肌、或腺器官或组织，例如内分泌腺/外分泌腺，包括例如肾上腺、胸腺以及男性和女性生殖器官。
应理解，本文所用术语“吸收”、“转运”、“代谢”和“消除”应用于所使用的任何器官或组织，但与基于灌注的测试中所使用的某些组织和器官特别相关。例如，吸收与肠和肺特别相关，而转运(例如血浆清除)和代谢尽管也与肠和肺相关，但与肝脏、肾脏和心脏特别相关。消除与肠、肝脏、肾脏和肺特别相关。
本文所用术语“毒性”涵盖对器官或组织的物理、化学、生化和生物损害，包括细胞水平的损害。毒性涉及物质对组织和器官的毒性作用或其他作用，包括但不限于细胞死亡、凋亡、基因突变、基因表达变化、生化抑制、代谢下降、诱导和氧化损伤，以及因药物相互作用而导致的毒性作用。所述术语“毒性”包括但不限于对激素的干扰或对其他身体化学物质的干扰。术语“干扰”包括但不限于使血液或其他体液中的激素或其他身体化学物质或分泌出的激素或其他身体化学物质的水平提高、降低或其它改变，和/或改变靶组织或细胞对激素或其他身体化学物质的响应能力。例如，改变受体介导的相互作用或其他潜在相互作用也包含在该术语描述的范围之内。
术语“功效”涵盖测量测试物质对器官或组织的积极、内环境稳定或健康促进的作用。此类测量包括，但不限于检测疾病特异性生物标记物的减少或消除，优选使用患病的器官或受病原体感染的器官。
在某些实施方案中，本发明的方法包括检测组织或器官特异性生物标记物以获得由测试物质诱导的急性或慢性毒性。所述生物标记物可以是，例如病原体或细胞来源的与病原相关的标记物或代谢分解产物。在捐献前受损或患病的器官或组织对本发明的方法特别有用。例如，来自患有期望使用候选药物治疗的疾病的供体的器官对药物研发特别有用。该类型的器官和组织包括受细菌和/或病毒感染、发炎和/或患有癌症的器官和组织，患有糖尿病的器官或组织，以及在捐献前具有撞击伤(pre-donation impact trauma)的器官。对于肺或肺组织，此类捐献前疾病可包括哮喘、慢性阻塞性肺病和囊性纤维化；对于心脏或心脏组织，其可包括心律失常；对于肝脏和肝脏组织，其可包括胆汁郁积、黄疸、门静脉高血压、坏死和肝硬化；对于肾脏或肾脏组织，其可包括急性肾衰竭；对于胰腺或胰腺组织，其包括胰腺炎。
本文所提供的用于确定物质在器官或组织中的结局和作用的方法包括：通过使用包含所述物质的医用液体灌注所述器官或组织，从而使所述器官或组织接触所述物质。除非另有指明，术语“物质”、“测试物质”、“测试化合物”和“化合物”可相互替代使用，并且包括但不限于药物或药品相关的物质，例如候选药物和药品，以及与药物或药品无关的物质，例如环境物质，如烟尘和其他工业排出物；农业产品和副产品；建筑材料；工业制品和副产品；食品，例如加工食品和副产品、食物和食品添加剂；烟草制品，例如香烟、雪茄或卷烟，或嚼烟提取物及其组分；清洁产品，例如洗涤剂、漂白剂、肥皂、洗发剂和调理剂(conditioner)；化妆品，例如用于皮肤、头发和指甲的化妆品；等等。
通常对用于临床移植的器官进行灌注保存，其中在低温停循环(hypothermic arrest)(约4℃-约8℃)下进行灌注是优选的保存方法。与此相反，尽管得到充分研究，但是在临床上还没有在包括正常体温(常温(normothermia))在内的生理条件下保存用于移植的器官，这是因为在实际应用中难以将器官维持在正常体温。对移植器官的高要求，具体而言为要求移植器官的功能最大化且炎症最小化，使常温的应用受到某种程度的限制。因为本发明的离体方法降低或消除了对移植的要求，克服了常温的很多限制。例如，可以通过血型匹配的血细胞向常温的离体器官供氧而无需考虑免疫原性问题，并且在常温灌注期间常温的离体器官出现功能性下降也是可以接受的，所述功能性下降例如由于在正常情况下由其他器官清除的毒素的累积，以及由于在正常情况下由其他器官产生的底物和因子的耗尽所导致。本文所用“常温条件”是指37±3℃范围内的温度。
本发明的实施方式包括使用本发明特征以提供获取物质信息(例如物质/作用的相互作用)的改进方式的商业方法和模型。因此，本发明的实施方式可以包括使第三方获得服务，包括检测物质在人器官或组织中的结局和作用。具体实施方式包括使第三方以信息产品的形式获得由所述测试产生的所得数据和/或信息。第三方可通过缴费获得所述服务和产品。应理解，所述费用可包括定额或一次付清基于变量的总额，或者任何其他适合形式的报酬、补偿或偿付形式。
因此，按照本文公开的方法进行测试并由该公开方法产生数据和信息的实体(在本文中称为提供商)可以通过交易并向第三方销售本文所述的服务和产品而产生收益。
其他实施方式包括在低温条件下保存来自目标物种(例如人)的一个或多个器官或组织的保存阶段，从而使所述器官或组织保持在回复生理温度后复苏并维持基本正常的代谢活性和功能的能力。本文所用术语“代谢活性”是指存活生物体特征性的生化活性水平。
在功能阶段，可使用常温的血液或基于血液的灌注液来灌注器官或组织以稳定所述器官或组织的生理特性。优选使所述器官或组织的生理特性和生化特性与体内器官或组织的生理特性和生化特性保持基本一致，这样由所述测试产生的数据基本上是明确、可重复和相关的。例如，在完整器官中，细胞保持其表型、血液和组织中的细胞类型处于其正常比例和定位，物质具有其在体内应具有的作用。
可以通过包括阳性和阴性对照来量化受试器官或组织的功能状态。可在所述物质之前或与所述物质同时添加对照，或者在收集到分析所述物质结局和作用所需的几乎所有必须样品后添加对照。可在使用包含所述物质的第二液体灌注所述器官或组织之前和/或之后使不包含所述物质的液体或灌注液通过所述器官。这样，所述器官可充当其本身的对照。所使用的阳性和/或阴性对照取决于具体试验的主要目的。
可以在“正常”、“患病”或受损的器官和组织中实施本发明方法的实施方式，其中尽量使每种器官或组织的生理特性和生化特性与特定疾病或病症的体内特征和性质保持相近。本发明方法的实施方式可包括使用多种医用装置、溶液和方案，包括溯源、获取、保存和评估所研究的器官和/或组织。
一方面，本文公开的方法可产生有关物质及其在人器官和/或组织中的结局和作用的数据和信息。关于此物质的数据或信息可包括此物质本身、其衍生物、代谢物和/或相关物质的特征。
关于此物质的所得数据或信息可包括该物质对离体器官或组织的作用、离体器官或组织对该物质的作用，以及该物质对与该离体器官或组织接触或相关的其他物质或其产物的作用。有关所述物质及其结局和作用的信息可包括但不限于所述物质的吸收、转运、代谢、消除、功效和/或毒性，更具体而言，其包括：物质吸收的速率和程度、提取、代谢物的鉴定、器官对血浆中所述物质和/或代谢物浓度的控制、组织结合和积累，以及组织的清除和消除。所述信息可进一步包含对物质干扰人激素和/或干扰其他身体化学物质的潜能的评价，例如使激素或其他身体化学物质水平发生提高、降低或其它改变。
另一方面，本文公开的方法可产生有关接触所述物质的离体器官或组织的数据和信息。应用本文公开的方法时，其检测结果可提供有关物质类型、细胞受体、生化途径、生理和病理机制、生物标记物和与存活生物体相关的其他现象的数据和信息。通过积累实施本文公开方法产生的数据和信息，可创建出具有统计学显著性和科学有效性的信息库。各种形式的数据和信息均可构成可传输的信息产品。
在本发明的实施方式中，向第三方提供的信息产品可包括由实施本文公开方法产生的原始数据。此外，向第三方提供的信息产品也可以(可选择地)包含对原始数据进行的可用和/或可信形式的多个水平的解释或评估。提供商可保留原始数据的所有权，而作为信息产品，第三方仅能获得来自所述原始数据的信息。因此，除了按照本文公开的方法进行测试并产生原始数据的服务之外，提供商还可以为第三方进行数据解释。
信息产品可以是第三方通过付费获得访问该信息远的形式。此类信息可以用于，例如比较在各种组织和器官中的作用，从而形成预测这些作用的模式和模型。信息产品可用于比较有关所述物质及其在不同组织和器官中、在不同物种中以及在不同的组织和器官条件下(例如正常、异常、患病或损伤或其它损害的组织和器官)的结局和作用的信息。
实施例
优选调整灌注液的性质适应具体的待测组织、器官或其组合，或适应测试化合物的化学或其他特征。对低温条件下的灌注，灌注液优选包含：氯化钙、氢氧化钠、HEPES或其他有机酸、磷酸酯(无机酯或有机酯)、甘露醇、葡萄糖、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁、核糖、淀粉、谷胱甘肽、腺嘌呤和水。
在低温条件下使用的优选灌注液，例如(Organ RecoverySystems，Inc.，Des Plaines，EL)的pH约为7.4，重量克分子渗透浓度约为330mOsm，并且包含以下组分：
  组分   量(g/1000mL)   浓度(nM)
  氯化钙(脱水)(离子化)   0.068   0.5
  氢氧化钠   0.70   18
  HEPES(游离有机酸)   2.38   10
  磷酸钾(一元碱)   3.4   25
  甘露醇(USP)   5.4   30
  葡萄糖，β-D(+)   1.80   10
  葡萄糖酸钠   17.45   80
  葡萄糖酸镁D(-)葡萄糖酸，半镁盐   1.13   5
  核糖，D(-)   0.75   5
  羟乙基淀粉(HES)   50.0   n/a
  谷胱甘肽(还原型)   0.92   3
  腺嘌呤(游离碱)   0.68   5
  无菌水   定容至1000mL   n/a
对常温条件下的灌注，灌注液优选包含：水、钠、钾、钙、镁、氯、缓冲成分(例如包含碳酸氢根离子和TES、MOPS或BES)、葡萄糖、甘油、胆碱、氨基酸成分(例如，谷氨酸(glutamate)、天冬氨酸(aspartate)和/或谷氨酰胺)，辅酶(例如硫胺脱羧辅酶)、维生素样组分(例如肉碱)和蛋白质(例如胰岛素)。或者，也可以使用人血浆。
在常温条件下使用的优选灌注液，例如RS1(英国伦敦)或OPB-I或OPB-2(Organ Recovery Systems，Inc.，Des Plaines，IL)，pH范围为约7.13至约7.41，重量克分子渗透浓度为约286mOsm，并且包含以下组分：
  OPB-1组分   OPB-1浓度(mM)
  有机酸   5
  氯   116.4
  钠   135
  钙(离子化)   1.2
  钾   5
  碳酸氢根离子   25
  葡萄糖   10
  TPP(脱羧辅酶)   0.04
  镁(离子化)   0.45
  谷氨酰胺   0.4
  谷氨酸(glutamate)   0.3
  甘油   0.11
  肉碱   0.05
  无菌水   n/a
  天冬氨酸(aspartate)   0.02
  胆碱   0.01
  蛋白质(胰岛素)   0.002(25.00mIU)
  牛血清白蛋白   6％
  缓冲液(BES)   n/a
此外，如下表中的示例性描述所述，可改良灌注液以用于某些器官。 灌注研究报告
如果将灌注研究结果报告提供给第三方或仅将其保留，那么所述报告可以为草稿或终稿形式，并且包含但不限于以下研究信息和数据：试验过程的描述，包括例如灌注方法和制备物(制备)的细节；在灌注研究开始和结束时器官或组织的重量；质量平衡数据，例如灌注液、血浆、流出物、器官或组织中，和/或适合使用的体液(例如胆汁)中的放射性同位素；血浆和/或器官或组织对标准品(也称作“对照”)的清除，对照方法学和物质；结合或未结合的标准品或任何适合的结合物的消除；标准品的代谢物的形成速率以及标准品的代谢谱的其他方面；对标准品的描述，包括例如代谢谱；如果适用，在各个收集时间点的生理流速，例如胆汁、动脉等；器官供体的详细情况和就医记录(按照许可)；测试物质的数据表或其他可得信息；测试物质的收到和使用记录；给药记录；样品收集记录；样品重量记录；样品贮存和运输记录；研究部位的定位；在研究期间进行的或与研究相关的任何其他测量和/或分析；和/或由合同实验方(contract facility)提供的任何报告和/或数据。对激素或其他身体化学物质的干扰
在评估物质对激素或其他身体化学物质的毒性或其它作用时，有用的信息包括但不限于确定物质如何影响外分泌腺/内分泌腺或其他腺产生和/或响应血液和其他体液中效应物激素(effector hormone)的能力，以及例如在何种浓度下使激素或其他化学物质的水平保持不变、下降、增加或其它改变，或者在何种浓度下使外分泌腺/内分泌腺或其他腺的分泌能力不变或发生变化。此外或可选择地，测定物质如何影响靶细胞或组织对内分泌腺/外分泌腺或其他腺产生的激素或其他身体化学物质的响应能力，例如受体介导的反应或其他潜在反应，也可能是有用的。
用于测试激素和其他身体化学物质干扰的优选测试系统是这样的测试系统，其中血液供给外分泌腺/内分泌腺或其他腺并由外分泌腺/内分泌腺或其他腺所提供且靶组织是完整的。优选在受控条件下将测试物质递送到外分泌腺/内分泌腺或其他腺，从而可以评估外分泌腺/内分泌腺或其他腺在响应激素或其他身体化学物质时通常释放到血液或其他体液中的分泌产物。优选的器官模型包括但不限于胰腺、胸腺、男性和女性生殖器官、甲状腺和肾上腺。
疑似影响内分泌功能(包括但不限于生殖、肾上腺和甲状腺功能)的一个或多个方面的物质的作用机理可涉及多个作用部位以及对内平衡过程的复杂干扰，例如干扰内分泌或其他系统、分泌、结合、反馈调控和/或靶标活性。间接作用包括但不限于由诱导或抑制代谢酶并引起内源激素或其他身体化学物质的产生或分解发生变化，或引起血液或其他体液中载体蛋白质水平变化的物质所导致的作用。
例如，性激素干扰物及其代谢物如果与内源配体结构类似，则可能与性腺细胞或附性器官细胞中的生理配体的受体发生直接相互作用，由此模仿激素的作用而导致受体激动或其他激动作用，或者致使天然存在的激素的结合和生物活性被阻断或降低，或其他拮抗作用。
下文是用以说明本发明方法的试验和器官或组织。本文公开了本发明的一般性质，下文的非限定性方法仅提供了充分公开的具体实施方式。灌注肠的方法实施例
在临床试验前产生关于物质在人肠中被吸收的明确数据的能力对于决定使用可能被吸收的物质非常重要。可使用分离的肠段产生这些数据，这是因为：(a)所述物质如同在体内一样通过肠腔呈递；(b)存在完整的肠腔和血液之间的屏障；和(c)灌注液的组成和流动特征模仿其在体内的情况。
灌注条件
每次分析使用约3L灌注液。所述灌注液优选包含悬浮在包含4-6％人血清白蛋白且pH优选为约7.4的缓冲液中的匹配人红细胞(优选预先清洗过)(约15％-约20％，v/v)。
优选使所述灌注液通过输血过滤器，随后通过白细胞清除过滤器，添加肝素并调节pH，如果必要优选将pH调至约7.4。在添加到灌注装置前，优选室温贮存所述灌注液。可将剩余的灌注液一份试样(aliquot)离心(在约4℃下以约1,500g离心约10分钟)以分离血浆。随后，可将血浆在约-20℃或更低的温度冷冻以在分析中作为空白对照使用。
肠样品和灌注
优选取出低温贮存的分离人肠段(约30cm-约45cm)，例如紧邻胆管入口下方的肠段，以用于各个分析。
将完整的肠样品称重并在约4-8℃，pH约7.4和压力约60-80mmHg下，用冷缓冲液通过肠系膜动脉(或其分支)冲洗约10-约15分钟。此动脉缓冲液冲洗通常涉及约0.5L的缓冲液。
在动脉缓冲液冲洗之后是平衡阶段，其中使约0.5L的氧饱和室温灌注液以约20mL/分钟的速率通过肠。可将约0.5L的灌注流出物废弃，随后将灌注切换到使用0.75L氧饱和灌注液的重循环模式。优选随时间将灌注速率提高到约90mL/分钟-约100mL/分钟的目标，但不超过最大压力限。使灌注液重循环直至肠核心温度为约35℃并可观察到肠蠕动。首次通过和首次重循环通常总计持续长达约60分钟。
在平衡阶段的结束时，将灌注液从所述装置排出，并在重循环模式下替换成约1L的约37℃新鲜氧饱和灌注液。此阶段为稳定阶段，其持续约10-约15分钟。随后，在满足灌注和生理参数(例如耗氧量、核心温度高于约35℃，流速约90mL/分钟，压力为约60-约80mmHg)的条件下，取出灌注液试样。
施用和样品收集
在施用测试物质前对人肠进行常温灌注的优选接受标准为：
在同一制剂(最大体积约15ml)中向分离肠的肠腔中施用(优选以脉冲剂量)优选标记(例如放射标记)的测试物质(约10mg，约100μCi)和优选3-5个标记的内标，所述测试物质和内标以不同的速率通过被动扩散而被吸收。将此时记为“计时起点”。
随后，以重模式灌注肠，优选灌注约2小时，并且优选在至少两个下列优选时间点取出灌注液试样(约3-约5mL)：给药前以及给药后5、10、15、30、45、60、90、105和120分钟。将每份样品约一半在约-70℃冷冻，并将每份样品的剩余部分离心，除去血浆并在约-70℃冷冻。或者，在5毫升的样品中，例如，将约1毫升作为完整灌注液保留，将剩余的约4毫升离心，并将上层血浆分成大致相等的4份试样以进行单独分析。
在灌注结束时，将肠段称重，收集肠腔内容物并称重，使用约100毫升水冲洗肠腔并加入到肠内容物中，记录总质量。将此混合物在最少量的水中均浆并且，如果需要以大致相等的4份试样(例如约40毫升的试样)冷冻。此外，优选使用盐水、水和/或醇清洗灌注装置。可将各洗液样品保存以用于后续分析(例如，质量平衡)。
灌注方法的实施方式允许向同一肠的连续肠段进行多个(单次或组合)施用。在此类实施方式中，整个肠段的灌注如上所述，但在平衡后，将肠(肠系膜和肠腔)分成3段，优选其长度大致相等，这样尽管灌注液仍循环通过每段且随后混合，但所述3段肠腔彼此完全分离。随后，向一段施用测试物质和标准品，并在施用后以达约1小时至约2小时的时间间隔取出灌注液试样。随后，通过例如烧灼术(cauterization)将此段从接近肠系膜处去除，保持肠系膜完整且密封。随后，使1L新鲜灌注液冲洗通过剩余两段，并收集首次通过的洗脱液。随后，加入新鲜灌注液(约1L-约1.5L)，并以比用于3段的流速小1/3的流速重循环。随后，向第二段施用，并重复整个过程直至所有3段均被施用，针对每个计时起点以在给药后达约1小时-约2小时的时间间隔收集灌注液试样。
活检
优选在施用前和灌注结束时进行活检，并在匀浆之前的收集点将其快速冷冻在液氮中。可对活组织进行组织病理学检测，并对标记酶和其他蛋白质进行表型检测。
对照
优选的对照包括但不限于灌注液试样和施用前收集的血浆，并且如果可能，可以是从单个器官收集的肠匀浆物。对照优选在约-80℃贮存。
分析
通过分析测试物质从肠腔到重循环灌注液中随时间的吸收速率，并将该速率与内标的吸收速率进行比较来测定所述测试物质的吸收。原始数据通常以皮摩尔/ml、总皮摩尔和/或百分剂量表示，并且包括所有吸收的化合物的百分数比例，以及标记的测试物质在灌注液、血浆、肠内容物和肠壁中的质量平衡。如果使用放射标记的化合物和标准品，则可以测量总放射性，并且如果需要，可以对标记的测试物进行HPLC图谱分析。
在灌注期间监测生理参数，例如动脉压和动脉流速、器官核心温度、血液pH、积极蠕动以及动脉和静脉的PO2和PCO2；血液生化参数，例如电解质平衡，包括但不限于钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(碱性磷酸酶)(U/l)、ALT(丙氨酸转氨酶)(U/l)、淀粉酶(U/l)、AST(天冬氨酸转氨酶)(U/l)、GGT(γ-谷氨酰转移酶)(U/l)、CaI(mg/dl)和BUN(血尿素氮)(mg/dl)的浓度；生物标记物，例如葡萄糖(mg/dl)的利用和乳酸(lactate)(mM)的生成；内标的吸收，例如3H-甘露醇(目标浓度约100μCi；目标剂量约20μM)；安替比林(目标剂量约20μM)；特布他林(目标剂量约20μM)；葡聚糖(约10-约70kD)和/或其他标记或未标记的标准品；以及测试化合物和/或代谢物的存在和特征。灌注肝脏的方法
目前使用来自体外制备物(即组织切片、分离的肝细胞、S9部分或微粒体)的数据尝试对人肝脏代谢进行预测。尽管这些研究很重要，但是它们有时：(a)不能模拟完整肝脏中的代谢；(b)鉴定的是可能的代谢而非实际的代谢；和(c)没有测量代谢物在血液和胆汁之间的后续分配，并由此没有测量肝外器官和组织与肝脏代谢的副产物的接触。
在分离的血管灌注人肝脏研究中，可以避免这些缺陷。作为代替，可以通过基于匹配血液的灌注液以生理流速向具有正常胆汁分泌机制的稳定存活肝器官或组织递送测试物质和标准品。因此，此模型非常适合用于测定人肝脏中物质摄取的性质和程度、代谢和清除率，以及胆汁排除、质量平衡以及代谢物在血液和胆汁之间后续分配的测量。此外，可在单独的实验中表征具体的代谢物。
示例性灌注条件
每次分析使用约5-6L灌注液。新鲜灌注液包含人红细胞(预先清洗并离心)，其悬浮在包含6％人血清白蛋白的缓冲液中(在约室温，v/v为约15％-约20％，pH约7.4)。如果已知此测试物质与α-1糖蛋白结合，则使用4％人血清白蛋白+2％的α-1糖蛋白代替6％人血清白蛋白。随后，使灌注液通过Pall 40微米的输血过滤器，随后通过白细胞清除过滤器，添加约15N.I.H.单位/mL的肝素并调节pH，如果必要，将pH调至约7.4。在添加到灌注装置前，优选室温贮存所述灌注液。可将例如约50mL的剩余灌注液试样离心(在约4℃下以约1,500g离心约10分钟)以分离血浆和血细胞。可将血浆在约-20℃或更低的温度冷冻以在分析中作为空白对照使用。
在灌注过程中记录门静脉和肝动脉中的流速、压力和温度。以约15分钟的间隔测量通过肝动脉和门静脉的入口以及通过腔静脉的出口的PO2/PCO2。各肝脏的平衡阶段可以为约45分钟-约60分钟，并将胆汁收集到预先称重的容器中。只向在灌注液流速和压力以及胆汁流速方面符合要求的制备物施用测试物质。
开始向灌注液中补充添加胆汁盐，随后在整个灌注阶段进行添加。胆汁盐包括但不限于溶于25％羟丙基-β-环糊精(HPβCD)的约1g甘氨胆酸钠水合物(Sigma G7132)、约0.5g甘氨脱氧胆酸钠(Sigma G9910)和甘氨鹅脱氧胆酸钠(Sigma G0795)，其中HPβCD溶液中的总胆汁盐质量为20g。优选开始时在每升灌注液中添加约1g胆汁盐HPβCD溶液，随后在第1、2、3、4和5小时向此灌注液中添加约1g溶液。由此，灌注液将由悬浮在补充有胆汁盐的人血浆中的经清洗的匹配人红细胞组成。
灌注的肝脏样品
取出低温贮存的分离人肝脏，并且如果可能，进行肝动脉、门静脉和腔静脉插管。随后，在约室温下使用约1L-约2L冷缓冲液在重力下作用(例如，Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液，pH约7.4)冲洗肝脏约10-约15分钟，以除去转运/贮存介质。
如上所述，将约1.5L包含悬浮于含有4％或6％人血清白蛋白的缓冲液中的人红细胞(经预先清洗)(在约室温下，v/v约15％-约20％，pH约7.4)的新鲜灌注液随后以约20mL/分钟泵入到肝动脉和门静脉中，并在平衡阶段重循环约45-约60分钟。
在将约1L灌注液废弃后，在灌注装置中重循环约2L的新鲜灌注液。在约10-约15分钟的稳定阶段，将灌注液的温度提高到约37℃，并将灌注流速提高到目标流速，例如以约200ml/分钟-约300ml/分钟通过肝动脉，约400-约800ml/分钟(优选约600ml/分钟)通过门静脉。
给药和样品收集
优选在如上所述的灌注试验之前确定测试物质的溶解性和稳定性。一旦灌注制备物的灌注流速和压力稳定，则向重循环灌注液中添加测试物质。施用测试物质前对人肝脏进行常温灌注的优选接受标准为：
施用载体优选为含水的，或者在化合物水溶性差的情况下，所述施用载体为在灌注液中终浓度为约0.1％v/v的DMSO。优选的施用方案包括：在一段时间(Tmax中值＝约1小时)内向灌注液中添加包含约50mg优选标记(如放射标记)的测试化合物，或未标记和标记(如放射标记)的测试化合物的混合物的DMSO作为输注物(infusion)。如果使用放射标记物，目标放射剂量优选为约100μCi/肝脏。
优选将每份施用溶液放入预先称重的连有套管的注射器中，并将此注射器重新称重。以脉冲剂量将此注射器的内容物排至灌注液中。在指定的“计时起点”添加测试物质，并将肝脏灌注约240分钟。在约240分钟结束时添加标准品，例如tetra-BSP(约20μM)，并再将肝脏灌注约120分钟。在给药后，将肝脏灌注共计约6小时。例如，在灌注期间的至少两个下列时间点收集灌注液样品(每份样品约10mL)：给药前以及给药后5、10、15、30、45、75、105、135、165、195、225和239分钟。
此外，在灌注过程中连续收集胆汁，例如在至少两个下列时间点进行收集：给药前以及给药后30、60、90、120、150、180、210和240分钟。
在“计时起点”后约4小时向肝脏施用至少一种阳性对照，并且在至少两个下列时间点收集灌注液样品：计时起点后245、150、255、270、285、300、330和360分钟。
对于每份约10毫升的样品，将约1毫升作为完整灌注液保留，将剩余的约9毫升离心，并将上层血浆分成大致相等的4份试样以进行单独分析。可将上清液和胆汁样品在约-80℃贮存直到用于分析所施用的测试物质或任何代谢物。在收集每份约10mL试样样品后，将约10mL的对照灌注液(不含测试物质的灌注液)添加到灌注系统中以保持恒定的体积。
如果需要，在灌注结束时收集所有剩余的灌注液和装置清洗液以进行质量平衡分析和/或代谢物谱(灌注液/血浆中)分析。在对测试物质进行放射标记的情况下，如果在灌注前没有将胆囊从肝脏摘除，则可以将胆囊匀浆并分析总放射性。
在收集到组织后，优选用盐水清洗灌注装置，并且在灌注结束时用水和醇清洗。优选将每份清洗样品保留以进行分析。此外，在施用后将施用注射器和套管重新称重，并用水和甲醇清洗。如果适当，则分析注射器/套管洗液的放射性，或者其他适合的标记物。通过从例如加入注射器/套管中的放射性总量减去注射器洗液的放射性计算所施用的测试物质的剂量。
活检
优选在给药前和给药360分钟后进行活检，并在收集点将其快速冷冻在液氮中。在灌注结束时，将剩余的肝脏均浆。可对活组织进行组织病理学检测，并对标记酶和其他蛋白质进行表型检测。
对照
优选的对照包括但不限于给药前收集的胆汁、灌注液试样和血浆，并且如果可能，也可以是从单个器官收集的肝脏匀浆物。优选将所有样品在约-80℃贮存。
分析
如果使用放射标记的物质和标准品，则可以测量总放射性，并且如果需要，可以提取标记的测试物和/或代谢物并进行HPLC图谱分析。此外，可对代谢物进行可能的结构鉴定，并且可以提取并分析血浆和胆汁中的标准品(例如tetra-BSP)及其谷胱甘肽结合物。
可在灌注期间监测生理参数，例如动脉压和流速、器官核心温度、血液pH、以及动脉和静脉的PO2和PCO2；血液生化参数，例如电解质，包括但不限于钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(U/l)、ALT(U/l)、淀粉酶(U/l)、AST(U/l)、GGT(U/l)、CaI(mg/dl)、胆红素(U/l)和BUN(mg/dl)的浓度；生物标记物，例如葡萄糖(mg/dl)的利用和乳酸(lactate)(mM)的生成；标准品的吸收，所述标准品例如3H-甘露醇、安替比林、普萘洛尔(propanalol)、阿替洛尔(atenolol)、四溴酚酞磺酸钠(bromosulphophthalein，tetra-BSP)、1-萘酚、7-乙氧基香豆素、特布他林(terbutaline)和/或其他标记或未标记的标准品；以及胆汁、灌注液和肝脏中测试物质和/或代谢物的存在和特征。灌注肾脏的方法
与评估物质在肾脏中的结局和作用特别相关的方法包括但不限于：(a)肾清除、血浆清除和肾小球滤过率-尿液是物质消除的主要途径，且肾脏是物质相互作用的主要部位；(b)代谢-肾脏具有显著的代谢活性，例如测定肾小管重吸收或主动分泌的百分比；和(c)分配-肾脏中形成的代谢物在血液和尿液间的分配能够表明其他器官与药理活性或毒性代谢物的后续接触。
与所有人器官一样，为经灌注的分离人肾脏(IPHK)设计验证方法，以用于在将肾脏从供体切除后的低温保存灌注和用于物质检测的常温生理灌注。
任选地，在使用IPHK进行测试之前，尽可能多了解用于测试的每个肾脏的历史记录，更重要的是将其目前的状况与成功移植的数百个肾脏和没有成功移植的数百个肾脏的数据库进行比较。这是接受肾脏进行药物研究的机制，并记录每个决定的基本原理。然而，根据本发明的公开，肾脏不需要处于移植所需的相同条件下。因此，例如可以使用比适于移植者年长的供体(例如，年长56岁)的器官或来自无心跳供体的器官，以及患病或受伤的器官。
灌注条件
在收到捐献的肾脏后将其尽快转入低温贮存，并在约6℃-约8℃使用如缓冲液(Organ Recovery Systems，Inc.，Des Plaines，IL)的缓冲液灌注至少约4小时。
随后，使用约1L新鲜灌注液冲洗肾脏，并使灌注流出物的温度升高到约37℃。当肾脏的灌注压力和流速以及尿液形成稳定时，用约1.5L新鲜灌注液替换第一灌注液。
施用和样品收集
在施用测试物质前对人肾脏进行常温灌注的优选接受标准为：
直接向灌注液中加入测试物质和内标，并在约2小时内每15分钟采集部分灌注液(约3ml-约5ml)，每15分钟分批收集尿液。将各灌注液样品再细分成大致相等的4份试样。将2份试样保留以进行分析，将其他2份离心除去血浆并在约-70℃冷冻保存以用于可能需要的其他分析。将尿样收集到油管(tarred tube)中，称重，并在约-70℃冷冻以用于后续分析，例如分析测试物质和代谢物。
在向IPHK施用测试物质足够长的时间后，例如约60分钟后，可向循环灌注液中添加外源的阳性对照以确认这些关键过程没有被内源化合物(即内标)掩蔽(covered)。这些额外(优选标记的)的对照包括但不限于p-氨基马尿酸(用于评估肾小管分泌)和谷胱甘肽结合物(用于评估硫醇尿酸途径的完整性)。
在添加阳性对照后的约2小时内，再以约每隔约30分钟收集灌注液和尿样，并将其保留以用于分析，所述分析包括但不限于测量生理参数；测量血液生化参数，例如钾(mM)、钠(mM)、氯(mM)、钙(mM)、葡萄糖(mg/dl)、乳酸(mM)、白蛋白(g/dl)、ALP(U/l)、ALT(U/l)、淀粉酶(U/l)、VAG(U/l)、AST(U/l)、2-GST(谷光甘肽S-转移酶)(U/l)、肌酸酐(mg/dl)和尿排泄物(urinaryexcretion，U/l)；测量尿液、灌注液和肾脏中的测试物质和/或代谢物；并测量尿液的生化参数，例如N-乙酰氨基葡糖苷酶、谷光甘肽S-转移酶以及蛋白质和肽。灌注人肺的方法
经灌注的分离人肺制备物(IPHLung)是用于研究肺特异性物质相关作用的通用系统，所述肺特异性物质相关作用包括但不限于评估例如定量肺通气功能，经气管的物质吸收，血液中的物质摄取，物质代谢、清除和保留，水肿程度，物质毒性和药物相互作用，以及通过使用喷雾递送组胺/舒喘宁或其他标准品诱导支气管收缩/扩张从而评估肺的生理功能。
此外，灌注试验克服了体外肺试验的很多问题，包括但不限于可对肺中40种以上的细胞类型进行研究，在这些细胞类型中，很多不能被分离，还有很多在培养时表型发生改变。
灌注条件
优选在约6℃-约8℃使用约2L缓冲液(例如Krebs-Ringer缓冲液)以约12ml/分钟-约18ml/分钟冲洗成对的呼吸肺，使其不含供体的血液。随后，在小于约18mmHg的压力下使用新鲜灌注液通过肺动脉灌注肺，并连续记录流速。可将来自肺静脉的流出物重循环(除首次通过的情况之外)。灌注试验中使用约2L灌注液。
优选的生物标记物为酶标记物，包括但不限于血管紧张肽转换酶。优选的标准品包括，但不限于约1mg/ml舒喘宁或其他支气管扩张剂(剂量约150μg)，约1mg/ml异丙托品(ipatropium)(剂量约150μg)和多胺。
施用和样品收集
在施用测试物质前对人肺进行常温灌注的优选接受标准为：
在施用前和其他采样时间收集灌注液样品，并在例如pH、pCO2、乳酸和无机离子方面对血液化学进行评估。此外，在相同时间点采集样品以评估血管紧张肽转换酶和其他酶的释放。
在以约0.3mg/ml-约1.0mg/ml(剂量约45-约150μg)的浓度使用喷雾器经气管施用测试物质或将测试物质加入灌注液中施用后(称作“计时起点”)，在施用前以及例如在吸收试验施用后的至少两个下列时间点取出灌注液试样(优选约3ml-约5ml)：5、10、15、30、45、60、90和120分钟。每份试样保留约1ml用于血液化学/生化测量以及血细胞比容测量。留出部分剩余试样(约1ml的完整灌注液)，并将其他部分离心，将所得的不含细胞的上清液进一步分成等份试样，将其在收集点时快速冷冻在液氮中。
在施用后约120分钟后，将此灌注液替换成新鲜灌注液，并循环约30分钟。例如在新鲜灌注液开始循环后5、10、15和30分钟采集灌注液样品(约3mL-约5mL的试样)。每份试样保留约1mL用于血液化学/生化测量以及血细胞比容测量。留出部分剩余试样(约1mL的完整灌注液)，并将其他部分离心，将所得的不含细胞的上清液进一步分成等份试样，将其在收集点时快速冷冻在液氮中。
在30分钟结束时，向灌注液中添加代谢标记物，并在添加代谢标记物后例如5、15、30和60分钟(如果可行，到灌注结束时和/或在其他时间点)再次采集灌注液样品，为约3mL-约5mL的试样，随后将其冷冻以用于此后对测试化合物和代谢物的分析。还在添加用于多胺摄取测定的代谢标记物后的例如5、15、30和60分钟，采集约1mL的血浆样品。所述标记物包括但不限于添加到灌注液中的探针、剂量为约20μM的乙氧基香豆素(CYP1A)以及剂量为约10μM的1-萘酚(葡糖醛酸化和硫酸化)。
在计时起点后约3小时30分钟，以约10-5M-约10-6M的浓度向灌注液中添加组胺或其他支气管收缩剂或血管扩张剂以进行药理评估。约10分钟后，评估支气管收缩情况。如果未发现支气管收缩，则再添加组胺，但将浓度分别提高到约10-5 M-约10-6M。每10分钟向灌注液中添加浓度提高的组胺直到出现支气管收缩的症状，此时开始吸入来自1mg/ml储液的剂量为2×150μg的对照，例如舒喘宁。优选使用带有150μl盘的ProDose设备进行给药。在约15分钟内检测是否出现支气管收缩。随后，可以以约10-7M的浓度向灌注液中添加罂粟碱或其他血管扩张剂，并检测支气管舒张的程度。
活检
可以使用例如充满中性缓冲福尔马林的容器(例如500ml的塑料螺旋盖容器)对各个肺进行组织学试验。取出带有全长支气管的肺叶，避免损伤实质组织。将结扎线松松地绕过支气管放置。可使用镊子夹持支气管，并使用注射器将福尔马林缓慢地注入整个肺叶。在肺叶膨胀75％后停止注入。将支气管结扎并将肺叶放置在福尔马林中。记录最初固定的日期和时间。肝毒性
肝功能和毒性研究中常用的5种全细胞制备物为：初代肝细胞、培养肝细胞、肝切片、灌注肝脏和体内肝脏。在设计试验以测定物质在体内的结局和作用时，应考虑这些方法中每一种所具有的优点和缺点。实践证明这是一个难以满足的标准。例如，药物研究中使用分离肝细胞带来的主要优点总是包括“便捷”以及由单个肝脏产生“大量”数据。然而，当数据的“质量”极为重要时，例如作出药物研发决定时，这种体外模型缺乏肝小叶结构，酶的区域分布被破坏，细胞中很多酶活性减小，并且缺失了重要的非实质细胞。类似地，在培养的肝细胞中，很多酶系统转化成胎儿状态而且细胞色素P450的含量减少，从而限制了其在毒性和药物代谢研究中的应用。然而，在没有替代方案的情况下，这些方法仍广泛使用。
与初代或培养肝细胞相反，肝切片保留了肝小叶结构，然而这种形式的细胞泄漏钾，最重要的是其不生产胆汁，而胆汁是从肝脏清除潜在毒素(内源和外源性)的主要途径。
灌注肝系统模拟的体内条件多于上述任何技术。正常的肝结构、微循环和胆汁生产得到保留。游离的化合物和蛋白结合的化合物以与在体内运行相同的流速和灌注压力通过血液(细胞和血浆)递送到所有的细胞类型。此外，在评估物质的肝毒性时，由于对灌注肝脏中的多种细胞类型危害较小，从而获得较少的假阳性和假阴性结果，以及更好的药代动力学/毒性相关性。
A.灌注条件
对来自人的肝脏的灌注如上所述。以(a)脉冲剂量、(b)重复脉冲剂量、(c)恒定输注或(d)提高的血浆浓度，将测试物质加入到灌注液中。在约4-8小时内每隔约15-30分钟收集灌注液和胆汁样品，并分析肝脏/胆损伤的标记物以及物质/代谢物的浓度。在一个实施方案中，每小时进行肝脏活检，并在如上所述的收集点快速冷冻在液氮中。B.毒性标记和阳性对照
  目标症状   诊断方法&组织化学
  形成脂肪肝   载体蛋白合成受抑制
  胆汁郁积   胆汁分泌
  坏死   蛋白质组学
  凋亡   蛋白质组学，成像
  缺血/再灌注损伤   蛋白质加合物
  遗传毒性   DNA-加合物
  门脉压力增高   直接
  诱导/抑制   微阵列
  解毒途径   活化/抑制
总之，此组试验记录了血液中相关浓度的物质和/或代谢物对一些关键肝功能的作用，包括：运进和运出肝脏的转运过程、转录-翻译-翻译后翻译修饰和蛋白质及结合蛋白质的胞外分泌、细胞因子产生、凋亡或坏死的刺激、自由基的产生、DNA-加合物的形成以及解毒途径的诱导或抑制。肾毒性
作为至关重要的器官，肾脏执行很多独特功能，可以监测这些功能以作为接触某些物质时损伤的证据。这些功能包括：体液体积的调控(控制血压的主要动力)；与肺合作，通过排泄固定的非挥发性酸并保留碱来调整身体pH；排泄废物并保留重要的身体组分，例如电解质、底物等；解除某些物质的毒性；合成并释放激素，例如凝乳酶和促红细胞生成素；将维生素D3转化成1，2-二羟基的形式。为了执行这些功能，需要整合肾脏的很多生理和生化作用。
A.灌注条件
如上所述，对来自人的肾脏进行低温灌注，在约37℃用灌注液冲洗和稳定，并使用约1L-约1.5L新鲜灌注液进行灌注。
以(a)脉冲剂量、(b)重复脉冲剂量、(c)恒定输注或(d)提高的血浆浓度，将测试物质加入到灌注液中。在灌注过程的约2-4小时内每隔约15-30分钟收集灌注液和尿样，并分析肾脏损伤的标记以及物质/代谢物的浓度。C.毒性标记和阳性对照
  目标症状   阳性对照   诊断方法
  急性肾衰竭   庆大霉素顺铂   蛋白质组学
  因灌注不足导致的肾前性氮质血症   ACE抑制剂环孢霉素   肾脏血液动力学
  急性间质性肾炎   别嘌呤醇磺胺类药物   炎症标记
  梗阻性肾病   氨甲蝶呤阿昔洛韦   尿流GFR
心脏毒性
A.灌注条件
保存后，取出冷藏的分离人心脏，并按照标准Langendorff法在约7.3±2的pH和约37℃的温度下使用包含清洗的匹配人红细胞(约15-约20％，v/v)和人血清白蛋白(约4％，v/v)的缓冲液进行灌注。在一个实施方式中，可将人血清白蛋白替换成人血浆。
保持PO2(约150-约250mmHg)和PCO2(约25-约35mmHg)并将电解质浓度调整到血液中的正常值。一旦器官的灌注压力和流速、心率和左室压力阶差(developed left ventricular pressure，DLVP)(dP/dt)稳定，则取出预施用样品，以(a)脉冲剂量、(b)重复脉冲剂量、(c)恒定输注或(d)增剂量输注，将测试物质加入到灌注液中。测量血液化学/生化标记，包括但不限于电解质、葡萄糖、PO2A-V差异、PCO2A-V差异、肌钙蛋白-1和白蛋白结合物。B.毒性标记和阳性对照
  目标症状   诊断方法
  Langendorff性质   压力流动心率
  复苏介入(Re-animation intervention)   纤维颤动起搏同位素
  工作能力   dP/dt
  心脏舒张   心脏舒张末压/体积比
  内皮功能   冠脉血流储备
  对细胞功能的干扰   蛋白质组学
  凋亡   Caspase 3
  坏死   肌钙蛋白-1
  缺血   白蛋白加合物
激素干扰物的鉴定
迫切需要得到验证的体内和体外筛选测定法以检测制备的化学物质和药物的激素干扰活性。迄今为止，现有技术中的很多筛选都使用非哺乳动物的脊椎动物和无脊椎动物，其尚不能代表在包括人在内的哺乳动物中发生的事件。使用具有血液的离体人内分泌腺(利用肾上腺、胸腺、胰腺、甲状腺和生殖腺)的灌注提供了与人相关的测试体系。示例性的方法包括通过正常脉管系统对内分泌腺血液灌注以及通过适合的静脉插管收集静脉流出物。在以临床和/或环境相关浓度向灌注液中添加的潜在激素干扰物不存在(对照)和存在(测试)的条件下测量所述腺对天然存在激素的摄取以及所述腺随后对内源产生的激素的释放。由此可以评估潜在化学物质的激素干扰活性。
如共有专利美国专利第6,673,594号和美国公开专利申请第2004/0224298号(均通过引用全文并入本文)所述，在实施本发明的方法时，可以使用用于灌注移植器官和组织的设备和装置。然而，本领域技术人员将认识到，根据本发明的方法使用器官和组织的方式不同于使用用于器官移植的灌注保持器官和组织的方式。
如同在本申请中明确记载其全文一样，本文引用的所有专利、专利申请、科技文献和其他原始资料和参考文献均通过引用将其全文并入本文。
应理解上述公开重点描述了本发明的某些具体实施方式，与这些实施方式相等同的改变或替换也在本发明的精神和范围之内。

Claims (9)

1.检测物质毒性的方法，包括：
使在常温条件下的包含所述物质的灌注液通过至少一种具有代谢活性、在捐献前受损或患病的捐献的离体人器官或组织，其中，在捐献所述器官或组织之前测定所述器官或组织是受损或患病的,其中所述物质选自由农产品、工业产品、建筑材料、烟草制品、清洁产品和化妆品组成的组；
在用包含所述物质的灌注液灌注所述至少一种捐献的人器官或组织前和/或后，使在常温以及生理的氧合作用、渗透压、电解质平衡和pH条件下的不含所述物质的灌注液通过所述至少一种捐献的人器官或组织，其中，所述至少一种捐献的人器官或组织作为其自身的对照，不含所述物质的灌注液包含阳性和阴性对照；
收集来自灌注器官或组织的数据，所述收集来自灌注器官或组织的数据包括：
分析来自所述灌注器官或组织的流出物，和
监测选自以下的一个或多个：细胞死亡、凋亡、基因突变、基因表达变化、生化抑制、代谢下降、诱导和氧化损伤以及身体化学物质的干扰；
和，
分析所述数据以评估所述物质的毒性，其中使用所述数据分析以下至少一种：激素水平、靶细胞-受体介导作用、腺体分泌功能、激素功能或其组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述器官或组织选自由胰腺、胸腺、男性生殖器官、女性生殖器官、甲状腺和肾上腺组成的组。
3.检测物质毒性的方法，包括：
使在常温条件下的包含所述物质的灌注液通过在常温条件下的至少一种具有代谢活性的离体人内分泌腺或内分泌腺组织，其中，所述离体人内分泌腺或内分泌腺组织是来自人的捐献的受损或患病的腺或组织，并且在捐献所述腺或组织之前测定所述腺或组织是受损或患病的；
在用包含所述物质的灌注液灌注所述人内分泌腺或内分泌腺组织前和/或后，使不含所述物质的灌注液通过所述人内分泌腺或内分泌腺组织，其中，人内分泌腺或内分泌腺组织作为其自身的对照，不含所述物质的灌注液包含阳性和阴性对照；
收集来自灌注腺或组织的数据，所述收集来自灌注腺或组织的数据包括分析来自所述灌注器官或组织的流出物；和
分析所述数据以评估所述物质对所述腺或组织的激素摄取或产生的作用,其中所述物质选自由农产品、工业产品、建筑材料、烟草制品、清洁产品和化妆品组成的组。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中通过电生理学检测、医学诊断成像、光谱检测、微透析、固态组织探针检测或其组合收集所述数据。
5.如权利要求1或3所述的方法，其中所述腺选自由胰腺、胸腺、男性生殖器官、女性生殖器官、甲状腺和肾上腺组成的组，或者所述器官或组织为选自由胰腺、胸腺、男性生殖器官、女性生殖器官、甲状腺和肾上腺组成的组的器官。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述腺或组织是受损的。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述腺或组织已被长期热缺血、长期低温贮存或机械性损伤所损伤。
8.权利要求1或3所述的方法，其中所述器官、腺或组织是患病的。
9.如权利要求1或3所述的方法，其中分析所述数据以评估激素水平是未改变的还是提高的、降低的或其它改变的。
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