CN101720671A - 金缕梅的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金缕梅组织培养方法，其培养步骤为：外植体消毒：(1)取金缕梅种子分别用酒精及次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗并剥去外种皮后，进行(2)种子无菌萌发→(3)不定芽增殖培养→(4)诱导培养→(5)增殖培养→(6)壮苗培养→(7)生根培养→(8)炼苗和移栽。采用组织培养方法，大大缩短金缕梅种子的育苗周期。与扦插繁殖相比，能有效地提高金缕梅的繁殖系数。在一个生长周期内，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖50～60倍。

Description

金缕梅的组织培养方法
一、技术领域
本发明涉及植物组织培养方法，具体地说是涉及金缕梅的组织培养方法。
二、背景技术
金缕梅(Hamaelis mollis Oliv.)是金缕梅科金缕梅属的小乔木或灌木，我国仅一种(中国植物志，1979，第35卷，第二分册，73)。原产我国东部、中部和西南部，主要分布于浙江、福建、安徽等省的山地，多为散生。金缕梅系阳性花木，喜温暖湿润气候，比较耐寒。
作为一种具有观赏价值的花木，金缕梅树形雅致，树冠呈圆球形或卵圆形。花期为早春二月，先花后叶，花形奇特，香气宜人，树叶秋季转黄色至红色，素有彩条花木的誉称，为著名观赏树木之一。用作风景区和城乡园林绿化建设中的早春花木，它可与多种花木配制，以孤植、丛植、片植、带植等多种方式种植，能收到绿化、花化、香化生态环境的良好效果。其黄色细长的花瓣宛如金缕。
种子较难发芽，多用分根繁殖。采取组织培养法进行金缕梅的快速繁殖，建立从离体萌发的幼苗到丛生芽生根的无性繁殖体系，有利于提高种子的利用率，扩大繁殖系数，对金缕梅走向园林应用具有较强的生产应用价值。目前，金缕梅常用的繁殖技术如下：1.播种繁殖
在秋季果实成熟后，连果枝采集回来，放在阳光下晒2～3天，果壳开裂，获取种子，随即用湿润砂层积贮藏，置于室内阴凉通风处，要常检查，防止干燥。经过两冬一夏，在春季3～4月当种子破胸露白时，从砂中筛出种子，在先整好地的苗床上，采用条播，每米播种沟内均匀地撒种子约50～60粒，覆细土，厚为种子的2～3倍，即1cm～2cm，并盖一层稻草，以不见土为度。播种后约半月至20天，发芽出土达1/3～1/2，趁阴天或晴天傍晚，轻轻揭除盖草。此后，及时做好松土、除草、追肥、抗旱等工作，以培育壮苗。在苗木落叶后到第二年春发叶前，开始动苗木，裸根定植或移植，可以获得较高成活率(郭承则等，彩花条木金缕梅，花木盆景，2003，(2)：37)。
2.扦插繁殖
以ABT-6号生根粉100mg/kg处理1h，然后插入扦插池中。扦插基质为砻糠灰，全光照喷雾条件下常规管理。7周后茎基部开始形成愈伤组织。18周后，平均新生根数目为7根/株，成活率为89％(易国文等，ABT生根粉在金缕梅扦插繁殖中的应用，2005，19(2)：67)。
三、发明内容
1.发明目的
本发明的目的是针对金缕梅现有繁殖技术较为陈旧的问题，提供一种金缕梅的组织培养方法，其目的在于提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
2.技术方案
外植体采自位于东经119.23°，北纬31.22°的浙江省龙王山自然保护区中40年树龄的金缕梅单株当年成熟的健壮种子。该地年平均气温15.1℃，年均降水1600mm，属亚热带温暖湿润季风气候。
一种金缕梅的组织培养方法，其培养步骤如下：
(1)外植体消毒处理
选取金缕梅单株当年成熟的健壮种子，依次进行自来水冲洗2h，于超净工作台上用70％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3～4次，再用稀释10倍的浓度为0.525％NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干种子表面水分，并剥去木质化外种皮待接入MS或1/2MS基本培养基中，蔗糖20～30g·L-1，琼脂0.7％，pH 5.7，培养温度25℃；
(2)种子无菌萌发
将剥好的成熟胚接入MS基本培养基中，暗培养2周后萌发；
①无菌苗的炼苗与移栽
将瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出幼苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度20～25℃，湿度85％～95％，适当遮荫，成活率达90％；
②胚轴组织培养
a.诱导培养
将初代培养中萌发的金缕梅幼苗切除胚根后接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质2，4-D2.0mg·L-1的诱导培养基中培养30天，光照条件：光照/黑暗，其中光照16h.d-1，光照度为2400lx；
b.不定芽增殖培养
将诱导培养基中的淡黄色的愈伤组织接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养6周，光照条件同a诱导培养；
c.增殖培养
将淡黄色愈伤组织中萌发的不定芽接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
d.壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1～2cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
e.生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2MS+生长调节物质BA0.1mg·L-1+生长调节物质NAA1.0mg·L-1中，先暗培养2周，再光照培养2周后生根，光照条件同a诱导培养；
f.炼苗和移栽
将有生根的金缕梅植株的培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度20～25℃，湿度85％～95％，适当遮荫，成活率达90％。
所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
所述的生长调节物质BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸。
所述的1/2MS基本培养基的成分为：大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐和有机成分与MS相同。
所述的大量元素为：(1)硝酸钾KNO3，1900mg·L-1，(2)硝酸铵NH4NO3，1650mg·L-1，(3)磷酸二氢钾KH2PO4，170mg·L-1，(4)硫酸镁MgSO4·7H2O，370mg·L-1，(5)氯化钙CaCl2·4H2O，440mg·L-1；
所述的微量元素为：(1)碘化钾KI，0.83mg·L-1，(2)硼酸H3BO3，6.2mg·L-1，(3)硫酸锰MnSO4.4H2O，22.3mg·L-1，(4)硫酸锌ZnSO4.7H2O，8.6mg·L-1，(5)钼酸钠Na2MoO4.2H2O，0.25mg·L-1，(6)硫酸铜CuSO4.5H2O，0.025mg·L-1，(7)氯化钴CoCl2.6H2O，0.025mg·L-1；
所述的铁盐为：(1)乙二胺二乙酸二钠Na2.EDTA，37.3mg·L-1，(2)硫酸亚铁FeSO4.7H2O，27.8mg·L-1；
所述的有机成分为：(1)肌醇C6H12O6.2H2O，100mg·L-1，(2)甘氨酸NH2.CH2.COOH，2mg·L-1，(3)盐酸硫胺素C12H17ClOS.2HCl，0.1mg·L-1，(4)盐酸吡哆醇C8H11O3N.HCl，0.5mg·L-1，(5)烟酸NC5H4COOH，0.5mg·L-1。
3.有益效果
应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高金缕梅的繁殖系数。与播种繁殖相比，组织培养法能有效利用种子，其萌发率高，育苗周期短。无菌条件下种子只需2周即可萌发，而常规种子萌发手续复杂，时间较长。与扦插繁殖相比，在一个生长周期即6个月内，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50～60倍。
四、具体实施方式
一种金缕梅组织培养方法，其培养步骤如下：
(1)外植体消毒处理
选取金缕梅单株当年成熟的健壮种子，依次进行自来水冲洗2h，于超净工作台上用70％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3～4次，再用稀释10倍的浓度为0.525％NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干种子表面水分，并剥去木质化外种皮待接入MS或1/2MS基本培养基中，蔗糖20～30g·L-1，琼脂0.7％，pH 5.7，培养温度25℃；
(2)种子无菌萌发
将剥好的成熟胚接入MS基本培养基中，暗培养2周后萌发；
①无菌苗的炼苗与移栽
将瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出幼苗，洗净。移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度22℃，湿度90％，适当遮荫，成活率达90％。
②胚轴组织培养
a.诱导培养
将初代培养中萌发的金缕梅幼苗切除胚根后接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质2，4-D2.0mg·L-1的诱导培养基中培养30天，光照条件：光照/黑暗，其中光照16h.d-1，光照度为2400lx；
b.不定芽增殖培养
将诱导培养基中的淡黄色的愈伤组织接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养6周，光照条件同a诱导培养；
c.增殖培养
将淡黄色愈伤组织中萌发的不定芽接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
d.壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1～2cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
e.生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2MS+生长调节物质BA0.1mg·L-1+生长调节物质NAA1.0mg·L-1中，先暗培养2周，再光照培养2周后生根，光照条件同a诱导培养；
f.炼苗和移栽
将有生根的金缕梅植株的培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度20～25℃，湿度85％～95％，适当遮荫，成活率达90％。

Claims (5)

1.一种金缕梅的组织培养方法，其培养步骤如下：
(1)外植体消毒处理
选取金缕梅单株当年成熟的健壮种子，依次进行自来水冲洗2h，于超净工作台上用70％乙醇灭菌30s，无菌水冲洗3～4次，再用稀释10倍的浓度为0.525％NaClO灭菌20min并抽真空，无菌水冲洗5次后，用灭菌滤纸吸干种子表面水分，并剥去木质化外种皮待接入MS或1/2MS基本培养基中，蔗糖20～30g·L-1，琼脂0.7％，pH 5.7，培养温度25℃；
(2)种子无菌萌发
将剥好的成熟胚接入MS基本培养基中，暗培养2周后萌发；
①无菌苗的炼苗与移栽
将瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出幼苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度20～25℃，湿度85％～95％，适当遮荫，成活率达90％；
②胚轴组织培养
a.诱导培养
将初代培养中萌发的金缕梅幼苗切除胚根后接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质2，4-D2.0mg·L-1的诱导培养基中培养30天，光照条件：光照/黑暗，其中光照16h.d-1，光照度为24001x；
b.不定芽增殖培养
将诱导培养基中的淡黄色的愈伤组织接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养6周，光照条件同a诱导培养；
c.增殖培养
将淡黄色愈伤组织中萌发的不定芽接入MS+生长调节物质BA1.0mg·L-1+生长调节物质NAA0.1mg·L-1的增殖培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
d.壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为1～2cm的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养30天，光照条件同a诱导培养；
e.生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2MS+生长调节物质BA0.1mg·L-1+生长调节物质NAA1.0mg·L-1中，先暗培养2周，再光照培养2周后生根，光照条件同a诱导培养；
f.炼苗和移栽
将有生根的金缕梅植株的培养瓶的瓶盖打开，室温下炼苗3d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩或蛭石苗床上，保持温度20～25℃，湿度85％～95％，适当遮荫，成活率达90％。
2.根据权利要求1所述的金缕梅的组织培养方法，其特征在于所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
3.根据权利要求1所述的金缕梅的组织培养方法，其特征在于所述的生长调节物质BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸。
4.根据权利要求1所述的金缕梅的组织培养方法，其特征在于所述的1/2MS基本培养基的成分为：大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐和有机成分与MS相同。
5.根据权利要求2所述的金缕梅的组织培养方法，其特征在于：
所述的大量元素为：(1)硝酸钾KNO3，1900mg·L-1，(2)硝酸铵NH4NO3，1650mg·L-1，(3)磷酸二氢钾KH2PO4，170mg·L-1，(4)硫酸镁MgSO4·7H2O，370mg·L-1，(5)氯化钙CaCl2·4H2O，440mg·L-1；
所述的微量元素为：(1)碘化钾KI，0.83mg·L-1，(2)硼酸H3BO3，6.2mg·L-1，(3)硫酸锰MnSO4·4H2O，22.3mg·L-1，(4)硫酸锌ZnSO4·7H2O，8.6mg·L-1，(5)钼酸钠Na2MoO4·2H2O，0.25mg·L-1，(6)硫酸铜CuSO4·5H2O，0.025mg·L-1，(7)氯化钴CoCl2·6H2O，0.025mg·L-1；
所述的铁盐为：(1)乙二胺二乙酸二钠Na2·EDTA，37.3mg·L-1，(2)硫酸亚铁FeSO4·7H2O，27.8mg·L-1；
所述的有机成分为：(1)肌醇C6H12O62H2O，100mg·L-1，(2)甘氨酸NH2CH2·COOH，2mg·L-1，(3)盐酸硫胺素C12H17ClOS·2HCl，0.1mg·L-1，(4)盐酸吡哆醇C8H11O3N·HCl，0.5mg·L-1，(5)烟酸NC5H4COOH，0.5mg·L-1。
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