CN101716188A - 用于防治糖尿病的动物胰腺提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种动物胰腺提取物，以及该动物胰腺提取物的药物用途。本发明所述的一种用于防治糖尿病的动物胰腺提取物，是从幼龄小猪的新鲜胰脏中提取的分子量不超过10000道尔顿的小分子量活性物质溶液，提取液为澄清液体，pH值为6.0-7.0，每1ml提取液中含多肽不少于15mg，不含胰岛素。本发明所述的动物胰腺提取物，是以糖尿病发生的源头器官胰腺为靶点，选择动物胰腺为原料，通过现代工艺提取得到的小分子活性多肽类物质，适用于各型糖尿病的预防和治疗，包括治疗重症糖尿病、防止轻型糖尿病的重症化、预防器官移植后糖尿病、减少抗排斥药物不良反应等，以及逆转或延迟重症糖尿病的发生和发展，防止糖尿病的各种并发症。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种动物胰腺提取物，以及该动物胰腺提取物的药物用途。
背景技术
糖尿病是以血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病群。糖尿病以其危害大、难治愈、费用高等特点，已经成为影响国人身心健康的重大疾病。糖尿病的诱发因素包括遗传、病毒感染、自身免疫、器官移植、饮食因素、不良情绪等。
糖尿病的发病率越来越高，目前全球糖尿病患者已达1.8亿左右，专家预测到2025年将超过3亿，其中75％在印度、中国等发展中国家。据统计，世界上糖尿病发病率为3％至5％，50岁以上的人均发病率为10％。其中绝大部分是II型糖尿病者。在全球范围内，每10秒就有一个人死于糖尿病，同时在这10秒内又有2个人罹患糖尿病。全球每30秒就有一人因糖尿病而截肢。每年患糖尿病的人数增加700万，而且多数集中在亚洲。在发达国家，糖尿病是成年人失明和视力障碍的主要原因。每年死于糖尿病的人数远远高于死于艾滋病的人数。在发展中国家，35-64岁的年龄段中，每10个人至少有一人死于糖尿病。据世界卫生组织预测，到2025年全世界糖尿病患者将达到3亿人，其中2.3亿人在发展中国家。
我国已成为糖尿病大国，全国糖尿病患者总数达4000万，居世界第二，仅次于印度，发病率约为5％；我国成人糖尿病发病率已超过11％。并以每年100万的速度递增。其中，I型糖尿病患者占10％，II型糖尿病患者占90％。与20世纪80年代的0.7％相比，增长了5倍。现在，我国每天有3000个新发的糖尿病患者(每28秒一个)，糖尿病花费188亿人民币。报道指出，一个国家的人均GDP达到700至1700美元时，正是糖尿病的高发期，中国目前正处于这一阶段。
我国在2004年国家中长期科技发展战略中，已将糖尿病列为“需要重点防治的专项重大疾病”。广东的糖尿病患病人数亦已超过300万。2008的调查数据显示，广州市糖尿病患病率为6.13％，高于全省3.5％和全国2.9％的平均水平。广东省卫生厅疾控处提供的数据显示，以目前广州1千多万人口计算，糖尿病准患者数量至少在90万人左右。
对于糖尿病的防治，应该预防与治疗相结合。控制和减少患病率，减少其死亡率和致残率为重点。治疗糖尿病药物可以通过不同方式如促进葡萄糖利用、保护胰岛β细胞、促进胰岛素稳定分泌和抑制α-糖苷酶活性等来达到防治糖尿病的目的。其中部分药物是从多方面、多靶点综合产生药效。目前，糖尿病的药物治疗主要有：(1)胰岛素，一直是糖尿病治疗的主要药物，可以直接调节人体的血糖水平；(2)磺脲类，主要通过刺激胰岛素分泌而发挥作用；(3)双胍类，抑制糖原异生及糖原分解，增加外周组织对葡萄糖的摄取和利用；糖苷酶抑制剂，通过抑制小肠粘膜上皮细胞表面的糖苷酶，延缓碳水化合物的吸收；(4)噻唑烷二酮，胰岛素增敏剂，通过增加外周组织对胰岛素的敏感性、改善胰岛素抵抗而降低血糖；(5)甲基甲胺苯甲酸衍生物，是近年开发的非磺脲类胰岛素促分泌剂。
近几年的研究显示，无论是I型还是II型糖尿病患者，都存在不同程度的胰腺β细胞功能损伤。但是，目前仍然缺乏保护胰腺β细胞、促进β细胞再生修复、延缓或者逆转糖尿病重症化而且毒副作用小的药物。
而动物胰腺，是一个调控机体糖代谢功能和产生大量活性生物分子的宝库。本项目研制的乳猪胰腺小分子活性多肽，为目前社会上庞大的糖尿病病人群体提供一个有效的防治手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰腺提取物，适用于各型糖尿病的预防和治疗。
本发明所述的一种用于防治糖尿病的动物胰腺提取物，是从幼龄小猪的新鲜胰脏中提取的分子量不超过10000道尔顿的小分子量活性物质溶液，提取液为澄清液体，pH值为6.0-7.0，每1ml提取液中含多肽不少于15mg，不含胰岛素。
本发明的另一目的是提供所述的动物胰腺提取物的提取方法。
本发明所述的动物胰腺提取物的提取方法，包括以下步骤：
A.初处理：对每个小猪胰腺外观、性状目检，不合格者弃去。将合格的小猪胰腺去除脂肪组织后，以纯水洗净至无血水，切碎；
B.匀浆：将切碎的小猪胰腺用注射用水清洗一次，沥去水份，称重，用胶体磨匀浆，将匀浆液和注射用水在25℃以下按质量比为1∶1.1加入高剪切匀浆机中循环5分钟，收集匀浆液，置-10℃以下保存；
C.粗滤：将冻存至少7天的匀浆液取出，流水解冻后，放入水浴中搅拌加热至80-85℃，放入300目滤布自然过滤，收集滤液，置于10℃以下冰水中搅拌冷却，同时滴加碱液调节pH值至6.5±0.5℃，得粗滤液；
D.精滤：将粗滤液过分子量为10000道尔顿的超滤膜，收集超滤液，置于-10℃以下保存；
E.浓缩：将冻存不少于10天的超滤液用自来水解冻，底部残渣用300目滤纸过滤，滤液与上清液合并，然后用分子量10000道尔顿的中空纤维柱进行反渗透浓缩；
F.分装：将浓缩液过分子量为10000道尔顿的中空纤维柱，再过0.22μm的微滤膜除菌，然后分装，得本发明所述的胰腺提取物，置-10℃以下保存。
本发明的又一目的是提供所述的胰腺提取物用于制备预防与治疗糖尿病的药物的用途。
本发明所述的动物胰腺提取物，是以糖尿病发生的源头器官胰腺为靶点，选择动物胰腺为原料，通过现代工艺提取得到的小分子活性多肽类物质。经实验证明，能够从分子水平保护和修复受损的胰腺β细胞，可以营养和促进胰腺β细胞的稳定和再生，维持胰岛素的稳定分泌，达到降糖的作用，从而适用于各型糖尿病的预防和治疗，尤其包括：治疗重症糖尿病、防止轻型糖尿病的重症化、预防器官移植后糖尿病、减少抗排斥药物不良反应等，以及适用于逆转或延迟重症糖尿病的发生和发展，防止糖尿病的各种并发症。
附图说明
图1是本发明所述的胰腺提取物对于糖尿病模型大鼠的实验中显示实验起点和终点大鼠体重变化的比较图表；图中，并列的两柱中，左柱代表每一组的起点体重百分数，右柱代表每一组的终点体重百分数。“-1”代表注射STZ造模前一天，“144”代表注射STZ造模后的观察天数，“129”代表开始给药治疗后的观察天数；图中，PE为胰腺提取物；pHGF为促肝细胞生长素。
图2是本发明所述的胰腺提取物对于糖尿病模型大鼠的实验中显示单位面积胰岛总数的比较图表；图中，PE为胰腺提取物；pHGF为促肝细胞生长素。
具体实施方式
实施例一：小猪胰腺小分子多肽的提取和鉴定
1.原材料
动物：杂种猪，猪龄在20周左右，合法屠宰厂宰杀，具有动物产品检疫合格证明。原材料的采集和运输均在低温20-25℃条件下处理完成。
2.胰腺质量控制：
2.1重量：完整的小猪胰腺(带少量脂肪组织)，平均重量为120±30克。
2.2外观、性状：胰腺表面光洁，色泽新鲜，灰白色，无异味，无包裹结节，剖面无异常。
2.3挥发性盐基氮测定：按1％比例随机抽取猪胰腺，每个胰腺切取10g，按国家标准GB/TS009.44-2003微量扩散法检查挥发性盐基氮的方法进行限量检测，应符合国家标准GB16869-2005，确保小猪胰腺的新鲜程度。
3.胰腺小分子多肽的提取
3.1小猪胰腺初处理：对每个小猪胰腺外观、性状目检，不合格者弃去；逐个称重，超重者弃去。将合格的小猪胰腺去除脂肪组织后，以纯水洗净至无血水，切碎。
3.2匀浆：将切碎的小猪胰腺用注射用水清洗一次，沥去水份，称重，用胶体磨匀浆，将匀浆液和注射用水在25℃以下按质量比为1∶1.1加入高剪切匀浆机中循环5分钟，收集匀浆液，置-10℃以下保存。
3.3加热、粗滤：将冻存至少7天的匀浆液取出，流水解冻后，放入水浴中搅拌加热至80-85℃，放入300目滤布自然过滤，收集滤液，置于10℃以下冰水中搅拌冷却，同时滴加碱液调节pH值至6.5±0.5℃，得粗滤液。
3.4精滤：将粗滤液过分子量为10000道尔顿的超滤膜，收集超滤液，置于-10℃以下保存。
3.5浓缩：将冻存不少于10天的超滤液用自来水解冻，底部残渣用300目滤纸过滤，滤液与上清液合并，然后用分子量10000道尔顿的中空纤维柱进行反渗透浓缩。
3.6分装：将浓缩液过分子量为10000道尔顿的中空纤维柱，再过0.22μm的微滤膜除菌，然后分装，得本发明所述的胰腺提取物，置-10℃以下保存。
实施例二：本发明所述的动物胰腺提取物对于糖尿病动物模型的影响
1.大鼠糖尿病造模
材料：Wistar大鼠，雄性，200±10g，购买自南方医科大学实验动物中心
试剂和器材：链脲佐菌素(STZ，Sunland公司，美国)；微量血糖测定仪(5D-2型，北京怡成生物电子技术有限公司)；动物称重电子天平(G&G，美国)。
方法：收到符合条件Wistar大鼠，适应性饲养一周后，禁食过夜，空腹腹腔注射STZ(30mg/kg)造模(方法参考文献：李才主编，人类疾病动物模型的复制，人民卫生出版社，2008年第一版；糖尿病动物模型，p345.)。注射STZ一周后，检测随机血糖，超过16.7mmol/L者选定为糖尿病大鼠。未实施干预的糖尿病大鼠，造模后三个月零七天观察到大鼠出现腹部溃疡和眼球白内障。
2.实验大鼠分组
| 组号 | 组别 | 给药方案(每只) | 用鼠数量(只) | 实验中减损数量(只) | 实验终点存活数量(只) |
| 一 | 空白对照(健康组) | 生理盐水1.0mL | 11 | 0 | 11 |
| 二 | 模型对照(糖尿病组) | 生理盐水1.0mL | 12 | 8 | 4 |
| 三 | PE低剂量组 | 原液0.5mL | 15 | 0 | 15 |
| 四 | PE高剂量组 | 原液2.0mL | 15 | 0 | 15 |
| 五 | pHGF治疗组 | 2mg/mL，1.0mL | 10 | 0 | 10 |
注：第二组至第四组是注射STZ造模的糖尿病大鼠。PE为胰腺提取物；pHGF为促肝细胞生长素，它是一个源于肝脏的提取药物，本实验中作为阴性对照。
3.给药方案
第三组，PE低剂量组；PE给药剂量为30mg/mL×0.5mL＝15mg/只；第四组，PE高剂量组；PE给药剂量为30mg/mL×2mL＝60mg/只。第五组，pHGF组；pHGF的给药剂量为2mg/mL×1mL＝2mg/只。第一期为1个月，每天给药一次；第二期为3个月，隔天给药一次。造模51天后，开始出现死亡；接下来的近一个月，全部十只共死亡8只；死亡率80％；集中在两个时间段死亡。其中一组4/5集中在9天内陆续死亡；另一组4/5集中在3天内死亡。
4.结果分析
4.1实验大鼠空腹血糖与随机血糖浓度比较
测定时间：2009年4月21日，测定实验大鼠禁食空腹血糖；2009年4月22日，测定实验大鼠餐后随机血糖；
血糖测定方法：
1.禁食方法：前一天下午5:30开始，撤除实验大鼠饲料，禁食不禁水；
2.当天上午8:30开始测定实验大鼠空腹血糖；
3.血糖测定
1).按照怡成公司提供的说明书使用血糖测定仪；
2).鼠尾取血方法：采用手术剪刀横切鼠尾末端，然后推压鼠尾至出现血滴；
3).用怡成血糖测定仪测定每只大鼠的鼠尾末梢血的血糖浓度。
4.完成血糖测定后，立即恢复实验大鼠喂食。
结果见下表：
表一：实验大鼠空腹血糖与随机血糖浓度比较
| 大鼠分组 | 空腹血糖均值(mmol/L) | 随机血糖均值(mmol/L) |
| 正常(11) | 3.64 | 6.10 |
| 模型(4) | 16.15 | 24.98 |
| 胰低(15) | 6.80 | 21.36 |
| 胰高(15) | 7.55 | 20.08 |
| pHGF(10) | 15.75 | 24.64 |
注：pHGF为促肝细胞生长素
上述实验，相当于两点法的糖耐量试验。从上表的实验数据可以看出，阴性对照药物pHGF和糖尿病模型组的糖代谢能力很差，即使经过过夜的禁食，也不能显著降低血糖水平，因此，这两组实验大鼠始终处于一种高血糖状态；而PE治疗组大鼠，通过PE的治疗，在一定程度上恢复了胰岛的功能，因此，能够将进食后空腹血糖降低到接近正常水平。上表数据结论：通过与正常组，模型对照组和阴性药物的实验比较，可以看出，PE有明显改善糖尿病大鼠的糖代谢能力，说明在一定程度上恢复了胰腺胰岛的功能。
4.2实验大鼠的体重变化
测定时间：2008年11月27日进行糖尿病造模前全部实验大鼠体重测定；2009年04月21日全部实验大鼠体重测定，结束本期实验
测定方法：用电子天平(1000g∶0.1g，美国双杰牌)逐一称重每只实验大鼠，并按照大鼠编号，记录体重数值。测定本期实验起点与实验终点这两个时间点的体重，进行比较。
计算方法：体重％＝实验组大鼠平均体重/正常组平均体重×100％
实验结果见图一。由于造模的糖尿病大鼠具有类似于临床病人典型的“三多一少”症状，即吃得多、饮得多、拉得多、体重减少，因此体重是糖尿病大鼠的一个非常敏感的检测指标。由上图可以看出，糖尿病模型组和pHGF阴性对照组，由于糖尿病症状最严重，体重减轻最多；与此相比，PE治疗组，由于PE的明确疗效，减轻了治疗组大鼠的糖尿病症状，因此，体重逐渐恢复，向正常组靠近。
结论：PE有明显减轻糖尿病大鼠临床症状，恢复体重的效果。
4.3单位面积胰岛总数变化
测定时间：给药治疗药物129天后。
测定方法：
1.给药结束对存活大鼠行颈椎脱臼法处死，处死后进行大体解剖，取胰腺进行病理学检查。
2.取材及处理。将所取全部脏器放入10％中性福尔马林液中，固定48h后，取材作常规石蜡包埋切片。切片厚度3-4μ，H.E染色。
3.用OLYMPUS BX41型光学显微镜观察组织病理学变化并进行摄影。用Image-Pro Express C图像分析系统进行胰岛细胞数目定量指标分析。
4.胰岛细胞数目：每张切片计算五个视野中胰岛细胞的总和。
检测结果：从图2可以看出，糖尿病模型组和pHGF阴性对照组的单位面积胰岛总数计数，都不超过100个；正常对照组超过180个；PE药物治疗组超过140个。因此，从这些监测数据可以看出，PE明确由促胰岛再生作用。
结论：通过直接观察和计数实验大鼠胰腺单位面积里的胰岛总数，可以明确推断PE有促进胰岛细胞再生的作用。
4.4糖尿病大鼠肾脏的主要病理性改变
测定时间：给药治疗药物129天后。
测定方法：给药结束对存活大鼠行颈椎脱臼法处死，处死后进行大体解剖，取肾脏进行病理学检查。将所取全部脏器放入10％中性福尔马林液中，固定48h后，取材作常规石蜡包埋切片。切片厚度3-4μ，H.E染色，用OLYMPUS BX41型光学显微镜观察组织病理学变化并进行摄影。
结果：见表二。
表二：糖尿病大鼠肾脏的主要病理性改变统计表(百分比)
注：组织学改变程度用-、+、++、+++来表示正常、轻度、中度和重度
PE为胰腺提取物；pHGF为促肝细胞生长素。
从上表的数据可以看出，通过观察肾小管透明变性这个指标，经过PE治疗的糖尿病大鼠，可以显著减轻肾脏的炎症性病变。
结论：PE可以缓解和治疗糖尿病大鼠肾脏的炎症性病变。
4.5糖尿病大鼠眼球的主要病理性改变
测定时间：给药治疗药物129天后。
测定方法：给药结束对存活大鼠行颈椎脱臼法处死，处死后进行大体解剖，取眼球进行病理学检查。将所取全部脏器放入10％中性福尔马林液中，固定48h后，取材作常规石蜡包埋切片。切片厚度3-4μ，H.E染色，用OLYMPUS BX41型光学显微镜观察组织病理学变化并进行摄影。
结果：见表三
表三糖尿病大鼠胰腺和眼球的主要病理性改变统计表(百分比)
白内障是糖尿病的一个典型的临床并发症。大鼠糖尿病模型，随着糖尿病的渐进性发展，最终都会出现眼球病变。从上表中可以看出，在我们观察的实验期限内，模型组和阴性对照组糖尿病白内障的发生率和严重程度，均显著高于PE药物治疗组。
结论：PE可以缓解和阻止实验糖尿病大鼠眼部糖尿病并发症-白内障的发生。
4.6胰腺提取物中胰岛素活性检测
测定时间：2008年12月9日
测定方法：
1.实验共设计三组：
第一组：正常Wistar大鼠5只，每只腹腔注射生理盐水5mL；
第二组：正常Wistar大鼠5只，每只腹腔注射胰腺提取物5mL；
第三组：糖尿病造模成功的Wistar大鼠5只，每只腹腔注射胰腺提取物5mL。
2.8:00a.m.开始撤除饲料，禁食。
3.血糖测定
1)9:00a.m.全部15只大鼠测定随机血糖一次；
2)血糖测定完毕后，立即按照设计方案腹腔注射生理盐水或者胰腺提取物；
3)注射完毕后的1小时、2小时、5小时和7小时分别测定血糖一次。
结果：见表四
表四注射胰腺提取物前后大鼠血糖浓度变化表
注：NS生理盐水，PE为胰腺提取物。
无论正常大鼠还是糖尿病大鼠，在注射胰腺提取物后的一小时左右，出现一个血糖高峰值；从正常大鼠的血糖基线值看，从实验开始到实验结束，血糖趋于不断降低(禁食空腹效应)。如果PE中存在胰岛素，那么，在给实验大鼠(无论正常大鼠还是糖尿病大鼠)腹腔注射PE后，都应该在注射后0.5小时到2小时之间，出现一个血糖动态下降变化的低谷。但是，在本实验中，非但没有观察到血糖下降，相反，在腹腔注射PE后1小时左右，观察到一个较缓的曲线峰。因此，通过本实验，可以看出本药品PE中没有胰岛素。
结论：通过正常大鼠和糖尿病大鼠的活体实验，证实本发明所提取的动物胰腺提取物中没有胰岛素存在。因此，该动物胰腺提取物对糖尿病的作用机理并不依赖于胰岛素。
Claims (3)
1.一种用于防治糖尿病的动物胰腺提取物，其特征在于，是从幼龄小猪的新鲜胰脏中提取的分子量不超过10000道尔顿的小分子量活性物质溶液，提取液为澄清液体，pH值为6.0-7.0，每1ml提取液中含多肽不少于15mg，不含胰岛素。
2.根据权利要求1所述的动物胰腺提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.初处理：对每个小猪胰腺外观、性状目检，不合格者弃去。将合格的小猪胰腺去除脂肪组织后，以纯水洗净至无血水，切碎；
B.匀浆：将切碎的小猪胰腺用注射用水清洗一次，沥去水份，称重，用胶体磨匀浆，将匀浆液和注射用水在25℃以下按质量比为1∶1.1加入高剪切匀浆机中循环5分钟，收集匀浆液，置-10℃以下保存；
C.粗滤：将冻存至少7天的匀浆液取出，流水解冻后，放入水浴中搅拌加热至80-85℃，放入300目滤布自然过滤，收集滤液，置于10℃以下冰水中搅拌冷却，同时滴加碱液调节pH值至6.5±0.5℃，得粗滤液；
D.精滤：将粗滤液过分子量为10000道尔顿的超滤膜，收集超滤液，置于-10℃以下保存；
E.浓缩：将冻存不少于10天的超滤液用自来水解冻，底部残渣用300目滤纸过滤，滤液与上清液合并，然后用分子量10000道尔顿的中空纤维柱进行反渗透浓缩；
F.分装：将浓缩液过分子量为10000道尔顿的中空纤维柱，再过0.22μm的微滤膜除菌，然后分装，得本发明所述的胰腺提取物，置-10℃以下保存。
3.根据权利要求1所述的胰腺提取物用于制备预防与治疗糖尿病的药物的用途。
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Effective date of registration: 20101208 Address after: 510600, Guangdong Province, Yuexiu District, Guangzhou Dongfeng East Road, No. 801 compound 111, 4 doors, 102 rooms Applicant after: Chen Guangming Co-applicant after: Wang Hongmin Co-applicant after: Rao Guirong Co-applicant after: Zhang Haisong Co-applicant after: Yang Fuqiang Co-applicant after: Mo Guoyu Co-applicant after: Xianqiang Pharmaceutical Co., Ltd., Guangdong Co-applicant after: Guangzhou JKTT Co., Ltd. Address before: 510600, Guangdong Province, Yuexiu District, Guangzhou Dongfeng East Road, No. 801 compound 111, 4 doors, 102 rooms Applicant before: Chen Guangming Co-applicant before: Wang Hongmin Co-applicant before: Rao Guirong Co-applicant before: Zhang Haisong Co-applicant before: Yang Fuqiang Co-applicant before: Mo Guoyu |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130123 Termination date: 20181214 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |