CN101701207A - 一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，该培养材料是通过合成N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物，再将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在组织培养用聚苯乙烯板上而得。本发明还公开了上述温度敏感角膜上皮细胞培养材料在培养人角膜上皮细胞中的应用。本发明温度敏感角膜上皮细胞培养材料制备方法制备得到的温度敏感角膜上皮细胞培养材料可塑性好，具有良好的生物相容性，可以支持角膜上皮细胞良好生长，不会引起炎症反应或造成细胞功能损伤，具有良好的临床应用前景。

Description

一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及人工角膜制备领域，具体涉及一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法与应用。

背景技术

角膜疾病是导致眼盲的第二大原因，仅次于白内障。穿透性角膜移植术是主要的治疗方法，但对于重度干眼症、Stevens-Johnson综合症、重度化学烧伤等的预后较差，且面临移植排斥、供体不足等问题。人工角膜的应用和组织工程角膜的研究为角膜疾病患者带来了希望，但角膜的构建材料依然是限制这两种角膜发展的重要因素(邵春益，傅瑶，范先群。组织工程角膜和人工角膜材料研究进展[J].国际眼科纵览，2007，31(1)：29-33)。

人工角膜(keratoprostheses，KPro)自1789年首度提出以来历经了200多年的发展(李娜，周伟，孙恒。人工角膜的研究进展[J].医学综述，2009，15(4)：575-579)，早期使用了不同的光学材料，如水晶、玻璃、赛璐珞、石英等，但它们对于宿主而言是非生物相容的，不能在眼内长期保留。目前的人工角膜主要由两部分组成：中央光学镜柱和周边支架。人工角膜光学镜柱材料多采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)，而周边支架材料较多，包括陶瓷、牙齿、聚四氟乙烯、PMMA、PHEMA等。PMMA由于其透明性、可塑性、抗拉力性及良好的生物相容性被视为一种理想的合成人工角膜光学材料而获得了普遍的应用。聚乙烯共聚水凝胶能耐受手术且能保持其透明性，但因尚未见临床应用报告，目前仅用于软性隐性眼镜和折支架部分材料。虽然在目前看来人工角膜是治疗碱烧伤、天疱疮、Stevens-Johnson综合症的唯一有效的方法，但由于材料的异物性，目前还没有一种人工角膜可以支持角膜上皮细胞的生长，同时严重的并发症如发炎、青光眼、血管化、后增殖膜等也一直困扰着患者，一般只作为最后的选择。

理想的人工角膜应该是一种上皮化的“人工供体角膜”，能像角膜移植术一样被植入。组织工程人工角膜(Tissue Engineering Cornea)是真正意义上的角膜替代物，它试图通过一定的培养技巧让合适的种子细胞良好生长于载体支架，在体外构建出形态、生理功能、生化特性、基因表达近似正常的三维角膜组织。支架材料是细胞增殖的场所，同时引导细胞生长，决定着所构建组织的形态。目前，常用载体材料主要为以下四种：胶原、壳聚糖壳聚糖、羊膜、聚羟基乙酸和聚乳酸，虽各具优点但均存在一定缺点(房兴峰，赵靖，谢立信。组织工程角膜支架材料研究现状[J]眼视光学杂志，2008，28(6)：619-621)：胶原、羊膜、脱细胞角膜基质等生物材料的生物相容性较好，但可塑性欠佳；PGA等合成材料可塑性较好，但会产生酸性降解产物。理想材料的选择一直是制约组织工程角膜发展的瓶颈问题。

聚异丙基丙烯酰胺(poly-N-isopropylacrylamide，pNIPAAm)是一种最典型的温敏性高分子智能凝胶材料。因其独特的温敏性和低临界溶液温度(Lowercritical solution temperature，LCST)与人体体温接近，受到了广泛的关注。早在上世纪就有了关于其温度响应性和临界相变的温度的报道(Hirakata Y，Tanaka T.Volume phase transition in a nonionic gel[J].Chem Phys，1984；81：6379.)。pNIPAAm分子链上同时连有亲水性的酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH₃)₂]，两者之间适当的平衡使pNIPAAm具有适度的溶解度。当水溶液温度低于LCST时，pNIPAAm高分子链与水发生水合而溶于水；当水溶液温度高于LCST时，高分子链脱水化，从水溶液中沉析。通过调节亲水性单体与疏水性单体的共聚比可达到控制pNIPAAm的LCST的目的。NIPAAm凝胶的温敏特性和对细胞无毒性使其成为组织工程中较理想的支架材料。Shimmura等(Shimmura S，Doillon CJ，Griffith M，et al.Collagen-poly(N-lsopropylacrylamide)-based membranes for corneal stroma scaffolds[J].Cornea，2003；22：81-88.)率先将pNIPAAm作为组织工程角膜材料并进行了相关研究：他们将pNIPAAm结合I型胶原构成复合物移植入兔角膜囊袋中，结果表明pNIPAAm-胶原混合物可促进上皮化，促进神经再生，可用于基质板层移植。传统的酶解法脱离支架细胞，只能获得游离的细胞且会使细胞在脱附后生物功能受损。Nishida等(Nishida K，Yamato M，，Hayashida Y，et al.Functional bioengineered corneal epithelial sheetgrafts from corneal stem cells expanded ex vivo on a temperature-responsive cellculture surface[J].Transplantation，2004；77：379-385.)根据pNIPAAm的温度响应性，将其接枝于组织培养用的聚苯乙烯板(PSt)表面，利用温度改变调控细胞黏附/脱附，初步实现了对细胞的保护。之后，该研究小组将剥离的细胞层用于角膜移植，发现细胞层能紧密黏附到角膜基质上，无需缝合。随访180d后，发现移植物还在原位，上皮显示正常的外观，再生的上皮细胞均来自移植的细胞。这种技术使移植过程不需支架，避免了传统组织工程相关的并发症如宿主对植入聚合材料的炎症反应，从而克服了组织工程受生物可降解支架限制的问题，具有良好的临床应用前景。

这项技术在国外(特别是日本)已有一定的研究基础，目前，已有应用于包括角膜、软骨、皮肤、心肌、肾、肝脏等方面的体内外移植的报道(KaneshiroN，Sato M，Ishihara M，et al.Bioengineered chondrocyte sheets may be potentiallyuseful for the treatment of partial thickness defects of articular cartilage[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，349(2)：723-731.；Perng CK，Kao CL，Yang YP，et al.Culturing adult human bone marrow stem cells ongelatin scaffold with pNIPAAm as transplanted grafts for skin regeneration[J].Journal of Biomedical Materials Research A，2008，84：622-630.；Shimizu T，Yamato M，Isoi Y，et al.Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cellculture surfaces[J].Circ Res，2002，90：40-48.；Kushida A，Yamato M，Isoi Y，et al.A Noninvasive transfer system for polarized renal tubule epithelial cell sheets usingtemperature-responsive culture dishes[J].European Cells and Materials，2005，10：23-30.)。该项技术在国内尚属空白，近几年来仅有我国科学家曹谊林教授领衔的国家973项目，通过角膜缘干细胞和角膜基质细胞与可降解生物支架材料在体外构建“活性”兔眼角膜组织，然后移植修复兔角膜缺损，形成了结构完整的透明角膜组织的报道。虽然该项技术已达国际先进水平，但是支架材料在体内降解所引发的移植排斥和并发症等将会限制其进一步发展。

Nishida等是国外免载体细胞培养技术的先驱，但其研究小组使用离子接枝法制备温敏性细胞培养板的成本高昂。区别于离子接枝法，紫外光化学接枝法具有可较严格地控制接枝反应在基材的表面有序进行，不会损坏基材的固有性能，且价格低廉、操作简便等特点。

本申请通过对原有合成条件、紫外光化学接枝条件的改善，尝试用紫外光化学接枝固定化N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物制备温敏性培养皿，使工艺更加简便快捷，成本低，通用性强。并对角膜上皮细胞的吸附及脱附行为进行初步研究，为今后构建新型免载体角膜奠定理论基础。

发明内容

本发明目的在于根据现有技术的不足，提供一种生物相容性好、不会引起炎症反应的，可以支持角膜上皮细胞良好生长的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法。

本发明是另一个目的在于提供上述温度敏感角膜上皮细胞培养材料的应用方法。

一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法是：合成N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物，再将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在聚苯乙烯板上。

其中，上述N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的制备方法如下：

(1)将N-异丙基丙烯酰胺单体和丙烯酸单体按照95∶5的摩尔比例溶于异丁醇，加入链转移剂3-巯基丙酸，通入氮气后，再加入引发剂偶氮二异丁腈，在密封条件下搅拌，进行水浴反应24h；

(2)以甲醇稀释上述反应所得溶液，加入乙醚中沉淀；

(3)用蒸馏水洗涤沉淀2～3次后，风干干燥，得到N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物；

(4)将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物、4-叠氮苯胺盐酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐混合，溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸中，于4℃暗反应30h；

(5)反应结束后，将反应液离心，用MES洗涤沉淀至洗涤液中不含叠氮苯甲酸时，得到N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物。

上述N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的制备方法优选如下方案：

N-异丙基丙烯酰胺单体和丙烯酸单体按95∶5的摩尔比例溶于6ml的异丁醇，并置于三口烧瓶中，同时加入链转移剂3-巯基丙酸和磁力搅拌子。三口瓶与氮气和冷凝管相通，通氮气10min后加入引发剂偶氮二异丁腈，密封水浴反应24h。磁子搅拌转速90R/min，水浴控温60℃。反应后所得的溶液以适量甲醇稀释，滴加到大量的乙醚中沉淀。沉淀以蒸馏水洗涤2-3次后风干干燥，获得温度应答性高分子N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物。将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物(10mg)，4-叠氮苯胺盐酸盐(21.36mg)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(47.92mg)溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸(1ml，0.1Mmol/L，pH5.5)，后移入棕色瓶中4℃暗反应30h。待反应结束后，将反应液40℃离心，用MES(0.1Mmol/L，pH5.5)洗涤沉淀，直至洗涤液中不含叠氮苯甲酸。获得沉淀即N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯衍生物，简称AzPhPIA。

本发明将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在聚苯乙烯板上的方法为：将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物经冰浴溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸中，滴加至聚苯乙烯板上，干燥；125W紫外灯于10cm处照射10min后，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物就固定在聚苯乙烯板上。

上述将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在聚苯乙烯板上的方法中，所用的聚乙烯板优选为24孔板，每个孔中滴加的溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸中的N-丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的体积为20μl。干燥温度优选为4℃。

本发明N-丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物可用于人角膜上皮细胞的培养。具体的，包括如下步骤：

(1)用含体积百分数为15％DMEM高糖培养基悬浮人角膜上皮细胞，接种于接枝有N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的聚苯乙烯培养板孔中；

(2)将聚苯乙烯培养板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的低临界溶液温度为21.5℃，比异丙基丙烯酰胺的低临界溶液温度降低了近10℃，在临床应用中具有更广阔的应用前景；

(2)N-异丙基丙烯酰胺的相变温度在人的生理温度附近且略高于环境温度，将其制成细胞培养用的支架材料，可获得用于移植手术的功能性细胞层。这种免载体细胞培养技术既避免了使用酶解法脱附细胞造成的细胞功能损伤，又打破了传统生物材料的限制，推动了组织工程角膜研究的发展；

(3)将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在聚苯乙烯板的孔中培养人角膜上皮细胞72h后，细胞能大面积贴附、铺展。生长状况良好，表明经固定N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的培养板具有良好的生物相容性，不会导致炎症反应。

附图说明

图1为N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酸、3-巯基丙酸、偶氮二异丁腈和N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的HPLC图谱，其中，NPIAAm为N-异丙基丙烯酰胺；AAc为丙烯酸；AIBN为偶氮二异丁腈；MPA为3-巯基丙酸；PIA为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸；

图2为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物和4-叠氮苯胺盐酸盐的红外图谱，其中，NIPAAm为N-异丙基丙烯酰胺；PIA为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸；AzPhPIA为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物；4-Azidoaniline为4-叠氮苯胺盐酸盐；

图3为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸水溶液在0～60℃区间内的相变过程，其中，A为0℃，B为10℃，C为20℃，D为30℃，E为35℃，F为40℃，G为50℃，H为60℃；

图4为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物水溶液在不同温度下的相变过程，其中，A为0℃，B为10℃，C为20℃，D为30℃，E为40℃，F为室温；

图5为N-异丙基丙烯酰胺水溶液在不同温度下的相变过程；

图6为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸在不同温度下的相变过程；

图7为N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在不同温度下的相变过程；

图8为N-异丙基丙烯酰胺接枝层聚合物在不同温度下，接枝培养板表面的接枝链状态照片(放大倍数：40×)，其中，A是温度为4℃时的状态，B是温度为37℃时的状态；

图9为人角膜上皮细胞的吸附和脱附照片，其中，A是细胞吸附时的细胞形态，B是细胞自发的从培养板表面脱附的形态。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1N-聚异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的结构表征

制备N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的反应是自由基聚合反应，一旦引发就进行得较彻底，单体残留量很少。加之，在实验过程中严格控制单体反应比例，并采用甲醇稀释，乙醚沉淀的方法精制，除去未反应的单体、引发剂和链转移剂，所以可基本排除反应物残留对检测结果的影响。使用日本岛津LC-6A高效液相色谱仪检测反应物(N-异丙基丙烯酰胺单体、丙烯酸、3-巯基丙酸、偶氮二异丁腈)和生成物(N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸)。高效液相色谱分析条件：在室温下用7125手动进样器以10μl的进样量使样品通过迪马ODS(150×4.6mm)色谱柱，流动相为10mm磷酸二氢钾∶甲醇＝90∶10(pH3.0)，流动相流速为1ml/min，用SPD-6AV紫外可见光检测器以214nm检测并记录结果。

通过对比分析(图1)可知，产物N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸在t_R＝11.494min处存在1个较强吸收峰，峰面积达92％，与反应物丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺单体、3-巯基丙酸及偶氮二异丁腈的保留时间不一致。同时，由于使用的是反相柱，样品极性越大保留时间越短。丙烯酸带有强极性的羧基，它的引入使N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的极性增大，保留时间缩短。但由于在聚合体系中丙烯酸仅占5％(N-异丙基丙烯酰胺单体和丙烯酸按95/5摩尔比例聚合)，聚合体系的极性性质仍由含量较多的N-异丙基丙烯酰胺单体决定，预测N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的t_R值应更趋近于N-异丙基丙烯酰胺单体的t_R值。检测结果与理论预测结果一致，可以初步判定N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的成功合成。

由图2可知，N-异丙基丙烯酰胺单体的红外图谱中3301cm^-1为N-H伸缩振动峰；3073cm^-1处为次强酰胺带的倍频收缩振动峰；位于1658cm^-1的强谱带是由酰胺的羰基伸缩振动引起，即所谓酰胺I带。次强谱带位于1550cm^-1处的酰胺II带是由N-H弯曲振动和C-N伸缩振动的组合吸收，位于1246cm^-1的谱带是由C-N-H振动产生，称为酰胺III带，所以可以知道有酰胺键存在。2971cm^-1、2935cm^-1及2877cm^-1处为甲基及亚甲基的C-H收缩振动峰；1455cm^-1、1410cm^-1为N-CH(CH₃)₂上CH₃的对称变形振动峰，1387cm^-1及1368cm^-1为异丙基上双甲基由于对称变形振动耦合分裂成的双峰。N-异丙基丙烯酰胺单体、N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸以及N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在这几个区域基本相同，可见聚合物的分子结构中都由亲水的酰胺基(-CONH₂)、疏水的异丙基-CH(CH₃)₂构成。C＝C伸缩振动吸收发生在1660-1600cm^-1，共轭使C＝C伸缩振动吸收峰向右移动，强度增大，出现在1622cm^-1处，从而证明了CH₂＝CH-的存在^[12]。将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的红外图谱与N-异丙基丙烯酰胺的红外图谱进行对比，发现在指纹区属于C＝C的伸缩振动峰(1923cm^-1)和弯曲振动峰(992cm^-1、964cm^-1、715cm^-1)^[15]均消失，表明已发生了加成反应。结合HPLC的检测结果可进一步判定N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的成功合成。

通过对比N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸、N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物和4-叠氮苯胺盐酸盐的红外光谱图，可知N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的红外光谱与N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的基本吻合，仅在2119cm^-1处出现差异。同时，4-叠氮苯胺盐酸盐在2126cm^-1处出现了强吸收峰，表明N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在2119cm处出现的吸收峰是-N₃的特征吸收峰，归属于-N₃的不对称伸缩振动，而吸收峰数值上的差异排除了未反应完全的叠氮苯甲酸对实验结果造成的影响，证实N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物已成功接上了叠氮基，具有光敏活性。

实施例2N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物材料的温敏性质及浊度

图3反映了N-异丙基丙烯酰胺在0-60℃区间内发生相转变过程。N-异丙基丙烯酰胺的水溶液在30℃以下基本透明，随温度升高开始发生浑浊，亦即发生了相分离现象，随温度的进一步增加，其浑浊程度逐渐增大，直到40℃左右混浊度达到稳定。当温度重新下降到30℃时，浑浊的溶液能重新变透明，可见其L℃ST在30-35℃区间内。由于N-异丙基丙烯酰胺分子主链上连有羧基，具有强亲水性，使其溶液在N-异丙基丙烯酰胺侧链发生相分离后只是发生浑浊，而不产生沉析，侧链相分离的结果导致接枝聚合物分子链间的物理缔合^[16]。

由图4可知在0-10℃，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物为黄褐色均一透明溶液。当温度升高到20℃时，溶液变浑浊。继续升高温度至30℃，开始出现淡黄色的沉淀。当温度达到40℃时，沉淀开始凝集，溶液变清，颜色变浅。室温放置一段时间，沉淀不溶解，且凝结成团状。逆温度梯度操作，沉淀重新溶解，反应过程可逆。表明N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物有较好的温敏性，其LCST在20℃附近。

随温度改变N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的水溶液出现透明-浑浊转变，而N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的水溶液则表现为透明-沉淀转变，这是由于在合成N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物时，原结构中的羧基已和4-叠氮苯胺盐酸盐发生反应，故其水溶液在发生相转变时产生沉析。在整个试验过程中，装有N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物水溶液的离心管底部始终有少量褐色颗粒状物质。此物质基本不受温度改变的影响，可能是在合成过程中，由于反应所需时间较长(约为30h)，单体浓度较低，聚合速率较慢，单体发生了均聚反应。

图5～7中，N-异丙基丙烯酰胺在2-(N-吗啉基)乙磺酸溶液中的LCST为30℃，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的LCST升到32℃。聚合物N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的LCST有所回落，降至21.5℃。相关研究表明，N-异丙基丙烯酰胺类聚合物的LCST与溶剂的组成等相关，而几乎与聚合物的分子量及浓度无关，更重要的是，LCST强烈依赖于聚合物自身的组成成分，即参与共聚单体的亲水/疏水组分含量。这是因为，在水溶液中，N-异丙基丙烯酰胺分子中存在两种作用力：①羰基和亚胺基与周围水分子的氢键作用力(亲水作用力)；②异丙基间的疏水缔合作用(疏水作用力)。低温时氢键起主要作用，表现为N-异丙基丙烯酰胺溶于水；温度升高时，氢键被破坏，疏水力逐渐起主要作用，当到达其LCST之上时，其分子链与水发生相分离，由溶解状态的线团型转变为坍陷的球型，导致N-异丙基丙烯酰胺析出。

当在N-异丙基丙烯酰胺分子链中引入其它单体结构单元时，亲水作用力与疏水作用力的相对大小会发生变化，LCST也会发生变化。实验中聚合物PIA的LCST较N-异丙基丙烯酰胺的高。这是因为丙烯酸是很强的亲水性单体，它的加入，使得共聚物分子链与水分子间形成氢键的能力增强，导致氢键力大于疏水力，引起LCST升高。而合成聚合物N-异丙基丙烯酰胺时，分子结构中亲水性的羧基与4-Azidoaniline发生反应，同时引入了疏水性的叠氮基，使得聚合物与水分子形成的氢键数目降低，故而表现为LCST的降低。本次实验结果与前人研究成果相一致。

实施例3经固定N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的培养板的温敏性测试

制备温敏性聚苯乙烯培养板时，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物溶液按20μl/well加样，10℃干燥。在紫外光化学接枝反应整个过程中需保证实验温度始终低于N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的LCST(21.5℃)。低浓度加样是因为单体浓度过高，会导致均聚反应增加，链终止反应增多，使接枝率下降。干燥后反应是由于含偶氮生色团单体对紫外光的吸收非常强烈，采用通常的液相接枝的方法不能得到接枝膜。保持反应温度始终低于N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的LCST，是因为高于LCST时，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物开始由亲水性向疏水性转变，不利于均相接枝反应。

接枝培养板表面形态结构随温度变化而改变的这种特异性是由于聚合物N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在温度高于或低于LCST时表现出的疏水或亲水行为引起的。将由于水温处于N-异丙基丙烯酰胺接枝层聚合物的LCST以下，聚合物分子链亲水，接枝培养板表面的接枝链处于自由舒展的状态，分子链在膜表面呈无规律分布，如图8(A)所示。当培养板被置于高于LCST的温度下干燥时，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物分子链由亲水变成疏水，接枝链因疏水作用而互相聚集。随着水分的蒸发，接枝链在膜表面的这种形态结构也随之被保留下来。从图8(B)可清楚观察到接枝培养板表面的变化。

实施例4人角膜上皮细胞的吸附与脱附行为研究

体外传代培养72h后，使用倒置显微镜观察细胞形态，由图9(A)可知，37℃下人角膜上皮细胞在培养板表面生长状况良好，已经大面积贴附、铺展并汇集成片，证明制备的温敏培养板具有良好的细胞相容性。将培养板置于冰箱中，使温度从37℃降至15℃左右，静置30min后向种植有细胞的培养孔中滴加PBS(1-2ml)并使用倒置显微镜观察。设置的空白对照，降温前后无明显变化。接枝有材料的板孔，细胞自发的从培养板表面脱附，见图9(B)。这是因为降温前后聚乙烯板表面性质无改变，而N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在低于LCST时高分子链由聚集态转向伸展态，表面性质由疏水转向亲水，削弱了细胞之间的粘合力，使细胞自发脱附。就材料对细胞的剥离效果而言，边缘区域较中央区域的效果理想。这是因为加样干燥时，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物在聚乙烯板表面分布不均匀，中间浓度较高而边缘浓度较低。在紫外光化学接枝反应时，材料边缘的单体浓度适中，叠氮基经激发成为活泼的自由基，迅速夺取聚乙烯板表面C-H键上的H，通过N-C键固定在聚苯乙烯板上。材料中间部分可能因单体浓度过高而发生均聚反应，造成温敏性的降低或完全丧失。使细胞难以自发脱附。

Claims (10)

1.一种温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述制备方法是：合成N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物，再将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在组织培养用聚苯乙烯板上。

2.根据权利要求1所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的合成方法如下：

(1)将N-异丙基丙烯酰胺单体和丙烯酸单体按照95∶5的摩尔比例溶于异丁醇，置于三口烧瓶中，同时加入链转移剂3-巯基丙酸和磁力搅拌子，三口烧瓶与氮气和冷凝管相通，通入氮气10min后，再加入引发剂偶氮二异丁腈，在密封条件下搅拌，进行水浴反应24h；

(2)以甲醇稀释上述反应所得溶液，加入乙醚中沉淀；

(3)用蒸馏水洗涤沉淀2～3次后，风干干燥，得到N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物；

(4)将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物、4-叠氮苯胺盐酸盐和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐混合，溶于2-(N-吗啉基)乙磺酸中，于4℃暗反应30h；

(5)反应结束后，将反应液离心，用MES洗涤沉淀至洗涤液中不含叠氮苯甲酸时，得到N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物。

3.根据权利要求2所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述搅拌转速为90R/min，水浴反应的温度为60℃。

4.根据权利要求2所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的质量为10mg，4-Azidoaniline的质量为21.36mg，WSC的质量为47.92mg。

5.根据权利要求1所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物通过紫外光化学接枝法固定在聚苯乙烯板上的方法为：将N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物经冰浴溶于MES中，滴加至聚苯乙烯板上，干燥；125W的紫外灯在10cm处照射10min后，N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物就已固定在聚苯乙烯板上。

6.根据权利要求5所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述聚苯乙烯板为组织培养用聚苯乙烯24孔板，每个孔中滴加的溶于MES中的N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的体积为20μl。

7.根据权利要求2或5所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述MES的用量为pH5.5，浓度为0.1Mmol/L的1ml MES。

8.根据权利要求5所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法，其特征在于所述干燥温度为4℃。

9.权利要求1所述温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法制得的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的应用，其特征在于所述温度敏感角膜上皮细胞培养材料用于培养人角膜上皮细胞。

10.根据权利要求9所述的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的制备方法制得的温度敏感角膜上皮细胞培养材料的应用，其特征在于培养人角膜上皮细胞包括如下步骤：

(1)用含体积百分数为15％DMEM高糖培养基悬浮人角膜上皮细胞，接种于接枝有N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸的叠氮苯胺衍生物的聚苯乙烯培养板孔中；

(2)将组织培养用聚苯乙烯培养板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

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