CN101696419A - 一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法 - Google Patents

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张爱联
屠发志
易国辉
屈直
张添元
罗进贤
崔艳艳
张泽华
马德勇
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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体是一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，首先对系列酶基因进行扩增，分别构建由pGAP调控的酿酒酵母表达载体，并转化为酿酒酵母基因组；经验证、筛选后得到酿酒酵母工程菌；将植物或植物废弃物于高温下用稀酸进行浸泡预处理后，应用所构建的酿酒酵母工程菌于28-30℃进行发酵生产乙醇。本发明采用了在构建酿酒酵母工程菌的同时进行同步糖化、转化的方法，省略了传统工艺中需要生产的系列酶的过程，在较大的程度上降低乙醇的生产成本，有利于大规模利用植物及其植物废弃物的纤维素和半纤维素生产乙醇。

Description

一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种将葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶重组于酿酒酵母基因组，然后利用酿酒酵母基因组，以植物的纤维素和半纤维素为原料生产乙醇的方法。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常应用的酒精生产菌，但是它只有代谢葡萄糖生成乙醇的酶系。目前利用植物纤维素是先加入系列纤维素酶使纤维素分解生成葡萄糖，然后再应用酿酒酵母菌的代谢作用将葡萄糖转化生成乙醇。植物材料中约含20-30％的半纤维素，半纤维素主要由D-木糖和L-阿拉伯糖(L-树胶醛糖)组成，在系列酶的作用下D-木糖和L-阿拉伯糖能转化为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛，然后再应用酿酒酵母菌的代谢作用将6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛转化生成乙醇。但是系列纤维素酶(葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶)转化木糖和阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛所需的系列的酶(转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶)的生产需要消耗大量的人力、物力和能源，使目前纤维素和半纤维素乙醇的生产成本过高，从而制约了利用植物及其植物的废弃物的纤维素和半纤维素生产乙醇产业的发展。
发明内容
本发明的目的是解决在利用植物物质的纤维素和半纤维素生产乙醇过程中，需添加的酶的生产成本高，使纤维素乙醇和半纤维素乙醇的生产成本高的问题，为植物的纤维素和半纤维素生产乙醇提供一种用酿酒酵母工程菌同步糖化纤维素生产乙醇和同步转化D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素的主要成分)生产乙醇的方法。
本发明所采用的技术方案：
一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其步骤如下：
1、从里氏木霉(Trichoderma ressiei)基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因；
2、分别构建由pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组(重组子)；
3、用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模版，进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组；
4、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出1.2μ/ml以上的酿酒酵母为工程菌；
5、将植物或植物废弃物于160～300℃的温度下用0.1％～3％的酸溶液(pH＜1)进行浸泡处理，分解得到木质素，并分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿拉伯糖)；所述酸是盐酸、硫酸或磷酸。
6、以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于28～30℃进行发酵生产乙醇。
本发明采用了直接利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，本发明的优点在于：
由于采用了同步糖化纤维素生成葡萄糖和将葡萄糖酵解生成酒精，以及同步转化构成半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛而进行酵解生成乙醇的方法，省略了需要生产成本高的系列纤维素酶(葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶)和转化木糖和阿拉伯糖为6-磷酸葡萄糖或3-磷酸甘油醛系列的酶(转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶)的生产，能够在较大的程度上降低利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的成本。
具体实施方式
下面才用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
1.从里氏木霉(Trichoderma ressiei)基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因。
2.分别构建由pGAP调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组；
3.用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模版，进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组。
4.用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出1.2μ/ml以上的酿酒酵母为工程菌。
5.将植物茎叶于280℃的温度下用0.3％的硫酸溶液进行浸泡处理，使分解木质素，分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿拉伯糖)。
6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于28℃进行发酵生产乙醇。
实施例二
本实施例的第一、第二、第三、第四步骤与实施例一相同。
5.将植物废弃物于210℃的温度下用1.8％的盐酸溶液进行浸泡处理，使分解木质素，分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿拉伯糖)。
6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于30℃进行发酵生产乙醇。
实施例三
本实施例的第一、第二、第三、第四步骤与实施例一相同。
5.将植物废弃物于180℃的温度下用2.7％的磷酸溶液进行浸泡处理，使分解木质素，分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖(半纤维素经预处理水解生成D-木糖和L-阿拉伯糖)。
6.以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于30℃进行发酵生产乙醇。

Claims (2)

1.一种利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其特征在于，其步骤如下：
1)、从里氏木霉基因组中扩增葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因；从大肠杆菌基因组中扩增转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶和L核酮糖激酶基因；
2)、分别构建由pGAP调控葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶基因的酿酒酵母表达载体，并将这些载体转化酿酒酵母基因组；
3)、用PCR方法扩增目标基因验证重组子：分别合成葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶、转醛醇酶、转羟乙醛酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶、L-树胶醛糖异构酶、L核酮糖激酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母基因组DNA为模版，进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组；
4)、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出1.2μ/ml以上的酿酒酵母为工程菌；
5)、将植物或植物废弃物于160～300℃的温度下用0.1％～3％的酸溶液进行浸泡处理，分解得到木质素，并分离出纤维素、D-木糖和L-阿拉伯糖；
6)、以纤维素和来自半纤维素的D-木糖和L-阿拉伯糖为原料，应用所构建的酿酒酵母工程菌于28～30℃进行发酵生产乙醇。
2.根据权利要求1所述的利用植物纤维素和半纤维素生产乙醇的方法，其特征在于：所述酸是盐酸、硫酸或磷酸。
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