CN101687908A - 类风湿性关节炎特异性自身抗体的抗原决定簇及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有通式(III)的二肽抗原决定簇，其中通过肽键连接半抗原Cit和Cys残基；其中A为－NH₂，B为－O－，D为－NH－，F为－NHCO－或－NR－，其中R为氢或酰基，G为－CONH－或－COOR，其中R为烷基，E为(CH2)_n’，其中n’为1至6的整数，S为－SH或当Cys的自由巯基(SH)通过二硫键与另一Cys交联时，S为－SS－。所述抗原决定簇灵敏且特异地与存在于患有类风湿性关节炎(RA)的患者的血清中的自身抗体反应，这可用于诊断或治疗RA。

Description

类风湿性关节炎特异性自身抗体的抗原决定簇及其用途

发明领域

本发明涉及来源于自身抗原的抗原决定簇的成分和序列及其在类风湿性关节炎(RA)的诊断、预防和治疗中的应用，所述自身抗原由患有类风湿性关节炎的患者的自身抗体识别。

发明背景

RA是病因不明的慢性炎症性自身免疫疾病。尽管已有几种治疗RA的治疗方法，但是目前没有治愈的病例。RA影响全世界约1％的人群，影响2％的年龄为65岁或更老的成人。RA可以发生在任何年龄，并且在女性中的流行比在男性中更常见，女性比男性约高3倍。RA是表现出长期预后不良的疾病。统计数字表明，80％的患者20年后身体是残疾的，并且预期寿命平均减少了3至18年。

RA是残疾、发病和死亡的主要原因。RA的特征为导致软骨和骨的累进性缺损的滑膜关节的对称性炎症。该过程通过沿着所谓的血管翳攻击软骨并通过募集破骨细胞侵蚀下面的骨。另外还侵袭腱和其它身体部分。由于受损的关节通常是不可修复的，这经常导致永久性失能(incapacitation)。对于大部分未治疗的RA患者，在2年内发生不可逆的关节损伤。

就个人、社会和经济成本而言，RA的影响巨大。最近的研究表明每一患者的平均年医疗费用在美国为$6300 USD，在加拿大为$6800CND，在德国为

4700以及在英国为￡2700。目前RA护理的全年总费用在加拿大为约20亿美元，在美国约为180亿美元；该数字预期在老年群体中明显增加。

亟需开发特异性治疗RA并具有最少的不良事件和成本的药物的新思路。对于RA发病机理，传统模式(paradigm)认为CD4+T细胞既直接地又通过驱动非T效应器细胞释放炎症细胞因子介导关节损伤。缓解疾病的抗风湿药物(DMARD)是治疗RA的主要药物，然而，它们面临疗效有限、毒性问题或这两者。诸如TNFα拮抗剂的基于生物制剂的介入性治疗已经表现出明显的抗炎作用，然而所述药物的使用有严重的风险。这样治疗的RA患者仅有约60-70％表现出ACR20应答(定义为RA患者对药物应答时所实现的最低限度的可接受应答)。生物制剂的成本是DMARD成本的约2至7倍，然而，这些治疗都不能有效地阻断疾病进展。

作为治疗的“金标准”，金类药物用于治疗RA以延缓并有时缓解该疾病已经超过78年。金抗关节炎活性的机制基于T细胞和半胱氨酸(Cys)蛋白酶尤其是组织蛋白酶的活性位点的靶向失活，其通过在金与受影响的抗原肽和组织蛋白酶的Cys巯基之间形成螯合物实现。在RA的滑膜和滑液中都检测到了直接促进炎症以及软骨和骨的降解的高表达的组织蛋白酶。组织蛋白酶的活性与诸如白细胞介素-1β(IL-1β)和TNFα的炎症细胞因子的浓度显著相关。组织蛋白酶抑制剂的早期临床数据显示其对RA护理可能是有效的。通过修饰巯基部分选择性抑制组织蛋白酶有可能导致开发治疗RA的新化学疗法。通过诸如Apotex、AstraZeneca、Aventis、Bayer、Bochringes Ingelheim、Celera Genomics、GlaxoSmithKline、Merck和Novartis的制药公司的巨大关注，已经推进了组织蛋白酶抑制剂设计和合成的进程。

RA发病机理的新模式集中在B细胞与CD4+T细胞之间的相互作用。基于抗CD20利妥昔单抗(rituximab)的B-淋巴细胞消减(BLyD)治疗具有对RA患者的治疗潜力。BlyD使得B细胞在几天内消失，但是临床改善和自身抗体下降可以持续长达9个月。根据病例报告、开放式初步研究以及随机、双盲、安慰剂对照试验中的报道，依照ACR50-70标准(定义为RA患者对药物应答时所实现的良好和极佳的应答)，观察到了长达1年的具有显著改善的持续临床应答。与DMARD甲氨喋呤或环磷酰胺联用的Blyd看起来是顽固性RA的合理治疗选择。这些阳性应答与C反应蛋白及包括所有类型的类风湿因子(RF)和第二代抗环瓜氨酸肽(抗CCP2)在内的自身抗体水平的大幅度减少有关。来自RA患者的记忆B细胞比来自正常对照的记忆细胞对利妥昔单抗更敏感。从RA患者中观察到了可能促进自身免疫发展的缺陷的B细胞耐受核查点。RA的临床病变可能是抗体介导的，并且BlyD阻止从B细胞的补充。RA病理学中的B细胞定型的定性或定量差别可能在观察到的不同应答中起作用。BlyD的效应有助于增加对下述观点的支持：RA中的炎症效应器机制和基本的免疫调节失调都由自身抗体而不是T细胞驱动。这种认识代表了理解RA的发病机理的明显进步。稀少的致病B细胞亚型的产生可能是RA发病机理的限速步骤。

尽管BlyD显示出良好的前景并且揭示了疾病的机制，但仍缺少常规使用的长期策略。因为BlyD治疗可以诱发低丙种球蛋白血症和严重的感染，所以即便在具有持续益处的情况下，利用经常重复的BlyD维持长期消减不大可能是可行的选择。鉴定驱动RA的发病机制的相关抗原对于形成基于抗原的免疫介入(immunointervention)，例如耐受化疫苗(tolerizing vaccine)是很关键的。优选通过抗体诱导自身免疫B细胞的死亡，并且完全确定施用所述抗体不会诱导或召回(recall)致病应答。特异性阻止疾病中的自身反应B细胞存活的小分子应该提供有效和低成本的RA治疗。作为巯基阻断剂的硫代苹果酸金盐(goldthiomalate)是用于RA的理想药物，因为它能诱导完全和永久的缓解，但问题是它很少实现这一效果并且更经常产生毒性有理由认为，如果我们了解如同金类的药物是如何真正地发挥作用的，应该不可能将其毒性与疗效分开。希望靶向致病B细胞克隆的策略的进一步开发将这种情况扩展至RA真正的长期缓解的最初目标是合理的。

已经提出在疾病症状出现的前3个月内存在“治疗时机窗”。适时地介入对于预防不可逆的关节损伤是关键的，并且在RA的最早期的积极治疗能明显地改善其医疗和经济结果。

利用患有确定的RA(平均疾病持续时间接近8年)的患者建立了美国风湿病学会(ACR)的1987年RA分类标准，其灵敏度为91％，特异性为89％。在临床实践中通常通过存在7个标准中的至少4个来确定RA，其中临床标准1至4必须存在超过6周。这些ACR标准在早期RA中通常不明显。RF是仅有的包括于ACR标准的血清标志物。RF可以在50-80％的RA血清中检测到，但是它经常存在于健康个体(特别是老年个体)和患有感染和其它自身免疫疾病的患者中。利用RF测试诊断RA不是最理想的。风湿病学家利用ACR标准来确定RA已经数十年了，但是由于ACR标准在早期RA中的有限效果，其仍然是不适当的。

亟需新标准从对确定的RA进行分类转变到对预计变成持久性和侵蚀性疾病的早期RA进行分类。新标准应当包括在早期阶段高度特异和灵敏地检测RA的可靠血清标志物。新测量将明确诊断早期RA，并能增强对疾病结果的预后。

最近发现结合瓜氨酸化蛋白/肽(CP)的自身抗体为RA的高特异性诊断标志物，这使RA患者的早期血清诊断评价发生了变革，并且代表了实现该目标的第一个可商购的检测。涉及瓜氨酸化的自身蛋白翻译后修饰被认为是生成对产生的RA特异性抗体进行应答的新表位的关键步骤。内源肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)酶催化肽基精氨酸转变成肽基瓜氨酸。非编码氨基酸瓜氨酸(Cit)被认为是蛋白质通过脱亚胺获得抗原性的新表位。

随着对蛋白质瓜氨酸化的免疫学发现，已经报道PADI4与RA之间的遗传关系在日本和韩国人群中有联系。但是，该联系在白种人、西班牙和英国人群中没有再现。在白种法国人群中的基于家族的研究也没有表现出PADI4与RA之间的联系。没有发现PADI4基因与严重度之间的联系的证据，所述严重度是通过侵蚀性结果或炎性多关节炎患者中存在抗瓜氨酸化抗原的抗体来评估的。

CP的抗体在发炎的滑膜局部产生，PADI2和PADI4也位于滑膜组织内。这些发现表明关节内和关节外蛋白质的局部瓜氨酸化可能是导致RA中产生自身抗体的初始事件。源自下述的CP被认为是候选自身抗原：滑膜组织或关节中的α-烯醇化酶(α-erolase)、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维粘连蛋白和波形蛋白，上皮组织中的角蛋白、核周因子和丝聚蛋白，软骨特异性胞外基质中的I型和II型胶原蛋白(CI、CII)以及EBV感染的B淋巴细胞和口咽部上皮细胞的病毒肽。除了这些，瓜氨酸化的无孢蛋白、组织蛋白酶D、β-肌动蛋白、CapZα-1、白蛋白、真核翻译起始因子4、组胺受体、蛋白质二硫键异构酶(PDI)ER60前体、线粒体乙醛脱氢酶(ALDH2)以及Spα(CD5抗原类蛋白)受体被鉴定为RA中候选瓜氨酸化自身抗原。RA患者可视化的990种滑膜蛋白中，用蛋白质组学方法鉴定的51种(5.2％)是瓜氨酸化的。990个蛋白点中的94个(9.5％)与RA血清反应。有趣地是，这94个RA血清反应点中的30个(31.9％)是CP，并且上述51个CP中的30个(58.8％)是RA血清反应的。但是，研究者到目前为止未能证明CP作为驱动抗原诱导试验小鼠关节炎模型的致关节炎性(arthritogenicity)和自身免疫性。在存在佐剂的条件下，用CP免疫小鼠时，观察到升高的免疫原性和致关节炎性，并且研究的小鼠中没有一个发展为关节炎。然而，在胶原蛋白诱导的关节炎中，线性瓜氨酸化肽(LCP)耐受小鼠显示了与对照相比明显降低的疾病严重性和发病率。从RA患者和对照患者的滑膜组织的任何滑膜炎中都观察到了瓜氨酸化的纤维蛋白。HL-60粒细胞中有组蛋白和核仁磷酸蛋白(nucleophosmin)/B23的瓜氨酸化，并且表皮和血浆中有角蛋白和抗凝血酶的瓜氨酸化。在患有RA相关的IP的患者、患有IP的患者和对照患者的肺样本中检测到了瓜氨酸化。在患有阿尔茨海默氏病(Alzheimers disease)患者的海马提取物中检测到了异常的聚集的CP。在试验型自身免疫脑脊髓炎的发展期间观察到了髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化。瓜氨酸化的脑蛋白与脑多发性硬化的病理生理学有关。在波曼氏囊(Browmans capsule)和梗阻性肾病中也发现了CP。因此，瓜氨酸化是自身蛋白翻译后修饰的普遍现象。瓜氨酸化对于诱导产生RA特异性抗体的自身免疫应答是关键的但不是必需的。瓜氨酸化不能诱导产生RA无关抗体的自身免疫应答。对瓜氨酸化在自身抗原的免疫原性中的特征了解甚少。涉及诱导RA特异性抗体的含有Cit的自身抗原的来源仍然是不清楚的。

基于用于检测RA特异性抗体的捕获抗原，已将RA特异性抗体分为抗CP(抗来自α-烯醇化酶、CI、CII、纤维蛋白、丝聚蛋白、角蛋白、核周因子或波形蛋白的CP的抗体)、抗LCP(抗来自丝聚蛋白原、丝聚蛋白、CI、CII或EBV核抗原的LCP的抗体)、抗CCP1(抗来自丝聚蛋白的单一CCP的抗体)以及抗CCP2(抗来自肽库的与已知蛋白质非同源的人工CCP的抗体)。抗CP测试显示了低灵敏度(46％)下的高特异性(约100％)(n＝8941)(Palosuo等人，1998；Hayem等人，1999；Vincent等人，1999；Forslin等人，2000；Goldbach-Mansky等人，2000；Menard等人，2000；Nogueira等人，2001；Bas等人，2002；Vincent等人，2002；Meyer等人，2003；Saraux等人，2003；Suzuki等人，2003；Suzuki等人，2003；Vencovsky等人，2003；Dubucquoi等人，2004；Grootenboer-Mignot等人，2004；Vittecoq等人，2004；Auger等人，2005；Boire等人，2005；Greiner等人，2005；Kinloch等人，2005；Nielen等人，2005；Suzuki等人，2005；Chen等人，2006；Dejaco等人，2006；Hill等人，2006；Lopez-Longo等人，2006；Matsuo等人，2006；Rodriguez-Mahou等人，2006；Tian等人，2006；VanderCruyssen等人，2006；Yoshida等人，2006；Agrawal等人，2007；Coenen等人，2007)。当使用天然来源或化学合成的LCP作为捕获抗原时，检测到了类似的特异性(约100％)和灵敏度(48％)(n＝3668)(Schellekens等人，1998；Girbal-Neuhauser等人，1999；Schellekens等人，2000；Union等人，2002；De Rycke等人，2004；Dubucquoi等人，2004；Hoffman等人，2004；Low等人，2004；Burhardt等人，2005；Koivula等人，2005；Merlini等人，2005；Anzilotti等人，2006；Koivula等人，2006；Pratesi等人，2006；Vander Cruyssen等人，2006；VanderCruyssen等人，2007)。与其LCP对应物相比，利用CCP明显地增加灵敏度而不牺牲特异性，抗CCP1在特异性约为100％时，灵敏度为53％(n＝2948)(Goldbach-Mansky等人，2000；Kroot等人，2000；Schellekens等人，2000；Bizzaro等人，2001；Bas等人，2002；Jansen等人，2002；Vincent等人，2002；Bas等人，2003；Jansen等人，2003；Meyer等人，2003；Saroux等人，2003；Vencovsky等人，2003；Zeng等人，2003；Feng等人，2004；van Gaalen等人，2005；Vander Cruyssen等人，2006)，并且抗CCP2在特异性约为100％时，灵敏度为66％(n＝19385)(Lee等人，2003；Pinheiro等人，2003；Suzuki等人，2003；Alessandri等人，2004；Berglin等人，2004；Bobbio-Pallavicini等人，2004；Bombardien等人，2004；Bongi等人，2004；Correa等人，2004；De Rycke等人，2004；Dubucquoi等人，2004；Forslind等人，2004；Girelli等人，2004；Grootenboer-Mignot等人，2004；Hitchon等人，2004；Kasapcopur等人，2004；Kastbom等人，2004；Lopez-Hoyos等人，2004；Low等人，2004；Mikuls等人，2004；Soderlin等人，2004；Solanki等人，2004；Vallbracht等人，2004；van Gaalen等人，2004；Vittecoq等人，2004；Aotsuka等人，2005；Boire等人，2005；Burkhardt等人，2005；Caramaschi等人，2005；Choi等人，2005；Dubrous等人，2005；Fernandez-Suarez等人，2005；Gao等人，2005；Garcia-Berrocal等人，2005；Greiner等人，2005；Hiura等人，2005；Huizinga等人，2005；Irigoyen等人，2005；Kamali等人，2005；Koivula等人，2005；Kwok等人，2005；Limaye等人，2005；Lindqvist等人，2005；Mu等人，2005；Nakamura等人，2005；Nell等人，2005；Nielen等人，2005；Quinn等人，2005；Raza等人，2005；Ronnelid等人，2005；Samanci等人，2005；Sauerland等人，2005；Shovman等人，2005；Sihvonen等人，2005；Spadaro等人，2005；Tampoia等人，2005；Tobon等人，2005；van der Helm-van Mil等人，2005；van Gaalen等人，2005；Verpoort等人，2005；Alenius等人，2006；Ates等人，2006；Atzeni等人，2006；Benucci等人，2006；Berglin等人，2006；Braun-Moscovici等人，2006；Caspi等人，2006；Ceccato等人，2006；Chen等人，2006；Dejaco等人，2006；del VaI del Amo等人，2006；Hill等人，2006；Inane等人，2006；Johansson等人，2006；Koivula等人，2006；Korkmaz等人，2006；Linn-Rasker等人，2006；Lopez-Longo等人，2006；Matsui等人，2006；Mewar等人，2006；Meyer等人，2006；Mikuls等人，2006；Panchagnula等人，2006；Pedersen等人，2006；Pierer等人，2006；Redaitene等人，2006；Rodriguez-Mahou等人，2006；Russell等人，2006；Shankar等人，2006；Spadaro等人，2006；Tamai等人，2006；vander Cruyssen等人，2006；van der Helm-van Mil等人，2006；Agrawal等人，2007；Coenen等人，2007；Forslind等人，2007；Inane等人，2007；Kaltenhauser等人，2007；Kudo-Tanaka等人，2007；Ligeiro等人，2007；Rantapaa-Dahlqvist等人，2007；Turesson等人，2007；van der Helm-van Mil等人，2007)。

RA患者可以具有抗CP阳性或抗CP阴性、抗LCP阳性或抗LCP阴性、抗CCP1阳性或抗CCP1阴性以及抗CCP2阳性或抗CCP2阴性的表型。在具有至少一种抗瓜氨酸化抗原的RA患者中，78％的患者具有抗CP和抗CCP2的抗体，30％的患者具有抗LCP和抗CCP2的抗体，73％的患者具有抗CCP1和抗CCP2的抗体；并且12-32％的患者只有抗LCP的抗体，3％的患者只有抗LCP的抗体，4-19％的患者只有抗CCP1的抗体，21-29％的患者只有抗CCP2的抗体。患有RA的患者含有三种抗CP，即AFA、AKA和APA中的至少一种，59％的患者共同地含有所有三种抗体，25％的患者同时含有两种抗体，18％的患者只有一种抗体。在RA患者中，约5％的抗CCP2状态在3年的抗风湿治疗中发生了变化：2％从阴性变成阳性，3％从阳性变成阴性。RA群体中瓜氨酸化CapZα-1的抗体的频数为53.3％，在抗原没有瓜氨酸化的RA群体中，抗体频数为36.7％。130个RA患者的血清样品的78.5％中检测到瓜氨酸化CII的抗体。14.6％的血清样品中检测到天然未瓜氨酸化CII的抗体，所有这些样品都是抗瓜氨酸化CII阳性的。RA患者的抗瓜氨酸化纤维蛋白原的抗体的IgG亚类谱是对IgG1为61％，对IgG1+IgG2、IgG1+IgG3或IgG1+IgG4为34.8％，并且对IgG1+IgG2+IgG3、IgG1+IgG2+IgG4或IgG1+IgG3+IgG4为4.2％。尽管瓜氨酸化抗原的抗体更特异性地与RA相关，但它们在对不同的含Cit抗原的反应模式中，确实具有明显的变异性。抗瓜氨酸化抗原的抗体不等同于RA患者的诊断标志物。

抗瓜氨酸化抗原的抗体的检测使得在疾病症状首次出现前长达14年就能够明确地诊断RA。这些抗体看起来在健康个体和患有未分化的关节炎的患者中对RA的未来发展都有高度预测性。瓜氨酸化抗原的抗体的活性与促炎细胞因子的上调有关。具有或不具有这些抗体的RA患者的表型在疾病活动的血清学参数(CRP、ESR和WBC)和临床表现方面是类似的，但是在疾病进程方面是不同的。具有这些抗体中的至少一种的患者对持续性RA的发展、加重的临床疾病、更肿胀的关节、高放射级数(great radiological progression)和关节破坏、严重骨损伤、死亡风险具有高预测值，并且要求更有效的抗风湿治疗。抗CCP2测试比抗LCP和抗CCP1测试鉴定更多的关节损伤进展患者。抗CP，而不是抗CCP2最好地预测了患有初发或早期多发性关节炎的患者的严重性。抗瓜氨酸化抗原抗体不等同于RA患者的预后标志物。

许多研究已经检测了积极的RA治疗对瓜氨酸化抗原的抗体的血清水平的影响。发现抗体的量是稳定的表型，其在诊断后、DMARD、生物制剂或生物制剂结合DMARD的治疗开始后以及临床和缓解进程后保持基本不变。RF，而不是抗体，与临床疗效有关，这表明在RA中有两套独立的自身抗体系统。这些结果与发现积极治疗引起反映抗CCP2的水平明显降低的临床改善的结果形成对照，所述积极治疗是通过包括英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)和依那西普(etanercept)在内的生物TNFα阻断剂或通过这些阻断剂联合DMARD甲氨喋呤进行的。BlyD治疗在应答患者中引起临床应答，并且与抗CCP2水平的明显下降有关。无应答患者没有表现出抗CCP2水平的任何明显变化。瓜氨酸化抗原的抗体被认为在RA发病机理中起重要作用。

DRB1 SE等位基因被认为与CCP2的抗体有关，并且在RA中预测严重度。瓜氨酸化肽的特征是与HLA-DRB1等位基因具有高亲和力肽相互作用。抗CCP2阳性RA仅与HLA-DRB1有关，并且抗CCP2阴性RA仅与HLA-DR3有关。抗CCP抗体的高效价与HLA-DRB104/10的存在显著有关。然而，来自大量天然和瓜氨酸化形式的纤维蛋白原肽的数据表明瓜氨酸化不是肽与HLA-DR相关的等位基因结合的先决条件，并且瓜氨酸化纤维蛋白原肽并没有比其天然形式更有效地刺激T细胞增殖。HLA-DRB1等位基因最有可能与抗CP的产生有关，因为这些等位基因混杂地结合纤维蛋白原肽。来自SE阴性RA患者的血清中有55％对抗瓜氨酸化纤维蛋白原是阳性的。HLA-DRB1的表达不是RA患者产生瓜氨酸化纤维蛋白原的抗体所必需的。

如果自身蛋白的瓜氨酸化是破坏免疫耐受的关键步骤，CP上产生的新表位应当比LCP、CCP1和CCP2模拟的表位令人信服地更为天然和有决定性。然而，不是所有含有Arg残基的蛋白质在体外有效地被瓜氨酸化后都能与抗CP反应。在71个15-聚体(mer)瓜氨酸化纤维蛋白衍生肽中，只有19个被抗CP特异地识别。免疫反应性CP中没有一个具有被抗CP、抗LCP、抗CCP1和抗CCP2靶向的所有表位。用抗CP检测RA的灵敏度明显地低于用抗LCP、抗CCP1和抗CCP2检测的灵敏度(46％比48％、53％和66％)，但是它们都是极其特异的(约100％)，这表明，抗原中存在的瓜氨酸化部分是关键的但不是足够的。抗CCP2阳性患者具有瓜氨酸化表位，其特征为预示发生了严重RA，相比之下，抗CCP2阴性患者具有天然表位，其特征为预示较不严重的RA。AFA与作为抗原的未瓜氨酸化的丝聚蛋白反应，并且其效价与RA患者的临床参数有关。这些研究表明并非所有的CP/LCP/CCP1/CCP2或未瓜氨酸化的蛋白/肽同等地与瓜氨酸化抗原的抗体反应。RA特异性抗体是抗半抗原抗体，并且半抗原由线性而不是构象基础上的Cit和非Cit残基组成。Cit与非Cit残基之间的相互关系以及周围的其它AA残基可以决定抗原上的Cit残基、非Cit残基或Cit和非Cit残基这两者的可视性，这导致了RA患者的可变的抗瓜氨酸化抗原阳性或抗瓜氨酸化抗原阴性表型。

有限质量的化学成分(通常MW小于1000)被定义为半抗原，当其被导入宿主动物时，不引发抗体的形成。但是，当其与高分子量载体共价偶联时，生成的半抗原-载体共轭物(conjugate)能在宿主动物中引发识别该半抗原的抗体的形成。翻译后修饰能通过增加自身表位使蛋白质获得自身免疫性，并引发抗生成的新表位的抗体。如果自身表位是像Cit残基(MW 157.20)一样小的半抗原，其不大可能完全地占据抗体的全部抗原结合位点。除了半抗原，蛋白质用于连接半抗原的桥接基(bridge group)可以成为额外的抗原性部分以形成新表位并且结合抗体。如果该新表位被错误的桥接基污染(contaminate)，该干扰能导致低估或高估抗体。桥接基识别是抗半抗原抗体的一般属性，其对利用半抗原-载体作为抗原的检测的灵敏度和特异性具有很大的影响。编码被RA特异性抗体识别的线性表位将决定Cit、非Cit AA、Cit残基、非Cit AA残基、桥接基或其某些组合是否有助于表位的整体结合需求。

在RA的诊断和治疗中仍然存在很大的挑战。关键问题包括：

1)CP缺乏对免疫系统的免疫原性。CP的抗体在RA患者中具有显著的接近100％的特异性并且不到1％的群体产生了CP的抗体，与CP的抗体相反，CP的存在对RA不是特异性的，而是所有人出现炎症的结果。针对CP的免疫并不在实验动物模型中导致RA。这表明存在涉及自身免疫的引发或持续的包括瓜氨酸化的过程，还是仅仅反映了尚未被发现的发生的炎症？这意味着存在未被发现的含有Cit的自身抗原吗？

2)瓜氨酸化抗原与已有的抗体的抗原性的不足。在46-66％的RA患者中检测到抗体对瓜氨酸化抗原的敏感性。这意味着相当一部分RA患者不产生抗瓜氨酸化抗原的抗体，还是由于不完全的抗原性，现有的捕获抗原不能识别它们？

3)瓜氨酸化抗原的抗体的诊断准确度不足。针对瓜氨酸化抗原的RA特异性抗体对是高度特异的，但不够灵敏。这表明Cit残基是负责检测瓜氨酸化抗原阳性RA的抗体的表位决定性组分吗？如果是这样，那负责检测瓜氨酸化抗原阴性RA的抗体的表位决定性组分是什么？

4)考虑到一部分RA患者不含有抗瓜氨酸化抗原的抗体，这表明抗体的存在对于RA的发生不是必需的，还是抗瓜氨酸化抗原阳性RA和抗瓜氨酸化抗原阴性RA的基本发病机理是不同的？

5)考虑到CCP2是中度灵敏的并且检测与CCP1、LCP和CP不同的亚型抗体，这表明桥接基识别的存在能导致瓜氨酸化抗原对于已有特异性抗体“可见”或“不可见”吗？这意味着至少部分的抗瓜氨酸化抗原阳性是不明确的抗瓜氨酸化抗原阴性，并且抗瓜氨酸化抗原阳性和阴性不属于两个独立的形成过程吗？

6)负责产生针对瓜氨酸化抗原免疫应答的抗原是什么？对RA特异性抗体靶向的表位进行作图是重要的并且能够阐明相应的抗原疑惑。

7)特异性抗体的产生和疾病的严重结果或治疗应答之间的联系。

8)如何、何时、何处及为什么产生了在免疫耐受中作为原因的(responsible)中断？免疫是否在动物中导致了关节炎？

9)昂贵的新生物制剂治疗的安全性和功效。

10)BLyD是否是治疗RA的方法？选择性地消减与RA有关的B细胞可以是有益的，因为这会防止产生RA特异性抗体。

11)如果RA特异性抗体与RA的发病机理有关，这是否意味着抗原特异性介入能预防慢性关节炎和长期关节损伤，并且没有与目前的治疗方案有关的副作用？

12)巯基依赖型组织蛋白酶是RA治疗开发的潜在靶标。负责RA发生或治疗的巯基部分是什么？

更多有价值的信息可以来自对负责自身抗体的特异性出现的瓜氨酸化表位成分的后续研究，该自身抗体是RA血清中的新型类风湿因子。如果基于自身抗体的早期RA分类代表了反映位于抗原性基质的不完全表位的RA亚型，其抗原性分子基础的分析能最终导致鉴定何种抗原性成分参与了不清楚的表位。如果这些成员属于关键的突变新表位，其能成为用于产生绝对灵敏和特异的RA测试平台。如果能证实表位检测的抗体与疾病的发生有关，将在临床实践中实现有助于RA诊断和治疗策略的深刻理解。

现有技术描述

第7,022,485号美国专利涉及用于诊断或治疗类风湿性关节炎的来自纤维蛋白的瓜氨酸多肽。

第5,888,833号美国专利涉及提取自哺乳动物马尔皮基氏(malpighian)上皮的抗原，其被存在于患有类风湿性关节炎的患者中的自身抗体特异性识别，对于与丝聚蛋白和人丝聚蛋白原共有的抗原决定簇，所述抗原包括抗原性蛋白及其肽片段。

第6,858,438号美国专利涉及来自包含被自身抗体识别的丝聚蛋白或丝聚蛋白原片段的抗原的肽，该肽与患有类风湿性关节炎的患者的自身免疫抗体反应。

上文引用的参考文献没有教导或提出类风湿性关节炎特异性自身抗体的抗原决定簇，所述决定簇的特征为存在半抗原Cit与Cys残基之间形成的酰胺键形成的二肽表位。

发明概述

本发明涉及被存在于患有RA的患者血清中的自身抗体特异性识别的抗原决定簇，其特征为存在由半抗原Cit与Cys残基之间形成的酰胺键形成的二肽表位。本发明所述的抗原决定簇的特征为存在至少一个这种二肽表位，有利地含有多二肽(polydipeptide)表位，并且AA残基的分子比为至少一个Cit对一个Cys。参见通式I-III。

因此，本发明的主要目的是提供开发基于AA的图谱库的方法，所述图谱库能覆盖并阐明RA特异性抗体确定的线性表位。图谱库特别用于在单个AA残基的水平上扫描这些表位并且准确地区分何种AA残基参与了表位与其对应抗体的相互作用。表位、编码该表位的组分以及该表位推导的AA序列已被确定，并显示与RA特异性抗体有关。

本发明另一目的是提供具有能识别并检测RA特异性抗体的特别显著的特征的抗原决定簇。在具体的实施方案中，表位检测的抗体检测患有RA疾病或面临发展RA疾病的风险的个体。

本发明的另一目的是为本领域提供免疫测定及其使用方法，从而能准确、廉价和简单地检测诸如血清或滑液的体液中的RA特异性抗体。在具体的实施方案中，捕获试剂是与固相支持物表面共价连接、能检测存在的RA特异性抗体的抗原决定簇。然后，利用与标记结合的抗人IgG评估该检测的抗体。

本发明的另一目的是提供与RA的发生有关的二肽表位的免疫反应形式。靶向表位的抗体用于引起RA患者的临床和治疗应答的方法。携带该表位的治疗组合物或含有该表位的分子可以用于药物学中以治疗或预防RA患者或有发生RA的风险的前RA患者的疾病。

通过下文的描述并结合所有附图，本发明的其它目的和优势将变得显而易见，其中通过示例和实施例说明了本发明的某些实施方案。本文包含的任何附图组成本说明书的一部分并包括本发明的示例性实施方案以及示例了不同的目的及其特征。

为了本发明的目的，“二肽表位”理解为表示通过偶联含有活性Cit的肽或非肽分子被免疫原性地半抗原化的单价半抗原自身表位，其序列是任何内源活性Cys酶或具有至少一个活性位点Cys的其它活性Cys-蛋白/肽种类的天然化学连接作用形成的序列。

为了本发明的目的，“天然化学连接”理解为表示特定的瓜氨酸化，其是通过在天然、重组或合成酶、蛋白质、肽或非肽分子的活性位点Cys上结合含有活性Cit的肽或非肽分子的定点半抗原化突变。

本发明所用的术语“活性Cys或活性位点Cys”表示天然、重组或合成酶、蛋白质、肽或非肽分子的亲核位点Cys。

本发明所用的术语“活性Cit”表示含有亲电子Cit的肽或非肽分子。

为了本发明的目的，例如，可以通过天然、重组或合成酶、蛋白质、肽或非肽分子的天然化学连接或通过直接将一种或多种二肽表位并入合成抗原的化学合成，在不存在或存在不同量的中性结合AA残基或中性结合AA残基模拟物(mimic)的条件下，制备“抗原”。

附图概述

图1显示被RA特异性抗体识别的抗原决定簇的表位作图，说明了天然存在的20个编码的AA和1个非编码的Cit中的每一个与从患有RA的患者获得的血清的反应性；

图2显示被RA特异性抗体识别的抗原决定簇的表位作图，说明了乙酰化的20个编码的AA和1个非编码的Cit中的每一个与从患有RA的患者获得的血清的反应性；

图3显示被RA特异性抗体识别的抗原决定簇的表位作图，说明了烷基化的20个编码的AA和1个非编码的Cit中的每一个与从患有RA的患者获得的血清的反应性；

图4显示被RA特异性抗体识别的抗原决定簇的表位作图，说明了烷基化和乙酰化的20个编码的AA和1个非编码的Cit中的每一个与从患有RA的患者获得的血清的反应性；

图5是通过天然化学连接对蛋白进行瓜氨酸化的图示；

图6是通式表。

发明详述

定义

“翻译后修饰”是蛋白质在其翻译后的修饰。这是许多蛋白质在蛋白质生物合成中的一个后期步骤。本文所用的“翻译后修饰”指的是将其他化学基团导入自身蛋白的抗原决定簇的组成中。

术语“自身免疫”指的是自身抗体或淋巴细胞错误地攻击产生它们的生物体的分子、细胞或组织的情况；这可以产生导致自身免疫疾病的病理结果。例如：类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮和I型糖尿病。

本文所用的术语“抗体”指的是“自身抗体”，其是形成的抗产生它的个体的正常身体物质的血清免疫球蛋白；一般通过抗体对物质的特异性结合来定义抗体。

术语“抗原”指的是能在哺乳动物中诱导免疫应答，并能被特异性抗体或特异性淋巴细胞特异结合的任何外源物质。抗原如果能引发免疫应答，还可以是免疫原，如果不能引发免疫应答，则是半抗原。术语“自身抗原”指在自身免疫疾病中为体液或细胞介导的免疫应答的靶标的抗原，尽管该抗原是正常组织的成分。术语“人工抗原”指的是在自然界中不存在的人工制备的抗原。

术语“半抗原”指的是具有抗原性特征但不具有免疫原性特征的物质。半抗原是单独给药时不能诱导免疫应答，但是与诸如蛋白质的大载体偶联时能诱导免疫应答的小分子，所述载体自身也不能引发免疫应答。可以用自由半抗原、修饰的半抗原或与相邻残基结合的半抗原检测针对半抗原-载体形成的抗体。本文所用的“单价半抗原”指的是仅具有一个连接位点的半抗原。本文所用的“捕获抗原”指的是作为抗原基质共价结合至固相支持物的单价半抗原的组合。

本文所用的术语“表位”指的是诸如一级结构和电荷的分子的集合特征，其依赖抗体的抗原结合位点(称为对位)，在抗原上共同形成抗体结合的区域。表位可以被定义为在蛋白质一级序列中靠在一起的一组氨基酸残基，或在一级序列中完全分开，但作为蛋白质自然折叠成其天然、全功能形态的结果而靠在一起的氨基酸。由在一级序列中靠在一起的残基组成的表位被称为邻近的、连续的、顺序的或线性表位，相对地，由在一级序列中分开的残基组成的表位被称为非连续的、构象的或“装配的”表位。

表位是天然存在的，并且可以被作图、分离、纯化或者另外被人制备/衍生。例如，可以通过从天然来源分离来制备表位，或根据本领域的标准方法合成表位。这些方法中的一种是使用蛋白质抗原的合成片段(肽)，其能与完整抗原的同源部分足够相似从而允许抗体的结合。抗体对表位的亲和力必须使得抗体/肽复合物在免疫检测的条件下不明显分离。该情况存在于线性表位，从而允许使用肽定义那些表位以及使用氨基酸和氨基酸模拟物定义单独的表位。衍生/制备的表位可以是天然表位的类似物。在本发明公开的全文中，术语表位和半抗原经常交换使用。

术语“自身表位”指的是自身抗原的一部分，其是自身免疫应答的特异性靶标。“表位”指的是长度为约4个至约8个氨基酸的设计的肽的氨基酸序列中的残基模式。抗体的结合位点将容纳约4-8个残基的抗原决定簇。

每一个氨基酸具有共同结构，其中中心碳原子与氨基(NH₂)、羧基(COOH)、氢和可变的侧链“R”共价连接。术语“残基”指的是当形成肽键或肽键模拟物时失去一分子水(来自含氮侧的H+和来自羧基侧的OH-)，从氨基酸形成的氨基酸残基(-NHCHRCO-)。

“负性结合残基”或“有害残基”是氨基酸残基或氨基酸残基模拟物，如果其存在于表位的某些位置，会降低表位对相应抗体的结合亲和力。

“中性结合残基”是氨基酸残基或氨基酸残基模拟物，如果其存在于表位的某些位置，不会改变表位对相应抗体的结合亲和力。

“正性结合残基”是氨基酸残基或氨基酸残基模拟物，如果其存在于表位的某些位置，会增加表位对相应抗体的结合亲和力。

“假正性结合残基”是氨基酸残基或氨基酸残基模拟物，如果其存在于表位的某些位置，会增加表位对相应抗体的结合亲和力，而实际上其不被视为来自表位的成分。

术语“间隔子(spacer)”理解为表示间隔子或连接子分子，其存在于分开的正性结合残基之间，以使这些残基共价连接至抗原决定簇。间隔子分子优选为中性结合残基。例如，间隔子分子可以是氨基酸残基、氨基酸残基模拟物及其组合。间隔子可以是如Cit或Cys的相同分子类型。间隔子分子可以通过，例如，酰胺键或可选择地通过酯键、亚胺键或其组合与正性结合残基连接。

“基本锚定残基”是位于沿着肽序列的特定位置的必需正性结合残基，其被认为提供了免疫原性肽和抗体之间的接触点，一般地，确定长度的肽内的一个、两个或三个正性结合残基限定了免疫原性肽的“表位”。这些残基被认为适合与抗体的抗原结合位点紧密接触，并且其侧链掩藏于结合位点自身的特异性口袋(pocket)中。

“天然”序列指自然界中发现的序列。

术语“分析物”指待测定或测量的化学组分。

术语“交叉反应性”指对一种抗原特异的抗体与第二种抗原反应的能力；基于IC50值(移置50％的结合的抗体的分析物的摩尔数)测量两种不同抗原性物质之间的关联性(％)。

测试的术语“灵敏度”指所有阳性中，测试检测到的真阳性的比例。因此，灵敏度是测试鉴定阳性的准确度的标准。所有的阳性是(检测到的)真阳性(TP)与(未检测到的)假阴性(FN)之和。因此，灵敏度为TP/(TP+FN)×100％。

测试的术语“特异性”指所有阴性中，测试检测到的真阴性的比例。因此，特异性是测试鉴定阴性的准确度的标准。所有的阴性是(检测到的)真阴性与(误诊的)假阳性(FP)之和。因此，特异性为TN/(TN+FP)×100％。

术语“检测(detecting)”或“检测(detection)”指定性或定量地测定研究的生物分子的存在。

氨基酸的全部集合指20个编码的天然存在的氨基酸和1个非编码的天然存在的Cit。

用于描述表位化合物的命名遵循惯例，其中氨基位于每一氨基酸残基的左侧(N-末端)，羧基位于每一氨基酸残基的右侧(C-末端)。氨基酸残基的α-形式表示为单个大写字母或第一个字母大写的三字母符号。瓜氨酸目前没有字母符号，简单地用“Z”或“Cit”表示。

α氨基酸的标准符号/命名如下所述：单字母三字母符号氨基酸：A Ala丙氨酸；C Cys半胱氨酸；D Asp天冬氨酸；E Glu谷氨酸；F Phe苯丙氨酸；G Gly甘氨酸；H His组氨酸；I Ile异亮氨酸；K Lys赖氨酸；L Leu亮氨酸；M Met甲硫氨酸；N Asn天冬酰胺；P Pro脯氨酸；Q Gln谷氨酰胺；R Arg精氨酸；S Ser丝氨酸；T Thr苏氨酸；V Val缬氨酸；W Trp色氨酸；Y Tyr酪氨酸；Z Cit瓜氨酸。

本文所用的缩写如下所述：

AA：氨基酸；ACR：美国风湿病学会；AFA：抗丝聚蛋白抗体；AKA：抗角蛋白抗体：APA：抗核周因子；Be：丁酯；BlyD：B淋巴细胞消减；BSA：牛血清白蛋白；CP：瓜氨酸化内源蛋白/肽；CCP：单环瓜氨酸化肽；CCP1：在第一代RA测试中形成的来自丝聚蛋白序列的CCP；CCP2：在第二代RA测试中形成的与丝聚蛋白或其它已知蛋白没有同源性的人工CCP；CRP：C-反应性蛋白；CT：C-末端；DMARD：缓解疾病的抗风湿性药物；EBV：爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-barr virus)；Ee：乙酯；ELISA：酶联免疫吸附测定；ESR：红细胞沉降率；IP：间质性肺炎；LCP：短直链瓜氨酸化肽；McAb：单克隆抗体；Me：甲酯；MHC：主要组织相容性复合物；MW：分子量；NO：一氧化氮；NOS：一氧化氮合成酶；NT：N-末端；PAD：肽基精氨酸脱亚胺酶；PADI2：PAD的同型2；PADI4：PAD的同型4；PBST：磷酸盐缓冲液-吐温20：PcAb：多克隆抗体；Pe：丙酯；RA类风湿性关节炎；RF：类风湿因子；SE：共同表位；TMB：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；TNFα：肿瘤坏死因子α；WBC：白细胞数。

目前缺乏关于研究中的表位的天然序列的知识。这不利于解释为什么瓜氨酸化抗原的抗体在高特异性下具有低灵敏度以及用作RA诊断和预后标志物时，与药物治疗相矛盾的临床和试验室应答。

Cit是化学结构与Arg非常类似的非编码氨基酸，唯一的不同是中性脲基代替了正电荷胍基。据报道，Cit为被RA特异性抗体识别的表位的必需组分。发明人未发表的表位作图研究发现Cit不结合任何RA特异性抗体，但是Cit残基可以。含有结合的氨基和羧基这两者的衍生Cit的反应性高于仅含有结合的氨基或羧基的衍生Cit的反应性。

存在于RA患者中的瓜氨酸化抗原的抗体以及作为抗体识别的表位的部分的Cit残基是有望准确编码到目前为止未很好了解的表位的两个主要条件。

通过测定与包括20种编码的氨基酸和1种非编码的Cit在内的21种α-氨基酸以及其衍生物的每一种的交叉反应性，对RA特异性抗体靶向的表位作图(mapping)进行了研究，所述衍生物代表可能存在于表位中的对应残基变体。通过3点药效团模型来描述这些分析物以表示对抗体结合具重要性的结构特征。点1是与α-碳相连的氨基(-NH₂)官能团或位于α-NH₂的其类似物。点2是与α-碳相连的羧酸(-COOH)或位于α-COOH的其类似物。点3是与α-碳相连的不同侧链R。分析物交叉反应性的三点分析可以提供更为灵敏和特异的方法以确定哪些氨基酸残基参与表位形成以及哪些氨基酸序列存在于该表位中。

本发明涉及RA的抗原决定簇，其特征为与至少一种类风湿性关节炎(RA)特异性自身抗体反应，其包括：

如通式III的二肽序列，包括至少一个α-Cit残基和至少一个α-Cys残基；

其中，所述α-Cit残基是具有如下通式I的半抗原部分

其中，A为NH₂；B为-O-；D为-NH-；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；

其中，所述α-Cys残基是具有如下通式II的半抗原部分，

其中S为-SH，或者当α-Cys的自由巯基(SH)通过二硫键与另一α-Cys交联时，S为SS；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR-，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；

由此提供了作为RA的抗原决定簇起作用的人工抗原成分。

本发明还涉及制备RA的抗原决定簇的方法，所述抗原决定簇的特征为与至少一种类风湿性关节炎(RA)特异性自身抗体反应，该方法包括：

通过以C-末端Cit硫酯作为亲电子试剂并且以N-末端-Cys作为亲核试剂的巯基-硫酯交换，通过硫酯捕获进行半胱氨酸连接，该连接导致在两个肽片段之间形成具有如下通式III的瓜氨酸化的含半胱氨酸的肽：

其中，所述α-Cit残基是具有如下通式I的半抗原部分

其中，A为NH₂；B为-O-；D为-NH-；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；以及

其中，所述α-Cys残基是具有如下通式II的半抗原部分

其中S为-SH，或者当α-Cys的自由巯基(SH)通过二硫键与另一α-Cys交联时，S为SS；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR-，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数。

对于上文所述的抗原决定簇，可以认为，自身抗体参与RA疾病的发病机理，且所述抗原/抗体复合物的形成表明存在RA特异性自身抗体并且作为RA的诊断。

在具体的实施方案中，包含至少一个Cit残基和一个Cys残基的人工抗原通过间隔子T_n’连接，其中n’为1至6的整数，从而产生具有如下通式IV的抗原决定簇：

在另一实施方案中，人工抗原N-末端-Cys由一个或多个Cit连接，从而产生具有如下通式V的抗原决定簇：

仍然在另一实施方案中，人工抗原N-末端-Cys由一个或多个Cit通过间隔子T_n连接，从而产生具有如下通式VI的抗原决定簇：

在另一迭代中，人工抗原N-末端-Cys由一个或多个Cit通过间隔子T_n’连接，包含至少一个Cys，从而所述抗原决定簇具有如下通式VII：

根据本发明，可以认为，抗原决定簇可以是与载体分子偶联的人工抗原。而且，可以共价或非共价地将人工抗原固定于固相支持物。另外，可以标记人工抗原。

还可以考虑提供药物组合物，其包含与药物可接受的载体结合的本发明所述的肽序列。以适合口服或肠胃外给药的药物制剂、其盐、稀释剂或赋形剂的形式提供药物可接受的载体。

根据本发明，还可以考虑提供单克隆抗体或多克隆抗血清，其包含特异性结合至少一种如本文所示的二肽序列呈现的半抗原部分；还提供了进行RA测试的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒以测定RA特异性自身抗体的存在，所述试剂盒包含：a)具有选自通式III-VII的通式、作为捕获抗原固定于固相支持物的至少一种抗原，由此将生物样品中的所述自身抗体与所述捕获抗原接触，并将标记的抗人IgG与由所述捕获抗原连接的所述自身抗体进行孵育，从而测定所述自身抗体的存在，其中确定了RA的诊断和严重性；以及提供了测定RA特异性自身抗体的存在的夹心ELISA试剂盒，其包含结合选自通式I-VII的至少一种抗原的单克隆或多克隆抗体，所述抗体作为捕获抗体固定于固相支持物；由此将生物样品中的所述自身抗体作为报道抗体与由捕获抗体连接的所述抗原反应，然后将标记的抗人IgG与由所述报道抗体、所述抗原和所述捕获抗体形成的所述夹心进行孵育，从而检测RA并且所述报道抗体的剂量变化确定RA的严重度。

现在将通过下文的实施例，更详细地解释本发明。

氨基酸衍生物的制备

通过肽的一级氨基酸序列制备被B细胞和B细胞分泌的抗体识别的线性表位，该序列以第一个氨基酸的氨基起始，并连续至最后的AA的羧基末端，并且两个AA残基之间存在肽键。

为了保证在单个AA残基的水平上研究线性表位，利用已知的方法(参见，例如，Herrera-Marschit & Leibach & Lubec，Amino Acids，ISSN：0939-4451，Springer Wien，2004)，通过在点1添加乙酰基，或在点2添加烷基或在点1和2添加乙酰基和烷基，对氨基酸进行衍生化。

可以从诸如Sigma化学制品公司(St Louis，MO)的化学制剂供应商处购买用于进行AA乙酰化和烷基化的氨基酸和衍生化试剂。AA衍生物通过反相高效液相色谱法测定的纯度至少为95％。通过气相色谱-质谱法(GC-MS)确定衍生的AA的成分。

表位成分

根据本发明，通过利用间接ELISA测定交叉反应性检测识别RA特异性抗体的线性表位成分，该间接ELISA以固定的CCP2作为捕获抗原(Immunoscan RA，Cat RA-96，Lot FS 2900)并且以包括来自欧洲诊断公司(Eurodiagnostic)(Immunoscan RA，Cat RA-96，Lot FS 3166)的1份血清和来自抗CCP2阳性RA患者的3份血清在内的4份阳性血清作为检测抗体。使用全部21种氨基酸及其衍生物作为分析物以测定是否任一分析物抑制检测抗体结合捕获抗原的作用。通过在一系列移动窗(moving window)中的单个AA水平观察不同的衍生化进行测定。只要可能的AA衍生物可以得到，则按照该程序确保不会错过表位的抗原成分。在流动相中开始该分析，其中首先将检测抗体与每一分析物孵育。于4℃孵育过夜后，向在表面固定了CCP2的96孔微板的每孔中添加100μl预吸附了检测抗体的分析物，并将其在室温摇动孵育1小时。然后倒空平板，将其用洗涤缓冲液洗涤5次，然后每孔添加100μl结合了过氧化物酶的抗人IgG(Immunoscan RA，Cat RA-96，Lot FS3165)，即报道抗体，并在室温摇动孵育1小时。倒空并洗掉任何未结合的物质后，向每孔中添加100μl过氧化物酶底物TMB(ImmunoscanRA，Cat RA-96，Lot FS 3156)并在室温避光孵育30min。通过向每孔中添加100μl 0.5M H₂SO₄终止反应，并且在A450nm处评估结果。

间接ELISA的思想基于未知量的分析物与已知量的固定抗原之间针对有限数目的检测抗体结合位点的抑制实验。如果检测抗体和固定的抗原的含量保持不变，检测抗体在固定的抗原结合的检测抗体与分析物结合的检测抗体之间的分布取决于样品分析物的量。固定抗原结合的检测抗体的量与分析物结合的检测抗体的量成反比。当分析物的存在导致抗体与CCP2的结合相互作用下降至少70％时，则认为分析物是表位的成分。相反，不被视为来自表位的成分的残基不能产生这种相互作用。因此，间接ELISA提供了关于被RA特异性抗体识别的线性表位的成分的准确信息。

如图1的抗原决定簇的氨基酸谱所示，用来自欧洲诊断公司(Euro-diagnostica)(血清1)和来自三个RA患者(血清2、3和4)的血清，对在不同浓度的不同氨基酸的CCP2阳性进行ELISA。每一竖条表示发现的50mM的AA抑制抗体结合固定的CCP2的能力。100％处的水平线表示CCP2与抗体的对照结合百分比。

如图2的抗原决定簇的乙酰基氨基酸谱所示，用来自欧洲诊断公司(血清1)和来自三个RA患者(血清2、3和4)的血清，对在不同浓度的不同乙酰基氨基酸的CCP2阳性进行ELISA。每一竖条表示发现的50mM乙酰基AA抑制抗体结合固定的CCP2的能力。100％处的水平线表示CCP2与抗体的对照结合百分比。

如图3的抗原决定簇的烷基氨基酸谱所示，用来自欧洲诊断公司(血清1)和来自RA三个患者(血清2、3和4)的血清对在不同浓度的不同烷基氨基酸的CCP2阳性进行ELISA。每一竖条表示发现的50mM烷基AA抑制抗体结合固定的CCP2的能力。100％处的水平线表示CCP2与抗体的对照结合百分比。

如图4的抗原决定簇的乙酰基氨基酸甲酯谱所示，用来自欧洲诊断公司(血清1)和来自三个RA患者(血清2、3和4)的血清对在不同浓度的不同乙酰基氨基酸甲酯的CCP2阳性进行ELISA。每一竖条表示发现的50mM的乙酰基氨基酸甲酯抑制抗体结合固定的CCP2的能力。100％处的水平线表示CCP2与抗体的对照结合百分比。

参见图5的通过天然化学连接对蛋白质进行瓜氨酸化的图示，CT-Cit和NT-Cys硫酯表示一对亲电子和亲核片段。CT-Cit硫酯经历了NT-Cys的巯基的亲核攻击。初始硫酯连接产物经历快速分子内的硫酯至酰胺的重排以得到在连接位点具有天然酰胺键的新表位Cit-Cys，其破坏自身蛋白的免疫耐受。第1部分为化学选择性巯基酯交换(transthiolesterification)；第2部分为分子内自发地S至N酰基转移。

还如图1所示，当检测中的分析物谱是α-氨基酸时，只有Cit和Cys表现出有限的抑制抗体结合固定的CCP2的能力。所有21种氨基酸都被排除为表位的部分。编码或非编码的氨基酸都没在线性表位中表现出任何抗原性残基谱。

还如图2所示，当检测中的分析物谱是乙酰化α-氨基酸时，乙酰基Cit和乙酰基Cys表现出强烈的抑制，乙酰基Arg表现出有限的抑制，而其余的18种乙酰基氨基酸几乎没有表现出对抗体结合CCP2的抑制。类似地，还如图3所示，当检测中的分析物谱是烷基化α-氨基酸时，记录了免疫应答的趋势。

还如图4所示，当检测中的分析物谱是诸如乙酰化氨基酸甲酯的乙酰化α-烷基氨基酸时，肽中模拟氨基酸残基揭示点1和点2之间的特征对于4种抗体对Cit和Cys的免疫识别是重要的。如表1所示，抗体对乙酰化-Cit、Cit-Me和乙酰化-Cit-Me分别表现出74％、81％和100％的交叉反应性；并且对乙酰化-Cys、Cys-Me和乙酰化-Cys-Me分别表现出50％、48％和57％的交叉反应性。

查看表1得到下面的解释和观察结果：

表1RA特异性抗体与α-氨基酸衍生物的交叉反应性

Me，甲酯化；Ee，乙酯化；Pe，丙酯化；Be，丁酯化；0，交叉反应性小于1％；n.d.，未检测到。

除了胍基代替了侧链中的脲基，Arg与Cit是相同的。抗体与Arg和Cit的交叉反应性为0。乙酰基-Arg、Arg-Me和乙酰基-Arg-Me具有与Arg相同的侧链，但是α位的羧基和氨基被乙酰化或烷基化或同时乙酰化和烷基化。抗体与乙酰基-Arg、Arg-Me和乙酰基-Arg-Me的交叉反应性分别为5％、6％和13％。

Met和Cys是仅有的含硫氨基酸。Met与Cys的不同在于增加了亚甲基并且甲基取代了侧链中巯基的氢。除了羟基的氧代替了侧链中巯基的硫，Ser与Cys是相同的。抗体对Cys、Met、Ser、乙酰基-Met、乙酰基-Ser、Met-Me、Ser-Me、乙酰基-Met-Me和乙酰基-Ser-Me分别表现出的交叉反应性为0。

通过4种乙酰化Cit衍生物分析了通过在α位连接使得Cit具有抗原性的桥接基。这4种乙酰化Cit衍生物与Cit的不同在于甲基、乙基、丙基或丁基取代了分子中羧基的氢。抗体对Cit-Me、Cit-Ee、Cit-Pe和Cit-Be表现出的交叉反应性分别为81％、72％、115％和124％。α-碳连接的含脲基侧链和与长度至少为3个碳原子的合适桥接基结合的氨基或羧基或这两者，是这些抗体识别Cit严格必需的。

乙酰基-Cys或Cys-Me与乙酰基-Cys-Me之间交叉反应性的微小差别表明Cys是桥接基，其保持它的羧基在自身蛋白中被结合，并使它含巯基的侧链和氨基自由地与Cit的羧基连接以形成新表位。α-碳连接的含巯基侧链以及至少一个被结合的氨基和羧基这两者是这些抗体识别Cys严格必需的。

Cit和Cys残基是两个正性结合残基，并且是两个基本锚定残基。Arg残基是假正性结合残基。除了Cit、Cys和Arg外的AA残基是负性或中性结合残基。

当Cit与Cys残基之间引入酰胺化时，形成了二肽新表位，这产生了具有抗原性的结构和电荷特征、含脲基和含巯基的侧链。

Cit表现出α-氨基酸家族的共同反应性。具体地，它能形成肽键；因此，它能存在于蛋白质中。然而，没有试验证据显示Cit能在翻译期间同Cys掺入蛋白质，因为没有证据表明存在能转运Cit同Cys的tRNA。

存在于蛋白质中的Cit一定是来自蛋白质的翻译后修饰。PAD被认为负责这种修饰，即将肽基Arg转变成肽基Cit的瓜氨酸化。

对肽的研究表明与Arg相邻的AA残基的类型影响它对通过PAD的瓜氨酸化的敏感性。例如，夹在两个Pro残基之间的单个Arg不能被瓜氨酸化；与通过二硫键与另一Cys交联的Cys相邻的Arg对瓜氨酸化表现出很高的抵抗性。

在这种条件下，由于胱氨酸二硫键的还原，PDA不能使在Cys侧面的Arg瓜氨酸化，并且很少发现在蛋白质表面的Cys，这证明在二肽新表位的形成中，存在不同于PAD的过程。

考虑到NOS酶(催化形成NO和Cit)在炎症部位的高活性，RA中依赖NO的组织损伤、鸟氨酸/瓜氨酸载体的依赖巯基的转运活性、Cys蛋白酶组织蛋白酶在抗原呈递中以及RA的关节炎症和损伤中依赖巯基的催化活性，以及RA血浆中改变的巯基模式包括明显低水平的蛋白质巯基和半胱氨酰甘氨酸及明显增加的胱氨酸、同型胱氨酸和与蛋白质结合的Cys及同型半胱氨酸，人们可以推测瓜氨酸化抗原形成与这些相关酶或蛋白质的依赖巯基的活性之间有某些联系。

通过Cys的亲核巯基残基形成这些酶的活性位点，其能容易地被亲电子部分靶向，所述亲电子部分位于被酶的底物结合区域识别的肽或其它结构内。亲电子部分能作为可逆或不可逆的抑制剂灭活靶向的酶。

设计新型治疗剂的进展主要集中于来自具有巯基诱捕药效团的低MW化合物的可逆性抑制剂，该药效团被认为通过靶向灭活酶的活性位点具有抗关节炎活性。

对不可逆性抑制剂的普遍顾虑在于尽管其有选择性，但它们具有半抗原化的潜在缺点，当随时间与反应性Cys酶和引起共价结合的天然肽连接的其它反应性Cys-蛋白种类反应时，它们能引起毒副作用或产生免疫原性半抗原。

还如图5所示，从而合理地假定，天然肽连接，而不是PAD，是参与产生新表位的唯一蛋白质翻译后修饰。该过程假定具有亲电子官能的CT-Cit酯或硫酯片段能与NT-Cys-亲核片段反应，然后发生形成天然肽键的S→N酰基重排，从而使Cit和Cys并入线性二肽基新表位。

对该表位区域的任何修饰，例如通过导入另外的取代基引起的电子离域或用任何其它氨基酸代替这些残基中的任意一个，能导致抗体结合的丧失或导致假阳性抗体结合，这表明Cit和Cys都是基本锚定残基，其连同肽连接形成RA特异性抗体的二肽表位成分的整体识别位点。

线性二肽表位的制备

可以通过重组技术联合翻译后修饰或化学合成通过合成来制备，或从诸如病原生物的天然来源来制备本发明所述的肽表位。肽表位可以单独合成或作为多表位肽合成。

本发明所述的表位可以具有多种长度，并且可以是其中性(不带电荷)形式或成盐形式。本发明所述的表位可以含有诸如糖基化、侧链氧化或烷基化的修饰，通常要满足的条件是修饰不影响表位的免疫原性。

能够以多种方式制备本发明的肽表位。对于优选的相对短的尺寸，可以根据常规技术在溶液或在固相支持物上合成表位。多种自动合成仪可以商购并能根据已知的方法使用。另外，可以利用化学连接将单独的肽表位接合以制备仍然在本发明范围内的更大的肽。

可选择地，可以应用重组DNA技术，其中将编码感兴趣的免疫原性肽的核酸序列插入表达载体，并将载体转化或转染至合适的宿主细胞中，并在适合表达的条件下进行培养。因此，包含本发明的一个或多个表位的重组肽、肽中含有Arg残基的表位能通过PAD进行酶促脱亚胺。

基于已知的二肽表位成分合成线性肽表位(表1)。形成在本文中称为多瓜氨酸GtD1和瓜氨酸化半胱氨酸CitD2的两种多表位肽，例如，每一种具有21个AA。通过固相策略合成CitD1和CitD2，CitD1对应于二肽表位的N末端，Cit残基：Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit，CitD2对应于从N末端的表位，Cit和Cys残基：Cit-Cys-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cit-Cys-Cys-Cit-Cit-Cit-Cit-Cys-Cit-Cit-Cys-Cit-Cys。通过高效液相色谱法测定的肽的纯度至少为95％。通过氨基酸测序和质谱法对肽的鉴定是一致的。所有的肽作为肽酰胺合成。

RA特异性自身抗体的检测

本文提供的方法包括检测能结合上文所述的抗原成分的RA特异性抗体的技术。这些方法允许检测二肽表位的循环抗体以表明RA患者中存在抗体，从而诊断RA或预测患有发展中的RA的个体的侵蚀性疾病或监控治疗该疾病的治疗剂的进展。

本领域有许多已知技术用于检测或测量抗体-抗原复合物，其在本文中又称为结合的抗体或免疫复合物。传统方法包括提供含有抗体的样本和该抗体特异性的已知的固定的抗原，将结合的抗体与游离抗体分离，并测定结合的抗体的量。本文的抗抗体指的是第二抗体或用可检测标记标记的报道抗体，其用于辅助测定结合的抗体的量。标记通常为酶或荧光或放射活性基团。然后利用诸如分光光度测定法、闪烁计数或流式细胞术的本领域技术人员熟知的方法检测标记。

可以通过包被或将抗原共价偶联至诸如96孔微板的孔或球或颗粒的固相来制备固定的抗原。

在优选的实施方案中，通过肽键将捕获抗原共价偶联至96孔免疫测定微板(Corning，Acton，MA)的孔中的N-氧代琥珀酰亚胺表面用于抗体的ELISA检测。将抗原以10μg/ml的浓度溶解于稀释剂(50mmol/L Na₃PO4，1mmol/L EDTA，pH 8.5)中，并每孔加入100μl于4℃进行偶联达16小时。用溶于稀释剂的2％BSA在室温封闭孔1小时。用含有溶于PBS(10mmol PB，300mmol NaCl)中的0.05％吐温20、1％BSA和10％FBS的的稀释缓冲液以1∶200的比率稀释用作检测抗体的患者血清和正常血清。含有抗CCP2的阳性标准血清在此处被称为RA，使用正常血清的阴性标准血清在此处被称为健康对照。向每孔中添加100微升稀释的血清。在室温摇动孵育1小时后，用PBST洗涤孔三次。将结合辣根过氧化酶的山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)以1∶10000的比率稀释于稀释缓冲液中，并将其用作报道抗体，向每孔中添加100μl稀释的结合辣根过氧化酶的山羊抗人IgG并在室温摇动孵育1h。用PBST洗涤四次后，用酶底物TMB检测结合的抗体。反应在室温下避光进行30min，而后向每孔添加100μl 2M硫酸以终止反应。在波长为450nm的吸光度(A450)处读板。通过计算的指数表示抗体的效价，该指数通过下述方法计算：([测量的样品血清的A450-阴性标准的A450]/[阳性标准的A450-阴性标准的A450])×100。测定内和测定间的变异小于10％。从接收器工作特性(ROC)曲线确定ELISA的最佳界限(cut-off)值。

结果

从根据ACR标准被诊断为RA的55名患者、从作为对照组的28名健康个体获得血清样品，并且将所有的样品通过全面的医学测试进行筛选。结果列于表2中。

表2捕获抗原成分对通过ELISA进行的RA测试的影响

捕获抗原	RA血清(％)(n＝55)	对照血清(％)(n＝28)
			CCP2	67	0
CitD1	89	0
			CitD2	98	0

在55名RA患者中，37名是抗CCP2抗体阳性的，49名是抗CitD1阳性的，并且54名是抗CitD2阳性的。表示为真阳性百分比的诊断灵敏度对抗CCP2、抗CitD1和抗CitD2分别是67％、89％和98％。在与CCP2反应的血清中，81％的血清被CitD1识别，并且所有的这些血清都被CitD2识别。在与CitD1反应的血清中，59％的血清被CCP2识别，并且所有的这些血清都被CitD2识别。这些结果清楚地证明，非Cit和Cys的氨基酸残基与灵敏度无关。利用线性二肽CitD2作为抗原底物获得的98％的灵敏度表明了与RF测试或CCP2测试相比显著和有效的改进。Cys对灵敏度的贡献通过作为基本锚定残基参与表位形成而不是作为中性残基在表位外限制有利于抗体结合的肽构象来实现。

在全部28个对照血清中，没有一个对抗CCP2、抗CitD1和抗CitD2是阳性的。因此，表达为真阴性百分比的诊断特异性，对抗CCP2、抗CitD1和抗CitD2分别是100％。

申请人认为新表位，特别是从天然肽连接产生的那些新表位，在其它自身免疫疾病中也起到关键的作用，所述天然肽连接来自修饰的氨基酸或肽通过酰胺键并入NT-Cys残基。因此，本发明还涉及连接部位的表位，其包含Cys和修饰的氨基酸或肽，与来自患有RA外的自身免疫疾病的患者的自身抗体反应。通过天然肽连接形成的新表位可用于开发针对这些疾病的单克隆抗体和诊断各自的自身免疫疾病，特别用于检测包括疑似患有自身免疫疾病的患者的血液、血浆和血清在内的体液中的自身抗体。而且，表位和抗体为借助组合化学开发有机化合物提供了可能性，该化合物用于包括自身免疫疾病治疗中的基于抗原的免疫介入在内的新型诊断和治疗，所述化合物包括在本发明的范围之内。

本说明书提及的所有专利和出版物代表本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物都通过引用的方式并入本文，其引用的程度如同每一单独的出版物被特别和单独地指出通过引用的方式并入本文。

应当理解，尽管示例了本发明的某些形式，但本发明并不局限于本文描述和显示的具体形式或布局。对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围内，可以做出各种变化，并且不应认为本发明局限于包括在本文中的说明书和任何附图/图形所显示和描述的内容。

本领域的技术人员容易理解，本发明完全适于实现发明目的并获得所述的以及其中固有的那些目标和优势。本文所述的实施方案、方法、程序和技术目前代表优选的实施方案，其旨在示例而不是限制本发明的范围。本领域的技术人员可以想到的本发明的变化和其它用途属于本发明的范畴并被所附的权利要求书的范围所限定。尽管结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，要求保护的本发明不应被不恰当地限制于这些具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员显而易见的所述实施本发明的方式的各种变化均在所附权利要求书的范围之内。

Claims (14)

1.类风湿性关节炎(RA)的抗原决定簇，其特征为与至少一种RA-特异性自身抗体反应，所述抗原决定簇包括：

如通式III的二肽序列，其包括至少一个α-Cit残基和至少一个α-Cys残基；

其中所述α-Cit残基为具有如下通式I的半抗原部分，

其中，A为NH₂；B为-O-；D为-NH-；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；

其中所述α-Cys残基是具有如下通式II的半抗原部分，

其中S为-SH，或者当α-Cys的自由巯基(SH)通过二硫键与另一α-Cys交联时，S为SS；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR-，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；

由此提供了作为RA抗原决定簇起作用的人工抗原成分。

2.制备特征为与至少一种类风湿性关节炎(RA)特异性自身抗体反应的RA抗原决定簇的方法，其包括：

通过以C-末端-Cit硫酯作为亲电子试剂并且以N-末端-Cys作为亲核试剂的巯基-硫酯交换，通过硫酯捕获进行半胱氨酸连接，该连接导致在两个肽片段之间形成了具有如下通式III的瓜氨酸化的含半胱氨酸的肽：

其中，所述α-Cit残基是具有如下通式I的半抗原部分，

其中，A为NH₂；B为-O-；D为-NH-；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数；并且

其中，所述α-Cys残基是具有如下通式II的半抗原部分，

其中S为-SH，或者当α-Cys的自由巯基(SH)通过二硫键与另一α-Cys交联时，S为SS；F为-NHCO-或-NR-，其中R为氢或酰基；G为-CONH-或-COOR-，其中R为烷基；并且E为(CH₂)_n’，其中n’为1至6的整数。

3.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述自身抗体与RA疾病的发病机理有关，且所述抗原/抗体复合物的形成表明存在RA特异性自身抗体并且作为RA的诊断。

4.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中包含至少一个Cit残基和一个Cys残基的所述人工抗原通过间隔子T_n’连接，其中n’为1至6的整数，从而产生具有如下通式IV的抗原决定簇：

5.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一个多或多个Cit连接，从而产生具有如下通式V的抗原决定簇：

6.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一个或多个Cit通过间隔子T_n连接，从而产生具有如下通式VI的抗原决定簇：

7.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原N-末端-Cys由一个或多个Cit通过间隔子T_n’连接，包括至少一个Cys，从而所述抗原决定簇具有如下通式VII：

8.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原与载体分子偶联。

9.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原被共价或非共价地固定于固相支持物上。

10.如权利要求1所述的抗原决定簇，其中所述人工抗原被标记。

11.药物组合物，其包含药物可接受的载体中的如权利要求1所述的肽序列。

12.单克隆抗体或多克隆抗血清，其包含特异性结合权利要求1所述的二肽序列所呈现的至少一个半抗原部分的抗体。

13.用于进行RA检测以测定RA特异性自身抗体的存在的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，所述试剂盒包含：a)至少一种具有选自通式III-VII的通式的抗原，其作为捕获抗原固定于固相支持物；

由此将生物样品中的所述自身抗体与所述捕获抗原接触并将标记的抗人IgG与由所述捕获抗原连接的所述自身抗体进行孵育，从而测定所述自身抗体的存在，其中确定了RA的诊断和严重性。

14.用于测定RA特异性自身抗体的存在的夹心ELISA试剂盒，其包含a)结合至少一种选自通式I-VII的抗原的单克隆或多克隆抗体，其作为捕获抗体固定于固相支持物；

由此将生物样品中的所述自身抗体作为报道抗体与由捕获抗体连接的所述抗原反应，然后将标记的抗人IgG与由所述报道抗体、所述抗原和所述捕获抗体形成的所述夹心进行孵育，从而检测RA并且所述报道抗体的剂量变化确定了RA的严重性。

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