CN101676404A - 一种线粒体nd2基因snp预测2型糖尿病易感性的方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，属于医学生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的mtDNA碱基多态性位点的(A4824 G)单核苷酸多态性，预测受试者对2型糖尿病的易感性：碱基为G时，受试者的易感性较低；碱基为A时，受试者的易感性较高。本发明的优点是：本发明首次阐明了mtDNA 4824单核苷酸多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的辅助诊断。

Description

一种线粒体ND2基因SNP预测2型糖尿病易感性的方法及试剂

技术领域

本发明涉及一种预测2型糖尿病易感性的方法及试剂，更具体地说是通过测定线粒体ND2基因(A4824G)单核苷酸多态性(SNP)频率，预测受试者对于2型糖尿病的易感性，该方法可用于辅助诊断和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

2型糖尿病(T2DM)是一组由于胰岛素分泌缺陷及生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病，它不是一种单一疾病，是由多种遗传和环境因素引起的、增龄性的、慢性内分泌代谢异常综合征。该病的复杂发病机制，使得在人群中的患病率约为5％～15％。糖尿病可以导致严重的合并症或并发症，致使死于T2DM各种并发症的人数仅次于心血管疾病和肿瘤的死亡人数，T2DM已成为威胁人类健康的第三大疾病(许曼音主编，《糖尿病学》上海科学技术出版社，上海，2003)。T2DM给患者带来沉重的经济负担、影响生活质量的同时，也给社会造成了巨大的压力。我国现有患者约3000多万，每个T2DM患者每月治疗费用为1000元，按次计算，因T2DM而给我国带来的经济损失是相当惊人的。但是，T2DM的确切病因迄今为止尚未阐明，而且还存在很强的遗传异质性。即往大量研究表明，T2DM在家系分析、双生子研究均呈现高度遗传一致性(Zimmet P，Alberti KG，Shaw J.Global and societal implications of thediabetes epidemic.Nature，2001；414：782-787.)。遗传因素在发病机制中的重要性得到了很多人群证据的证明，如染色体2q(NIDDM1)位点是墨西哥美国人的相关位点，染色体12q(NIDDM2)是在芬兰人群中发现的，在Pima印第安人中常染色体基因组扫描发现了几个LOD分数较高的染色体区域(3q24，9q21和22q12)(Walker M.Gene detectionin type 2 diabetes.International Diabetes Monitor，1998；10：14-15)。

目前进行T2DM遗传病因研究，多采用SNPs作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明(K.S.Park，H.D.Shin，B.L.Park，H.S.Cheong，Y.M.Cho，H.K.Lee et a1.，Polymorphisms in the leptin receptor(LEPR)--putative association with obesity and T2DM，J.Hum.Genet.51(2006)85-91.)。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需＞1％。SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNPs包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个(Brookes AJ.Theessence of SNPs.Gene，1999；234：177-186.)。SNPs以其密度高，平均每1kb就有1个；代表性强，位于基因内部的SNPs可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNPs在人群中为双等位基因标记，可简单以“+/-或I/0”直接分型，成为很好的遗传标志(Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A.A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation.Genome Res，1998；8：1229-1231)。

线粒体是细胞内的重要细胞器，普遍存在于真核细胞中，它具有独特的超微结构，通过氧化磷酸化合成ATP供给细胞各种生命活动的需要。1981年Anderson等发表了人类线粒体DNA(mtDNA)的全序列(Anderson S，Banker AI，Banell BG，et al.Sequence andorganisation of the human mitochondrial genome.Nature.1981，290：457-465)。1992年Van den等首先报道了一个线粒体tRNA^Leu(UUR)基因3243位点A→G突变的2型糖尿病伴耳聋的家系。此后国内外的许多研究进一步证实了这一突变位点存在于少部分2型糖尿病家系及散发病例中(如Audesh Bhat，Anil Koul，Swarkar Sharma，et al.The possible role of 10398A and16189C mtDNA variants in providing susceptibility toT2DM in two North Indian populations：areplicative study.Hum Genet，2007，120：821-826.)，使得线粒体的研究成为糖尿病研究领域中的新热点之一，目前已发现mtDNA的20多种点突变与糖尿病相关，如A3243G、T16189C、A5178G等。

A4824G位于线粒体ND2基因，其表达产物为NADH脱氢酶(复合体I)亚单位2，该突变为错义突变，突变后使苏氨酸被替代为丙氨酸，可能影响NADH脱氢酶的生化特性，从而进一步影响糖代谢及氧化应激水平。

经对现有国内外文献检索，未见有针对线粒体基因组ND2基因mtDNA4824位点与糖尿病相关联的研究报道。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是：提供一种预测2型糖尿病易感性的方法。

本发明要解决的第二个技术问题是：提供一种预测2型糖尿病的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测2型糖尿病易感性的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的mtDNA第4824位碱基的多态性，预测受试者对2型糖尿病的易感性：基因型为G时，受试者的易感性较低；基因型为A时，受试者的易感性较高。

本发明提供了一种分离核酸，在第4824位为A，其反义链为T。该核酸序列为人类线粒体基因全序列(轻链)。Genbank：REFSEQ AC_000021.2gi：115315570，剑桥参考序列见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝115315570。

本发明提供了一组等位基因特异性的引物，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的碱基序列，长度为19-22bp，能特异性地扩增出包含ND2基因第4824位单核苷酸多态性(SNP)(A4824G)的产物，具有序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

本发明提供了一种检测T2DM易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增ND2基因的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。检测扩增产物与正常mtDNA第4824位SNP相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括特异性内切酶等。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

本发明试剂盒供10人份检测应用，保存温度为-20℃，其组分、含量和来源包括：

20ul 10X  PCR缓冲液(Pharmacia)，

6ul  10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

5ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(Takara)，

各2ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO：1)和R1(SEQ ID NO：2)引物(自制)，

1.5ml纯水(自制)，

10ul 10X限制酶反应缓冲液(Fermentas)，

3ul(2unit/ul)限制酶Hpa II(Fermentas)。

试剂盒的使用方法：

(1)通过PCR扩增ND2基因：先制备混合液，加入基因组DNA溶液2ul、2ul 10X PCR缓冲液、0.6ul 10mM dNTP、0.5ul Taq DNA聚合酶、分别0.2ul的F1和R1为正义引物和反义引物。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在94℃5分钟，95℃45秒，56℃45秒，72℃45秒，72℃7分钟，进行30个循环。反应完成后，将3ul每种PCR反应液在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，如扩增了682bp的片段，获得了单一条带，即为扩增成功。

(2)通过用限制酶处理PCR反应产物测定mtDNA4824处的多态性：向10ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、3U限制酶Bstp I，并在37℃水浴中消化过夜。之后，在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。

(3)多态性定型：用限制酶Bstp I处理后片段，4824位碱基如果为A，出现389bp和293bp的两条带；如果为G，仅出现682bp一个条带。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等，通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。

从基因组DNA中，可扩增含ND2基因突变点的DNA片段，以获得用于测定的大量样本。这种通过扩增含ND2基因突变点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。例如，可按PCR方法，使用引物进行扩增，此引物经合理设计以便仅扩增含ND2基因多态性的部分。这种引物可经常规方法制备。待扩增区的碱基长度不受限制。当按本发明所述制备引物时，可获得适宜的测定样品，其作为扩增的DNA片段，并具有特异性长度。

进行PCR-RFLP方法时，欲扩增的DNA被设计成含有能适用于此后RFLP方法的特异性酶切位点。

对此设计无限制，只要用酶切割DNA区获得的片段长度在突变基因、野生型基因的情形中不同。可使用通过ND2基因的突变产生或丢失的限制酶位点。

因此，根据PCR方法扩增的所需DNA片段，通过上述合理选择的限制酶得以设计。酶切产生的片段通过电泳证实，它们显示特定的条带。根据在上述方法中获得的带型，可测定mtDNA A4824G单核苷酸多态性。

在进行本发明的基因诊断时，优选使用用于测定根据mtDNA A4824G单核苷酸多态性的突变类型存在的诊断试剂，诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定mtDNA A4824G单核苷酸多态性突变类型的方法。特定的试剂按采用的测定方法来适当地选择。试剂的特征是，组成测定由mtDNA A4824G单核苷酸多态性定义的突变类型的手段是必要的，如，DNA片段或作为用于测定的特异限制酶。试剂，例如特定制备的用于PCR扩增步骤的引物，该步骤用于包含mtDNA A4824G单核苷酸多态性的突变点的特定扩增片段，不被认为是本发明诊断试剂的必要成分，它们也包含于本发明的诊断试剂之中。

本发明的优点是：本发明首次阐明了mtDNA A4824G单核苷酸多态性位点与T2DM的相关性，提供了一种预测T2DM易感性的方法，该方法可用于T2DM的辅助诊断。本发明提供的检测试剂盒，灵敏度高，特异性强，便于推广实施。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以使公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制。

附图说明

图1为PCR-直接测序法所得的多核苷酸序列结果经生物信息学比对后识别线粒体ND2基因mtDNA4824SNP标记。

图2为mtDNA A4824G的基因分型电泳图。图谱中上方1-14和Marker为电泳泳道，其中，4、5、6、8泳道：为G基因型的基因分型结果；1、2、3、7、9、10、11、12、13、14泳道：为A基因型的基因分型结果；Marker泳道：为Marker2000，指示碱基(bp)的分子数量(图右侧)。图左侧，对应的为mtDNA A4824G处，等位基因A被G代替，形成限制性内切酶Bstp I的酶切位点。PCR扩增和酶切后结果表明：突变型G不含酶切位点，仅有一条682bp的片断；野生型A被Bstp I完全消化，形成389bp和293bp的两条片断。

图3-1和图3-2为Bstp I酶切电泳分型方法结果由DNA测序验证图。线粒体ND2基因mtDNA 4824基因位点使用本专利试剂盒基因型分型结果与DNA测序结果一致。

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下。

需要时，用高压锅(120℃，20分钟)灭菌

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

SDS：十二烷基硫酸钠

TE：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA(pH8.0)

10×PCR缓冲液：100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM氯化镁(MgCl2)0.01％(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

甲酰胺颜料：95％去离子甲酞胺，0.05％葡聚糖蓝

ARS：过硫酸铵→10×TBE：Tris(108g)，硼酸(55g)，EDTA2Na(9.3g)，溶于纯水中，总体积为1升。

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取

一.病例选择

按WHO(1999)标准明确诊断入选病例，须经空腹8-12小时口服溶入300ml温水中的75g无水葡萄糖，2小时后检测其血浆葡萄糖值≥11.1mmol/L，共计收集来自中国北方的无亲缘关系T2DM患者133例，男性71例、女性62例。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了本单位伦理委员会批准。

二.制备基因组DNA

在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2％NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2％的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10％SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16ul和20ul，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37℃过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tris溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离10分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着逆混合并以3000rpm离心分离10分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10，3M NaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70％的乙醇洗涤以获得基因组DNA。使这样获得的DNA，基因组DNA溶解于TF中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/ul，置-20℃冰箱保存。

实施例2：SNP的识别确定

本发明采用PCR-RFLP和PCR测序技术同时对mtDNA 4824位点(其等位位点对为A/G)进行检测。

一.方法

1.特异性引物如下

F1：5′-GGGGCTTTTACAACCAATATG～3′(SEQ ID NO：1)

R1：5′-TAGGATTGATGATGGCGTAAG～3′(SEQ ID NO：2)

2.通过PCR扩增mtDNA 4824附近部分片段，制备混合液，加入上述实施例1制备的基因组DNA溶液2ul、2ul 10X PCR缓冲液、0.6ul 10mM dNTP、0.5ul Taq DNA聚合酶和0.2ul上述步骤1)叙述的每种引物。接着，加入纯水，使总体积为20ul。反应在94℃5分钟，95℃45秒，56℃45秒，72℃45秒，72℃7分钟，进行30个循环。反应完成后，将10ul每种PCR反应液在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳获得了单一的条带，观察在BioRad成像仪，应用Gel Doc 2000程序。

3.通过用限制酶处理PCR反应产物测定mtDNA 4824，使用F1和R1分别为有义引物和反义引物进行PCR。

二.结果

扩增了682bp的片段。往10ul上述扩增的PCR反应产物中加入1ul限制酶反应缓冲液、3U限制酶Bstp I，并在37℃消化过夜。此后，在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。多态性的测定为：用限制酶Bstp I处理片段，4824位碱基如果为A，出现389bp和293bp的两条带；如果为G，仅出现682bp一个条带。见图2，电泳图谱。

实施例3：mtDNA 4824单核苷酸多态性与T2DM的相关

一.统计方法

利用STATA8.0和SPSS 11.0软件中Yates卡方检验计算mtDNA 4824单核苷酸多态性的携带者频率，进行连续校正和单侧渐近概率分析，统计学的显著性水平设定为P＜0.05。采用单因素Logistic回归分析计算T2DM的患病风险OR值及其95％可信区间(CI)。

二.结果

1.健康人mtDNA 4824单核苷酸多态性分布

按实施例1和2的方法测定了159个健康人的基因多态性。20人在第4824位碱基有G多态性(12.6％)，139人有A的多态性(87.4％)。

2.T2DM病人mtDNA 4824单核苷酸多态性分布

按实施例1和2的方法测定133个T2DM病人的基因多态性。6人在第4824位有G碱基多态性(4.5％)，发现127人有A碱基多态性(95.5％)。

3.T2DM病例和健康对照组比较

T2DM病例和健康对照组先按照BMI进行分组之后，比较其mtDNA 4824，其等位位点对为A/G多态性的频率分布，详见表1。

表1可见，mtDNA第4824位的常见SNP位点的G等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，当突变为G时，在健康正常群体中的分布频率大大高于在患者群体中的频率，相差约8％，有显著性差别(P＝0.016)。而且OR值反映位点A的频率在T2DM中高出正常人3.05倍，95％CI下限＞1，均表明这是T2DM患病的一个较高风险的等位基因。A4824G位于ND2基因，其表达产物为NADH脱氢酶(复合体I)亚单位2，该突变为错义突变，突变后使苏氨酸被替代为丙氨酸，在功能上可能通过影响DNA的序列和空间结构，影响了DNA的转录和剪切。

表1mtDNA 4824单核苷酸多态性(SNP)频率风险性在T2DM和健康正常人群中的比较

实施例4：检测试剂盒

本试剂盒供10人份检测应用，保存温度为-20℃，包括：

20ul 10X PCR缓冲液(Pharmacia)，

6ul 10mM dNTP混合液(Pharmacia)，

5ul(2unit/ul)Taq DNA聚合酶(T8kara)，

各2ul(50pmol/ul)F1(SEQ ID NO 2)和R1(SEQ ID NO 3)引物(自制)，1.5ml纯水(自制)，

10ul 10X限制酶反应缓冲液(Fermentas)，

3ul(2unit/ul)限制酶Bstp I(Fermentas)。

引物序列为：

F1：5′-GGGGCTTTTACAACCAATATG～3′(SEQ ID NO：1)

R1：5′-TAGGATTGATGATGGCGTAAG～3′(SEQ ID NO：2)

本试剂盒经PCR-RFLP检测后，可轻易检测出第4824位的A→G的SNP。

本发明具有实用性的例证：

1.本发明的mtDNA 4824单核苷酸多态性的检测方法，可用于分析人线粒体的ND2基因上的常见SNP的A等位位点，应用在对T2DM的辅助性诊断和对个体是否有多大的T2DM患病风险进行评估，以利于开展T2DM的早期干预和治疗。

2.利用本发明阐述mtDNA 4824碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，促进T2DM新药开发。

3.本发明建立的检测mtDNA 4824单核苷酸多态性的核酸序列和T2DM相关位点，可高灵敏度，特异性地应用于T2DM基因诊断用的试剂盒。

如上所述，得出结论，mtDNA单核苷酸多态性在第4824位碱基的多态性与T2DM具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因诊断。

本发明叙述了与T2DM相关的新突变点，并提供了一种测定mtDNA 4824单核苷酸多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定mtDNA 4824单核苷酸多态性的多态性。结果，本发明提供了一种测定T2DM相关基因多态性的基因诊断方法。

序列表

<110>卫生部北京医院

<120>一种线粒体ND2基因SNP预测2型糖尿病易感性的方法及试剂

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成的引物F1

<400>1

ggggctttta caaccaatat g    21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成的引物序列R1

<400>2

taggattgat gatggcgtaa g    21

Claims (3)

1.一种预测2型糖尿病易感性的方法，其特征在于：该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的mtDNA 4824多态性位点的A/G单核苷酸多态性，预测受试者对2型糖尿病的易感性：碱基为G时，受试者的易感性较低；碱基为A时，受试者的易感性较高。

2.一组预测2型糖尿病易感性的引物，其长度为19～22bp，能特异性地扩增出包含ND2基因第4824位单核苷酸多态性(SNP)(A4824G)的产物，具有序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

3.一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成，保存温度为-20℃：

20ul 10X PCR缓冲液，

6ul 10mM dNTP混合液，

5ul 2unit/ul Taq DNA聚合酶，

各2ul 50pmol/ul F1和R1引物，

1.5ml纯水，

10ul 10X限制酶反应缓冲液，

3ul 2unit/ul限制酶Bstp I，

引物F1为序列表SEQ ID NO：1所示的碱基序列，引物R 1为序列表SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

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