CN101671325B - 微红新月蕨化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微红新月蕨化合物及其制备方法和应用。本发明提供了新的微红新月蕨化合物的化学结构式，所述化合物从植物微红新月蕨制备得到，具有杀虫、杀菌、抑制癌细胞活性，可广泛应用于制备杀虫剂、杀菌剂和治疗癌症的药物。本发明首次从蕨类植物中找到活性化合物，为进一步研究蕨类植物的防虫抗病提供重要的技术基础；本发明制备方法简单，制备成本低，适合工业化推广。

Description

微红新月蕨化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学技术领域，具体涉及从植物微红新月蕨中制备得到的化合物及其制备方法及化合物的应用。

背景技术

植物和昆虫由于相同的生境，自远古时代起就一直生活在一起，两者相互依存、相互制约、共同演化发展。在漫长的进化过程中，植物为了防御昆虫的危害，在代谢过程中产生次生物质，这些次生代谢产物对昆虫具有拒食、忌避、毒杀和抑制昆虫的生长发育等作用。

目前植物性农药是生物农药研发的一个热点，植物性农药研究的理论基础是植物与昆虫的协同进化关系，由于被子植物和现代农业昆虫的密切关系，人们的研究焦点主要集中在被子植物。如印楝素、鱼藤酮等已经商品化的植物性杀虫剂均是被子植物源杀虫活性成分，而氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、新烟碱类杀虫剂的活性母体或者说是先导化合物也均来源于被子植物。目前应用的商品化植物性杀虫剂，没有来源于蕨类和裸子植物的活性成分。

然而，根据协同进化关系来看，蕨类植物与昆虫的协同进化历史远远长于被子植物，自原始昆虫开始一直到现代昆虫形成，蕨类植物就开始与昆虫协同进化，整个过程持续将近3亿年。被子植物起源于白垩纪，与昆虫的协同进化史只有6500万年，在这6500万年里，被子植物就对昆虫形成了完善的防御体系，其中次生代谢物质是植物防御害虫的重要手段之一。某种程度上来说，蕨类或裸子植物对昆虫的防御体系可能比被子植物更为完善。进入新生代后，就是在显花植物出现后，现代农业昆虫才放弃了裸子和蕨类植物，这些植物的一些防御手段可能湮灭在历史的长河中，但也可能保留下来了。

蕨类或裸子植物挺过了第三纪和第四纪的两次冰川时期，并在与占优势地位的被子植物的竞争中繁衍下来，说明它们的抗逆性更强，而防虫抗病是这些能力的重要体现。

因此，我们从蕨类和裸子植物中可能找到古老的对现代昆虫具有毒杀活性的化合物，这些化合物在防治当今害虫中可能起到意想不到的效果。基于这一点，目前尚无相关技术报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一类从植物微红新月蕨(Pronephrium megacuspe)制备得到的化合物。

本发明的另一目的是提供所述化合物的制备方法。具体是提供一种从微红新月蕨(Pronephrium megacuspe)中制备化合物新月蕨素A(I)、新月蕨素B(III)、新月蕨素C(IV)、新月蕨素D(V)、新月蕨素E(VI)和新月蕨素F(II)的方法。

本发明还有一个目的就是提供所述化合物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种微红新月蕨化合物，化学结构式如式(I)～(VI)所示：

上述化合物分别命名为新月蕨素A(I)、新月蕨素B(III)、新月蕨素C(IV)、新月蕨素D(V)、新月蕨素E(VI)和新月蕨素F(II)。

本发明同时提供了上述化合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)采集微红新月蕨全草，阴干后粉碎；

(2)用有机溶剂提取粉碎后的微红新月蕨全草，提取液减压浓缩制得膏状提取物；

(3)将膏状提取物溶解后用有机溶剂萃取，得到有机溶剂部分浸膏产物；

(4)有机溶剂部分浸膏产物经硅胶常压柱层析后收集馏分分别上HP-20大孔吸附树脂、硅胶常压柱层析、Sephdex-20即可得到纯化合物。

步骤(2)所述有机溶剂为95％甲醇；所述提取是冷浸提取，优选提取3次，每次提取的时间是3天。

步骤(3)所述有机溶剂为乙酸乙酯；

步骤(4)所述硅胶为200～300目，所述常压柱层析采用三氯甲烷∶甲醇＝1∶0～1∶1。

步骤(4)所述馏分分别为三氯甲烷∶甲醇＝1∶0、三氯甲烷∶甲醇＝20∶1、三氯甲烷∶甲醇＝10∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶1。

本发明同时提供了上述化合物在制备杀虫剂、杀菌剂或治疗癌症的药物方面的应用。

尤其是：

所述新月蕨素E和香豆素的配合使用应用于制备治疗肝癌药物；特别是二者以1∶1的比例配合使用对人体外肝癌细胞的毒性更强。

所述新月蕨素B和新月蕨素F配合使用在制备抑菌制剂方面的应用；特别地，二者的配合对荔枝霜疫霉菌的抑菌活性很强，其中新月蕨素B∶新月蕨素F＝1∶1混合使用对荔枝霜疫霉菌的抑菌活性更强。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一类具有杀虫、杀菌、抑制癌细胞活性的化合物，所述化合物是从蕨类植物中找到的，为进一步研究蕨类植物的防虫抗病提供重要的启示；

本发明经过大量的实验也已经证明所述化合物的生物活性，可广泛应用于制备杀虫剂、杀菌剂和治疗癌症的药物；

本发明制备方法简单，制备成本很低，适合工业化推广。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1

化合物新月蕨素A、新月蕨素B、新月蕨素C、新月蕨素D、新月蕨素E和新月蕨素F的制备

(1)取微红新月蕨全草7.5Kg，阴干，粉碎，用95％甲醇共80ml冷浸提取3次，每次3天，将3次冷浸提取的滤液合并后减压浓缩后得浸膏约800g；

(2)将浸膏悬浮于1升水中，分别用1.5升、1升、1升乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压回收，得乙酸乙酯部分浸膏230g；

(3)乙酸乙酯萃取部分经300目硅胶常压柱层析后得到4个馏分，柱层析条件：三氯甲烷∶甲醇＝1∶0至1∶1；4个馏分分别为三氯甲烷∶甲醇＝1∶0、三氯甲烷∶甲醇＝20∶1、三氯甲烷∶甲醇＝10∶1、三氯甲烷∶甲醇＝5∶1、三氯甲烷∶甲醇＝1∶1。

馏分2至5(Fr.2～5)分别上HP-20大孔吸附树脂，HP-20大孔吸附树脂条件：水∶甲醇＝1∶0、水∶甲醇＝90∶10、水∶甲醇＝0∶1，水∶甲醇＝1∶0冲洗下来的部分弃去，分别收集水∶甲醇＝90∶10、水∶甲醇＝0∶1部分，得到馏分Fr.2.1、Fr.2.2、Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.4.1、Fr.4.2、Fr.5.1、Fr.5.2；馏分Fr.2.1经2次硅胶常压柱层析，所述硅胶常压柱层析条件：石油醚∶丙酮＝1∶0～0∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0～0∶1，收集石油醚∶丙酮体积比95∶5到90∶10的馏分经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)纯化，以甲醇洗脱，得到新月蕨素B3.5mg；收集石油醚∶丙酮体积比85∶15到60∶40的馏分经第2次硅胶常压柱层析，收集石油醚∶乙酸乙酯体积比4∶1到3∶1的馏分经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)纯化，以甲醇洗脱，得到新月蕨素A2.6mg；馏分Fr.2.2经过一次硅胶常压柱层析，所述硅胶常压柱层析条件：石油醚∶乙酸乙酯＝1∶0～0∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯体积比90∶5到80∶10的馏分经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)纯化，以甲醇洗脱，得到新月蕨素C 2.0mg；馏分Fr.3.1经过硅胶常压柱层析，所述硅胶常压柱层析条件：石油醚∶三氯甲烷＝1∶0～0∶1，收集石油醚∶乙酸乙酯体积比90∶5到10∶1和8∶1到3∶1的馏分分别经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)纯化，以甲醇洗脱，得到新月蕨素D2.8mg和新月蕨素E3.2mg；馏分Fr.5.2经过硅胶常压柱层析，所述硅胶常压柱层析条件：三氯甲烷∶丙酮＝1∶0～0∶1，收集三氯甲烷∶丙酮体积比95∶5到85∶15的馏分经羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)纯化，以甲醇洗脱，得到新月蕨素F4.2mg.通过NMR谱、质谱等相关图谱确认纯化合物的结构式，即得化合物新月蕨素A、新月蕨素B、新月蕨素C、新月蕨素D、新月蕨素E和新月蕨素F。

实施例1制备的相关化合物的波谱数据见表1～6。

表1  新月蕨素A的波谱数据(δin ppm，J in Hz，C₅D₅N)

表2  新月蕨素B的波谱数据(δin ppm，J in Hz，C₅D₅N)

表3  新月蕨素C的波谱数据(δin ppm，J in Hz，DMSO-d₆)

表4  新月蕨素D的波谱数据(δin ppm，J in Hz，C₅D₅N)

表5  新月蕨素E的波谱数据(δin ppm，J in Hz，C₅D₅N)

表6  新月蕨素F的波谱数据(δin ppm，J in Hz，CD₃OD)

实施例2本发明制备的化合物对昆虫具有生物活性的实验

对亚洲玉米螟3龄幼虫拒食活性的测定方法：本发明方法制备的化合物用丙酮溶解，配制成浓度为1000μg/mL的母液。用丙酮+水把母液分别配制成浓度为50μg/mL的药液，药剂中丙酮的最终浓度为30％。采用新鲜玉米心叶法，叶碟直径1cm，用配制好的药液分别浸渍叶碟3s，待溶剂挥发干后放入垫有湿润滤纸的培养皿中，每皿1片叶碟，接入已饥饿4h的亚洲玉米螟3龄幼虫1头，每处理重复10次，每次检查完实验结果后换上新的药剂处理叶片。分别在处理24h、48h、72h后测量各处理剩余叶面积。

对小菜蛾3龄幼虫触杀活性的测定方法：触杀活性的测定使用点滴法。每处理3次重复，每重复10头幼虫。本发明方法制备的化合物用丙酮溶解，配制成浓度为2000μg/mL的母液，用丙酮稀释母液，分别配制成浓度为1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL的药液。用微量点滴仪将1μL本发明制备的化合物各浓度药液点滴到小菜蛾3龄幼虫的前胸背板，以丙酮为对照。处理完毕后把小菜蛾3龄幼虫转移至干净培养皿中，饲喂新鲜无药剂的甘蓝叶子，72h后检查试虫的死亡率。

对小菜蛾3龄幼虫和亚洲玉米螟3龄幼虫的生物活性实验结果见表7和表8：

表7  1μg/头供试化合物对小菜蛾3龄幼虫的触杀活性(72h)

表8  50μg/mL供试化合物对玉米螟的拒食活性测定

实验证明，本发明提供的化合物对昆虫具有良好的生物活性。

实施例3本发明化合物具有细胞毒性的实验

药液配制：用少量丙酮或二甲基亚砜(DMSO)将本发明制备得到的供试化合物溶解后配成母液，在超净工作台上以0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，并用含1％DMSO的培养基分别将药剂配成试验所需浓度，丙酮的最终浓度为2.5％，DMSO的最终浓度为1％。以含1％DMSO或2.5％丙酮的培养基为对照。

离体细胞毒性试验方法：采用MTT法。取对数生长期的SL细胞、人体肝癌细胞(SMMC-7721)、人乳腺癌细胞(MCF-7)接种于96孔培养板内，每孔加入100μL，培养24h，将培养板翻转倒出培养液，每孔加入100μL相应浓度的药液，继续培养20h、44h，即测定前4小时加入MTT母液10μL并轻微震荡，放入27℃继续培养4h后倒出培养液，每孔加入100μL DMSO用酶标仪进行检测490nm的吸光值，整个过程需避光。以对照的细胞相对活力为100％，将各组吸光值按以下公式换算为细胞相对活力。

供试化合物对人体外肝癌细胞的毒性结果见表10。

表9  50μg/mL供试化合物对斜纹夜蛾卵巢细胞的细胞毒性

表10  供试化合物对人肝癌细胞(SMMC-7721)的细胞毒性(48h)

表11  供试化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞毒性(48h)

实验证明本发明提供的化合物具有细胞毒性。供试化合物对斜纹夜蛾卵巢细胞的细胞毒性结果见表9，供试化合物对人体肝癌细胞和乳腺癌细胞的离体细胞毒性结果见表10和表11，同时，新月蕨素E+香豆素(1∶1)对人体外肝癌细胞的毒性更强。

实施例4本发明化合物的抑菌活性实验

对荔枝霜疫霉的活性测定方法(菌丝生长抑制法)：将本发明方法制备的化合物用丙酮溶解，配制成浓度为2000μg/mL的母液。取浓度为2000μg/mL的化合物母液为最高浓度，再对半稀释，分别配制成药液浓度为1000、500、250、125μg/mL。制备PDA培养基，待PDA培养基冷却到45℃左右，分别吸取1mL各浓度的化合物药液加入9mL融化的培养基中，立即混匀后倒平板，每浓度设置3个重复。培养基中最终药剂浓度分别为200、100、50、25和12.5μg/mL。培养基凝固后接入荔枝霜疫霉菌种(5mm)置于培养皿中央，带菌丝一面朝下，置于恒温培养箱(25℃)中培养7d后，采用十字交叉测量法测量菌落直径，计算生长抑制率并计算抑制中浓度(IC₅₀)。

实验结果见表12。

表12  活性化合物对荔枝霜疫霉病菌的IC₅₀值(7d)

对香蕉炭疽病菌的活性测定方法(孢子萌发抑制率法)：将本发明方法制备的化合物用少量丙酮溶解，配制成浓度为200μg/mL的母液。取浓度为200μg/mL的化合物母液为最高浓度，再对半稀释，分别配制成药液浓度为100、50、25、12.5μg/mL。孢子悬浮液的制备：香蕉炭疽病菌在PDA培养基平板上，于25±1℃，RH 95％条件下培养5～7d后，用无菌水洗下孢子，配制成孢子悬浮液，浓度为10×40倍显微镜下观察每个视野30～40个孢子。孢子囊悬浮液和不同浓度的化合物溶液按照体积比1∶1混合，得到不同浓度的含药孢子悬浮液，同时以溶解提取物或化合物相同体积的对应溶剂加入孢子悬浮液中为空白对照，在25±1℃，RH 98％条件下培养5～7h。取培养后的含药菌液与空白对照，在10×40倍显微镜下观察并统计孢子萌发结果。在自然状态下植物病原菌的孢子存在一部分就是不萌发的，所以孢子萌发抑制率在计算时需要加以校正，一般采用Abbott氏公式进行校正。

实验结果见表13

表13  活性化合物对香蕉炭疽病菌的IC₅₀值(5～7h)

实验证明本发明化合物对荔枝霜疫霉菌(Peronophth litchii)和香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)具有良好的抑菌活性，同时，新月蕨素B+新月蕨素F(1∶1)混合使用对荔枝霜疫霉菌的抑菌活性更强。

Claims (10)

1.一种微红新月蕨化合物，其特征在于具有如式(I)～(VI)所示化学结构式：

2.一种权利要求1所述微红新月蕨化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采集微红新月蕨全草，阴干后粉碎；

(2)用有机溶剂提取粉碎后的微红新月蕨全草，提取液减压浓缩制得膏状提取物；

(3)将膏状提取物溶解后用有机溶剂萃取，得到有机溶剂部分浸膏产物；

(4)有机溶剂部分浸膏产物经硅胶常压柱层析后收集馏分分别上HP-20大孔吸附树脂、硅胶常压柱层析、Sephadex LH-20即可得到纯化合物。

3.根据权利要求2所述微红新月蕨化合物的制备方法，其特征在于步骤(2)所述有机溶剂为95％甲醇；所述提取是冷浸提取3次，每次3天。

4.根据权利要求2所述微红新月蕨化合物的制备方法，其特征在于步骤(3)所述有机溶剂为乙酸乙酯。

5.根据权利要求2所述微红新月蕨化合物的制备方法，其特征在于步骤(4)所述硅胶为200～300目，所述常压柱层析采用三氯甲烷∶甲醇＝1∶0～1∶1；所述Sephadex LH-20采用的洗脱剂为丙酮或甲醇。

6.一种权利要求1所述微红新月蕨化合物的应用，其特征在于具有式(I)～(VI)所示结构的化合物在制备杀虫剂、杀菌剂或治疗癌症的药物方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于具有式(VI)所述结构的化合物新月蕨素E和香豆素的配合使用应用于制备治疗肝癌药物方面。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述新月蕨素E和香豆素以1∶1的比例配合使用应用于制备治疗肝癌药物方面。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于具有式(III)所示结构的化合物新月蕨素B和式(II)所示结构的化合物新月蕨素F混合使用在制备抑菌制剂方面的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述新月蕨素B和新月蕨素F以1∶1的比例配合使用对荔枝霜疫霉菌的抑菌方面。