CN101669032A - 通过膜联蛋白a3对前列腺癌症的自身免疫调节 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诊断前列腺癌的方法，所述方法包括用特定试剂测定膜联蛋白A3(ANXA3)和/或针对ANXA3的自身抗体。本发明允许对良性、癌前和恶性病况加以区分。此外，所述方法具有预后相关性。

Description

通过膜联蛋白A3对前列腺癌症的自身免疫调节
技术领域
本发明涉及诊断前列腺癌的方法，所述方法包括用特定试剂测定膜联蛋白(annexin)A3(ANXA3)和/或针对ANXA3的自身抗体。本发明允许对良性、癌前和恶性病况加以区分。此外，所述方法具有预后相关性。
背景技术
在以前的区分性定量蛋白表达研究中显示，ANXA3与前列腺癌症显著相关(1)。但是，对于ANXA3在人前列腺中的作用和生物学却所知甚少。目前显示，ANXA3是所谓的外来体(多种上皮细胞释放的小囊泡)的一部分(2)，这些外来体在对先天免疫系统的调控中的作用也极少为人所知(3)，它们的抗肿瘤活性非常近来才被发现(4)。近来的报道显示前列腺癌症患者中有针对所谓前列腺小体(其是来自前列腺的外来体)的自身免疫性(5)。
用于治疗或诊断前列腺癌症和泌尿生殖道的其它上皮癌症的蛋白生物标记物被描述于US 2005 130 876、WO 03 086 461、WO 2005 078124、EP 05 011 042.8和EP 05 026 092.6中。这些文献的内容都通过引用并入本文。
US 60/812,089和US 60/859,489公开了一种癌症诊断方法，其中，用高度特异性的单克隆抗体针对膜联蛋白A3的存在和/或含量来分析样品。这些文献的内容都通过引用并入本文。
虽然ANXA3已知是前列腺癌症的标记物，但仍需要改进的方法用于对良性、癌前和恶性病况加以区分性诊断。
发明内容
本研究的目的之一是调查ANXA3在良性前列腺上皮、高度前列腺上皮内瘤(HGPIN)和前列腺癌症的上皮组分中的表达和定位，以及理解前列腺转化进程中的定位改变和区别。
根据本发明，我们发现，良性前列腺组织中抗ANXA3染色强且在尖部(apical)，而在癌症中其较弱并且处于更基底处。用超过1900个病例进行的组织阵列研究显示，ANXA3表达在良性、癌前和恶性前列腺组织中的不同模式具有预后相关性并且提供了机制性的理解。
在进展期癌症中，观察到ANXA3在非上皮散布(interspresed)细胞中的存在，其通过针对调控性T-细胞(Tregs)的复染色而局部化(colocalize)。此外，可在癌症患者中检测到针对ANXA3的自身抗体的存在。这些针对ANXA3的自身抗体可能是在癌症细胞的氧化应激下被诱导出来的。这证明：经由外来体的ANXA3释放构成了一种保护性机制，在前列腺癌症患者中，癌症细胞通过诱导针对含ANXA3的前列腺小体的自身免疫试图复原。因此，可通过ANXA3外来体和/或癌症细胞来调节Tregs的信号化。此外，可通过ANXA3阳性T细胞来诱导/调控针对前列腺小体/外来体的自身免疫抗体。
综合考虑，强烈表明：良性前列腺增生(BPH)期间ANXA3向前列腺细胞外区室中的释放构成针对癌症的防御机制，癌组织通过诱导针对ANXA3的自身免疫抗体以及通过涉及到调控性T-细胞(Tregs)的机制，最终使得这种释放停止。不同的ANXA3染色模式也首次提供了在通过Gleason分数、pT-分期和PSA划分的中等风险组中预测PSA无进展存活的可能性。
在第一个方面，本发明涉及诊断癌症(优选地，前列腺癌症)的下述方法，其中针对膜联蛋白A3的细胞内分布来分析组织样品。
在另一方面，本发明涉及诊断癌症(优选地，前列腺癌症)的下述方法，其中，针对膜联蛋白A3的细胞内分布和/或含量以及针对对膜联蛋白A3的自身免疫应答，对样品(例如组织样品或体液样品)加以分析，其中，优选通过针对膜联蛋白A3的自身抗体的存在和/或通过调控性T-细胞的存在，来表征自身免疫应答。
本发明的另一方面涉及诊断癌症(优选地，前列腺癌症)的下述方法，其中，针对针对膜联蛋白A3的自身抗体的存在和/或含量以及任选地针对调控性T-细胞的存在和/或含量，对样品加以分析。
本发明的还一方面涉及对已被归类为具有发展性前列腺癌症中等风险的受试者进行程度划分的方法，其中，针对膜联蛋白A3的存在、定位和/或含量对来自所述受试者的样品加以分析。
本发明的还一方面是用于诊断癌症(优选地，前列腺癌症)的测试试剂，其包含(i)用于测定膜联蛋白A3的试剂和(ii)用于测定针对膜联蛋白A3的自身抗体的试剂和/或用于测定调控性T-细胞的试剂。
本发明的还一方面是用于诊断前列腺癌症的测试试剂，其包含用于测定针对膜联蛋白A3的自身抗体的试剂。
可根据本发明诊断的癌症优选是泌尿生殖和/或胃肠道的癌症，例如前列腺、膀胱、肾、尿道、卵巢、子宫或结肠的癌症。特别地，癌症是上皮癌。在一种尤其优选的实施方式中，癌症是前列腺癌症。
在一种优选的实施方式中，本发明包括对疾病阶段的区分性诊断和/或预后评价。例如，本发明允许对选自下述的疾病阶段进行区分性诊断：
(i)良性病况，特别地，良性前列腺病况，例如，良性前列腺增生(BPH)、纤维化和慢性前列腺炎，
(ii)癌前病况，例如，多种阶段(PIN-1-3)的前列腺上皮内瘤，包括高度上皮内瘤(HGPIN)1，和/或
(iii)恶性病况，例如，前列腺癌，特别是通过Gleason分数和pT-分期指示的处于进展期(progressed)状态的进展期(advanced)前列腺癌。
更优选地，本发明允许一方面在良性和癌前病况之间进行区分性诊断，另一方面对恶性病况进行区分性诊断。
在本发明的一种优选的实施方式中，在样品中测定ANXA3的存在、含量和/或分布，所述样品可以是体液或组织样品。更优选地，样品是组织样品，例如，来自前列腺组织的组织切片或活检样品。在另一实施方式中，可在样品中测定ANXA3的细胞内分布/定位，其中所述样品是组织样品，优选是组织切片或活检样品，例如来自前列腺组织的。优选地，在上皮细胞中测定ANXA3的细胞内定位，特别是在前列腺上皮细胞中测定。应当注意，可在单种组织样品或不同样品(例如，来自同一受试者的体液样品和组织样品)上测定存在、含量和细胞内定位。
样品中高含量的ANXA3(例如，对应于组织样品的强染色)基本上指示良性病况。中等/低含量的ANXA3(例如，对应于组织样品的弱/中等染色)指示癌前病况或者早期/早-中期恶性病况。样品中不存在ANXA3指示恶性病况，基本上是处于进展期状态的恶性病况，例如，在中期或晚期。此外，样品中不存在ANXA3指示前列腺癌证的侵略性亚组，特别是具有手术(根治性前列腺切除术)后进展的高风险。
ANXA3的尖部细胞内定位，特别是ANXA3在尖部定位的囊泡(例如外来体和前列腺小体)中的存在，基本上指示良性或癌前病况。ANXA3的扩散性细胞内定位，特别是组合不存在尖部定位的囊泡的情况时，指示恶性病况。
针对ANXA3的自身免疫应答的存在，例如，针对ANXA3的自身抗体的存在，和/或强ANXA3-阳性(但是是细胞内的，非尖部的)调控T-细胞的存在，基本上指示恶性病况，特别是处于进展期状态的恶性病况。
本发明包括对样品中多肽或细胞的测定。优选地，这种测定包括免疫学方法，其中，使用免疫测试试剂来测定组分的存在、含量和/或定位。
用于测定样品中ANXA3的试剂优选是特异于ANXA3的抗体，例如，多克隆抗体或单克隆抗体。尤其优选的是高特异性单克隆抗体，如US60/812,089和US 60/859,489(它们通过引用并入本文)所述。
用于测定样品中ANXA3自身抗体的试剂优选是ANXA3多肽或其包含可被自身抗体识别的表位的片段。更优选地，ANXA3多肽是重组ANXA3多肽。
用于测定样品中调控性T-细胞的试剂优选是针对调控性T-细胞的标记物(例如，CD25或Foxp3或其它此类标记物)的抗体。
本发明的方法可在适于免疫测定的任何测试形式中进行，包括适于自动设备的测试形式。在一些测试形式中，可优选使用带有标记基团(例如可视标记物，例如，胶乳或金粒、荧光标记物基团、酶标记物基团等)的试剂。可根据标准方法来生产试剂和标记基团的缀合物，例如通过将试剂的反应活性氨基酸侧基团(例如羧基、氨基和/或硫醇基)与标记基团共价偶联，例如通过双功能间隔(spacer)分子。
优选地，从人类受试者获得样品。在一些实施方式中，所述方法是非侵入性的诊断流程，其中，样品可以是尿样，特别是exprimate尿样或粪便样品。如果需要的话，可对样品进行预处理流程，例如凝胶过滤。在另一些实施方式中，所述方法可以是组织化学流程，其中样品可以是组织样品，特别是活检样品，例如，钻取(punch)或穿刺(lance)活检样品或来自TUR-P(经尿道前列腺电切术)的样品。在组织化学流程中，可通过测定ANXA3在样品中的定位来对细胞内或细胞外的ANXA3进行选择性测定。
在一种优选的实施方式中，本发明包括对ANXA3的半定量或定量测定。这种半定量或定量测定可包括：基于预先确定的分离点值(cut-off value)来评估测试结果以及将评估结果与疾病阶段关联起来。可通过根据已知方法，在来自健康人和/或具有预先确定的疾病阶段的人的样品中测定ANXA3来确定分离点值。此外，还可通过评估经染色的组织样品以及将评估结果与疾病阶段关联起来，来测定ANXA3在样品中的量。
本发明还涉及对自身抗体针对ANXA3的自身免疫应答的测定和/或对调控性T-细胞存在的测定。这种测定可单独进行或可与对ANXA3的测定组合进行。自身抗体的存在指示恶性病况，特别是处于进展期阶段的恶性病况。对自身抗体的测定任选与对调控性T-细胞的测定相组合。调控性T-细胞的存在指示恶性病况，特别是处于进展期阶段的恶性病况。
可对样品进行分级分离流程，这允许对细胞内和细胞外ANXA3进行分别的测定。例如，可对样品加以离心，以获得细胞沉淀团和上清液，其中，在细胞沉淀团中测定细胞内膜联蛋白A3，在上清液中测定细胞外膜联蛋白A3。在一种尤其优选的实施方式中，所述方法包括对细胞外ANXA3进行选择性测定。在另一种尤其优选的实施方式中，所述方法包括对细胞内ANXA3进行选择性测定。
本发明的方法还可包括对其它癌症标记物(例如，癌症标记物)加以测定。对其它癌症标记物的测定可以在其中测定ANXA3的相同样品中进行，或者可在不同样品中进行，例如，血、血清和/或血浆样品。尤其优选的是对血、血清或血浆标记物的测定，特别是对激肽释放酶(kallikrein)蛋白酶家族中至少一种成员(例如前列腺特异性抗原(PSA))和/或至少一种上皮细胞标记物(特别是前列腺特异性膜抗原(PSMA))的测定。
本发明可以是下述筛选流程，其中，针对癌症，特别是前列腺癌症，对个体或个体的组加以测试。
另一方面，所述方法还可包含预后评估或治疗后续测试，其中，对已经诊断为癌症(特别是前列腺癌症或其之前阶段)阳性的个体进行预后评估和/或治疗控制监测。
在一种尤其优选的实施方式中，本发明涉及对疾病进展的预后评估，这在任何诊断评价(特别是针对治疗控制)中都是有用的工具。预后评估可基于仅对ANXA3的测定或者基于与其它标记物(例如PSA)的组合。例如，通过组织学评估和/或通过测量PSA或其它癌症标记物的水平，可将患者分为低风险组(例如PSA水平≤10ng/ml)、中等风险组(例如PSA水平＞10但＜20ng/ml)和高风险组(例如PSA水平≥20ng/ml)。在这些组中测定ANXA3可产生更多的有用信息，特别是在被分类为中等风险组的患者中。如果这些中等风险患者是ANXA3阳性的，那么无PSA存活的百分比将显著高于被测定为ANXA3阴性的患者。因此。本发明允许对个体患者组进行进一步的风险划分。优选地，可基于ANXA3测定结果对本来被分类为中等风险组的患者重新分类。ANXA3阳性的患者可被重新分类进低风险阻，而ANXA3阴性(以及任选地，具有针对ANXA3的自身免疫应答)的患者被分进高风险组。
进一步地，通过下述附图和实施例更详细地解释本发明。
附图描述
图1显示了良性前列腺增生样品(1A)、来自具有中等Gleason分数的前列腺癌症组织的样品(1B)和具有ANXA3阳性散布细胞的进展期癌症组织切片(1C)中ANXA3染色强度和定位的区别。这种类型的细胞还对CD3(一般性的T-细胞标记物)染色阳性(1D)；以及对CD25阳性(针对调控性T-细胞(Tregs)的特异性标记物)(1E)以及对Foxp3(另一种针对Tregs的特异性标记物)阳性(1F)。
图2显示了ANX染色结果(阴性、弱、中等、强)的总结，这取决于分别的病况(良性病况、癌前病况PIN和恶性病况)，即，根据Gleason(GS)分数分类的癌症：在良性上皮中发现了最高的染色强度。
(a)染色强度在PIN和具有增加的去分化的癌中减少。
(b)尖部ANXA3染色与增加的癌症严重性负相关。
两种参数与前列腺转化的多个阶段的关联性是高度显著的(p值＜0.001)。
ANXA3：膜联蛋白A3；PIN1：前列腺上皮内瘤。
图3显示了不同患者组中ANXA3染色与无PSA存活时间的关系。
(a)关于染色模式(尖部对比扩散)，对ANXA3阳性肿瘤的亚分析，使得可以分类为预后相关的亚组
(b)根据风险组分类，无PSA进展存活的概率
(c)通过ANXA3状态(阳性对阴性)进行亚划分，使得可以将代表最大群体的中等风险组(n＝969)分入高风险和低风险亚组(p＝0.0001)。ANXA3：膜联蛋白A3；PSA：前列腺特异性抗原。
图4显示了无PSA存活时间与ANXA3状态之间的关系。阴性ANXA3染色状态与无PSA存活显著相关。根据(b)Gleason级别、(c)pT分期和(d)外科手术前PSA(以ng/ml计)的无PSA存活概率。ANXA3：膜联蛋白A3；PSA：前列腺特异性抗原。
图5显示了自身抗体在来自前列腺癌症患者中的存在。
实施例
I.材料和方法
1.1抗体
下述抗体用于本研究：
克隆tgc7 ProVII5C5(DSM ACC2780)，单克隆，2.4mg/ml；针对靶标蛋白ANXA3。
1.2组织
分析了含有＞3000份组织样品的已有的前列腺癌症TMA。在结果部分提供了对组成的详细描述。
1.3免疫组织化学(IHC)
开发了适于在经福尔马林固定的组织中进行膜联蛋白A3检测的IHC方案。详细方案在下文中给出。
ANXA3免疫染色(IHC)方案
载片制备
●对TMAs在二甲苯中脱蜡至少1小时，GFS 2×5分钟二甲苯。
●在递减的乙醇系列直到蒸馏水中进行再水化
●在PBS缓冲液中漂洗5分钟
预处理(表位恢复)
●在乙酸pH2中对载片进行5分钟高压灭菌
●在PBS缓冲液中漂洗5分钟
过氧化物酶封闭
●在1％H2O2/甲醇中孵育10分钟
●在PBS缓冲液中润洗2×5分钟。
抗体孵育
●在PBS中以1∶8100(0.3μg/ml)稀释一抗(ANXA3)
●用100-200μl经稀释的抗体覆盖组织/TMA切片
●在潮湿腔中于30℃孵育2小时
●在TRIS-PBS缓冲液(1∶10)中漂洗2×5分钟
●在30℃应用经HRP缀合的二抗(EnVision DAKO K4003，抗兔)30分钟
●在TRIS-PBS缓冲液中漂洗2×5分钟
发色团
●用DAB-发色团(Liquid DAB DAKO Code No.：K 3467)在室温下覆盖载片10分钟
●在PBS缓冲液中彻底清洗载片
●用苏木精(Harris Hematoxylin HTX 31000，Medite GmbH)复染色1 min sec
●用水漂洗
●在水递减的乙醇系列中，在HCl-乙醇蓝中区分5分钟
●覆盖二甲苯。
1.4 IHC计分
一位病理学家对所有染色加以评估。版本a)，对于每份组织样品和抗体而言，通过目测以四级计分(0、1、2、3)来估计膜染色强度。除此之外，以4级计分来估计染色阳性的肿瘤细胞的比例(＜20％、＞＝20＜40％、＞＝40-＜90％、＞90％)。从这两个参数建立最终的IHC分数。≤≥
分数定义
分数 定义
阴性 Int  0
弱 ≤40％的肿瘤细胞中Int 1，或者≤20％的肿瘤细胞中Int 2
中等 ＞40％的肿瘤细胞中Int 1，或者＞20≤90％的肿瘤细胞中Int 1，或者＜40％的肿瘤细胞中Int 3
强 ≥90％的肿瘤细胞中Int 2，或者≥40％的肿瘤细胞中Int 3
对于某些统计分析而言，可将癌症分为阴性组(阴性)或阳性组(弱、中等、强)
1.5数据文件描述
本研究中产生的所有数据都被概括于数据文件中，其中主题描述如下所示：
主题名称 解释
TMA封闭数定位 TMA坐标TMA坐标
PSA 外科手术前的PSA(ng/ml)
pTpNGleason模式Gleason分数 pT分期组织病理学淋巴结状态Gleason分级(模式)Gleason分级(分数)
风险组 被分类为低、中等和高的风险类别
复发后续的月ANXA3％PCAANXA3  Int  PCAANXA3分数PCA PSA复发被染色的前列腺癌症细胞的比例(PCA)染色强度(0-3)IHC结果。关于定义见2.4
ANXA3模式PCA 定义为扩散胞质(扩散)对尖部着重的胞质(尖部)染色的染色模式
组合分数/模式ANXA3％PINANXA3  Int  PINANXA3分数PIN 组合分数，包括IHC分数和染色模式被染色的PIN细胞的比例染色强度(0-3)IHC结果。关于定义见2.4
ANXA3模式PIN 定义为扩散胞质(扩散)对尖部着重的胞质(尖部)染色的染色模式
ANXA3％良性ANXA3％Int良性ANXA3％分数良性ANXA3％模式良性 被染色的良性细胞的比例染色强度(0-3)IHC结果。关于定义见2.4定义为扩散胞质(扩散)对尖部着重的胞质(尖部)染色的染色模式
1.6统计学
用齐平方检验来计算不同肿瘤亚组中ANXA3表达差异的概率。用Kaplan-Meier绘图进行计算，以展现ANXA1表达对患者诊断的影响。进行Cox回归分析来进行多元分析。
2.结果
基于对含有1679份来自根治性前列腺切除术的标本的癌症核心的组织微阵列的分析，来自用针对ANXA3的特异性抗体进行的免疫细胞化学的代表性图像(图1)显示了良性前列腺增生(1A)、具有中等Gleason分数的前列腺癌症组织(1B)和进展期癌症(1C)的典型标本中ANXA3染色强度和定位的差异。此外，分析了135个良性和125个瘤前(高度PIN)伤口的组。
通常，ANXA3染色主要是胞质性的，其显示了有胞质和膜结合/囊泡模式的细胞内差异。在良性腺体上皮中，看到显著的细胞和核ANXA3染色。此外，在细胞顶点集中的小胞质囊泡中发现了染色，这导致了尖部着重的胞质染色模式。在细胞顶点，频繁观察到ANXA3阳性囊泡的形成，这对应于进入腺体小管的泌离分离过程。
良性分泌细胞和HGPIN伤口被均匀阳性染色，主要是尖部着重的胞质染色。但是，在HGPIN中，染色强度显著减少(p＜.0001)。在癌症中，染色强度进一步显著减少(包括2 7％的阴性染色，p＜.0001)，并且观察到明显从尖部着重的胞质染色模式转变为扩散胞质染色(p＜.0001)。图2中提供了对这些结果的概括。
阴性ANXA3染色与pT-分期和Gleason分数相关(p＜.0001)，但与PSA无关(p＝0.29)。Kaplan-Meier分析揭示了显著降低的无PSA进展存活(p＜.0001；对数秩检验)。在多元分析中，阴性ANXA3染色显示是独立的预后预测因素(HR 1.20，p＝.002)。表1和2中提供了细节。
通过抗体染色对进展期癌症中散布的单细胞的进一步分析显示，这些细胞主要是T-细胞(1D)，更具体地，调控性T-细胞(Tregs)，因为它们表达CD25(1E)和Foxp3(1F)(6)。Tregs近来已被报导称作用于肿瘤特异性的耐受性(7)。
关于对ANXA3阳性癌症的分析，针对Gleason分数有相关性(p＝0.04)，但是，与预期相反，高级别的癌症显示最大比例的强染色癌症(35.6％)，而弱染色的癌症在低级别和高级别的癌症中几乎相等(35.6对36.3％)。染色强度还与PSA水平相关(p＝0.0029)。ANXA3强染色的癌症在PSA≥20ng/ml的类别中最常见(41.1％)，而ANXA3弱染色在低于20ng/ml的PSA类别中最常见。对于局部进展期的癌症而言，有染色强度降低的趋势，但是这并没有达到统计显著性的要求(p＝0.0630)。
在1317名患者中可观察到PSA后续。生物化学上的复发被定义为在两次连续测量中PSA＞＝0.1ng/ml。354名患者发展出了PSA复发。所有后续上的中位数为3 3个月，而无复发患者的后续中位数为39个月。进行ANXA3-一元分析，我们显示，较之ANXA3阳性肿瘤而言，ANXA3染色阴性与显著降低的无PSA存活时间相关(p＜0.0001)。在关于染色模式方面对ANXA3阳性肿瘤的亚分析能进一步将该组患者分入两个预后相关亚组。较之尖部染色而言，在具有扩散上皮染色的ANXA3阳性肿瘤中，预后显著更糟(对数秩检验p＝0.0013，图3A)。
除了组合使用良好建立的经典预后参数PSA、Gleason级别和pT-分期之外，为进一步研究ANXA3状态是否有预后相关性，我们将我们的群体分入3个风险组。根据PSA1级别和分期，患者被分类为进展低风险、中等风险和高风险。在进展低风险的那些人群中，外科手术前PSA为10ng/ml或更低，前列腺切除术标本的Gleason分数为6或更小，癌症为器官局限性的。在进展高风险的人群中，外科手术前PSA超过20ng/ml，前列腺切除术的Gleason分数为7或更高，肿瘤分期为＞pT3。不处于低风险或高风险的那些被分入中等风险组。
如图3B所示，风险类别显示了进展的显著不同风险(p＜0.0001)。通过ANXA3状态(阳性对阴性)进行的化学能将中等风险组(代表了最大的群体(n＝922))分为高风险和低风险亚组(p＝0.0001)。在低风险或高风险组中不能定义亚组(表3)。对中等风险的Kaplan-Meier分析还显示ANA3阴性患者的PSA PFS显著降低(图3C)。
较之ANXA3阳性肿瘤而言，ANXA 3染色阴性与显著降低的无PSA存活时间相关(p＜0.0001，图4A)。然而，针对染色分数(弱对中等对强)对ANXA3阳性癌症的划分没能显示预后相关亚组(对数秩检验，p＝0.642，数据未示出)。除ANXA3染色(阴性对阳性)之外，一元分析还显示了针对已经建立的预后因子(Gleason分数、pT分期和外科手术前的PSA血清水平)的预后显著性(p＜0.0001，图4B-D)。
我们继续测试了癌症患者中抗ANXA3自身免疫性的可能性，这通过在夹心ELISA中针对针对重组ANXA3的免疫反应活性筛选患者血清来进行。对照包括ANXA5、MCV1 Ana，有及没有磷酸丝氨酸包覆。事实上，我们在一些前列腺癌症患者中发现了非常高且特异性的抗ANXA3效价。如图4所示，这些患者之一的多克隆血清对重组ANXA3，来自前列腺癌症细胞系(PC3细胞)的天然ANXA3染色(较之用相应的单克隆抗ANXA3抗体染色而言)。从该患者的全血分离B细胞，使用我们的特异性单克隆抗体，重组ANXA3和PC3细胞提取物作为阳性对照，我们能分离和培养相应的生产抗ANXA3抗体的B-细胞克隆，并由此继续分离和培养人单克隆抗ANXA3抗体。图5显示了相应的Western印迹杂交。
3.讨论
ANXA3在从良性到恶性前列腺上皮转变期间的定位和细胞内分布的持续改变及其预后显著性表明了ANXA3在前列腺组织生物学中的重要地位。分泌的ANXA3在前列腺的细胞外区室中的存在(符合报导的蛋白在外来体/前列腺小体中的存在(2)和提出的这些囊泡的抗癌症作用(4))让我们测试了ANXA3是否可被前列腺癌症患者的PC3细胞提取物或尿中的抗体所获取。FACS分析确实显示，ANXA3是潜在的抗原性表面蛋白(数据未示出)。筛选来自癌症和BPH患者的血清(来自大规模的临床研究，以评价ANXA3的诊断价值)，我们在一小组癌症患者中发现了自身抗体，并分离出了产生抗ANXA 3抗体的B细胞的相应克隆。
在目前针对早期前列腺癌症检测的标准生物标记物(PSA)的缺陷的背景上(8、9)，考虑到使用活检或完全前列腺切除术后的标本进行风险评估的困难决定性(10、11)，ANXA3提供了综合诊断蛋白生物标记的潜力。
ANXA3的关键特征之一是细胞内和细胞外分布和定位使得不仅能在体液中进行稳定的、非侵入性的检测以用于前列腺癌症的早期检测，并且还可反映DNA/RNA分析物(基本上仅可检测总ANXA3的替代物)所无法反映出的肿瘤生物学的重要方面。
我们的结果与BPH1的前列腺上皮分泌的ANXA3(可能在外来体/前列腺小体中)的抗癌和保护性作用一致，ANXA3在BPH经过PIN到Gleason分数更高的前列腺癌症的前列腺转化期间逐渐丢失。外来体ANXA3的降低是由于调控性T-细胞在进展期癌症中诱发的自身免疫机制(针对细胞外前列腺小体的表面抗体)导致的。
中等风险组的大群患者首次得以被进一步分类，未来继续基于ANXA3的前列腺癌症进展预测是人们很有兴趣的。鉴于ANXA3在前列腺癌症中的这种分子背景(7)，又暗示了其在向癌性阶段的前列腺转化的免疫调控中的作用，以及ANXA3在膜转运(membranetrafficking)、淋巴细胞移动、细胞运动和信号转导中的作用(12)，其在外来体(2)和前列腺小体(3)中的存在是特别有兴趣的。前列腺小体被认为能调控先天的免疫系统(14，15)，并且近来还与前列腺癌症的不同阶段相关联(15，16)。
将组织和尿ANXA3关联起来还可进一步协助理解癌症相关的ANXA3定位和释放的动力学。有这种可能性：本文所述的对作为针对前列腺癌症标记物的ANXA3进行的研究具有更普遍的牵连，因为有两篇非常近来的报道发现ANXA3是针对卵巢透明细胞腺癌(17)和结直肠癌(18、19)的负相关标记物，类似于我们的研究。因此，ANXA3释放针对上皮腺癌起到普遍性的癌症相关作用这一假设值得更多的注意力。
ANXA3染色阴性在前列腺癌症中作为独立预后因子代表了我们的研究得最为重要的发现。ANXA3染色阴性揭示了在根治性前列腺切除术后进展高风险的前列腺癌症的生物攻击性亚组。总之，ANXA3代表了有前途的候选组织标记物，当与标准预后参数组合时，其能在个体患者中提供更为精确的预后预测，因此有助于未来患者管理。
表：
Figure G2008800117836D00151
表1：良性、癌前(PIN)和恶性前列腺上皮中的ANXA3染色
Figure G2008800117836D00152
表2：ANXA3染色与pT-分期、Gleason分数(GS)和PSA的关联
Figure G2008800117836D00161
表3：根据ANXA3的状态，风险划分，将患者分为进展低风险、中等风险和高风险，示出了生物化学复发速率
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Claims (20)

1.诊断癌症的方法，其中，针对膜联蛋白A3的细胞内分布对样品加以分析。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症是泌尿生殖和/或胃肠道的癌症。
3.权利要求1或2的方法，其中所述癌症是上皮癌症。
4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中所述试剂是抗体。
6.权利要求1-5中任意一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
7.权利要求1-6中任意一项的方法，其是组织化学流程。
8.权利要求7的方法，其中所述样品是组织样品，特别是活检样品。
9.权利要求1-8中任意一项的方法，其中在上皮细胞，特别是在前列腺上皮细胞中测定所述膜联蛋白A3的细胞内分布。
10.权利要求1-9中任意一项的方法，其包括对选自下述的疾病阶段进行区分性诊断：
(i)良性病况，
(ii)癌前病况，和
(iii)恶性病况。
11.权利要求1-10中任意一项的方法，其中还测定至少一种另外的标记物。
12.权利要求11的方法，其中所述另外的标记物是前列腺特异性抗原(PSA)和/或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
13.权利要求1-12中任意一项的方法，其中测定其它针对膜联蛋白A3的自身抗体。
14.诊断癌症特别是前列腺癌症的方法，其中，针对膜联蛋白A3的存在、含量和/或细胞内分布以及针对针对膜联蛋白A3的自身免疫应答，对样品，例如组织或体液样品，加以分析，其中，优选地，通过针对膜联蛋白A3和/或前列腺小体/外来体的自身抗体的存在或通过ANXA3阳性调控性T-细胞的存在来表征所述自身免疫应答。
15.诊断癌症特别是前列腺癌症的方法，其中，针对针对膜联蛋白A3的抗体的存在和/或含量以及任选地针对调控性T-细胞的存在和/或含量来分析样品。
16.权利要求1-15中任意一项的方法，其中，膜联蛋白A3的不存在指示前列腺癌的攻击性亚组，特别是手术后进展高风险的亚组。
17.对已被分类为前列腺癌症发展中等风险的受试者进行划分的方法，其中，针对膜联蛋白A3的存在和/或含量来分析来自所述受试者的样品。
18.诊断癌症的测试试剂，其中包含：
(i)测定膜联蛋白A3的试剂，以及
(ii)测定针对膜联蛋白A3的自身抗体的试剂和/或测定调控性T-细胞的试剂。
19.权利要求18的试剂，用于诊断前列腺癌症。
20.用于诊断前列腺癌症的测试试剂，其中包含用于测定针对膜联蛋白A3的自身抗体的试剂。
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