CN101649101B - 具有新颖核壳结构和pH响应性的磁性纳米粒子及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类由三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的多层核-壳结构的磁性复合纳米粒子及和该复合纳米粒子作为药物的载体的应用。三嵌段共聚物的第一嵌段为甲氧基聚乙二醇，第二嵌段为丙烯酸和丙烯酸酯的无规共聚物，或甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯的无规共聚物；第三嵌段为聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯。其中第三嵌段聚合物与Fe3O4纳米粒子的表面结合。带有氨基或胺基的药物如阿霉素可负载于复合纳米粒子的次外层的聚阴离子层。负载的药物在中性条件下不释放，在pH 5.5以下时释放。

Description

具有新颖核壳结构和pH响应性的磁性纳米粒子及用途
技术领域
本发明的目的是提供一种具有磁性、pH敏感、最外层为生物相容性好的聚乙二醇、次外层为疏水性可调节的聚阴离子和核为Fe3O4纳米粒子的多层核-壳结构的复合纳米粒子(纳米载体)及其制备方法和该复合纳米粒子作为药物的载体的应用。
背景技术
聚合物/磁性纳米粒子复合材料是将磁性无机纳米粒子分散于聚合物基体中形成的复合材料。由于此种材料结合了聚合物和磁性无机纳米粒子的优点，兼具磁响应性和聚合物的功能性，因而在医学、生物化学及工业应用等领域显示出广泛的应用前景，包括细胞分离、分类、免疫测定、固定化酶、催化剂分离、核磁共振成像等。其中，对聚合物/磁性纳米粒子复合材料在药物控释方面的应用研究的最为广泛。
某些用于治疗的药物如癌的化疗药通常具有毒性高、溶解性差、体内循环时间短等缺点，导致应用受到了很大的限制。减少药物的毒性，提高药物的生物利用度是医药学面临的一个具有挑战性的问题。由于各种药物释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度，因而对它们的研究越来越受重视。其中药用载体发展迅速，微球、脂质体和聚合物纳米粒子是研究最多的药用载体，它们各具优缺点。微球适合化学栓塞及局部注射，但不适于注射用药；脂质体可用于多种给药途径和制剂，当它作为抗癌药物载体时可使药物选择性地杀伤癌细胞，提高疗效，但它的结构不稳定，易被网状内皮组织系统清除。与前两者相比，聚合物纳米粒子作为药物载体具有独特的优势。组成纳米粒子的聚合物的结构多变、稳定、载药范围广。聚合物纳米粒子的表面如果由亲水性和生物相容性好的聚合物如聚乙二醇(PEG)覆盖，则其不易被网状内皮组织系统清除，具有优良的组织渗透性，在体内滞留时间长。聚乙二醇(包括甲氧基聚乙二醇等衍生物)具有非常好的生物相容性，其免疫原性极弱，已经获美国FDA批准用作多种药物制剂的添加物或载体，可用于口服、静脉注射等给药。
靶向释放策略包括：(1)被动靶向：纳米粒子不易透过正常组织的毛细血管壁，但易透过癌、炎症和血管梗塞等病变组织的多孔性的血管系统，进入到这些组织中，而这些组织的弱的淋巴引流作用又使进入的纳米粒子不易再扩散出去，即EPR作用。(2)配体靶向：将对癌细胞有特异识别作用的配体偶联于载体的表面，从而识别癌细胞。(3)生理微环境感应释放：如pH感应释放，负载的药物在血液中(pH7.4)不释放，当负载药物的载体到达癌组织并通过细胞内吞作用进入癌细胞后，由于细胞内较酸性的环境(pH 4-6)使药物释放。(4)物理作用激发靶向释放：如超顺磁性的载药纳米粒子通过外磁场达到靶向目的。近年来，将多种靶向策略集中于同一体系来增加靶向作用。如Nasongkla等将抗癌药阿霉素和磁性Fe3O4纳米粒子簇通过疏水作用包埋于PEG-PLA(PLA为聚乳酸)的胶束中，在酸性条件下阿霉素质子化使其水溶性增大而释放，在pH 7.4和5.0时6小时分别释放1.7％和10.4％。这一释放体系的缺点是药物负载量低和释放速率低(参考：N.Nasongkla，E.Bey，J.Ren，H.Ai，C.Khemtong，J.S.Guthi，S.F.Chin，A.D.Sherry，D.A.Boothman and J.Gao，Nano Lett.，2006，6，2427-2430)。Yang等报道了类似的多功能体系，所用嵌段共聚物为PEG-PLGA(PLGA为乳酸和2-羟基乙酸的无规共聚物)，此载体对阿霉素的负载量也仅有3.5％(参考：J.Yang，C.H.Lee，H.J.Ko，J.S.Suh，H.G.Yoon，K.Lee，Y.M.Huh and S.Haam，Angew.Chem.Int.Ed.，2007，46，8836-8839)。
因此，开发载药量高、释放速度快的多功能药物靶向控释载体是十分需要的。
文献报道(参考：Shourong Wan，Yuee Zheng，Yuanqin Liu，Husheng Yan and Keliang Liu，J.Mater.Chem.，2005，15，34243430)，在丙烯酸甘油单酯或甲基丙烯酸甘油单酯与丙烯酸或甲基丙烯酸的二嵌段共聚物的存在下，碱性共沉淀Fe2+/Fe3+(摩尔比为1∶2)得到分散于水中的二嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子，其中聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯嵌段附着于Fe3O4纳米粒子表面上，而聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸嵌段处于复合纳米粒子的表面，带正电荷的药物可通过离子作用负载于复合纳米粒子表面的聚阴离子上。但在中性或酸性条件下复合纳米粒子的表面带负电荷(羧酸根负离子)，具有细胞毒性，因此不适合作为药物载体。聚乙二醇与聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯的二嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子，其聚乙二醇处于复合纳米粒子的表面(参考：Shourong Wan，Yuee Zheng，Yuanqin Liu，Husheng Yan andKeliang Liu，J.Mater.Chem.，2005，15，3424 3430)，应该具有好的生物相容性，但该复合纳米粒子没有载药的功能基。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有磁性、pH敏感、最外层为生物相容性好的聚乙二醇、次外层为疏水性可调节的聚阴离子和核为Fe3O4纳米粒子的多层核-壳结构的复合纳米粒子(纳米载体)及其制备方法和该复合纳米粒子作为药物的载体的应用。具体地说，该纳米载体是由三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子组成，Fe3O4纳米粒子核的尺寸为5～20纳米，三嵌段共聚物的结构可用下面通式表示：
上式中b表示嵌段共聚物，r表示无规共聚物。第一嵌段为甲氧基聚乙二醇(MPEG)，其平均聚合度x为10～230，第二嵌段为聚丙烯酸、或聚甲基丙烯酸、或丙烯酸与丙烯酸酯的无规共聚物、或甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯的无规共聚物。R＝H或CH3，m＝10～100，n＝0～30，R′＝CH3、C2H5、C3H7、C4H9或C6H13。此段为疏水性在一定范围内可调节(通过含酯基的链节比例的调节)的聚阴离子。第三嵌段为聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯，z＝10～50。
纳米载体的制备方法包括直接法和间接法。直接法为将二价铁盐和三价铁盐(摩尔比1∶2)与三嵌段共聚物溶于去离子水中，铁盐的总浓度(以Fe计)为0.5％～5％，铁盐(以Fe计)与三嵌段共聚物的质量浓度比为2∶1～1∶3。溶液在氮气保护下在搅拌下向溶液中加入碱性溶液如氨水或NaOH水溶液，使体系的pH值大于8，反应一定的时间后形成三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子，所需反应时间与温度有关，如在室温下需反应12～24小时，如果在80℃下反应仅需0.5～1小时。待反应完全后其混合液离心(5000rpm×10min)，将上清夜转移到透析袋中，用去离子水反复透析，得到分散于水中的三嵌段聚合物包裹Fe3O4纳米粒子的纳米载体。冷冻干燥后得到三嵌段聚合物包裹Fe3O4纳米粒子的纳米载体固体产品。间接法制备三嵌段聚合物包裹Fe3O4纳米粒子的纳米载体的方法为：首先制备在水介质无机阴离子如高氯酸根离子包裹Fe3O4纳米粒子的磁硫体(参考：R.Massart，IEEE Trans.Magn.，1981，MAG-17，1247)，然后向磁硫体中慢慢加入聚合物的水溶液，室温下搅拌12小时后，混合液离心(5000rpm×10min)后，将上清夜转移到透析袋中，用去离子水反复透析，得到分散于水中的三嵌段聚合物包裹Fe3O4纳米粒子的纳米载体。
三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的纳米载体中三嵌段聚合物中的第三嵌段聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯的作用是与Fe3O4纳米粒子表面结合。第一嵌段甲氧基聚乙二醇处于纳米载体的最外层，使载体具有好的生物相容性；第二嵌段聚阴离子形成纳米载体的次外层，为药物负载层。阳离子药物(如含氨基或胺基的药物)或同时带阳离子和疏水性基团的药物(如阿霉素、表阿霉素、正定霉素、丝裂霉素或米托蒽醌等)通过离子作用、或离子作用和疏水作用的共同作用负载于纳米载体的聚阴离子层。在中性条件下(pH＝6～8)，纳米载体中的聚阴离子的羧基以羧酸根负离子的形式存在，而药物的氨基或胺基以质子化的正离子形式存在，药物通过离子作用负载于聚阴离子层。如果阳离子药物带有疏水性的基团，则可与聚阴离子层的疏水基团如聚阴离子层带酯基的链节和(或)聚阴离子的主链存在疏水作用。根据热力学第二定律的原理，当离子作用和疏水作用同时作用于同一分子时，即螯合作用，其总的作用力大于它们单独作用时作用力的加和(参考：S.Cheng，H.Yan，C.Zhao，J.Chromatogr.A，2006，1108，43-49)。因此离子作用和疏水作用的共同作用会大大增大其负载作用力。当体系的酸性增大时，负载药物的纳米载体中的聚阴离子的羧酸根负离子质子化而变为中性的羧基，使药物与载体间的离子作用消失。如果负载的药物与载体之间还存在疏水作用，则离子作用消失后，由于螯合作用的消失，疏水作用单独的作用力较小，使负载的药物释放。实现使负载的药物pH感应释放。
本发明所用三嵌段共聚物的合成可用现有任何合成嵌段共聚物的方法，如活性自由基聚合(包括原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-裂解链转移自由基聚合(RAFT)等)、阴离子聚合等。
附图说明
图1：MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4复合纳米粒子的透射电镜照片。
图2：动态光散射测定的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4纳米粒子在水中的粒径分布图。
图3：MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4纳米粒子的磁滞回归曲线，H为磁场强度，M为磁化强度。
图4：紫外吸收测定的复合纳米粒子在Pb(Ac)2溶液中的稳定性比较。
图5：鼠成纤维细胞在不同浓度纳米粒子存在的条件下培养24小时后的相对存活率曲线。
图6：负载阿霉素的复合纳米粒子释放阿霉素的曲线。
具体实施方式
下面，通过示例性的实施例具体说明本发明。应当理解，本发明的范围不应局限于实施例的范围。任何不偏离本发明主旨的变化或改变能够为本领域的技术人员所理解。本发明的保护范围由所附权利要求的范围确定。
下面的实施例中所用缩写为：MPRG，聚乙二醇单甲醚；MPEG-Br，α-溴代异丁酸MPEG酯；tBA，丙烯酸叔丁酯；PtBA，聚丙烯酸叔丁酯；tBMA，甲基丙烯酸叔丁酯；PtBMA，聚甲基丙烯酸叔丁酯；nBMA，甲基丙烯酸正丁酯；PnBMA，聚甲基丙烯酸正丁酯；PAA，聚丙烯酸；PMAA，聚甲基丙烯酸；SA，丙烯酸2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇酯；PSA，聚丙烯酸2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇酯；SMA，甲基丙烯酸2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇酯；PSMA，聚甲基丙烯酸2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇酯；PGA，聚丙烯酸甘油单酯；PGMA，聚甲基丙烯酸甘油单酯；PMDETA，1，1，4，7，7-五甲基二乙烯三胺；b，表示嵌段共聚物；r，表示无规共聚物。
实施例1
MPEG-Br的制备：将10g干燥的MPEG(平均分子量为2000)和1.4mL三乙胺溶于70mL四氢呋喃中，冰水浴冷却和搅拌下缓慢滴加4.3mLα-溴代异丁酰溴与20mL四氢呋喃的混合液，滴加完毕后，室温下搅拌反应48小时。旋转蒸发除去四氢呋喃，加入100mL水溶解所得产物。然后以二氯甲烷萃取，每次30mL，共萃取5次，收集有机相。分别用1mol/L HCl(30mL×3)，1mol/L NaOH(30mL×3)，饱和食盐水(30mL×3)依次洗涤，并收集有机相，最后以无水MgSO4干燥。过滤，除去干燥剂，旋转蒸发除去溶剂，所得浓缩液以冰无水乙醚沉淀，收集沉淀，真空干燥，得MPEG-Br。
实施例2
分别用平均分子量为600、1000、5000和10000的干燥MPEG各10g代替实施例1中的平均分子量为2000的MPEG，除所用α-溴代异丁酰溴的量不同外，其它操作同实施例1。所用α-溴代异丁酰溴的量分别为：14.3mL、8.6mL、3mL和2mL。制得相应分子量的MPEG-Br。
实施例3
MPEG-b-PtBMA的制备：将2g实施例1制备的MPEG-Br，150mgCuBr，2.8g tBMA溶于2.5mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入210μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入预热到60℃的油浴中，搅拌反应10小时，得绿色粘稠物。以丙酮溶解所得绿色聚合物，得深绿色溶液，溶液过Al2O3柱，收集滤液，旋转蒸发浓缩，以水与甲醇的混合液(4∶1，体积比)沉淀之，得乳白色絮状物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBMA。经1H NMR峰面积积分，以MPEG为参比得PtMBA的聚合度为18。
实施例4
MPEG-b-PtBMA-b-PSMA)的制备：将2g实施例3制备的MPEG-b-PtBMA，48mg CuBr，2.5g SMA溶于2mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入69μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入已预热到90℃的油浴中，搅拌反应12小时。以丙酮溶解所得聚合物，溶液过Al2O3柱，收集滤液。旋转蒸发浓缩，以石油醚(30℃～60℃)沉淀之，得微黄色粘稠物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBMA-b-PSMA。经1H NMR峰面积积分，以MPEG和PtMBA为参比，得PSMA的聚合度为15。
实施例5
MPEG-b-PtBA的制备：将0.35g MPEG-Br(实施例2中由分子量为600的MPEG得到)，150mg CuBr，6.2g tBA溶于5mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入210μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入预热到60℃的油浴中，搅拌反应10小时，得绿色粘稠物。以丙酮溶解所得绿色聚合物，得深绿色溶液，溶液过Al2O3柱，收集滤液，旋转蒸发浓缩，以水与甲醇的混合液(4∶1，体积比)沉淀之，得乳白色絮状物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBA。经1H NMR峰面积积分测定PtBA的聚合度为75。
实施例6
MPEG-b-PtBA-b-PSA的制备：将2g实施例5制备的MPEG-b-PtBA，30mg CuBr，3.1g SA溶于3.0mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入42μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入已预热到90℃的油浴中，搅拌反应12小时。以丙酮溶解所得聚合物，溶液过Al2O3柱，收集滤液。旋转蒸发浓缩，以石油醚(30℃～60℃)沉淀之，得微黄色粘稠物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBA-b-PSA。经1H NMR峰面积积分测定PSA的聚合度为45。
实施例7
将2g MPEG-Br(实施例2中由分子量为5000的MPEG得到)，60mg CuBr，2.8g tBMA溶于2.5mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入82μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入预热到60℃的油浴中，搅拌反应10小时，得绿色粘稠物。以丙酮溶解所得绿色聚合物，得深绿色溶液，溶液过Al2O3柱，收集滤液，旋转蒸发浓缩，以水与甲醇的混合液(4∶1，体积比)沉淀之，得乳白色絮状物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBMA。经1H NMR峰面积积分测定PtMBA的聚合度为46。
实施例8
将2g实施例7制备的MPEG-b-PtBMA，25mg CuBr，2.5g SMA溶于2mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入35μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入已预热到90℃的油浴中，搅拌反应12小时。以丙酮溶解所得聚合物，溶液过Al2O3柱，收集滤液。旋转蒸发浓缩，以石油醚(30℃～60℃)沉淀之，得微黄色粘稠物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-PtBMA-b-PSMA。经1H NMR峰面积积分测定PSMA的聚合度为28。
实施例9
MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)的制备：将2g实施例1制备的MPEG-Br，150mg CuBr，2.3g tBMA，0.6g nBMA溶于2.5mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入210μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入预热到60℃的油浴中，搅拌反应10小时，得绿色粘稠物。以丙酮溶解所得聚合物，溶液过Al2O3柱，收集滤液，为无色液体。旋蒸充分浓缩，以水做沉淀剂沉淀之，得白色絮状物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)。经1H NMR峰面积积分，得PtMBA的聚合度为13，PnBMA的聚合度为5。
实施例10
MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA的制备：将1.9g实施例9制备的MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)，47.4mg CuBr，4.0g SMA溶于3.0mL环己酮中，在氮气保护和搅拌下向体系中加入69μL PMDETA，溶液变为浅绿色，继续反应2小时后，取下反应瓶，浸入已预热到90℃的油浴中，搅拌反应12小时。以丙酮溶解所得绿色聚合物，溶液过Al2O3柱，收集滤液，为微黄色液体。旋蒸充分浓缩，以石油醚(30℃～60℃)沉淀之，得微黄色粘稠物。真空干燥24小时，即可制得MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA。经1H NMR峰面积积分测定PSMA的聚合度为25。
实施例11
MPEG-b-PMAA-b-PGMA的制备：称取0.5g实施例4中制得的MPEG-b-PtBMA-b-PSMA溶于6mL无水二氯甲烷中，然后加入2mL三氟乙酸，室温搅拌4小时。然后向体系中再加入2mL三氟乙酸，继续搅拌4小时。慢慢滴加蒸馏水0.5mL，滴加完水后完再于室温下搅拌2小时。旋转蒸发，充分除去溶剂及过量的酸，得到粘稠液体。加少量水溶解后转移到透析袋中(分子量上限为3500)，在去离子水中反复透析至pH值接近7，得无色透明溶液。冷冻干燥得白色粉末状固体MPEG-b-PMAA-b-PGMA。
实施例12
分别用实施例6、8和10中所得MPEG-b-PtBA-b-PSA、MPEG-b-PtBMA-b-PSMA和MPEG-b-(PtBMA-r-PnBMA)-b-PSMA分别代替实施例11中的MPEG-b-PtBMA-b-PSMA，其它操作同实施例11，得到相应的MPEG-b-PAA-b-PGA、MPEG-b-PMAA-b-PGMA和MPEG-b-(PMAA-r-PnBMA)-b-PGMA。
实施例13
MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子的制备：在圆底烧瓶中将0.25g实施例11制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA，0.1gFeCl2·4H2O和0.26g FeCl3·6H2O溶于10mL去离子水中，在氮气保护下将烧瓶浸入已预热80℃的油浴中。搅拌10分钟后向烧瓶中注射器滴加25％的氨水0.2mL。混合液在80℃下反应1小时后，自然冷却至室温。将混合液离心(5000rpm×10min)后，上清液转移到透析袋(分子量上限为14000)中，用去离子水反复透析，得到MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe3O4磁性纳米粒子的复合纳米粒子(MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4)水溶液。
透射电镜照片(TEM)表明，核心Fe3O4纳米粒子的平均直径约为8nm(图1，由于电子透射Fe3O4和聚合物的能力的差别很大，照片中只显示Fe3O4核，而聚合物壳是显示不出来的)。图2为分散于水中的复合纳米粒子的动态激光光散射测得的粒径分布图，粒子评价直径为23nm；图3为复合纳米粒子的磁滞回归曲线，表明纳米粒子具有超顺磁性。
实施例14
在圆底烧瓶中将0.25g实施例11制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA，0.1g FeCl2·4H2O和0.26g FeCl3·6H2O溶于10mL去离子水中，在氮气保护下室温搅拌10分钟后向烧瓶中注射器滴加25％的氨水0.2mL，混合液在室温下继续搅拌24小时。将混合液离心(5000rpm×10min)后，上清液转移到透析袋(分子量上限为14000)中，用去离子水反复透析，得到MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe3O4磁性纳米粒子的复合纳米粒子。TEM表明Fe3O4核的平均直径为11nm。
实施例15
用实施例12中得到的MPEG-b-PAA-b-PGA代替实施例13中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA，其它操作同实施例13，得到MPEG-b-PAA-b-PGA包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子。TEM表明Fe3O4核的平均直径为12nm。
实施例16
用实施例12中得到的MPEG-b-PMAA-b-PGMA代替实施例13中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA，其它操作同实施例13，得到MPEG-b-PMAA-b-PGMA包裹Fe3O4磁性纳米粒子的复合纳米粒子。TEM表明Fe3O4核的平均直径为9nm。
实施例17
用实施例12中得到的MPEG-b-(PMAA-r-PnBMA)-b-PGMA代替实施例13中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA，其它操作同实施例13，得到MPEG-b-(PMAA-r-PnBMA)-b-PGMA包裹Fe3O4磁性纳米粒子的复合纳米粒子。TEM表明Fe3O4核的平均直径为7nm。
实施例18
将2g FeCl2·4H2O溶于25mL 1mol/L HCl中的溶液和5.4gFeCl3·6H2O溶于25mL去离子水中的溶液置于三口瓶内混合，通氮气。向三口瓶内滴加160mL 1.5mol/L氨水，溶液中产生黑色沉淀，室温下继续搅拌反应24小时。通过磁铁吸住沉淀倾去上层清液并用水洗涤3次。在氮气保护下向三口瓶内滴加2mol/L HClO4 50mL，室温搅拌15分钟。静置10分钟，按上法倾去上层清液，沉淀用水洗涤1次，将沉淀迅速转移到透析袋中，用去离子水反复透析到pH值6～7，得ClO4 -稳定的Fe3O4纳米粒子水溶液，测得Fe3O4的浓度为：22mg/mL。将0.23mL制得的Fe3O4纳米粒子溶液与4.77mL水混合，在搅拌下向稀释的Fe3O4纳米粒子溶液中滴加5mL由实施例12中得到的MPEG-b-PAA-b-PGA的水溶液(2mg/mL)，室温搅拌24小时。所得混合液离心(5000rpm×10min)后，上清液转移到透析袋(分子量上限为14000)中，用去离子水反复透析，得到MPEG-b-PAA-b-PGA包裹Fe3O4磁性纳米粒子的复合纳米粒子。TEM表明Fe3O4核的平均直径为9nm。
实施例19
复合纳米粒子稳定性的研究：将一系列实施例13所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH分别调节pH值至1、2、4、6、8、10、12、13和14，使最终复合纳米粒子的浓度相同(1mg/mL)，分别离心10分钟(2000rpm)，然后分别测定340nm处的吸光值。结果表明，pH值为1、2、13和14的样品的吸光值明显降低，吸光值低于最大吸光值的80％。而pH值为4、6、8、10、和12的样品的吸光值变化不大，变化范围在10％之内。说明复合纳米粒子在pH 4～12的范围内在水中可稳定分散。
将一系列实施例13中所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液用NaCl溶液稀释，使最终NaCl的浓度分别为0.5％、1％、2％和5％，而复合纳米粒子的浓度相同(1mg/mL)，分别离心10分钟(2000rpm)，然后分别测定340nm处的吸光值，结果表明，所有样品的吸光值的变化不大，变化范围在5％之内。说明复合纳米粒子在0.5％～5％NaCl溶液中可稳定分散。
用实施例15、16、17和18所制备的聚合物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子做如上相同的实验，结果表明这些复合纳米粒子在pH4～12的范围内和在0.5％～5％NaCl溶液中都能稳定分散。
向一系列实施例13中所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液加入不同量的乙酸铅(Pb(Ac)2)水溶液，使最终复合纳米粒子的浓度相同(1mg/mL)，分别离心10分钟(2000rpm)，然后分别测定340nm处的吸光值，结果如图4所示。用二嵌段共聚物PMAA-b-PGMA(PAA的聚合度为25，PGMA的聚合度为19)包裹的Fe3O4纳米粒子(PMAA-b-PGMA-Fe3O4)代替MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4做相同的实验，如图4所示。图4表明，水介质中加入乙酸铅对三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子的分散稳定性影响不大，但当乙酸铅浓度大于～0.04％后，二嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子聚集沉淀。其原因可做如下分析，二嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子由于聚阴离子处于粒子的表面，Pb2+与聚阴离子的羧基络合，使粒子间发生交联而沉淀。但三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子由于表面有聚乙二醇的保护作用，不发生粒子间的交联，因此未发生沉淀。
实施例20
复合纳米粒子的细胞毒性的实验：将实施例13中所得的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4和实施例19中提到的PMAA-b-PGMA-Fe3O4分别加入到培养液中进行细胞培养实验，然后用MTS方法测定细胞的相对存活率，具体实验方法可参考：S.Wan，J.Huang，M.Guo，H.Zhang，Y.Cao，H.Yan，K.Liu，J.Biomed.Mater.Res.A，2007，80，946-954。图5为MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4和PMAA-b-PGMA-Fe3O4细胞毒性的比较。可以看出，最外层为MPEG的三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的复合纳米粒子的细胞毒性明显较小。
实施例21
阿霉素在复合纳米粒子中的负载：在搅拌下向实施例13中制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液(10mL，2mg/mL)中滴加阿霉素盐酸盐水溶液(2mg/mL，0.4mL)，搅拌反应过夜后将混合液透析(分子量上限为14000)48小时，得到负载阿霉素的复合纳米粒子。经分析透析外液中阿霉素的含量，换算出复合纳米粒子中阿霉素的负载量为21％(阿霉素的质量除以复合纳米粒子干重的量)。
实施例22
用实施例15制得的复合纳米粒子代替实施例21中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4，其它操作条件同实施例21，得到负载阿霉素的复合纳米粒子，阿霉素的负载量为15％。
实施例23
用实施例17制得的复合纳米粒子代替实施例21中的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4，其它操作条件同实施例21，得到负载阿霉素的复合纳米粒子，阿霉素的负载量为23％。
实施例24
表阿霉素在复合纳米粒子中的负载：在搅拌下向实施例13中制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液(10mL，2mg/mL)中滴加表阿霉素盐酸盐水溶液(2mg/mL，0.4mL)，搅拌反应过夜后将混合液透析(分子量上限为14000)48小时，得到负载表阿霉素的复合纳米粒子，负载量为20％。
实施例25
正定霉素在复合纳米粒子中的负载：在搅拌下向实施例13中制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液(10mL，2mg/mL)中滴加正定霉素盐酸盐水溶液(2mg/mL，0.4mL)，搅拌反应过夜后将混合液透析(分子量上限为14000)48小时，得到负载正定霉素的复合纳米粒子，负载量为22％。
实施例26
丝裂霉素在复合纳米粒子中的负载：在搅拌下向实施例13中制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液(10mL，2mg/mL)中滴加丝裂霉素水溶液(2mg/mL，0.4mL)，搅拌反应过夜后将混合液透析(分子量上限为14000)48小时，得到负载丝裂霉素的复合纳米粒子，负载量为22％。
实施例27
米托蒽醌在复合纳米粒子中的负载：在搅拌下向实施例13中制备的MPEG-b-PMAA-b-PGMA-Fe3O4水溶液(10mL，2mg/mL)中滴加米托蒽醌盐酸盐水溶液(2mg/mL，0.4mL)，搅拌反应过夜后将混合液透析(分子量上限为14000)48小时，得到负载米托蒽醌的复合纳米粒子，负载量为23％。
实施例28
负载阿霉素的复合纳米粒子的控释：取4份各3mL实施例21中制备的负载阿霉素的复合纳米粒子溶液装入透析袋(分子量上限为14000)，分别置于pH值分别为7.4、6.5、5.5和4.5的磷酸盐缓冲液(20mmol/L，100mL)中透析，在不同的时间测定透析外液中阿霉素的浓度(通过紫外吸收检测，检测波长为234nm)。换算出释放率，不同pH值下阿霉素的释放率与释放时间的关系见图6。

Claims (10)

1.一种三嵌段共聚物包裹Fe3O4纳米粒子的核-壳结构的复合纳米粒子，其核为Fe3O4纳米粒子，平均粒径为5～20nm，三嵌段共聚物的结构用下面通式表示：
Figure FSB00000531526300011
上式中b表示嵌段共聚物，r表示无规共聚物，第一嵌段为甲氧基聚乙二醇，其平均聚合度x为10～230，第二嵌段为聚丙烯酸、或聚甲基丙烯酸、或丙烯酸与丙烯酸酯的无规共聚物、或甲基丙烯酸与甲基丙烯酸酯的无规共聚物，R＝H或CH3，m＝10～100，n＝0～30，R′＝CH3、C2H5、C3H7、C4H9或C6H13，第三嵌段为聚丙烯酸甘油单酯或聚甲基丙烯酸甘油单酯，z＝10～50，其中第三嵌段与Fe3O4纳米粒子核表面结合，第一嵌段形成复合纳米粒子的最外层。
2.根据权利要求1所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于二价铁盐、三价铁盐和三嵌段共聚物共溶于水中，用碱将溶液的pH值调节到大于8，经反应而得到；或者先制备无机阴离子包裹Fe3O4纳米粒子的磁硫体，然后向磁硫体中加入三嵌段共聚物水溶液而得到。
3.根据权利要求2所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述无机阴离子是高氯酸根离子。
4.根据权利要求2所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于二价铁盐和三价铁盐的摩尔比1∶2，铁盐的总浓度以Fe计为0.5％～5％，铁盐以Fe计与三嵌段共聚物的质量浓度比为2∶1～1∶3。
5.根据权利要求2所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于调节溶液pH值的碱是无机碱，或有机碱。
6.根据权利要求5所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于所述无机碱是氨水、NaOH、KOH，所述有机碱是甲胺、二甲胺、三甲胺或四甲基铵。
7.根据权利要求2所述的复合纳米粒子的制备方法，其特征在于调节溶液pH值后的反应温度为室温到100℃，反应时间为10分钟到24小时。
8.根据权利要求1所述的复合纳米粒子的用途，其特征在于复合纳米粒子作为含氨基药物或含胺基药物的载体。
9.根据权利要求1所述的复合纳米粒子作为药物载体的用途，其特征在于复合纳米粒子作为阿霉素、表阿霉素、正定霉素、丝裂霉素或米托蒽醌的载体。
10.根据权利要求1所述的复合纳米粒子作为药物载体的用途，其特征在于负载药物的复合纳米粒子用于pH感应药物释放。
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