CN101631818A - 聚赖氨酸树状聚体造影剂成像大分子 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及分支大分子及其作为成像剂或造影剂的用途。具体而言，本发明涉及由赖氨酸或赖氨酸类似物衍生而来并具有多个功能部分的树状聚体，以及它们在成像技术中的应用(其中可以使用靶向造影剂对疾病状态进行成像)。

Description

聚赖氨酸树状聚体造影剂成像大分子
技术领域
本发明总体上涉及分支大分子及其在诊断应用中作为成像剂或造影剂的用途。具体而言，本发明涉及由赖氨酸或赖氨酸类似物衍生而来并具有多个功能部分的树状聚体，以及它们在成像技术中的应用(其中可以使用靶向造影剂对疾病状态进行成像)。
背景技术
本说明书对任何现有出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者任何已知事物的引用，不能并且不应该成为认可或承认、或者以任何方式表明：这些现有的出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本说明书所涉及的致力研究领域中的部分普通常识。
多年来，诸如核磁共振成像(MRI)、X射线、核放射性药物成像、紫外线-可见光-红外光成像以及超声波之类的诊断成像技术已经被用于医疗诊断中。在多种成像模式中，MRI和光学成像方法是独特的，这是由于它们产生了对化学环境敏感的复杂信号。
核磁共振成像(MRI)通过测定水的氢核(以及具有相似的化学位移的核)的特征(该特征被穿过切片的化学环境所改变)来获得机体薄切片的图像。信号强度取决于在给定位置处水的量以及磁性驰豫的时间。正是后者的特征可以通过使用造影剂来操纵，从而改变信号强度以及不同组织在MR图像上的表观。
造影剂为这样的化学物质，其被引入到待成像的解剖学或功能区域，从而通过改变驰豫时间来增大不同组织之间、或者正常组织与异常组织之间的差异。
特别对于MRI而言，获得充分的敏感性是重要的问题，其中需要使图像增强部分的浓度为10-1000μM以产生充分的信号。因此，可以使用这样的靶向试剂，其将浓缩的成像剂传递至靶物，使得在成像过程中可以观察到充分改善的信号。然而，即使这样，如果所需的靶物以低浓度存在，则对于靶向试剂而言，所述的问题更加复杂。例如，为了对以低于μM浓度存在的生物受体靶物进行成像，在靶物位点处需要信号增强程度较大，从而证实充分的图像对比。
最通常使用的造影增强剂为诸如金属离子之类的顺磁种类。钆(Gd)是优选的，这是因为其具有7个未配对的电子，这些电子会对相邻的水质子产生特别短的顺磁效应。由于用于驰豫增强的顺磁金属离子通常是具有毒性的，所以将这些离子置于生理学相容的复合体中会减小它们的毒性，而不会大幅地减小它们的效力。
存在多个顺磁颗粒会增强造影增强剂的用途。与具有较少颗粒的大分子试剂相比，存在多个顺磁颗粒还会减少实际所需的造影剂的量。例如，据信，对于有效的MRI造影剂而言，必需使目标组织中水质子的T1驰豫时间减少50％。在将使用每个抗体分子与4个Gd原子缀合的抗体用于MRI的肿瘤增强情况的分析中，没有发现肿瘤增强，从而预计每个大分子需要更高比例的成像金属原子。
常规的MRI造影增强剂在每个分子中仅具有一个螯合掩蔽剂。这些试剂在受试者体内或者在其他生理学环境中，通常具有短期活性。因此，在许多情况下，必需给药大剂量以便取得所需的造影增强程度。在其他情况下，在未给予对于受试者而言是潜在致死剂量或其他生理学不耐受的剂量的情况下，是不能得到最大的造影增强程度的。
因此，需要新的成像剂，该成像剂可以有利地提供多个信号传导或成像实体和/或特异性地靶向多种细胞或组织。
发明概述
目前已经发现，具有多个成像或信号传导实体、且具有至少一个官能团(该官能团能够使所述的大分子靶向欲成像的位点)的大分子可以提供有用的成像剂。
因此，本发明的第一个方面提供了一种大分子，其包含：
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)第一功能部分，其通过第一氨基氮原子与所述的核心部分连接；
(iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及
(iv)一个或多个第二功能部分，其与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元的最外层的表面氨基氮原子连接；
其中
所述的第一和第二功能部分均包含选自靶向分子信号传导实体的试剂，使得所述的大分子具有至少一个靶向分子和至少一个信号传导实体。
本发明进一步涉及根据本发明的大分子在诊断成像，特别是MRI造影成像中的用途。
优选的是，所述的靶向分子为肽或抗体；更优选的是，能够靶向在细胞上表达的受体和标志物的肽和抗体。靶向作用可以改善本发明的赖氨酸或赖氨酸类似物树状聚体聚合物在指定靶位点处的浓度，从而有利地导致较低量成像剂的给药。
赖氨酸树状聚体可以有利地适用于作为具有足够的图像增强、延长的血管内保持以及改善的组织靶向等的造影剂的用途。
在本发明的某些实施方案中，所述的第一功能部分为靶向分子，而所述的第二功能部分为信号传导实体。
在本发明的一些实施方案中，所述的靶向分子能够选择性地与以下中的一种或多种结合或相互作用：
(a)活化的白细胞；
(b)活化的血小板；
(c)血纤蛋白(fibrin)；或
(d)活化的内皮细胞。
另人惊奇的是，申请人发现，在一些实施方案中，当将造影剂用于诊断应用(包括核磁共振成像(MRI)等)中时，其可以表现出改善的图像清晰度以及靶物特异性。
大分子的多个信号传导实体可以为相同的实体或不同的实体。在本发明的某些实施方案中，所述的信号传导实体为诸如顺磁金属离子之类的顺磁颗粒，其可以通过螯合掩蔽剂而有利地与赖氨酸或赖氨酸类似物树状聚体聚合物螯合。
如本文所述，所述的大分子可以仅包含第一和第二功能部分，或者可以包含一个或多个第三(以及可任选地第四或第五)功能部分。因此，所述的大分子可以包含作为第一功能部分的靶向分子、多个信号传导实体(第二功能部分)、以及至少一个第三功能部分，该第三功能部分可以为与第二功能部分不同的信号传导实体，或者可以为与第一靶向分子相同或不同的靶向分子。
所述的靶向分子和所述的信号传导部分可以直接与合适的氮原子(处于表面或核心)连接，或者通过连接体和/或有助于连接的改性基团来间接连接。
可以通过将所述的靶向分子与树状聚体的核心部分的第一氨基氮原子连接、并通过将一个或多个信号传导部分与树状聚体的表面连接而有利地制备所述的大分子。
因此，在另一个方面，本发明提供了用于制备如上文所述的、具有靶向分子的树状聚体聚合物的方法，该方法包括以下步骤：
提供
(a)树状聚体聚合物，其包含：
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及
(b)靶向分子；
以及使所述的靶向分子与所述核心的第一氨基氮原子、或表面氨基氮原子连接。
在本发明的某些实施方案中，所述的靶向分子与所述核心的第一氨基氮原子连接。
可任选地，所述的第一氮原子和/或所述的靶向分子可以被有助于连接的改性部分改性。
然后，可以将信号传导实体与所述的树状聚体的表面连接。
因此，本发明还提供了大分子，其包含：
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)靶向分子，其通过所述的第一氮原子与所述的核心部分连接；以及
(iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；
其中构造单元的最外层的表面氨基氮原子能够具有多个信号传递实体。
在本发明的其他方面中，提供了用于对哺乳动物中的细胞靶物进行成像(例如核磁共振成像)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向哺乳动物给药根据本发明的成像剂；
(b)使所述的成像剂与所述的细胞靶物结合；以及
(c)对所述的哺乳动物进行成像，从而生成图像。
在某些实施方案中，所述的成像剂为造影剂，而所述的图像通过MRI来获得。用于对哺乳动物的细胞靶物进行MR成像的方法可以用于检测细胞靶物，其中所述的细胞靶物为疾病或症状的指示剂。
在本发明的某些实施方案中，所述的疾病或症状为血液凝固紊乱或者诸如早期动脉硬化之类的炎性症状。
附图说明
图1示出了基于LIBS抗体(在PCT/AU2006/000943中有所描述)的序列(pMT/BiP/V5-His M-LIBS-C)，其中所述的抗体具有通过用于偶联的标准的分子生物学技术而引入的额外C末端半胱氨酸。
图2示出了基于LIBS抗体(在PCT/AU2006/000943中有所描述)的序列(pHOG-LIBS-His-gga-QQ)，其中所述的抗体具有通过用于偶联的标准的分子生物学技术而引入的Q标签。
图3示出了用于制备实施例6示例性示出的[COC2-MA]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Gd-GlyMeDOTA]32的反应图。
实施方案详述
除非本文另作要求，否则在本说明书全文以及所附的权利要求书中，词语复数形式的“包括”及变体“包含”和“含有”应该被理解为涵盖了一个所述的整数或步骤、或者多个整数或步骤构成的组，但是没有排除任何其他的一个整数或步骤、或者多个整数或步骤构成的组。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“螯合掩蔽剂”，我们是指能够与具有治疗或诊断用途的金属离子相结合的部分。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“抗体”包括完整的抗体、或衍生物或片段(例如通过酶或化学裂解而产生的或者通过重组而得到的)，或者通过蛋白质表达技术或者通过化学合成而产生的抗体结合区域的模拟物(其保持了特异性的结合活性)。具体而言，所述的术语包括单克隆抗体以及由单克隆抗体得到的所有的多种形式，包括但不限于：全长抗体(例如具有完整的Fc区域)；抗原结合片段，包括例如Fv、Fab、Fab’和F(ab′)2片段；以及采用重组方法形成的抗体衍生的多肽，例如单链抗体。本文所用的术语、“抗体”以及“多种抗体”是指在例如转基因动物中或者通过噬菌体展示而形成的人抗体、以及嵌合抗体和人源化的抗体。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“连接”是指大分子的化学成分之间通过共价键、氢键、吸附作用、金属键合、范德华力、离子键合、螯合-金属-螯合连接键、配体-受体连接键、由肽的类似物的DNA和RNA的互补双链而形成的双链体或三链体、或者它们的组合而形成的相连。本发明所包括的具体形式为共价键。所述的连接可以为直接连接，或者通过一个或多个插入部分(例如一个或多个桥连、隔离物或连接体部分，这些术语在本文中可以互换使用)而形成的间接连接。此外，连接基团或功能部分或胺可以进一步通过有助于连接的改性剂改性。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“活化的”，当其用于指具体的靶向分子时，我们是指能够与在方法中涉及的配体发生反应的任何形式的特定的靶向分子。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“键合”，我们是指给定多肽与受体相结合的能力，使得多肽抗体或其衍生物与所述受体之间的相互作用是相对特异性的。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“衍生物”，当其使用与多肽(特别是抗体)有关时，是指具有相似的氨基酸序列(即，至少80％、85％、90％或95％的同源性)并且至少在一定程度上保持了所述多肽的活性的功能等价物。
如本文所用，术语“表面”用于指树状聚体的构造单元的最外层。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“表面构造单元”是指大分子的构造单元的最外层，即，没有与表面构造单元的表面上的胺连接的其他构造单元。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“表面上的胺”或者“表面上的氨基”或者“表面上的氨基氮原子”是指由表面构造单元衍生的树状聚体基序的任何最外面的氮。这些表面上的胺代表了用于其他构造单元、连接体或功能部分(任选地通过改性基团)的连接点。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“赖氨酸类似物”是指具有单一一个顶部羧基、以及两个或三个伯胺基团的分子。在一种情况下，对于母体赖氨酸1而言，赖氨酸类似物可以是不对称的，这种情况被定义为将伯胺与羧酸酯顶部相连的键和原子是不同的。在第二种情况下，赖氨酸类似物可以为对称的，其中对称被定义为将每个伯胺与羧酸酯相连的键和原子是相同的，并且忽视当每个伯胺进一步发生反应时所潜在性地引入的不对称情况。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“树状聚体基序”是指大分子的分离的单元，当大分子的一个分支在所述的键(其将所述的构造单元或核心的一个反应性胺与所连接的构造单元的顶部羧酸酯基团相连)处被割断时，树状聚体基序将“脱离”。树状聚体基序的顶部羧酸酯基团代表了这样的点，在合成本发明的大分子的过程中，树状聚体基序在所述的点处与生长中的大分子核心连接。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“构造单元”是指在树状聚体基序的组装过程中使用的赖氨酸或赖氨酸类似物。所述的构造单元可以为表面以下的构造单元，其为构造单元的层的一部分或一代，其中所述的构造单元具有可以与其他构造单元的顶部羧酸酯基团进一步发生反应的胺。所述的这些层可以依次描述为表面下第一层，其是指与所述的表面层紧密相邻的第一个表面下的层；表面下第二层为在所述的表面层以下的第二层；表面下第三层为在所述的表面层以下的第三层；以此类推。
如本文所用，术语“层”或“代”是指与所述的核心部分具有相同程度的连接性的多个构造单元，即具有相同数量的、将所讨论的构造单元与所述核心的氨基氮原子连接的构造单元。例如，直接与所述的核心部分的氮原子连接、或者通过连接体基团而与所述的核心部分的氮原子连接的构造单元被称为第一层或第一代。在其与所述核心部分的氮原子之间具有一个构造单元的构造单元被称为第二层或第二代。一层或一代构造单元必需包含至少两个构造单元。对于所用的构造单元而言，每层构造单元为同质的，然而不同的构造单元可用于制备不同的层。因此，在本发明的某些实施方案中，所述的大分子由一层或多层单一一种构造单元(例如赖氨酸)构成。在其他实施方案中，所述的大分子包含至少两层构造单元，其中至少两层构造单元由不同的构造单元构成。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“末端表面上的胺”，我们是指树状分子(dendron)的任何表面反应性胺基。此类基团被命名为末端是因为它们可以作为其他树状聚体反应或末端终止反应的终点或位点。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“末端表面上的基团”，我们是指可以与表面上的胺相连接的任何保护基团或有机基团。具有终点的表面上的胺基的性质和数量可以通过标准的分析技术(包括质子/碳NMR、ESI或MALDI质谱)来测定。
在本说明书和权利要求书中使用的术语“胺保护基团”是指这样的基团，就该基团而言，其除去过程具有一定的顺序，从而使得这些并非用于切除的基团对切除环境是惰性的。当将保护基团定义为“可溶的”时，其是指用于除去一个基团的环境可以影响第二个基团的整体性，而如果第一个基团的整体性有待保持的话，就需要首先除去第二个基团。当保护基团被进一步定义为“正交(orthogonal)”时，其是指每个基团对于除去正交组中的每一个其他基团所需要的切除环境是惰性的。重要的应该注意，当采用了合适的反应条件时，保护基团仅为可溶的或者仅为正交的。合适的保护基团可以选自：Boc，CBz，Fmoc，Dde，CF3CO2，2-卤代-Cbz，Aloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2，2，4-二硝基苯-磺酰基，优选的是选自：Boc，CBz，Fmoc 2-卤代-Cbz，Aloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2，2，4-二硝基苯-磺酰基。本领域中描述了多种用于多胺分子的选择性单保护的普通方法。此类方法在Krapcho and Kuell Synthetic Commun.(1990)20：2559中有所描述。
本发明的大分子由至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造分子构建而成。本发明所包括的构造单元的实例包括以下这些(其中#表示顶部羧基的羰基残基)：
赖氨酸*1具有以下结构：
Figure G2007800345645D00101
甘氨酰-赖氨酸*2具有以下结构：
Figure G2007800345645D00102
类似物3具有以下结构，其中a为整数1或2；而b和c独立地为整数1、2、3或4。
Figure G2007800345645D00103
类似物4具有以下结构，其中a为整数0、1或2；而b和c独立地为整数2、3、4、5或6。
Figure G2007800345645D00104
类似物*5具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。
Figure G2007800345645D00105
类似物6具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4或5。
Figure G2007800345645D00111
类似物7具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。
Figure G2007800345645D00112
类似物8具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b、c和d独立地为整数1、2、3、4或5。
Figure G2007800345645D00113
类似物9具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5。
Figure G2007800345645D00114
此外，所述构造单元的任何亚甲基可以被亚甲氧基(CH2-O)或亚乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
在本发明的某些实施方案中，所述的构造单元选自：赖氨酸1、甘氨酰-赖氨酸2或赖氨酸类似物5：
Figure G2007800345645D00121
其中a为整数0、1或2；此外，1、2或5的任何亚甲基可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
所述构造单元的羧酸酯基团和胺基可以被衍生，从而增大或减小这些基团的活性。可以使用诸如Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-卤代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺酰基之类的胺保护基团来保护(衍生)反应性胺基。
通常，游离羧基不具有足够的反应性来与胺反应形成酰胺键，这样优选的是提供有助于脱水作用并由此驱动反应完成的一些手段。这可以通过例如“活化”羧基作为酰基卤化物衍生物或活性酯衍生物来实现(The Peptides，Analysis，Synthesis and Biology Vol 1 MajorMethods of Peptide Bond Formation；Academic Press New York 1979eds Gross，E.and Meienhofer，J.，Peptides：Chemistry andBiology，Wiley-VCH Weinheim 2002，Sewald，N.and Jakubke，H-D.，The Chemical Synthesis of Peptides Clarendon Press，Oxford 1994，Jones，J.)。
在第一种活化方法中，在脱水反应物存在下(如果需要的话，其他活化试剂也可以存在)，使含有羧酸的反应物与含有羟基部分的第二种反应物发生反应，从而得到这样的产物，其中含酸部分与含羟基部分通过酯键相连。该产物被称为“活化酯”。选择舍有羟基部分的反应物，使得所述的产物酯可以容易地与伯胺发生反应，从而生成氨化物，并释放出之前所述的含有羟基部分的反应物。在一些情况下，活性酯是足够稳定的，从而能够在使用之前对其进行分离、纯化和储存。
在第二种活化方法中，可以使含有羧基的反应物与活化试剂“原位”发生反应，从而形成酰基类物质，该物质进一步与伯胺(其同样以“原位”方式存在，或者是在合适的先前活化时间之后加入的)反应，从而形成所需的酰胺键。
两种活化方法在PCT/AU2006/001591中都有更详细的描述。
树状聚体基序的赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元与核心化合物发生反应。所述的核心可以是含有三个或多个反应性(氨基)氮的任何化合物，其中一个反应性(氨基)氮最终成为用于第一功能部分(第一氨基氮原子)的连接点。应该理解，该氮原子可以在树状聚体的构建过程中通过合适的保护基团来保护。
在本发明的某些实施方案中，所述的核心可以通过使二氨基化合物的一个氮原子与赖氨酸或赖氨酸类似物反应，从而形成三氨基核心化合物的方法来制备。然后，所述的二氨基化合物的未反应的氨基成为用于连接第一功能部分的氨基，而所述的赖氨酸或赖氨酸类似物的至少两个氨基成为用于所述的构造单元的连接点。
适用于与赖氨酸或赖氨酸类似物(例如本文示例性举出的那些)反应、从而制备出所述的核心部分的二氨基化合物包括：
Figure G2007800345645D00131
其中a为1至9的整数，例如1、2、3、4或5；
Figure G2007800345645D00132
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4或5，例如2或3；并且d为0-100的整数，例如1-30，特别是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30；
Figure G2007800345645D00133
其中a和b独立地为整数0、1、2、3、4或5；
Figure G2007800345645D00141
其中a和c独立地为整数1、2、3、4、5或6；而c为整数0、1、2、3、4、5或6；
Figure G2007800345645D00142
其中a和d独立地为整数1、2、3、4、5或6；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。
可以使用未经过进一步改性(即，与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应)的三氨基化合物，或者可以使该三氨基化合物与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应来形成四氨基核心。
三氨基化合物的实例包括：
Figure G2007800345645D00143
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4、5或6；
Figure G2007800345645D00144
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；
Figure G2007800345645D00152
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f独立地为整数1、2、3、4、5或6。
可以使用未经过进一步改性(即，与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应)的四氨基化合物，或者可以使该四氨基化合物与赖氨酸或赖氨酸类似物发生反应来形成五氨基核心。四氨基化合物的实例包括：
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。
Figure G2007800345645D00162
其中a、b、c和d独立地为整数1、2、3、4、5或6。
Figure G2007800345645D00163
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h独立地为整数1、2、3、4、5或6。
此外，所述核心的任何亚甲基都可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前提条件是这种替代不会导致在所述的核心内形成碳酸酯部分或氨基甲酸酯部分。
在某些实施方案中，所述的核心为得自赖氨酸或赖氨酸类似物与二氨基化合物反应的三氨基化合物，其中所述的二氨基化合物选自：
Figure G2007800345645D00171
其中a为整数1、2、3、4或5；
其中a、b和c独立地为整数2或3；而d为1-30的整数；
Figure G2007800345645D00173
其中a和d独立地为整数1或2，而b和c独立地为整数0、1或2。
在具体的实施例中，所述的核心由二氨基化合物(例如化合物11，其中a、b、c和d均为1(NEOEOEN))和赖氨酸或赖氨酸类似物(例如类似物5，其中a、b、和c均为2(Su(NPN)2))构成。
在其他实施方案中，所述的核心为选自以下物质中的单独的三氨基或四氨基化合物，或者为三氨基或四氨基化合物与赖氨酸或赖氨酸类似物的反应产物，其中所述的三氨基化合物为：
Figure G2007800345645D00174
其中a、b和c可以相同或不同，并且为1至2的整数；
其中a、b和c独立地为整数0、1或2；而d、e和f独立地为整数1或2。
其中所述的四氨基化合物为：
Figure G2007800345645D00182
其中a、b、c和d独立地为整数0或1；
Figure G2007800345645D00183
其中a、b、c和d独立地为整数1或2；
Figure G2007800345645D00184
其中a、b、c和d独立地为0、1或2；而e、f、g和h独立地为整数1或2。
赖氨酸和赖氨酸类似物树状聚体聚合物的制备是公知的，并且在美国专利号4,289,872和4,410,688的实施例中有所描述。
通常，所述的树状聚体具有保留了单一一个反应性位点(该位点被保护(通过合适的保护基团))的核心，而所述核心的其余氨基位点用于构造单元定加入。所述核心的被保护的反应性位点最终用于将单一的实体(第一功能部分)与大分子的核心连接。
在构建所述的树状聚体的过程中，可以利用胺保护基团，通过例如使构造单元上的两个可利用氨基中的仅仅一个氨基、或构造单元上的三个可利用氨基中的仅仅一个或两个氨基发生反应，或者备选地，使仅在一部分表面构造(例如每个第二或第三构造单元、或者三分之二的构造单元)单元上的所有氨基发生反应，从而仅使一层或一代中构造单元的一部分表面上的胺基进一步发生反应。然而，在本发明的某些实施方案中，在特定层或代中的构造单元的每一个氨基都会进一步与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元发生反应，直到所需数量的层或代被构建完成为止。在这种方式中，例如，当使用具有两个氨基的构造单元时，层中构造单元的数量为紧邻下层中构造单元的数量的二倍，而当使用具有三个氨基的构造单元时，层中构造单元的数量为紧邻下层中构造单元的数量的三倍。
信号传导实体为能够通过产生可测定信号来进行检测的实体，例如分子、或其残基、离子或原子。
合适的信号传导实体的实例包括：
信号发生器，其包括由于其的存在而使所述系统产生可检测且可测定的搅动的任何物质。信号发生器可以被定义为这样的实体，其以电磁辐射(例如X射线、紫外线(UV)辐射、红外线(IR)辐射等)的形式发射出任何可检测量的能量，并且包括磷光和荧光实体、以及γ和X射线发射器、或者物质(例如中子、正电子、β粒子、α粒子等)，并包括放射性核、正电子发射器等；例如但不限于：荧光实体、磷光实体和辐射(例如放射性核、粒子、和辐射源)、以及使用上文所述的任何一种或多种物质(包括但不限于信号发生器)标记的核苷酸、毒素或药物；
信号反射器，例如但不限于：顺磁或磁性实体，如Fe、Gd或Mn、硝酰基、NMR移位反应物(例如Eu或Pr盐)；
信号吸收器可以定义为这样的实体，其吸收电磁辐射或物质形式的可检测量的能量。一些实例为染料、造影剂、电子束遮光剂、芳香UV吸收剂、以及硼(其吸收中子)。一种给定的实体既可以为信号吸收器、又可以为信号发生器，即，荧光或磷光性物质能够吸收光和发射光；硼吸收中子并发射放射线；而其他的实例例如有但不限于造影剂(如Gd、Mn或Fe)和电子束遮光剂(如Pb或Fe)。
在本发明的某些实施方案中，所述的信号传导实体为顺磁颗粒。
用于本发明的造影剂的顺磁颗粒优选为原子序数为21-29、42、44或57-83的金属离子，并且更优选的是原子序数为21-29、42、44或57-83的顺磁形式的金属离子。这些顺磁金属离子具有未配对的电子；所述离子中未配对电子的数量决定了离子使用的稳定性。所述的顺磁金属离子可以选自以下这些：
  原子序号   金属   离子   未配对电子的数量
  24   铬   Cr3+   3
  25   锰   Mn2+   5
  26   铁   Fe3+   5
  27   钴   Co2+   3
  29   铜   Cu2+   1
  59   镨   Pr3+   2
  63   铕   Eu3+   6
  64   钆   Gd3+   7
  65   铽   Tb3+和4+   6和7
  66   镝   Dy3+   5
  67   钬   Ho3+   4
  68   铒   Er3+   3
更优选的顺磁离子包括Fe3+，Mn2+和Gd3+，最优选的顺磁离子为Gd3+。
如上文所述，所述的顺磁金属离子优选地与赖氨酸或赖氨酸类似物树状聚体聚合物螯合。天然形式的顺磁金属离子的主要问题是它们的毒性。因此，优选的是形成金属离子螯合掩蔽剂复合体，从而产生毒性大幅减小的热力学和动力学稳定的化合物。由此，树状聚体的末端表面上的基团可以包括能够形成金属离子螯合掩蔽剂复合体的螯合掩蔽剂。
在本发明的其他实施方案中，所述的信号传导实体为荧光试剂。这种试剂是公知的，并且被成像领域所了解。具体试剂包括荧光部分的丹酰基、以及荧光素。
本发明成像剂的靶向树状聚体可以进一步改善被传递至靶器官或组织中的试剂的浓度。因此，如上文所述，本发明的大分子具有至少一个与所述的树状聚体连接的靶向分子(有利的是在所述树状聚体的核心处)，从而提供所述试剂以靶向作用。靶向分子为这样的分子或其残基，其通过特异性地与诸如细胞表面受体之类的另一种分子结合或相互作用，而可以指导并浓缩所述的树状聚体在特异性的位点处，例如特定种类的细胞或组织。此类靶向分子优选的为肽，例如抗体，可任选地为单链形式的抗体。
在优选的实施方案中，靶向分子对在细胞表面上表达的受体或标志物进行靶向。这种靶向分子可以选自以下这些物质：
●能够与活化的白细胞结合的分子。优选的是，所述的分子与Mac-1受体分子结合，更优选的是与活化形式的Mac-1受体分子结合。这种靶向分子在国际申请号PCT/AU2006/001586中有所描述，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
●能够与活化的血小板结合的分子。合适的血小板靶向分子抗LIBS抗体已经在国际申请号PCT/AU2006/00943中有所描述，该文献的全部公开内容以引用方式并入本文。备选地，所述的血小板靶向分子可以靶向细胞粘附分子P-生物素。
●能够与血纤蛋白结合的分子。优选的是，所述的分子选择性地与血纤蛋白β链的氨基末端结合。
●能够与活化第内皮细胞结合的分子。优选的是，所述的分子与细胞粘附分子(例如血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和P-选择素)结合。
因此，在本发明的该实施方案中，提供了一种成像剂大分子，其包含：
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)第一功能部分，其通过第一氨基氮原子与所述的核心部分连接；
(iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；
(iv)一个或多个第二功能部分，其与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元的最外层的表面氨基氮原子连接；
其中
所述的第一功能部分和第二功能部分均包含选自靶向分子和信号传导实体的试剂，从而使得所述的大分子具有至少一个靶向分子和至少一个信号传导实体，其中所述的靶向分子能够结合：
(a)活化的白细胞；
(b)活化的血小板；
(c)血纤蛋白；或
(d)活化的内皮细胞。
优选的是，在活化的白细胞上被靶向的分子为Mac-1。上文所述的Mac-1靶向分子优选为包含氨基酸序列基序DX1X2X3X4X5X6X7X8X9Y的多肽，其中X1为S或非氨基酸；X2独立地为T、L或F；X3独立地为L或W；X4独立地为A或G；X5独立地为P、F或非氨基酸；X6为Q或非氨基酸；X7独立地为I、L或S；X8为F或Y；而X9为E或D。所述的多肽或衍生物可以呈现多种形式。但是，在最优选的形式中，所述的多肽或衍生物包括氨基酸序列DSTLAPIFEY，DLWGFQLFDY或DFWGSYDY。
在本发明该实施方案的备选形式中，所述的Mac-1靶向分子为单链形式的抗体。优选的是，所述的单链抗体包含以下区域中的一个或多个区域，所述的区域为：HCDR1，HCDR2，HCDR3，LINKER，LCDR1，LCDR2，LCDR3。在一个实施方案中，HCDR1为AASGFIFRDYDMD或AASGFSNYGIH，或者等价序列；HCDR2独立地为TSSYTIQDAA或VALISYDNGNKKFYA，或者等价序列；HCDR3区域独立地为DLWGFQLFDY，DFWGSYDY或DSTLAPIFEY，或者等价序列；LINKER独立地为KLEEGEGSEARV或者等价序列；LCDR1独立地为GGNNIGSKSVH或GGNNIGSTTVH，或者等价序列；LCDR2独立地为YDSVRPS或DDNERPS，或者等价序列；LCDR3独立地为QVWDSNTDHYV或QVWDSGSDHVV，或者等价序列。
在本发明该方面的备选实施方案中，上文所述的血小板靶向分子具有结合活化的血小板或与活化的血小板相关分子的能力。通常，这可通过与活化的血小板表面上的标志物相结合来实现。目前具有多种主要存在于活化的血小板上的标志物，包括P-选择素、CD40L和活化的GPIIb/IIIa。优选的是，所述的靶向分子靶向GPIIb/IIIa上配体诱导的结合位点(LIBS)。在这种形式中，所述的靶向分子可以诱导抗LIBS抗体。
备选地，所述的血小板靶向分子可以为这样的分子，其靶向细胞粘附分子的选择素家族的成员。优选的是，所述的选择素家族为P-选择素，并且可以包括抗P-选择素的抗体。
在其他实施方案中，所述的靶向分子能够与活化的内皮细胞结合。优选的是，这些分子靶向细胞粘附分子，并包括上文所述的与P-选择素相结合的分子。备选地，所述的分子能够与细胞粘附分子VCAM-1相结合。
在另一实施方案中，所述的靶向分子可以靶向血纤蛋白。所述的血纤蛋白靶向分子优选为单链形式的抗体，更优选的是单克隆抗体，最优选的是抗血纤蛋白59D8，其可以选择性地与血纤蛋白β链的氨基末端结合。当凝血酶从完整的纤维蛋白原上除去纤维蛋白肽A和B时，所述的氨基末端会暴露出来。
在本发明该方面的优选的实施方案中，提供了这样的成像剂，其包含如上文所述的树状聚体、一种或多种信号传导实体、以及第一和第二靶向分子。有利的是，所述的第一靶向分子为第一功能部分(其与树状聚体的核心连接)，而第二靶向分子与树状聚体的表面连接。所述的第一和第二靶向分子可以为相同的分子。例如，两个多肽或其衍生物能够与高亲和性的Mac-1受体-1特异性地结合。备选地，可以使用不同的分子，其中第二靶向分子与不同的、但是位于相同的靶物器官或组织上的受体结合。例如，第二靶向分子可以与易于发展成动脉硬化症的内皮细胞上表达的VCAM-1结合。因此，造影剂可以靶向已经粘附在活化的内皮细胞上的活化的白细胞。
备选地，所述的第一靶向分子可以靶向VCAM-1，而所述的第二靶向分子可以靶向P-选择素，其中VCAM-1和P-选择素均在活化的内皮细胞上表达。基于这些教导、以及已知靶向分子的细胞定位和组织分布，技术人员能够理解它们的其他组合。
由于造影剂大分子的挠性降低，已经表明在多个位点处进行结合增强造影剂的信号强度。此外，造影剂大分子与多个靶位点的结合包括以下额外的优点：
●增大靶物亲和性并提供更强的特异性；
●减慢了所述试剂由靶物上解离的速率，由此增大了造影剂的使用时间。
本发明的大分子可以通过分支(devergent)或汇聚(convergent)树状聚体合成来制备。分支和汇聚的合成是本领域已知的方法。在一个实施方案中，所述的大分子通过分支合成构建，其中所加入的构造单元的最后一层(表面)可以任选地具有被保护的氨基，和/或带有氨基(其具有已经连接的功能部分，或者经改性剂改性)，和/或带有连接体部分(其用于随后连接功能部分)。
备选地，在汇聚合成方法中，包含多于一个单一构造单元的树状聚体基序或楔(wedge)可以与树状聚体的核心或表面上的氨基连接。此外，树状聚体基序的表面上的氨基可以任选地被保护，和/或可以已经具有一个或多个连接的功能基团，和/或被改性剂改性，和/或带有用于功能部分的相似部分。
带有靶向分子的树状聚体聚合物可以通过除去位于所述树状聚体的核心第一氨基氮或表面上的氨基氮原子处的任何合适的氨基保护基团，并将靶向分子与脱保护的氨基原子连接(任选地通过连接体，以及任选地通过使用改性剂基团对用于连接的氨基氮原子进行改性)来制备。
如上文所述，所述的功能部分可以在所选的连接位点处与所述的大分子直接连接，或者通过可切除或不可切除的连接体与所述的大分子连接。
术语“连接体”在本文中是指起到将功能部分与表面上的氨基原子或核心氨基原子相连的作用的任何化学实体。本发明所包括的示例性的连接体包括诸如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚芳基(polyaryl)、肽、烷基和烯基链、以及糖类(单糖、寡糖和多糖)之类的聚合物。
在具体的实施方案中，所述的连接体包含PEG链，例如1-100亚乙氧基重复单元，例如2-20或20-40的重复单元。
可以使用基于PEG的长链基团作为连接体部分。例如，可以按照与普通肽相似的方法来使用PEG肽，不同之处在于PEG部分提供了额外的体内稳定性以及用于载体的物质。通常，PEG肽用于将药物与抗体载体缀合，并且具有以下优点：在暴露酶切除位点的同时增大抗体与药物之间的距离；降低缀合体的免疫原性；增加血液循环的时间以及增大所述复合体的溶解性。在缀合体内化并且活性药物在经过酶的作用而释放(其不必以游离药物的形式释放)以后，观察到阿霉素与多卡米星(Duocarmycin)衍生物的抗增殖作用。
在将连接体部分用于将功能部分与所述大分子的核心或表面上的胺相连的情况下，可以在连接体部分与树状聚体的合适的胺发生反应之前或者之后来进行连接体与功能部分之间的反应。
因此，可以采用多种方法来使用连接体，从而将第一功能部分与所述的核心相连。在第一种方法中，可以将连接体与所述的核心相连，而将第一功能部分与连接体相连。备选地，可以首先将连接体与功能部分相连，然后与所述的核心相连。在第三种方法中，所述的核心和功能部分这二者都可以与连接体或连接体成分相连，随后使两个连接体一起反应，从而在所述的核心和第一功能部分之间形成连接体部分。
类似地，可以采用多种方法来使用连接体，从而将第二(或者第三或第四)功能部分与所述树状聚体的表面相连。可以使连接体与所述树状聚体的表面上的氨基氮原子相连，然后将第二(或者第三或第四)功能部分与连接体相连。备选地，可以首先将连接体与功能部分相连，然后与表面上的氨基氮原子相连。如上文所述，可以将连接体部分或其成分与表面上的氨基氮原子以及第二(或者第三或第四)功能部分这二者相连，随后使两个连接体或成分发生反应，从而在所述的表面与功能部分之间形成连接体部分。
此外，可以将连接体部分引入到根据本发明的大分子的合成中，例如在构造单元之间。如上文所述，可以将连接体与表面上的氨基氮原子或形成下一层的构造单元相连，或者与这二者均相连，从而最终在构造单元之间形成连接体。
实施用于将一个或多个连接体部分引入到树状聚体或树状聚体基序上(在所述的表面上或者在核心中)的反应，从而确保在具有连接体部分的大分子的所有脱保护表面上的胺能够完全反应。通常，上述过程通过使用过量的所选连接体部分来完成。
可以在连接体与功能部分发生反应之前，使连接体与脱保护树状聚体基序或大分子发生。在其他实施方案中，与大分子相连的连接体可以反之带有保护基团，而该保护基团需要脱保护从而能够与功能分子发生反应。
优选的是，胺保护基团选自：Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸酯(4-NO2-CBz)Fmoc，Dde，CF3CO2，2-卤代-CBz，Alloc，Me3SiEtSO2，Troc，o-NO-2PhSO2以及2，4-二硝基苯-磺酰基，并且优选的是选自：Boc，CBz，4-硝基苄氧基氨基甲酸(4-NO2-CBz)，Fmoc 2-卤代-CBz，Aloc以及Me3SiEtSO2。
根据所连接的功能部分的需要，连接体可以为可切除的或者为不可切除的。可以对可切除的连接体加以设计，使得其可以被酶切除，并且例如可用于靶向表达所述酶的组织的大分子中。备选地，酸性不稳定的连接体可以为优选的，使得与其相连的化合物可以在酸性条件(例如在缺氧组织中)下被释放。
连接体部分可以包括经选择使其主链变硬化(stiffen)的重复单元，或者可以为部分交联的，从而使主链变硬化。
连接体可以通过使该连接体中具有合适的稳定或不稳定的基团而制成可切除的或不可切除的。连接体中合适的可切除的和不可切除的基团的实例包括：
  连接体种类   概括
  氨基化合物   通常用作稳定的连接体。
  腙   其为在生理学pH下最稳定的酸性不稳定的连接体，已经显示，该连接体水解所述的键而释放出抗肿瘤药物之后能够抑制某些肿瘤细胞的生长。
  肟   其为在生理学pH下最稳定的酸性不稳定的连接体，已经显示，该连接体水解所述的键而释放出抗肿瘤药物之后能够抑制某些肿瘤细胞的生长。
  亚胺   其为在生理学pH下最稳定的酸性不稳定的连接体，已经显示，该连接体水解所述的键而释放出抗肿瘤药物之后能够抑制某些肿瘤细胞的生长。
  酯   酯的切除性能主要与它们的结构、数量或可切除的位点有关，其中单酯比二酯更稳定。通常，酯要比酰胺键更不稳定，但是比二硫键更稳定。原酸酯的切除取决于酸性pH。
  肽   已经将多种肽键作为通常的非特异性酶可切除性连接体进行研究。它们的稳定性在很大程度上取决于它们所连接的分子和序列。
  二硫化物   其为最不稳定的可利用的连接体之一，并且在循环中显示出较差的稳定性。其通常用于帮助毒性种类的物质/载体在靶器官中的快速代谢
  胸苷   虽然其之前没有被用作可代谢的连接体，但是在许多实体肿瘤中，胸苷磷酸化酶都是过表达的，并催化胸苷进行磷酸切除，从而形成胸腺嘧啶以及脱氧核糖-1-磷酸。
i)氨基化合物连接体
酰胺键的性质在确定游离药物是否由缀合体中释放出来中是重要的。例如，药物(例如多柔比星)与载体通过酰胺键缀合形成了缀合体，该缀合体是水解稳定的，并且在体外不能发挥任何抗癌作用。通过酰胺键而直接与载体键合的药物还不容易被切除形成游离药物，但是如果载体本身是可降解的，则所述的药物可以被切除形成药物-氨基酸。由载体(通过直接的氨基化合物连接体键合)中释放出游离药物仅能够在稀少的环境中取得，其中在所述的环境下，所述的药物本身是类肽分子，并且药物与载体之间的键为可酶切的。
ii)腙、肟和亚胺连接体
对于将药物从载体上切除而言，腙、肟和亚胺键不需要酶的存在。在低pH(例如在肿瘤血管外的空间中或者在溶酶体内)环境下，所述的连接体能够在C＝N键处被水解切除。通常使用的腙、肟和亚胺连接体得自连接体的腙、肟和胺部分分别与药物活性部分的羰基(酮或醛)所进行的反应。所述的连接体还可以通过改变在C＝N键部分周围的烷基的数量，或者通过使用吸电子的部分(增大酸性不稳定性)或者供电子(降低酸性不稳定性)部分进行取代，从而减慢水解的速率。
iii)酯连接体
可以制备酸不稳定且可代谢的酯连接体。已经使用原酸酯来使PEG与结合阴离子膜载体的脂质缀合。所述的缀合体在酸性条件(pH4-6)下的稳定性取决于酯或原酸酯连接体的结构。通常，α-甲氧基-ω-{N-(2-十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH4和5下均显示出良好的稳定性，α-甲氧基-ω-{N-(2-胆甾醇氧基-[1，3]二氧戊环-4-基)甲基氨基}-聚乙二醇110在pH5下是非常稳定的，但是在pH4下会适度的不稳定，α-甲氧基-ω-{N-(2-甲基-s-十八烷氧基-[1，3]二氧戊环-5-基)-氨基}-聚乙二醇110以及α-甲氧基-ω-{N-2-(3-羟丙基-胆甾醇基氨基甲酸酯)-2-甲基-[1，3]二氧戊环-5-基-氨基}-聚乙二醇110是不稳定的。就与小分子缀合的简单酯而言，与单酯(其比二硫化物更稳定，但是比酰胺键不稳定)相比，二酯的功能性提供了更多的代谢切除位点。
iv)肽连接体
到目前为止，肽连接体是所有可切除的连接体中最通用的，这是因为可以使用氨基酸的许多不同组合来控制切除的速率和切除的酶类。但是，这些连接体具有与其作为药物和载体的缀合体用途有关的两个问题：1)它们通常可以被遍布全身的非特异性肽酶切除，并由此可以在非肿瘤分布位点处形成非特异性的药物毒性；以及2)切除可以在所述的连接体位点处进行，这会形成仍保持与药物分子键合的氨基酸。这种情况可能会妨碍药物分子的化疗效果。备选地，所结合的氨基酸不会改变药物的药理学作用，但会影响其药物动力学。然而，这些切除作用可以通过在肽连接体(其与药物分子直接结合)中选择合适的氨基酸(例如脯氨酸)来控制。
通常，将组织蛋白酶B可切除的连接体设计成在药物缀合体经过溶酶体系统的内吞作用之后切除，这是因为组织蛋白酶位于溶酶体中，而在细胞质中不存在。内吞作用通常在载体(其通常为直接针对癌特异性细胞表面受体的抗体或者癌特异性细胞表面受体的配体的抗体)与细胞膜结合后被引发。
非特异性蛋白酶(即，对具体的肽序列为非特异性的蛋白酶)可以在PEG化的大分子发生充分的外渗并在肿瘤组织中累积之后由该PEG化的大分子上切除药物。
关于肽切除的速率的以下指导指出，a＞b的情况表明a的切除速率大于b的切除速率。对于用作活性药物与树状聚体末端氮之间的连接体的肽序列而言：末端Cys＞非末端CysGly＞末端Gly＝末端，GlyPheGly＞末端GlyGlyGly和末端GlyGlyGlyPhe＝末端GlyProGly。
注意：CysGly键由GSH还原。相对于其他肽键而言，GlyGlyGly键通常非常稳定。二肽的切割通常对具体蛋白酶是特异性的，并且可以根据肿瘤细胞内所包含的多种蛋白酶的表达来控制。
v)二硫化物连接体
二硫化物连接体是如今使用的最不稳定的连接体，并且在体外发生快速还原性切除。然而，它们的体内稳定性通常高于它们的体外稳定性。它们可以在含硫氨基酸之间通过二硫化物键或者在非肽类二硫化物键之间形成。它们还对机体内的其他亲核硫醇显示出较高的反应性，因此显示出快速的血浆清除作用。
连接体切除性的一般概述
在循环中，连接体切除性的顺序如下：
二硫化物＞长链肽≥酯＞腙≥四肽(GlyGlyGlyPhe)＝三肽(GlyPheGly＞GlyGlyGly＝GlyProGly)≈或＞二肽(AlaVal、AlaPro、GlyPro、PheLeu、Val-Cys)＞戊二醛＝氨基化合物。
多种连接体的稳定性是基于它们所缀合(即，酶与连接体的易接近性)的基团、缀合体在所需活性的位点处的表现(即，细胞吸收或细胞外累积)以及缀合体的性质(即，酯对比氨基化合物)的。二硫化物缀合体与所述的当前系统的体内表现被认为是相对不可预测的。虽然长链肽更容易被蛋白酶所接近，从而被快速切除，但是它们在非特异性位点处被切除的太快，从而导致释放出不具有生物学活性的药物活性肽/氨基酸种类。
基于C＝N的连接体(腙、肟和亚胺)、酯或肽缀合体的切除至少要在多天内发生，这允许缀合体在肿瘤组织中累积。每种连接体都具有它的优点，但是酯或腙连接体是优选的。将药物活性物质与大分子相连的酯键提供了可快速切除的键，虽然这种切除并非是靶位点特异性的，但是这种切除会释放出游离的药物活性物质。与酯相比，形成腙键的缀合体在普通的循环中是更稳定的，并且在肿瘤位点处通过水解C＝N键而以更高的特异性进行切割。但是，所述的药物活性分子需要通过引入羰基部分或肼部分来进行改性，从而形成腙。
在一些实施方案中，所述的连接体部分可以包含两个反应性基团，F′和Y′，它们通过一个或多个碳或杂原子(优选的是通过烃主链)相连。所述的反应性基团F′可以是活化的，从而与反应性胺部分(例如核心上或者树状聚体基序表面层或表面以下的层上的那些)发生反应。通常，所述的反应性基团F′为羧基或其残基。其他的功能部分Y′为包含保护基团的胺，或者是对该部分进行选择使得其具有特异的反应性，该反应性与所需功能部分(其与核心上或者树状聚体基序表面层或表面以下的层连接)的反应性基团是互补的。Y′的典型实例包括胺基、羟基、硫醇、烯基或炔基、腈、卤化物、羧酸酯或叠氮基团。
除了上文所述的连接体以外，根据本发明可以使用光切除性(photocleabable)连接体。例如，可以使用光切除性异双功能连接体。光切除性异双功能连接体可以为溶于水的或者溶于有机溶剂的。光切除性异双功能连接体包含可以与胺或醇发生反应的活化的酯、以及可以与硫醇基发生反应的环氧化物基团。在酯与环氧化物基团之间为3，4-二甲氧基-6-硝基苯基光异构基团(photoisomerisationgroup)，当该光异构基团暴露于近紫外光(365nm)中时，其释放出完整形式的胺或醇。因此，当使用所述的连接体将药学活性成分与大分子相连时，该药学活性成分可以通过将靶区域暴露与近紫外光而以生物学活性或可活化形式释放。
在其他实施方案中，大分子的制备可以进一步包括对胺基和/或连接体和/或功能部分进行改性的步骤，从而有助于功能部分与胺直接连接，或者通过可切除或不可切除的连接体连接。
因此，在大分子表面或核心中的胺基可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与连接体或功能部分的连接。备选地或此外，可以对连接体进行改性，从而有助于与表面或核心中的胺基相连接。
用于与功能部分连接的连接体的末端可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与功能部分的连接。备选地或此外，功能基团可以通过改性剂基团来进行改性，从而有助于与连接体连接，或者直接与表面或核心中的胺基连接。
在具体的实施方案中，用于与第一功能部分和/或第一功能部分连接的核心上的第一氨基氮原子、和/或第一功能部分被进一步修饰，从而有助于第一功能部分与核心的连接。
可以对氨基(表面上的或核心中的)部分和/或连接体和/或功能部分进行改性，从而允许任一功能部分与氨基原子通过连接体相连，其中所述的功能部分通过使用能够对化学部分进行诱导的基团而衍生得到，其中所述的化学部分选自：卤代乙酰胺、马来酰亚胺或其他硫醇反应性部分、反应性硫醇或可互换的二硫化物部分、脂肪族或芳香族醛、酮、烷氧基胺、肼、叠氮化物、炔、低聚组氨酸阵列和任何肽阵列、次氮基三乙酸基团、任何羧酸酯或其反应性残基(例如活化酯)；能够与有机卤化物发生反应的化学部分，例如有机甲锡烷基(organostannyl group)、丙烯酸酯、硼酸(或酯)以及通过金属催化的偶联反应而生成的有机炔(分别命名为Stille、Heck、Suzuki和Sonogashira)，能够进行酶连接(例如通过使用谷氨酰胺转移酶)的任何部分，以及天然形成化学连接的任何部分。用于衍射，从而引入改性剂的方法是本领域已知的。
更优选的是，所述的化学改性剂可以选自以下的物质：
(i)马来酰亚胺
Figure G2007800345645D00321
(ii)卤代乙酰胺(X＝Cl、Br和I)
Figure G2007800345645D00322
(iii)酰肼
Figure G2007800345645D00323
(iv)烷氧基胺
Figure G2007800345645D00324
(v)3-(2-吡啶基二硫代硫代)丙酸酯
Figure G2007800345645D00325
在某些实施方案中，可以对表面上或核心中的胺进行改性，从而允许通过使用包含化学部分的基团衍生的功能部分的连接，其中所述的化学部分选自：卤代乙酰胺(haloacetamide)、马来酰亚胺或其他硫醇反应性部分、可反应的硫醇或可互换的二硫化物部分、醛、酮、烷氧基胺部分、肼、叠氮化物、炔、低聚组氨酸阵列、次氮基三乙酸基序。
在优选的方法中，除去所选的胺(例如核心胺)的保护基团，并使这种胺在可以形成酰胺键的条件下与卤代乙酸衍生物或马来酰亚胺衍生物(例如3-马来酰亚胺丙酸或4-马来酰亚胺丁酸)发生反应。用于将含硫醇的肽和蛋白质与所述的硫醇活性基团偶联的一般方法在Hermanson，G.T.Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)中有所描述，并且该文献被本文所引用。
用于将大分子与诸如肽和抗体之类的分子共价偶联的一般方法在本领域的技术水平范围内。此类方法在Hermanson，G.T，Bioconjugate Techniques(Academic Press 1996)(该文献被本文所引用)，Blatter et al，Biochem.，24；1517(1985)和Jue et al，Biochem.，17：5399(1978)中有所描述。用于将包含相邻组氨酸残基的肽或蛋白质与包含次氮基三乙酸基序的大分子或固体支持物(通过与镍络合)相连的方法在Hochuli et al J.Chromatogr，1987 411 177，Sigal et al Anal.Chem.1996 68 490和Gershon et al J.Immunol.Meth，1995 183 65中有所描述。上文所引述的文献均以引用方式全文并入本文。
优选的是，所述的靶向分子通过化学部分，通过形成共价键或金属络合而与树状聚体聚合物相连。
优选的是，所述的靶向分子为抗体形式的多肽或多肽。
在本发明优选的实施方案中，所述的靶向分子(优选为抗体形式的肽或肽)被合成为在N或C末端处具有多个相邻的组氨酸残基(聚组氨酸基序)、半胱氨酸标签或它们的组合，从而有助于与被保护的树状聚体发生反应。
靶向肽和抗体可以被表达融合到N或C末端(优选为N末端)的聚组氨酸基序中。可以使用末端聚组氨酸基序通过镍络合物使靶向肽与本发明造影剂的树状聚体缀合，其中镍离子作为末端表面基团而存在于树状聚体上，或者以与次氮基三乙酸部分形成络合体的形式而存在于延伸出树状聚体的连接体的末端上。备选地，可以将聚组氨酸基序用于使用镍亲和树脂的一步纯化中，并且任选地，通过包含肠激酶或肽链内切酶酶切识别位点从经纯化的分子中除去。这种纯化方法是本领域的技术人员公知的。
更优选的是，所述的靶向多肽或抗体可以被表达融合到N或C末端，优选为N末端的半胱氨酸尾部。半胱氨酸包含高度亲核的硫醇基团，该基团可以在硫醇特异反应性基团(例如氯代、溴代或碘代乙酰胺基或马来酰亚胺部分)存在下使用，从而形成使所述的靶向多肽或抗体与所述的树状聚体偶联的硫醚键。这些硫醇反应性基团通过合适的衍生试剂(例如卤代乙酰氯、或者甘氨酸或3-氨基丙酸的马来酰亚胺衍生物)与树状聚体种类物质的一个或多个选择性去保护的末端表面胺发生反应以树状聚体材料的形式提供。
此外，靶向多肽或抗体还可以与半胱氨酸和组氨酸尾部组合表达。所述的半胱氨酸和组氨酸尾部可以分别在彼此相对的末端处表达(例如N末端半胱氨酸尾部和C末端组氨酸尾部)，或者均在N末端或C末端表达。
优选的是，所述的顺磁金属离子可以在与所述的靶向分子连接之前，与树状聚体上的螯合掩蔽剂部分连接，由此使顺磁金属离子与靶向分子的非特异性结合最小，并避免了可以导致分子发生变性的条件。而且，还包括使顺磁颗粒与靶向树状聚体的分子络合物螯合，然后进行纯化，从而除去过量的未被螯合的顺磁颗粒。
i)合适的螯合掩蔽剂
合适的螯合掩蔽剂包括但不限于聚氨基聚羧酸(PAPCA)螯合掩蔽剂，特别是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物。其他备选物包括：1，4，7-三氮杂环壬烷；1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，7-双(乙酸叔丁酯)(DO2A-t-bu-酯)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三(乙酸叔丁酯)(DO3a-t-bu-酯)；1，4，7-三(叔丁氧羰基)-1，4，7-四氮杂环十二烷(DO3-t-BOC)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”’-三乙酸(DO3A)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-a，a’，a”，a”’-四(甲基乙酸)(DOTMA)；乙二胺四乙酸(EDTA)；反-1，2-二氨基环己烷-N，N’，N”，N”’-四乙酸(CDTA)；1，8-二氧-三亚乙基-四胺-N，N’，N”，N”’-四乙酸(DTTA)；1-氧杂-4，7，10-三氮杂环十二烷三乙酸(DOXA)；4，10，16-三氧杂环十八烷-N，N’，N”-三乙酸(TTTA)；1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)；亚乙基双(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-Cl-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHPG、5-t-Bu-EHPG以及5-sec-Bu-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA以及二苄基-DTPA；双-2-(羟基苄基)-亚乙基二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；包含至少3个碳原子(更优选的是包含至少6个碳原子)并且包含至少2个杂原子(O和/或N)的大环化合物类别，该大环化合物可以包含1个环、或者2个或3个在杂原子环元件处彼此相连的环，例如苯并-DOTA、二苯并-DOTA以及苯并-NOTA(其中NOTA为1，4-三氮杂环壬烷-N，N’，N”-三乙酸)、苯并-TETA、苯并-DOTMA、苯并-TETMA(其中TETMA为1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)、1，3-亚丙基二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物、以及1，5，10-N，N’，N”-三(2，3-二羟基苯甲酰)氨基甲苯(MECAM)的衍生物。
DTPA具体参照式(I)至(IV)的任何一项中所示的结构：
Figure G2007800345645D00361
优选的是，造影剂的树状聚体具有顺磁Gd螯合物，例如二亚乙基三胺五乙酸钆(GdDTPA)、四胺1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’-乙四乙酸钆(GdDOTA)以及1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸钆(GdDO3A)。本领域已知，在某些应用中，其他金属可以取代Gd(III)。本发明使用的优选的螯合剂为DTPA。本发明所包括的代表性螯合剂和螯合基团的实例在WO 98/18496、WO 86/06605、WO91/03200、WO 95/28179、WO 96/23526、WO 97/36619、PCT/US 98/01473、PCT/US 98/20182以及美国专利号4,899,755中有所描述，所有这些文献均以引用方式并入本文。
在每种树状聚体表面上的螯合剂部分的数量取决于核心(由该核心处开始组装树状聚体)的化合价以及在树状聚体组装中使用的赖氨酸构造单元的层的数量。例如，在二价核心上1层赖氨酸构造单元的树状聚体具有携带4个螯合掩蔽剂部分的能力；在二价核心上2层赖氨酸构造单元的树状聚体具有携带8个螯合掩蔽剂部分的能力；在二价核心上3层赖氨酸构造单元的树状聚体具有携带16个螯合掩蔽剂部分的能力；以及在二价核心上4层赖氨酸构造单元的树状聚体具有携带32个螯合掩蔽剂部分的能力。
ii)螯合掩蔽剂与赖氨酸树状聚体聚合物的连接-直接方式
可以以多种方式实现螯合掩蔽剂部分与本发明的赖氨酸树状聚体聚合物的连接。例如，Krejcarek等人(Biochemical and BiophysicalResearch Communications 77：581(1977))的混合酐过程；Hnatowich等人(参见Science 220：613(1983)等)的环状酐过程；Meares等人(参见Nal.Biochem.142：68(1984)等，其为Schering在EP-A-331616中使用的技术，从而产生用作MRI或X射线造影剂的位点特异性聚螯合剂)的主链衍生过程；以及由(例如)Amersham(参见WO-A-85/05554)和Nycomed(参见EP-A-186947等)使用的连接体分子过程(其产生了用作MRI造影剂的双功能螯合剂的顺磁金属离子螯合剂)。
大环螯合剂部分可以与树状聚体上的末端表面胺基缀合，或者可以对树状聚体的末端表面胺基进行改性，从而形成末端羧酸盐、醇、硫醇盐等。树状聚体胺基与螯合剂部分之间的连接优选为酰胺键、衍生自树状聚体的氨基氮以及衍生自位于大环螯合剂上的羧基或羧基衍生物官能团的氨基羰基基团。优选的是，大环螯合剂为PAPCA，更优选的是DTPA，最优选的是羰基或羰基衍生官能团与所述的螯合剂连接。
本发明树状聚体中的螯合掩蔽剂部分优选衍生自具有反应性羧基或胺基(其并非为金属配位键合所必需的)的螯合剂。所述的反应性基团可以为这样的一种基团，在游离螯合掩蔽剂中，该基团可以起到金属配位基团的作用，只要缀合的螯合掩蔽剂部分保持与金属离子络合的能力即可。备选地，所述的反应性基团可以为所述螯合掩蔽剂侧链或主链碳上的取代基。
大环螯合掩蔽剂还可以通过非配位伯胺基而与所述的树状聚体缀合。具有非配位伯胺基的大环螯合掩蔽剂包括：伯胺侧链衍生的DOTA大环、伯胺衍生的DO3A以及伯胺衍生的六氮杂和八氮杂的大环和大双环(HAM、Sepulchrate和Sarcophagine)以及种类广泛的衍生醚冠穴状物。
这些螯合掩蔽剂上的非配位伯胺基可以在公知的条件下与卤代乙酰基卤化物发生反应，从而生成卤代乙酰胺。该卤代乙酰胺可以与树状聚体的伯胺发生反应，从而在螯合掩蔽剂和树状聚体之间形成稳定的酰胺连接物。在De Riemer et al，J.Labelled Compd.Radiopharm.18：1517(1981)中所述的卤代乙酰基卤化物可用于将含胺螯合掩蔽剂与树状聚体连接。
此外，大环螯合掩蔽剂上的胺基还可以与光气发生反应，从而生成反应性异氰酸酯基，或者与硫光气发生反应，从而生成反应性异硫氰酸酯基。这些基团可以与树状聚体表面基团的伯胺发生反应，从而在配体与树状聚体之间分别生成稳定的脲或更稳定的硫脲连接物。Gansow，Inorg.Chimica Acta 91：213(1984)和Moi et al，J.Amer，Chem.Soc.110：6266(1988)描述了通过分别使用了光气和硫光气方法来形成异氰酸酯或异硫氰酸酯部分，从而将螯合掩蔽剂与具有胺基的蛋白质相连接的方法。此外，参见Desreux，Inorg.Chem.19：1319(1980)；Bryden et al.Anal.Chem 53：1418(1981)；Delgardo etal，Talanta 29：915(1982)。
对于具有悬垂的羧酸酯的大环物质(包括但不限于：DOTA、TETA、TRITA(1，4，7，10-四氮杂环十三烷四乙酸)和NOTA)而言，可以使一种羧酸酯活化，从而与树状聚体的伯胺基发生反应。由羧酸酯基来形成反应性实体的方法已经在上文中有所描述。此类反应顺序使得树状聚体被大环螯合掩蔽剂部分通过稳定的酰胺连接物而被取代。在优选的方法中，螯合掩蔽剂的仅有一个多羧酸酯部分被活化用于与树状聚体形成酰胺键，并且这种形成过程是通过在每个螯合掩蔽剂中使用单一一个羧酸活化反应物的等价物、并使用足够过量(相对于树状聚体的胺)的螯合掩蔽剂以确保完全反应来进行的。树状聚体-螯合掩蔽剂构建物的纯化是通过使用分子排阻色谱法或超滤技术来完成的。
iii)螯合掩蔽剂与树状聚体的连接-间接方式
备选地，所述的树状聚体可以通过与大环螯合掩蔽剂连接的连接体基团来与大环螯合掩蔽剂部分相连。
所述的连接体部分可以为包含1-30个碳原子(通过单一一个键或多个键共价连接)的任何小的亚单元，其中至多10个碳原子可以被O、N、P、S、F、Cl、Br、H或I所取代。所述的连接体起到了将螯合掩蔽剂与树状聚体相连的作用。连接体的实例包括：线性或分支的烷、烯或炔，它们均任选地被诸如羰基、醚、酰胺、胺、脲、硫醚、芳基、磷酸酯、氨磺酰之类的官能团取代。某些实施方案的优选连接体包括两种或多种化学官能团，其中的一种官能团与树状聚体连接，而其他官能团与螯合掩蔽剂连接。备选地，所述的螯合掩蔽剂可以与二胺、二环氧化物、二醇、二酸或二官能化的PEG连接体部分相连。
顺磁颗粒的引入
将顺磁颗粒(优选的是金属离子)与螯合掩蔽剂络合的方法是在本领域的技术水平范围内。所用的每种金属都可以通过三种一般方法中的一种方法被引入到大环螯合掩蔽剂部分中，所述的方法为：直接引入、模板合成和/或金属转移(transmetallation)。其中，直接引入是优选的。
可以将金属离子Fe(III)，Cr(III)，Mn(II)，Hg(II)，Pb(II)，Bi(III)以及镧系元素通过以下的一般过程直接引入到PAPCA中。将水溶形式的金属(通常为无机盐)溶解于适量的经过蒸馏的去离子水中。优选的是，对此类盐加以选择，使得其不会干扰金属离子与螯合掩蔽剂的结合。溶液的pH会低于7。将含有等摩尔量聚螯合掩蔽剂的水性溶液在室温下边搅拌边加入到所述的金属溶液中。所得混合物的pH通过加入碱(通常为0.1M的NaOH)而缓慢升高，直到聚螯合掩蔽剂的供体基团去质子化，通常pH的范围为7至9(取决于螯合掩蔽剂部分)。试样镧系元素要特别小心保持pH在8以下，以避免金属氢氧化物发生沉淀。将金属引入到DOTA衍生的和相关的大环螯合掩蔽剂部分中通常是缓慢的过程，如下文引用的文献所述。
Choppin et al，J.Inorg.Nucl.Chem.，33：127(1971)，Margerum，Rec.Chem.Prog.，24：237(1973)以及D′Olieslager etal，J.Inorg.Nucl.Chem.，35：4255(1973)描述了将镧系元素直接引入到PAPCA中的方法。Margerstadt，Mag.Res.Med.，3：808(1986)以及WO-A-87/06229描述将Gd(III)引入到DOTA中的方法。上述文献均以引用方式全文并入本文。
在本发明的另一个方面中，提供了单瓶或多瓶试剂盒以及使用说明书，其中所述的试剂盒包含所有制备本发明的造影剂所需的成分。
造影剂的用途
在本发明的其他方面中，提供了用于对哺乳动物中的细胞靶物进行成像(例如核磁共振成像)的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向哺乳动物给药根据本发明的成像剂；
(b)使所述的成像剂与细胞靶物结合；以及
(c)对所述的哺乳动物进行成像，从而形成图像。
优选的是，所述试剂的信号传导实体包括顺磁颗粒，其可以包括与造影剂的树状聚体螯合的金属离子，更优选的是与造影剂的树状聚体螯合的Gd离子。
在优选的实施方案中，对细胞靶物的成像是疾病或症状的指示。
在一个实施方案中，所述造影剂的树状聚体聚合物可以适用于检测活化的内皮细胞，其中上文所述以及在此进一步详述的靶向分子可以选自能够与内皮粘附分子、VCAM-1或P-选择素结合的分子，所述内皮粘附分子例如Mac-1受体分子的活化形式。因此，所述的造影剂可以适用于诊断早期动脉硬化症，如下文所述。就所述的目的而言，还可以利用对血纤蛋白进行的检测。
在另一个实施方案中，所述的造影剂可以适用于检测活化的血小板，其中如之前所述以及在此进一步详述的那样，所述的靶向分子可以为抗LIBS的抗体或能够与P-选择素结合的分子。因此，所述造影剂的树状聚体聚合物可以适用于诊断血液凝固紊乱，特别是早期的血液凝固紊乱。
本文所述的MRI造影剂可以与现有的造影剂相同的方式使用。
在本发明的其他方面中，提供了药物组合物，该药物组合物包含：
根据本发明的大分子；以及
可药用的赋形剂、载体或佐剂。
合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂、缓冲剂以及pH调节剂。合适的添加剂包括生理学生物相容的缓冲剂(例如盐酸氨基丁三醇)、或者加入(例如1至50摩尔％)的钙盐或钠盐(例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)。如果需要的话，所述的药物组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂、或者pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准的载体，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
待治疗的受试者包括哺乳动物受试者：人、灵长类、家畜动物(包括牛、马、绵羊、猪和山羊)、宠物(包括狗、猫、兔、豚鼠)、以及捕获的野生动物。此外，还包括了诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠之类的实验室动物，这是因为它们可以提供方便的测试系统。在本发明的某些实施方案中，还可以包括诸如鸟、两栖动物和鱼之类的非哺乳动物种类。
可以根据适用于对人类或动物模型系统进行静脉内给药的药物组合物的常规过程来配制所述的组合物。通常，用于静脉内给药的组合物为无菌等渗水性缓冲剂溶液。在需要的情况下，所述的组合物还可以包含增溶剂以及诸如利诺卡因之类的局部麻醉剂，以减轻注射位点的疼痛。通常，多种组分或者以分开的方式提供，或者一起被混合在单位剂型中，例如干的冻干粉或无水的浓缩物。所述的组合物可以储存在指示了活性单位中活性剂的量的密封容器(例如安瓿或sachette)。在所述的组合物通过灌输进行给药的情况下，其可以被分散在装有无菌药物级“注射用水”或盐的灌输瓶中。在所述的组合物通过注射进行给药的情况下，可以提供用于注射的无菌水、或盐的安瓿，这样可以将多种组分在给药前混合。
所述的组合物优选的是以可注射组合物的形式对患者进行给药。组合物的给药方法优选的是肠胃外给药。合适的肠胃外给药途径包括：血管内给药(例如静脉内推注、静脉内灌输、动脉内推注、动脉内灌输、以及使用导管向脉管系统进行滴注)；组织外周和组织内注射；皮下注射或沉积，包括皮下灌输(例如通过渗透泵)；以及通过例如导管或其他安放器械(例如栓剂或植入，包括多孔、无孔或凝胶材料，sialastic膜或过滤器)直接施加到组织上。
可以按照与其他诊断试剂或治疗试剂相似的方法向包括人在内的哺乳动物给药本发明的药物组合物。给药剂量和给药模式取决于多种因素，包括年龄、体重、性别、患者的状况以及遗传因素，并且最终由医务人员在对变化的剂量进行试验确定、然后按照本文所述进行成像之后来决定。通常，具有诊断敏感性或治疗效力所需的剂量为宿主机体质量的约0.001-50,000μg/kg，优选为宿主机体质量的约0.01-25.0μg/kg。最佳的剂量可以通过下文公开的内容凭经验确定。
现在，针对两个具体应用来描述使用MRI造影剂的方法。
动脉硬化症的早期诊断
动脉硬化症是最明显的冠心病，由于由动脉内部多数层的灶性增厚而引发的损伤使得冠心病产生了进行性且为慢性的动脉内腔狭窄。富集脂质的动脉粥样硬化损伤由血管、内皮细胞和平滑肌细胞、以及成纤维细胞和浸润的白细胞(其将动脉硬化症定义为一种慢性炎症)构成。白细胞募集是引发动脉硬化症中的重要步骤。
动脉粥样硬化损伤的发展需要白细胞(例如单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)、内皮细胞、血管平滑肌细胞、生长因子以及细胞因子之间的复杂的相互作用。对任一种所述成分表面上的一种或多种分子进行检测可以用于动脉硬化症的早期诊断。在所述发展中的首先且最重要的事件之一是白细胞与内皮细胞内层的粘附，并且随后发生血细胞渗出。粘附作用是通过与内皮细胞(特别是活化的内皮细胞)上表达的粘附分子的相互作用而介导的。
更具体地说，粘附作用可以通过内皮细胞上表达的细胞内粘附分子-1(ICAM-1)与白细胞上表达的β2-整合素受体Mac-1之间的相互作用来介导的。通常，当Mac-1处于活化形式下时，其仅能够参与到炎性途径中。因此，有价值的是能够检测出作为动脉硬化症早期诊断的、白细胞与血管壁的粘附。
另一种重要分子为VCAM-1。VCAM-1是一种在内皮细胞、上皮细胞、树突细胞以及巨噬细胞上表达的免疫球蛋白样粘附分子。取决于α4β1整合素VLA-4的亲和力情况，VCAM-1能够介导滚动型(rollingtype)粘附和紧密粘附。虽然ICAM-1与其他内皮粘附分子具有结构上的相似性，但是VCAM-1的调节方式是特别的。VCAM-1不会在基线条件下表达，但是在动脉粥样硬化条件(包括早期损伤)下会被快速诱导，从而产生更强的粘附以及单核细胞和淋巴细胞的迁移。
此外，还涉及P-选择素。P-选择素是细胞粘附分子的选择素家族中的成员。其在受到刺激的内皮细胞上表达，并介导白细胞在受到刺激的内皮细胞上滚动。
就这种效果而言，可以通过本文所述的能够与活化形式的Mac-1受体分子、VCAM-1粘附分子或P-选择素粘附分子结合的分子使本发明造影剂的树状聚体靶向所述的炎性损伤。
考虑到上文所述的多肽或衍生物活性，所述的造影剂可以用于医学治疗和诊断中。
因此，本发明进一步提供了用于检测活化的Mac-1、VCAM-1粘附分子或P-选择素粘附分子在受试者或测试物中的存在、缺乏或水平的方法，该方法包括将受试者、或者受试者的生物样品或测试物暴露于造影剂或其组合物，其中所述的靶向分子能够分别与高亲和性的Mac-1受体-1、VCAM-1或P-生物素特异性的结合。
活化的Mac-1、VCAM-1或者特别是P-选择素的存在为动脉硬化症的指示。因此，本发明提供了诊断早期动脉硬化症的方法，该方法包括以下步骤：
向哺乳动物给药造影剂，其中所述的造影剂包含能够与活化形式的Mac-1受体分子结合的靶向分子；
使所述的MRI造影剂与所述的细胞靶物结合；以及
对所述的哺乳动物进行成像，从而形成MR图像。
在另一实施方案中，所述的靶向分子能够与VCAM-1结合，在另一实施方案中，所述的靶向分子能够与P-选择素结合。
优选的是，所述造影剂的顺磁颗粒包括与所述造影剂的树状聚体螯合的金属离子，更优选的是与所述造影剂的树状聚体螯合的Gd离子。
在本发明的另一实施方案中，提供了用于检测血纤蛋白在受试者或测试物中存在、缺乏或水平的方法，该方法包括将受试者、或者受试者的生物样品或测试物暴露于造影剂或其组合物，其中所述的靶向分子能够与血纤蛋白特异性的结合。
血纤蛋白可以形成部分动脉粥样硬化块。因此，本发明提供了诊断早期动脉硬化症的方法，该方法包括以下步骤：
向哺乳动物给药造影剂，其中所述的造影剂包括能够与血纤蛋白结合的靶向分子；
使所述的MRI造影剂与所述的细胞靶物结合；以及
对所述的哺乳动物进行成像，从而形成MR图像。
优选的是，所述的靶向分子为能够与血纤蛋白β链的氨基末端进行选择性地结合的单链单克隆抗体。
炎性过程的一般检测
Mac-1与多种病理过程有关，例如发炎、动脉硬化症和缺血，因此在多种疾病(包括心肌梗塞、脓血症、风湿性关节炎)中，Mac-1的活性状态和表达水平发生改变。已经表明Mac-1的表达与冠心病动脉血管成形术之后的再狭窄风险有关，与患有急性心肌梗塞的患者在血管形成术之后的促凝血活性有关，并且反应了抗血小板试剂对冠状动脉内支架置入之后的单核细胞活性的治疗效果。综上，通常在免疫应答相关疾病和炎性疾病中，具有特异性活性的抗Mac-1的scFv提供了新的诊断机会。
检测活化的血小板
凝结必需受到极为严格的调节，这是因为即使是一个不合适的凝块，也能够导致致命的后果。事实上，血液凝结是中风和心脏病发作的主要原因，而这两种疾病也是致人死亡的两个主要原因。此外，当前的治疗性抗凝血剂还是死亡率和发病率的主要来源，其中所述的死亡率和发病率是由效力的限制所导致的，而流血并发症导致甚至更严重。这样，理想的是能够在早期检测出血栓的形成，以便使使用抗凝血剂来进行治疗的需要和/或程度最小。
在受伤组织修复后，血液凝结的过程以及随后凝块的溶解被称为止血。该过程的最初阶段为血管收缩。这会限制血液流动到受伤区域。然后，血小板由凝血酶所活化，并在受伤位点处聚集，从而形成暂时的疏松的血小板塞子。蛋白类的纤维蛋白原是刺激血小板聚集的主要原因。血小板通过与胶原蛋白(其在血管内皮内层破裂之后暴露出来)结合而发生聚集。一经活化，血小板释放出腺苷-5′-二磷酸、ADP和TXA2(其活化了其他血小板)、血清素、磷脂、脂蛋白、以及对于凝血级联重要的其他蛋白质。
目前有多种主要存在于活化的血小板上的标志物，包括P-选择素、CD40L和活化的GPIIb/IIIa。所述的标志物可以为这样的物质，其呈现出非活性和活性形式，这样在活化的血小板中，与凝结系统中的其他成分相比，一种形式比其他形式占优势。一种在血小板表面上最丰富的表达分子为糖蛋白受体(GP)IIb/IIIa(CD41/CD61)。该受体属于整合素的粘附分子家族，并且还被称为αIIbβ3。整合素由两种非共价连接的亚单元构成，就与GPIIb/IIIa配体纤维蛋白原的结合而言，所述的整合素发生了构型改变，其由一种低亲和性受体变为高亲和性受体。除了配体结合袋暴露以外，这种构象变化还诱导了GPIIb/IIIa上所谓的配体诱导结合位点(LIBS)的暴露。由于这些结合位点对活化的和/或配体结合的GPIIb/IIIa受体具有特异性，并且由于GPIIb/IIIa是非常丰富的(每个血小板的表面上具有大约60,000-80,000个分子)，所以用于凝块靶向的表位的先决条件是非常独特的。
所述的造影剂可以适用于对受试者中的凝结紊乱进行诊断或预后的方法，该方法包括检测受试者的血管中的活化的血小板。
本发明提供了检测血液凝结紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
向哺乳动物给药造影剂，其中所述的造影剂包括作为抗LIBS的抗体的靶向分子；
使所述的MRI造影剂与所述的细胞靶物结合；以及
对所述的哺乳动物进行成像，从而形成MR图像。
在另一实施方案中，所述的靶向分子能够与P-选择素结合。优选的是，所述的分子为单链抗体。
优选的是，所述的血液凝结紊乱与活化的血小板有关。
优选的是，所述的造影剂的顺磁颗粒包括与所述造影剂的树状聚体螯合的金属离子，更优选的是与所述造影剂的树状聚体螯合的Gd离子。
活化的血小板的检测向临床医生提供了用于多种医疗应用中的相关标志物。一种应用为对在破裂的冠心病斑块上或倾向于破裂的那些斑块上的活化的血小板进行成像。这允许对急性冠心病综合症(其具有之后的预防性地将血管支架植入到可能的相关损伤中)进行早期非侵入性的诊断。由于冠心病血管造影术仅提供了关于血管内腔的信息、但没有提供关于血管壁本身的形态，所以上述诊断是特别有用的。因此，可能破裂或倾向于破裂的斑块不能用冠心病血管造影术来检测。
其他应用包括使用在国际申请号PCT/AU2006/00943(并入本文中)中所述的单链抗体和方法、以及能够与P-选择素结合从而检测活化的血小板(例如，在肺部或外周栓塞中，或者在外周或脑动脉中的破裂的动脉粥样硬化斑块上)的任何累积情况的分子。这些损伤可以在疾病过程中的早期进行检测，并进行选择性地治疗。
技术人员能够理解，本文所述的单链抗体和方法可用于鉴定易患凝结紊乱，而不必表现出凝结紊乱的临床公认的迹象或症状的个体。
在所述方法的优选形式中，检测活化的血小板的步骤包括使用单链抗体。优选的是，所述的单链抗体与抗LIBS的抗体或P-选择素抗体相同或相似。事实上，技术人员能够理解，可以使用单链抗体的片段，只要该片段包含用于结合活化的血小板的位点即可。不希望被理论所限制，据信，单链抗体的紧凑的尺寸在所述的应用中是特别有利的。指出，所述的抗体能够从血栓表面以外渗透到存在有大量活化的血小板的区域中。这允许对结合的抗体进行更有效的检测，因此可以进行更敏感的成像。
所述的方法可以用于诊断和鉴定血栓症(例如深度静脉血栓)、血栓栓塞(例如肺栓塞)以及活化的血小板的沉淀(例如在不稳定的动脉粥样硬化斑块的位点处)。早期检测是非常有利的，其可以给药凝块溶解试剂和/或抗凝血剂治疗和/或干预过程。
可以在本发明该方面的方法中使用的其他分子为血纤蛋白，其为凝结的后期成分。血纤蛋白与在纤维蛋白原经过凝血酶切割后而新形成的凝块有关。因此，提供了一种检测血液凝结紊乱的方法，该方法包括以下步骤：
向哺乳动物给药造影剂，其中所述的造影剂包括能够结合血纤蛋白的靶向分子；
使所述的MRI造影剂与所述的细胞靶物结合；以及
对所述的哺乳动物进行成像，从而形成MR图像。
优选的是，所述的靶向分子为选择性地与血纤蛋白β链的氨基末端结合的单链单克隆抗体。
应该理解，本说明书所公开和定义的发明扩展到所提及的、或者由内容或附图显而易见的一个或多个单个特征的所有备选组合。所有这些不同的组合构成了本发明的多种备选方面。
现在，参照所附的实施例来更充分地描述本发明。但是，应该理解以下的说明仅是示意性的，不应该以任何方式作为对上述发明的通性进行的限定。
实施例
现在，参照以下的非限定性示意性实施例和附图来对本发明进行描述。
为了鉴定本发明所述的多种单个化合物，已经开发出命名系统。该命名法用于简化化合物的描述，并且用于替代复杂的IUPAC名称(使用该名称可能易于出错并难以解释)。
所述树状聚体的命名利用了以下缩写：
Figure G2007800345645D00481
Figure G2007800345645D00491
星号表示以酰胺形式与赖氨酸分支单元或加帽部分的羧基键合的胺基。#号表示以酰胺形式与核心或赖氨酸分支单元的胺键合的羧基。
所述的树状聚体的命名采用了以下形式：
核心[最后的完整的层：重复单元]n[加帽试剂]m[不完整的外层：构造单元]p[加帽试剂]q
其中：
●核心为三氨基部分，其中第一层赖氨酸重复单元被加入到该部分中；
●n为在所述树状聚体的最外部的完整的层上，赖氨酸重复单元的数量；p为在所述树状聚体的不完整的外层上，赖氨酸重复单元的数量；
●m为在构造单元的最外部的完整的层上，加帽试剂(例如甘露糖部分或末端胺保护基团)的数量；q为在构造单元的不完整的外层上，加帽试剂的数量；
●任选地，加帽基团和/或构造单元可以被悬挂在所述的核心上；
然后按照上文所述的相同的原则，使用前缀[加帽试剂]r[重复单元]s来表示。
本发明所包括的示例性大分子可以根据下式方便地示出：
[第一功能部分]核心[构造单元]m[第二功能部分]p[第三功能部分]q
其中：
所述的核心和构造单元如本文所述，而所述的功能部分选自靶向分子和信号传导实体；
m表示构造单元(包括表面和表面以下的层)或大分子的总数。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，m为2-32的整数，例如2、4、8、16或32；
p表示第二功能部分的数量，其中所述的第二功能部分与构造单元表面(最外)层上的氨基氮原子连接。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，p为1-64的整数，例如2、4、8、16、32或64；
q表示第三功能部分的数量，其中所述的第三功能部分与构造单元表面(最外)层上的氨基氮原子连接。例如，在每层都包含具有2个氨基的构造单元的情况下，q为0-63的整数，例如pa dn q不大于64。
由于在树状聚体结构的构造中仅使用的赖氨酸重复单元且核心的化合价是已知的，并且还由于在加入新的赖氨酸层的过程中，每个树状聚体层的所有末端氮基团均与赖氨酸充分反应，所以所述的命名法通过规定核心和外层而起到了完全描述所述树状聚体的大小的作用。
其他缩写如下：
 缩写   全名
 PyBop   六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-磷鎓
 DIPEA   N，N-二异丙基乙胺
 DCC   1，3-二环己基碳二亚胺
  HOBt   1-羟基苯并三唑氢氧化物
  NaH   氢化钠
  BnBr   苄基溴
  TBDMSCl   叔丁基二甲基氯硅烷
  EtAlCl2   乙基二氯化铝
  TFA   三氟乙酸
  DCM   二氯甲烷
  EtOAc   乙酸乙酯
  MeOH   甲醇
  MeCN   乙腈
  DMF   二甲基甲酰胺
  DMSO   二甲基亚砜
  PBS   磷酸缓冲盐
  TLC   薄层色谱
  HPLC   高效液相色谱
  MS   质谱
  DPTA   二亚乙基三胺五乙酸
  DOTA   1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸
HPLC和MS设备的详细情况：
HPLC-具有2996二极管阵列检测器(Diode Array Detector，DAD)的Waters 2795
MS-具有ESI探针的Waters ZQ4000，其中输入流被分流，从而使进入MS的量为约50μL/min。
如所述的那样，在正、负电喷雾离子化模式下获得质谱数据。使用Maximum Entropy运算法(MaxEnt)(其由MassLynx软件v4.0执行，该软件由Waters Corporation提供)对原始数据进行去卷积。在实验内容中报告的数据对应于对理论零带电状态去卷积后所观察到的数值。
实施例1
[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2
i.苄氧基羰基氨基-3，6-氧杂-8-氨基辛烷：[CBz]NEOEOEN在20分钟内，向由2，2′-(次乙二氧基)二乙基苯胺(4.45g，30mmol)和TEA(0.7mL，50mmol)在MeCN(50mL)中形成的溶液中滴加由N-(苄氧基羰氧基)琥珀酰亚胺(1.2g，5.0mmol)在MeCN(10mL)中形成的溶液。一旦该加入过程完成，便在室温下对所得的溶液搅拌过夜。真空除去乙腈，并将得到的无色残余物再次溶解于水(50mL)中。用DCM(3×25mL)洗涤所得的水性溶液，并在真空下还原合并的有机提取物。将残余物溶解于2M HCl(25mL)中，并用二乙醚(3×25mL)洗涤。然后，将水层用NaOH中和至pH 7，并在真空下蒸发至干态。将所得的残余物加入到EtOAc(25mL)中，并过滤，然后在Na2SO4上干燥。真空除去溶剂后得到无色油状物(840mg，2.9mmol，60％)。ESIMS(+ve)283[M+H]+；C14H22N2O4[M+H]+的计算m/z：283.34。
ii.2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯
在室温下，将由二亚丙基三胺(171g，1.32mol)在THF(200mL)中形成的溶液在1h内滴加到由叔丁基-1H-咪唑-1-羧酸酯(444g，2.64mol)在THF(1.2L)中形成的溶液中。将所得的溶液回流4h，然后在室温下搅拌过夜。在真空下除去THF，并将残余物溶解于DCM(2L)中。将DCM溶液首先用NaOH(2M，2×1L)洗涤，然后用10％w/v柠檬酸(2×1L)洗涤。丢弃DCM和NaOH溶液。然后，将水性柠檬酸溶液用NaOH(4M，直至pH 14)碱化，再用DCM(3×600mL)萃取，然后将合并的DCM提取物真空浓缩，从而得到澄清的油状物，该油状物通过冷却而固化，从而得到白色固体(346g，80％)。
iii.HO-Su(NPN)2[Boc]2
将2-({2-[(叔丁氧羰基)氨基]丙基}氨基)丙基氨基甲酸叔丁酯(208.5g，0.63mol)和甲苯(900mL)装入装配有顶置式搅拌器的3L容器中。一次性加入琥珀酸酐(63g，0.63mol)，并将所得溶液在60℃下加热过夜。将混合物冷却至室温，然后加入二乙醚(1×200mL)，并过滤出固体。将该固体用二乙醚(2×200mL)洗涤，然后进行干燥，从而得到白色固体(230g，91％)。
iv.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2
向由[CBz]NEOEOEN(Example 1i)(440mg，1.6mmol)在DMF(4mL)中形成的溶液中加入TEA(0.22mL，1.6mmol)和PNPO-Su(NPN)2-Boc2(950mg，1.8mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂，并将残余物溶解于EtOAc(250mL)中。将该溶液用盐水(125mL)、1MNa2CO3(3×50mL)、水(125mL)和1M KHSO4洗涤，再用盐水(125mL)进行二次洗涤，然后在Na2SO4上干燥。将溶液真空浓缩，并通过硅胶色谱(MeOH/DCM梯度)纯化，从而得到澄清的粘性油状物(165mg，0.23mmol，15％)。ESI MS(+ve)496[M+H]+；C24H41N5O6[M+H]+的计算m/z：496.61。
实施例2
[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4
将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Boc]2(Example 1iv)(13.89g.20.0mmol)溶解于乙酸(50mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴上冷却。以将溶液的温度保持为5℃或低于5℃的速率加入经冰冷却的TFA(50mL，0.73mol)中。移走冰浴，并将该溶液在室温下搅拌5h。然后，以将混合物保持在5℃以下的速率，加入经冷却的和冰冷却的水(100mL)。真空蒸发挥发物，并将水加入到油状残余物中。然后，将该溶液真空浓缩，并用更多的水(2×100mL)重复上述过程。将所得的油状物溶解于水(50mL)中，并将所得的溶液过滤并冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(17.1g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.90(外观五重峰，J＝6.6Hz，2H)；1.99(m，2H)；2.57(m，2H)；2.65(m，2H)；2.89(t，J＝6.6Hz，2H)；3.00(t，J＝7.5Hz，2H)：3.30-3.38(复合体，6H)；3.42-3.58(复合体，6H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.0min；ESI MS(+ve)496.2[M+H]+；C24H42N5O6 +[M+H]+的计算m/z：496.3。
在室温下，将由DBL-OPNP(12.8g，17.7mmol)在DMF(80mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2.TFA]2(19.5g，35.4mmol)和TEA(17.9g，0.177mol)在DMF(80mL)中形成的溶液中。经过16h的搅拌后，加入由甘氨酸(1.50g，29.0mmol)在水(50mL)中形成的溶液，并持续搅拌16h。真空除去挥发物，并将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，然后将该溶液依次用5％w/v Na2CO3(10×50mL)、盐水(50mL)和1M HCl(2×50mL)洗涤，再用盐水(50mL)洗涤。将所得的EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并过滤，然后真空除去溶剂，从而得到无色油状产物(20.74g)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.15-1.95(复合体，16H)；1.43(s，18H)；1.44(s，18H)；2.51(m，2H)；2.64(m，2H)；3.02(t，J 6.6Hz，4H)；3.17(ma，2H)；3.25-3.45(复合体，8H)；3.48-3.58(复合体，4H)；3.61(s，4H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝8.6min；ESI MS(+ve)1153.0[M+H]+；C56H98N9O16 +[M+H]+的计算m/z：1152.7。
实施例3
[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8
将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[Boc]4(20.74g，18.0mmol)溶解于乙酸(50mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却。以将溶液的温度保持在5℃或5℃以下的速率，加入冰冷却的TFA(50mL，0.73mol)。移走冰浴，并将所得溶液在室温下搅拌5h。然后，将该溶液冷却至5℃，并以将所得混合物保持在低于5℃的速率下加入冰冷的水(100mL)中。真空蒸发挥发物，并将水(100mL)加入到残余油状物中。然后将所得的溶液真空浓缩，并用更多的水(2×100mL)重复上述过程。将油状物溶解于水(50mL)中，然后将溶液过滤并冷冻干燥，从而得到泡沫状固体。通过1H-NMR和HPLC/ESI MS对上述材料的分析表明，Boc基团的除去不完全。将部分去保护的材料用乙酸(50mL)和TFA(50mL)处理，然后按照上文所述进行再加工，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(25.1g)，其为浅黄色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.44(m，4H)；1.70(m，6H)；1.86(m，6H)；2.50(m，2H)；2.64(m，2H)；2.99(t，J7.2Hz，2H)；3.12-3.47(复合体，12H)；3.52-3.63(复合体，12H)；3.95(m，2H)；5.12(s，2H)；7.32-7.50(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝10.4min；ESI MS(+ve)752.4[M+H]+；C36H66N9O8 +[M+H]+的计算m/z：752.5。
在室温下，将由DBL-OPNP(16.8g，13.9mmol)在DMF(100mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]2[NH2.TFA]4(33.98g，61.3mmol)和TEA(13.5g，0.134mol)在DMF(100mL)中形成的溶液中。搅拌11h后，加入1M的甘氨酸水性溶液(10mL)；在1h和1.5h后，再次加入等量的甘氨酸溶液。再持续搅拌2h，然后真空蒸发挥发物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，并将所得溶液依次用0.5M HCl(2×50mL)，10％w/v Na2CO3(6×50mL)和盐水(50mL)洗涤。将EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并过滤，然后真空除去溶剂，从而得到所需的无色油状产物(26.26g，91％)。1H-NMR(300MHz，d6-DMSO)δ(ppm)1.00-1.75(复合体，112H)；2.32(m，2H)；2.47(m，2H)；2.75-3.50(复合体，32H)；3.75-3.90(复合体，4H)；4.10-4.25(复合体，2H)；5.01(s，2H)；6.38(br.m，1H)；6.60-6.95(复合体，8H)；7.25(m，1H)；7.28-7.39(复合体，5H)；7.60-8.05(复合体，7H)。HPLC(Hydrophobic/TFA)Rt＝15.2min；ESI MS(+ve)1033.8[M+2H]2+/2；C100H179N17O28 2+[M+2H]2+/2的计算m/z：1033.7。
实施例4
[CBz]NEOEOEN(Su(NPN)2)[Lys]8[Boc]16
将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[Boc]8(24.52g，11.9mmol)溶解于乙酸(108mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却，直到乙酸开始冻结为止。然后，以将溶液的温度保持在10℃或10℃以下的速率下加入TFA(108mL，1.40mol)。然后，移出冰浴，并将所得溶液在室温下搅拌15h。真空蒸发乙酸和TFA，并将水(100mL)加入到残余的油状物中。然后，将溶液真空浓缩，并使用更多的水(3×100mL)重复上述过程。将所得的油状物溶解于水(100mL)中，并将溶液过滤，然后冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(29.2g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-2.05(复合体，40H)；2.53(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(复合体，8H)；3.10-3.45(复合体，16H)；3.55-3.75(复合体，8H)；3.95(t，J6.6Hz，2H)；4.06(t，J6.6Hz，2H)；4.20-4.30(复合体，2H)；5.15(s，2H)；7.35-7.55(复合体，5H)；HPLC(亲水/甲酸盐)Rt＝8.4min；ESIMS(+ve)1265.1[M+H]+，633.0[M+2H]2+/2；C60H114N17O12 +[M+H]+的计算m/z：1264.9，C60H115N17O12 2+[M+2H]2+的计算m/z：633.0。
在室温下，将由DBL-OPNP(48.2g，87.2mmol)在DMF(120mL)中形成的溶液加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]4[NH2.TFA]8(25.83g，11.87mmol)和Et3N(23.9g，0.228mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在搅拌19h后，加入由甘氨酸(3.27g，43.6mmol)在水(80mL)中形成的溶液。持续搅拌2h，然后真空蒸发挥发物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中，并将溶液依次用5％w/v Na2CO3(1×100mL；4×50mL)和1M HCl(2×50mL)洗涤，再用盐水(50mL)洗涤。将EtOAc溶液干燥(Na2SO4)，并进行热过滤，然后真空除去溶剂，从而得到所需的产物，其为黄色玻璃状固体(27.12g，59％)。在波纹滤纸上沉淀出一部分产物，然后将该材料溶解于甲醇中，再进行过滤并真空除去甲醇，从而得到额外的产物(9.02g，20％)，其为黄色泡沫。对这两部分产物进行分析，从而得到了一组相同的1H-NMR和ESI MS数据。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.00-1.75(复合体，232H)；2.51(m，2H)；2.65(m，2H)；2.75-3.50(复合体，40H)；3.50-3.65(复合体，8H)；3.90-4.50(复合体，14H)；5.08(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。HPLC(疏水/TFA)Rt＝19.7min；ESI MS(+ve)1947.3[M+2H]2+/2，1298.3[M+3H]3+/3；C188H339N33O52 2+[M+2H]2+/2的计算m/z：1946.8，C188H340N33O52 3+[M+3H]3+/3的计算m/z：1298.2。
实施例5
[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32
将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Boc]16(25.75g，6.62mmol)溶解于乙酸(122mL)中，并将经搅拌的溶液在冰浴中冷却直到乙酸开始冻结为止。移除冰浴，并小心加入TFA直到乙酸刚好溶解。将经搅拌的溶液再次放置在冰浴中，然后以将所得溶液的温度保持在10℃或10℃以下的速率加入剩余的TFA(所用的TFA的总量为108mL，1.40mol)。移除冰浴，并将溶液在室温下搅拌17h。将该溶液在冰上冷却，然后加入到冰冷的水(400mL)中，同时确保所得溶液的温度被保持在10℃以下。真空蒸发发挥成分，并将水(250mL)加入到所得的油状残余物中。然后，将所得溶液真空浓缩，并使用更多的水(2×250mL)重复上述过程。将最终的油状物溶解于水(200mL)中，并将溶液过滤，然后冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(27.6g)的无色玻璃状固体。1H-NMR(300MHz，D2O)δ(ppm)1.25-1.65(复合体，40H)；1.65-2.05(复合体，48H)；2.50(m，2H)；2.62(m，2H)；2.95-3.05(复合体，16H)；3.05-3.45(复合体，24H)；3.55-3.70(复合体，8H)；3.94(t，J6.6Hz，4H)；4.05(t，J6.6Hz，4H)；4.15-4.30(复合体，4H)；4.30-4.40(复合体，2H)；5.13(s，2H)；7.35-7.50(复合体，5H)；HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.9min；ESIMS(+ve)763.9[M+3H]3+/3，573.4[M+4H]4+/4；C108H212N33O20 3+[M+3H]3+的计算m/z：764.2，C108H213N33O20 4+[M+4H]4+的计算m/z：573.4。
在室温下，将ca.2-3g份的DBL-OPNP(27.66g，59.2mmol)加入到由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[NH2.TFA]16(13.83g，3.36mmol)和Et3N(13.1g，0.129mol)在DMF(150mL)中形成的溶液中。在搅拌17h后，加入由甘氨酸(2.22g，29.6mmol)在水(50mL)中形成的溶液。持续搅拌3h，然后将溶液加入到经快速搅拌的水(400mL)中。从所得的沉淀出的橡胶中倒出上清液体。将橡胶状材料溶解于DMF(100mL)中，并将溶液缓慢加入到由片冰(500g)和水(500mL)形成的经充分搅拌的混合物中。通过过滤收集沉淀的白色固体，并将其再次悬浮于5％w/v Na2CO3中，进行超声波处理，再进行过滤。将所得的固体用水(4×100mL)充分洗涤，并干燥，从而得到所需的产物(22.10g，87％)，其为浅褐色粉末。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ(ppm)1.10-1.95(复合体，472H)；2.52(m，2H)；2.65(m，2H)；2.95-3.10(复合体，30H)；3.10-3.30(复合体，30H)；3.30-3.45(复合体，12H)；3.45-3.65(复合体，8H)；3.80-4.15(复合体，16H)；4.20-4.45(复合体，14H)；5.09(s，2H)；7.25-7.40(复合体，5H)。由于不溶于HPLC流动相中，所以不能得到该产物的HPLC和ESI MS数据。相反，除去Boc基团，并由衍生的的聚三氟乙酸盐来得到这些数据：
将[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32(389mg，51.6μmol)溶解于乙酸(1.9mL)中，并将经搅拌的溶液冷却至0℃，直到乙酸开始冻结为止。小心加入TFA(1.9mL，24.8mmol)，直到乙酸刚好溶解。将溶液在室温下搅拌21h。真空除去挥发物，并将水(5mL)加入到油状残余物中。然后，将溶液真空浓缩，并使用更多的水(2×5mL)重复上述过程。将最终的油状物溶解于水(5mL)中，并进行过滤，再进行冷冻干燥，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[TFA]32(397mg，96％)，其为无定形的白色固体。1H-nmr(300MHz，D2O)δ(ppm)1.20-1.65(复合体，92H)；1.65τ1.85(复合体，62H)；1.85-2.05(复合体，30H)；2.51(m，2H)；2.61(m，2H)；2.95-3.10(复合体，34H)；3.10-3.45(复合体，38H)；3.55-3.70(复合体，8H)；3.94(t，J 6.6Hz，8H)；4.05(t，J 6.6Hz，SH)；4.15-4.28(复合体，8H)；4.28-4.39(复合体，6H)；5.00(s，2H)；7.32-7.49(复合体，5H)；HPLC(Hydrophilic/TFA)Rt＝8.8min；ESI MS(+ve)1447.8[M+3H]3+/3，1086.1[M+4H]4+/4；C204H404N65O36 3+[M+3H]3+的计算m/z：1447.1，C204H405N65O36 4+[M+4H]4+的计算m/z：1085.6。
实施例6
[MAL-(CH2)2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Gd-GlyMeDOTA]32
参照图3来说明标题化合物的制备。按照US 6,045,776所述制备Gd-GlyMeDOTA NHS酯。
反应方案如下所述：
将1(R1＝Boc，R2＝CBz)[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Boc]32用TFA/乙酸进行处理，从而得到2a(R1＝H，R2＝CBz)[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[NH2.TFA]32；在2a与Gd-GlyMeDOTA的NHS酯在DMSO中发生反应后，可以得到2c(R1＝Gd-GlyMeDOTA，R2＝CBz)[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Gd-GlyMeDOTA]32；除去CBz基团(Pd/C，甲酰胺，DMF/H2O)，从而得到2d(R1＝Gd-GlyMeDOTA，R2＝H)[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Gd-GlyMeDOTA]32，接着，该化合物与3-马来酰亚胺丙酸(NHS酯)和DIPEA在DMSO中发生反应，从而得到2e(R1＝Gd-GlyMeDOTA，R2＝MAL-(CH2)2CO)[MAL-(CH2)2CO]NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]16[Gd-GlyMeDOTA]32。
实施例7
MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA]16
i.HO-Su-p-Bn-DTPA-OtBu
向DMF(5mL)中的p-NH2-Bn-DTPA-OtBu(100mg，0.128mmol)加入TEA(50μL，0.35mmol)和琥珀酸酐(25mg，0.25mmol)。在室温下，将混合物搅拌16h。真空蒸发溶剂，从而得到油状物粗品，通过硅胶色谱(洗提剂：15～20％MeOH/DCM)纯化该粗品，从而得到HO-Su-p-Bn-DTPA-OtBu(110mg，97％)。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝5.76min；ESI MS(+ve)m/z＝880[M+1H]；C45H74N4O13的计算m/z：879.1g/mol。
ii.[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16
在0℃下，向由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[NH2.TFA]16(135mg，0.033mmol)和HO-Su-p-Bn-DTPA-OtBu(600mg，0.68mmol)在DMF(20mL)中形成的经搅拌的混合物中加入DIPEA(289μL，1.91mmol)和PyBop(630mg，1.21mmol)。将混合物加温至室温，并搅拌16h。真空蒸发溶剂，从而得到油状物粗品，通过Sephadex(洗提液，MeOH)纯化该粗品，从而得到[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(350mg，66％)的白色泡沫。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝8.15min；ESI MS(+ve)m/z＝16070；C828H1360N97O212的计算m/z：16066.1g/mol。
iii.[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16
向由[CBz]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(130mg，8.1μmol)在9∶1DMF/H2O(10mL)中形成的溶液中加入HCOONH4(150mg，2.45mmol)和10％Pd-C(130mg，0.13mmol)。将悬浮物在室温下搅拌16h。然后，使悬浮物过滤通过0.45微米的过滤器，并将滤液在真空下还原，从而得到[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16的澄清粘性油状物(120mg，93％)。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝8.06min；ESI MS(+ve)m/z＝15940，C820H1354N97O210的计算m/z：15931.9g/mol。
iv.MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16
向由[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(30mg，1.8μmol)在DCM(5mL)中形成的溶液中加入TEA(150μL，1.04mmol)，然后加入MAL-PEG1100-NHS(11mg，7.9μmol)。将所得的溶液在室温下搅拌16h。将该反应溶液真空浓缩，从而得到油状物，通过HPLC(洗提剂：CH3CN/H2O/0.1％TFA)纯化该油状物，从而得到MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16的泡沫(11mg，32％)。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝8.04min；ESIMS(+ve)m/z＝17220；C878H1460N99O238的计算m/z：17211.4g/mol。
v.MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA]16
向MAL-(CH2)2CONH-PBG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(3.5mg，0.2μmol)中加入20％的TFA/DCM(3mL)。将所得的溶液在室温下搅拌2h。将该反应溶液真空浓缩，从而得到MAL-(CH2)2CONH-PEG1100-CO-NEOEOEN[Su(NPN)2][Lys]8[Su-p-Bn-DTPA]16的泡沫(3.5mg)。HPLC/MS(亲水/TFA)Rt＝9.40min(宽峰)；ESI MS(+ve)m/z：未得到该化合物(C588H820N99O238)的质谱。
实施例8
N-荧光素尸胺
在室温下，在惰性气氛中，将DMF(1mL)中的荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(30mg，0.063mmol)加入到由1，5-二氨基戊烷二盐酸盐(66mg，32mmol)在pH 8.4的缓冲溶液(0.1M Na2HPO4/0.1M HCl，2mL)中形成的经搅拌的溶液中。将溶液搅拌12h，然后真空蒸发溶剂。通过HPLC纯化所得的混合物粗品，从而得到N-荧光素尸胺的黄色油状物(20mg，68％)。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝6.67min；ESI MS(+ve)m/z＝461[M+1H]；C24H26N2O6的计算m/z：460.5g/mol。
实施例9
[TFA.NH2(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA]16
i.BocNH(CH2)5NH2(N-Boc-尸胺)
在室温下，在惰性气氛中，通过注射器泵将由2-(Boc-氧亚氨基)-2-苯基乙腈(226mg，0.92mmol)在1，4-二噁烷(30mL)中形成的溶液加入(速率＝8mL/hr)到由1，5-二氨基戊烷二盐酸盐(1g，5.52mmol)和TEA(1ml，7.12mmol)在1∶1的1，4-二噁烷∶水(40mL)中形成的经搅拌的溶液中。将反应物搅拌12h，并将DCM(20mL)加入到反应混合物中。提取有机相，并进行真空浓缩。将黄色残余物溶解于二乙醚(15mL)中，并加入5％的HCl溶液。将酸性溶液用二乙醚洗涤，然后使用2.5M的NaOH将水层的pH调节至pH 14。向其中加入乙酸乙酯(20mL)，并将有机层用盐水(2×50mL)洗涤，并干燥(MgSO4)。真空蒸发掉溶解溶剂，从而得到N-Boc-尸胺的黄色油状物(100mg，55％)。HPLC/MS(亲水/TFA)Rt＝6.17min；ESI MS(+ve)m/z＝203[M+1H]；C10H22N2O2的计算m/z：202.3g/mol。
ii.[HO-Su]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16
向由[NH2]EOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(20mg，1.3μmol)在DMF(1mL)中形成的经搅拌的溶液中加入TEA(150μL，1.04mmol)和琥珀酸酐(2mg，0.02mmol)，并将混合物搅拌16h。然后，将该反应溶液用DCM(2mL)稀释，然后向该溶液中加入N-(2-氨基乙基)氨甲基聚苯乙烯(20mg，0.06mmol)，再将混合物在室温下搅拌2h。接着，将该反应混合物过滤通过0.45微米的过滤器，并将滤液在真空下还原，从而得到[HO-Su]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16的澄清粘性油状物(20mg)。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝8.11min；ESI MS(+ve)m/z＝16030；C824H1358N97O213的计算m/z：16032.0g/mol。
iii.[BocNH(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16
向处于0℃的由[HO-Su]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(20mg，1.3μmol)和N-Boc-尸胺(2mg，9.9μmol)在DMF(1mL)中形成的经搅拌的溶液中加入DIPEA(289μL，139μmol)和PyBop(10mg，19μmol)。将混合物加温至室温，并搅拌40h。蒸发溶剂，从而得到残余物，通过HPLC(洗提剂CH3CN/H2O/0.1％TFA)纯化该残余物，从而得到[BocNH(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(1mg，产率为5％)的白色泡沫。HPLC/MS(疏水/TFA)Rt＝7.97min；ESI MS(+ve)m/z＝16220；C834H1378N99O214的计算m/z：16216.3g/mol。
iv.[TFA.NH2(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA]16
向[BocNH(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16(1mg，0.062μmol)中加入20％TFA/DCM(5mL)。将所得的溶液在室温下搅拌2h。然后将该反应溶液真空浓缩，从而得到[TFA.NH2(CH2)5NHSu]NEOEOEN[Su(NPN)2]Lys8[Su-p-Bn-DTPA-OtBu]16的泡沫(1mg)。HPLC/MS(疏水/TFA)，没有得到这种化合物(C558H820N99O238)的LC/MS。
实施例10
NDP-α-MSH-CH2CO NEOEOEN[Su(NPN)2]{GlyLys[ε-Flu][α-Lys(PEG570)2}2
i.HO-Su(NPN)2[CBz]2
将由(NPN)2[CBz]2(20.0g，0.05mol)和琥珀酸酐(6.0g，0.06mol，1.2当量)在甲苯(180mL)中形成的混合物在65℃下加热16h。将反应物冷却至室温，并滤出白色的固体，然后将该固体用甲基叔丁基醚(3×100mL)洗涤，从而得到高产量的产物(23.54g，94％)。
ii.PNPO-Su(NPN)2[CBz]2
在室温下，向由4-硝基酚(1.91g，13.7mmol)和HO-Su(NPN)2[CBz]2(13.7mmol)在EtOAc(150mL)中形成的经搅拌的溶液中加入由DCC(2.97g，14.4mmol)在EtOAc(50mL)中形成的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，然后过滤(从而除去DCU)。然后，将混合物用K2CO3(1.0M)和盐水1∶1(3×300mL)洗涤，然后进行干燥(MgSO4)、过滤和浓缩，从而得到7.80g的PNPO-Su(NPN)2[CBz]2。
iii.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2
向由[Boc]NEOEOEN(3g，12mmol)在1∶1的DMF/DMSO(60mL)中形成的溶液中加入TEA(3.4mL，240mmol)、以及由PNPO-Su(NPN)2[CBz]2(7.5g，12mmol)在DMSO(30mL)中形成的溶液。将溶液在室温下搅拌15h。真空浓缩该溶液，然后将其再次溶解于水(300mL)中。将水性溶液用EtOAc(3×300mL)洗涤，并将合并的有机洗液在Na2SO4上干燥。真空除去溶剂，并通过硅胶色谱(3％MeOH/DCM)纯化油状物粗品，从而得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2的无色粘性油状物(8.2g，93％)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.20min；ESI MS(+ve)730.3[M+1H]；C37H55N5O10)的计算m/z：729.9。
iv.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2
向由[Boc]MEOEOEN[Su(NPN)2][CBz]2(500mg，0.68mmol)在三氟乙醇(13mL)中形成的溶液中加入的10％w/w钯碳(723mg，34mmol)。将悬浮液在氢气气氛下、在大气压力下搅拌15h。然后，将该悬浮液过滤通过0.2μm的过滤器，并真空浓缩滤液，从而得到[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2的澄清油状物(250mg，80％)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝4.50min.ESI MS(+ve)462.5[M+H+]；C21H43N5O6的计算m/z：461.6。
v.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc]
在室温下，向由MeOGly.HCl(12.56g，0.11mol)和DMF(200mL)形成的经搅拌的悬浮液中缓慢加入TEA(42mL，0.30mol)。然后，将2-3g份的活性酯PNPO-α-Boc-ε-CBz-Lys(50.15g，0.10mol)加入到悬浮液中。将嫩黄色混合物在室温下搅拌18h。真空除去挥发物，所得的残余物分配在EtOAc(200mL)，10％Na2CO3(100mL)与水(175mL)之间。将有机层依次用5％Na2CO3(4×200mL)，0.25M HCl(3×50mL)和盐水(1×50mL)洗涤，然后进行干燥(MgSO4)、过滤和浓缩，从而得到无色油状产物(44.39g，98％)。HPLC(疏水/甲酸盐)Rt＝5.22min.ESI MS(+ve)452.02[M+H]+；C22H33N3O7的计算m/z：451.52。
vi.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA]
向由MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Boc](43.4g，96.03mmol)在乙酸(150mL)中形成的经搅拌的冰冷的溶液中分部加入无水TFA(总量为170mL)。然后将反应物在室温下搅拌5h。在减压下除去挥发物，并通过与甲醇(5×200mL)共沸除去残留的TFA和乙酸。得到了浅黄色油状产物(46.04g)。HPLC(亲水/甲酸盐)12.33min；ESI MS(+ve)352[M+H]+；C17H25N3O5的计算m/z：351.40。
vii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2
向由MeO-GlyLys[ε-CBz][α-NH2.TFA](96mmol)在DMF(200mL)中形成的经搅拌的溶液中加入TEA(33.5mL，0.24mol)，然后加入DBL-OPNP(49.4g，0.106mol)。将溶液在室温下搅拌17h。将由甘氨酸(3.98g，53mmol)在水(50mL)中形成的溶液加入到反应混合物粗品中，并再继续搅拌18h。向其中加入水(200mL)，并通过过滤收集黄色沉淀，然后将其再次悬浮于5％Na2CO3(200mL)中；并搅拌1.5h。通过过滤收集产物粗品，并将该粗品再次悬浮于水(3×200mL)中；通过过滤收集固体，并进行风干，从而产生精细的黄色粉末产物(61.07g，94％)。HPLC(疏水/甲酸盐)Rt＝7.90min；ESI MS(+ve)680.15[M+H]+；C33H53N5O10的计算m/z：679.82。
viii.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2
向处于0℃的由MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][Boc]2(4g，7.36mmol)在乙酸(15mL)中形成的经搅拌的悬浮液中滴加TFA(15mL)。将混合物加温至室温，并在室温下搅拌过夜。除去溶剂，并将残余物溶解于水(100mL)中，并进行过滤。将滤液冻干，从而得到无色油状物(4.4g)。HPLC/(亲水/TFA)Rt＝5.03min；ESI MS(+ve)＝480[M+H+]；C23H37N5O6的计算m/z：479.5。
ix.MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2
向由MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][NH2.TFA]2(735mg，1.04mmol)在DMF(无水，20mL)中形成的经搅拌的悬浮液中加入TEA(1.5mL，每个胺5当量)，然后加入由m-dPEG570-NHS(1.5g，每个胺1.05当量)在DMF(10mL)中形成的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜。除去溶剂，并将残余物在硅胶柱(0.063-0.04mm，洗提剂7％～30％MeOH/DCM)上纯化，从而得到所需的无色油状产物(1.0g)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝7.87min；ESI MS(+ve)828[M+2xNH4]2+，811[M+2H]2+，541[M+3H]3+；C75H137N5O32的计算m/z：1620.9。
x.HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2
向由MeO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(1.0g，0.62mmol)在THF(20mL)中形成的经搅拌的悬浮液中加入1M的LiOH(2mL)。将混合物在室温下搅拌3h；然后使用1M的HCl将该混合物酸化至pH 6。除去溶剂，并将残余物溶解于水中并冻干，从而得到无色固体产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝7.61min；ESI MS(+ve)821[M+(2xNH4)]2+，804[M+2H]2+，536[M+3H]3+；C74H135N5O32的计算m/z：1606.9。
xi.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4
向处于0℃的由[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][NH2]2(实施例11iv)(100mg，0.22mmol)和HO-GlyLys[ε-CBz][α-Lys][PEG570]2(700mg，0.44mmol)在DMF(无水，9mL)中形成的经搅拌的溶液中加入PyBop(250mg)和DIPEA(160μL)。将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去挥发物，从而得到残余物，在硅胶柱上将该残余物进行层析色谱(0.063-0.04mm，洗提剂10％-30％MeOH/DCM)，从而得到600mg的无色油状产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝9.18min；ESI MS(+ve)886[M-Boc+4H]4+，729[M+5H]5+，709[M-Boc+5H]5+；使用转换计算将所得的数据去卷积，从而得到3638.9[M+H]+；C169H309N15O68的计算m/z：3639.3。
xii.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-NH2]2[Lys]2[PEG570]4
向由[Boc]NEOEOEN(Su(NPN)2)[GlyLys]2[ε-CBz]2[Lys]2[PEG570]4(20mg，5.5μmol)在三氟乙醇(1.0mL)中形成的经搅拌的溶液中加入10％w/w钯碳(20mg，9.4μmol)。将悬浮液在氢气中在大气压力下搅拌15h。然后，将该悬浮液过滤通过0.2微米的过滤器，并对过滤物在真空中进行还原，从而得到澄清的粘性油状产物(15mg，81％)。HPLC(亲水/TFA)Rt＝7.50min；ESI MS(+ve)1130.4[M+3H]3+，843.7[M+4H]4+，675.1[M+5H]5+；使用转换计算将所得的数据去卷积，从而得到3371.0；C153H297N15O64的计算m/z：3371.1。
xiii.[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4
向由[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-NH2]2[Lys]2[PEG570]4(25mg，60μmol)和TEA(25μL)在DMF(无水，8mL)中形成的经搅拌的溶液中加入荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯(9mg，每个胺1.25当量)。将混合物在室温下搅拌2h。除去发挥物，从而得到残余物，通过HPLC(甲酰铵缓冲剂)由该残余物中纯化出产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.71min；ESI MS(+ve)1023[M+4H]4+，819[M+5H]5+，682[M+6H]6+；使用MaxEnt或转换计算将数据去卷积，从而得到4087；C195H317N15O76的计算m/z：4087.6。
xiv.[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4
将由[Boc]NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4(1mg，0.25μmol)形成的悬浮液悬浮于20％TFA/DCM(1mL)中，并在室温下搅拌1h。除去挥发物，从而得到产物。HPLC(亲水/TFA)Rt＝8.13min；ESI MS(+ve)1330[M+3H]3+，998[M+4H]4+，798[M+5H]5+；使用MaxEnt或转换计算将数据去卷积，从而得到3987；C190H309N15O74的计算m/z：3987.5。
xv.MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4
向由[TFA.NH2]EOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4(14mg，3.4μmol)在DMF(5mL)形成的经搅拌的溶液中加入TEA(100μL，0.73mmol)和3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(20mg，75μmol)。将反应溶液搅拌16h。将该溶液真空蒸发从而得到混合物粗品，通过HPLC纯化该粗品，从而得到MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4(0.7mg)。HPLC/MS(亲水/TFA)Rt＝8.40min；ESI MS(+ve)m/z＝4140；C197H314N16O77的计算m/z：4138.7.1。
xvi.NDP-α-MSH-MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4
向所述的肽(3-巯基-NDP-α-MSH，3-巯基-Ser-Tyr-Ser-Nle-His-DPhe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2，1mg，0.59μmol)中加入新鲜制备的由MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4(50μg，0.012μmol)在缓冲剂(pH 8.4，0.1M Na2HPO4/0.1M HCl，0.5mL)中形成的溶液。将混合物在室温下搅拌3h。通过HPLC/MS分析反应混合物，结果为HPLC/MS(亲水/TFA)Rt＝9.03min；ESI MS(+ve)5830([M+H]+)；C276H428N38O95的计算：5830.6。
实施例11
单链抗体-MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4
向缓冲剂(pH 8.4，.1M Na2HPO4/0.1M HCl)中的过量单链抗体中加入新鲜制备的MAL-(CH2)2CO NEOEOEN[Su(NPN)2][GlyLys]2[ε-荧光素]2[Lys]2[PEG570]4溶液，在反应几个小时后，通过SDS-PAGE可以检测到树状聚体-抗体片段构建体。
实施例12
具有Q标签的单链抗体的突变
按照国际申请号PCT/AU2006/000943的描述制备所述的抗体。
通过标准的分子生物学方法在His标签之后的C末端(序列：......RTGHHHHHHGGAPKPQQFM)或者在前导序列之后的N末端(序列：SPKPQQFMGGGSGGGSAMAQVQLQ......)引入谷氨酰胺转移酶识别标签(Q2-tag)(Lin C-W.，Ting，A.Y.J.Am.Chem.Soc.2006 128，4542-4543)。通过测序证明克隆的特征。
谷氨酰胺转移酶反应
将Tris-HCl缓冲剂(0.1M，pH 7.5，10mM CaCl2)中具有C末端Q2标签的抗体(75μL，1.5nmol)与N-荧光素尸胺在实施例8(10μL，最终浓度为1mM)或实施例9iv(最终浓度为1mM)，以及15μL豚鼠肝脏的谷氨酰胺转移酶(最终浓度为0.05U)混合。在室温下反应过夜，从而进行标记。
谷氨酰胺转移酶反应产物的分析
采用流式细胞仪在活化的和非活化的血小板上对与抗体偶联的实施例8进行分析(详细过程如下文所述)。如所预计的那样，由上述试验得到的结果清楚地表明了对活化的血小板的排他性的结合。
使用Gadolium对与所述的抗体偶联的实施例9iv进行加载和透析，并在MRI中对人血栓进行成像(详细过程如下文所述)。由上述试验得到的结果表明，人血栓的表面具有明亮的T1加权的GadoliumMRI信号，并显示Gadolium加载的树状聚体通过抗体靶向活化的血小板而成功地结合。血栓内没有色斑形成表明Gadolium标记事件具有选择性。
在将所述的抗体与实施例9iv进行温育而谷氨酰胺转移酶未与酶偶联的对照试验中，没有显示出任何MRI信号。
具有C末端半胱氨酸的单链抗体的突变
按照国际申请号PCT/AU2006/000943的描述制备所述的抗体。
通过标准的分子生物学方法使抗体突变，从而在His标签后形成C末端半胱氨酸(序列：......RTGHHHHHHGGAC)。通过测序证明克隆的特征。
在与反应物偶联前制备C末端半胱氨酸单链抗体
在偶联前，在氮气气氛下，在脱氮的饱和Nellis缓冲剂(10mM Na-磷酸盐缓冲剂，0.2mM EDTA，30mM NaCl，pH 6.7)中使用二硫酚苏糖醇(最终浓度为2mM)来进行选择性的温和的还原。在氮气下，通过透析(10,000道尔顿的透析膜，对500ml Nellis缓冲剂透析6h，其中每2h更换3次缓冲剂)除去过量的二硫酚苏糖醇。
C末端半胱氨酸单链抗体与实施例7v的偶联反应
在室温下，在氮气中，将处于30μL脱氮饱和Nellis缓冲剂(10mM Na-磷酸盐缓冲剂，0.2mM EDTA，30mM NaCl，pH 6.7)中的具有游离半胱氨酸(1nmol)的单链抗体与5nmol的实施例7v混合1h。在室温下，通过与0.5mmol半胱氨酸温育15min而使该未反应的马来酰亚胺失活。通过分子排阻色谱法除去非缀合的单链抗体以及含有未反应的游离马来酰亚胺的底物。终产物使用Gadolium加载，并通过对人血栓进行染色、然后通过MR成像来进行分析(参见以下的详细过程)。
C末端半胱氨酸单链抗体与实施例6的偶联反应
具有游离半胱氨酸的单链抗体(1nmol)可以按照与上文刚刚叙述的实施例相同的方式与实施例6偶联。
对具有实施例7v的C末端半胱氨酸单链抗体的分析
对抗体-实施例7v融合产物的MRI分析表明，人血栓的表面具有明亮的T1加权Gadolium MRI信号，并显示Gadolium加载的树状聚体通过抗体靶向活化的血小板而成功地结合。血栓内没有色斑形成表明Gadolium标记事件具有选择性。
将未被还原的抗体与实施例7v进行温育的对照试验没有显示出任何MRI信号。
在偶联反应之前制备Traut试剂改性的单链抗体
在室温下，通过加入1∶1、1∶2、1∶5和1∶10当量的处于脱氮饱和Nellis缓冲剂(10mM Na-磷酸缓冲剂，0.2mM EDTA，30mM NaCl，pH6.7)中的Traut试剂(2-亚氨基硫烷-HCl)，来对所述的单链抗体进行Traut改性，从而在表面可利用的赖氨酸残基处形成游离的硫醇基。
硫醇官能化的抗体与多种包含马来酰亚胺试剂的偶联反应
在室温下，在氮气中，将处于30μL脱氮饱和Nellis缓冲剂(10mM Na-磷酸盐缓冲剂，0.2mM EDTA，30mM NaCl，pH 6.7)中的具有游离硫醇(1nmol)的单链抗体与1-5nmol的含有马来酰亚胺的底物[2KDa的三叉式PEG、20KDa的线性PEG或者实施例7v]混合1h。在室温下，通过与0.5mmol的半胱氨酸温育15min，而使该未反应的马来酰亚胺基团失活。通过分子排阻色谱法除去非缀合的单链抗体以及含有未反应的游离马来酰亚胺的底物。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹证明偶联情况(参见以下的详细过程)。终产物使用Gadolium加载，并通过针对结合情况在活化的血小板上使用流式细胞仪以及通过对人血栓进行染色、然后通过MR成像来进行分析(参见以下的详细过程)。
硫醇官能化抗体的分析
通过使用摩尔浓度增加的Traut试剂(单链抗体/traut试剂的比例为1∶1、1∶2、1∶5、1∶10)进行SDS PAGE、随后与2KDa的三叉式PEG、20KDa的PEG或实施例7v发生反应而进行的分析表明，分子量较大的构建体的比率较高。对于使用树状聚体制得的融合产物(实施例7v)而言，完整的起始抗体被消耗，从而仅产生较大分子量的构建体。这是符合我们的预期的。
通过蛋白质印迹分析，得到抗体-施例7v融合构建体的其他证据，所预计的那样证明，在SDS PAGE中所观察到的较大分子量的构建体确实为所述的融合产物。
使用流式细胞仪对抗体-实施例7v融合产物进行进一步的表征，以确定该抗体是否仍是功能性的。与活化和非活化的血小板的结合分析(参见以下的详细过程)表明，所述的构建体仍具有活性，并且排他性地与活化的血小板结合。
最后，抗体-实施例7v融合蛋白的MRI分析表明，人血栓的表面具有明亮的T1加权Gadolium MRI信号，并显示Gadolium加载的树状聚体通过抗体靶向活化的血小板而成功地结合。血栓内没有色斑形成证明Gadolium标记事件具有选择性。
将未被改性的抗体与实施例7v进行温育的对照试验没有显示出任何MRI信号。
抗体-树状聚体融合构建体的标准Gadolinium加载
在室温下，在摇动条件下，通过加入PBS(0.1M，pH 7.4)中的64nmol的GdCl3.6H2O，来使用Gadolinium加载抗体-树状聚体构建体(1.5nmol)过夜。通过透析，除去过量的Gadolinium(10,000道尔顿的透析膜，对500mL PBS透析12h，其中每4h更换3次缓冲剂)。
体外形成的人血浆血栓的标准染色
为了在体外形成人血栓，将1mL富集血小板的血浆(将柠檬酸化的血液在1000rpm下离心10分钟)与100μL ADP、88μL肌动蛋白、25μL 1M CaCl2混合在1.5mL的反应管中。将样品在37℃下在水浴中温育12min；再在37℃、持续旋转条件下，与抗体-树状聚体融合产物温育另外的30min。将血栓用2mL的PBS洗涤3次，每次持续10min，并固定于福尔马林溶液(1％)中，然后进行成像。
标准的MRI成像过程
在4.7 Tesla动物MRI扫描仪(Biospin Bruker)上，对血栓进行MRI。得到TE/TR为15ms/350ms的T1加权图像，并且分辨率为512×512μm(FOV 7cm，平均为4)。取得1mm厚的10片薄片。
标准的流式细胞仪的条件
将人柠檬酸化的全血在改性的Tyrode缓冲剂中以1/50稀释(通过加入20μM ADP来活化，或者是未经活化的)，然后与5μg/mL的单链树状聚体产物预温育10min。通过尸胺的FITC信号来检测尸胺加成产物，通过直接针对单链抗体的组氨酸(6)标签的二级抗体(PentaHis Alexa Fluor 488 Conjugate)来检测单链单体。在使用CellFIX固定之后，在FACSCalibur流式细胞仪中测定样品。
还原条件下的SDS-PAGE和蛋白质印迹
将蛋白质和蛋白质-树状聚体融合产物在12％SDS-PAGE凝胶上分离，然后转移到Immobilon P膜上以进行免疫印迹。在使用含有0.2％Tween 20(PBS-Tween)和1％BSA的磷酸缓冲盐对所述的膜进行过夜封闭之后，加入HRP标记的抗His(6)的抗体(以1∶500稀释)，并在室温下温育2h。将所述的膜用PBS-Tween缓冲剂多次洗涤，然后通过加入过氧化物酶底物来观察过氧化物酶的活性。

Claims (29)

1.一种大分子，其包含：
(i)核心部分，其具有用于与第一功能部分连接的第一氨基氮原子，以及用于与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元连接的至少两个其他的氨基氮原子；
(ii)第一功能部分，其通过所述的第一氨基氮原子与所述的核心部分连接；
(iii)至少一层赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元，其最外层具有用于与一个或多个第二功能部分连接的表面氨基氮原子，这些所述的层通过所述的核心部分的至少两个其他氨基氮原子而与所述的核心部分连接；以及
(iv)一个或多个第二功能部分，其与赖氨酸或赖氨酸类似物构造单元的最外层的表面氨基氮原子连接；
其中
所述的第一功能部分和所述的第二功能部分均包含选自靶向分子信号传导实体的试剂，使得所述的大分子具有至少一个靶向分子和至少一个信号传导实体。
2.根据权利要求1的大分子，其中所述的构造单元选自：
赖氨酸*1，其具有以下结构：
Figure A2007800345640002C1
甘氨酰-赖氨酸*2，其具有以下结构：
Figure A2007800345640002C2
类似物3，其具有以下结构，其中a为整数1或2；而b和c独立地为整数1、2、3或4，
Figure A2007800345640003C1
类似物4，其具有以下结构，其中a为整数0、1或2；而b和c独立地为整数2、3、4、5或6，
类似物*5，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640003C3
类似物6，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数0、1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640003C4
类似物7，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640003C5
类似物8，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b、c和d独立地为整数1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640004C1
类似物9，其具有以下结构，其中a为整数0、1、2、3、4或5；而b和c独立地为整数1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640004C2
其中，所述构造单元的任何亚甲基都可以被亚甲氧基(CH2-O)或亚乙氧基(CH2-CH2-O)替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯(-O-C(O)-O-)或氨基甲酸酯(-O-C(O)-N-)部分。
3.根据权利要求2的大分子，其中所述的构造单元选自赖氨酸1、甘氨酰-赖氨酸2或赖氨酸类似物5：
Figure A2007800345640004C3
其中a为整数0、1或2，并且其中1、2或5的任何亚甲基可以被亚甲氧基或亚乙氧基替代，前体条件是这种替代不会导致在所述的构造单元内形成碳酸酯或氨基甲酸酯部分。
4.根据权利要求1-3的任意一项中的大分子，其中所述的核心为三氨基化合物，该化合物得自赖氨酸或赖氨酸类似物与二氨基化合物的一个氨基氮原子的反应，其中所述的二氨基化合物选自：
Figure A2007800345640004C4
其中a为1-9的整数，例如1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640005C1
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4或5，例如2或3；而d为0-100的整数，例如1-30，特别是1-5、6-10、11-15、16-20、21-25或26-30，
其中a和b独立地为整数0、1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640005C3
其中a和c独立地为整数1、2、3、4、5或6，并且其中c为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a和d独立地为整数1、2、3、4、5或6，并且其中b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6。
5.根据权利要求4的大分子，其中所述的二氨基化合物选自：
其中a为整数1、2、3、4或5，
Figure A2007800345640005C6
其中a、b和c独立地为整数2或3；而d为1-30的整数，
Figure A2007800345640006C1
其中a和d独立地为整数1或2；而b和c独立地为整数0、1或2。
6.根据权利要求5的大分子，其中所述的核心得自化合物11和类似物5，在化合物11中a、b、c和d均为1，而在类似物5中a、b和c均为2。
7.根据权利要求1-4的任意一项中的大分子，其中所述的核心为三氨基化合物或四氨基化合物，或者四氨基化合物或五氨基化合物，其中所述的四氨基化合物或五氨基化合物得自赖氨酸或赖氨酸类似物与三氨基化合物或四氨基化合物的一个氨基氮原子的反应，其中所述的三氨基化合物和所述的四氨基化合物选自：
Figure A2007800345640006C2
其中a、b和c独立地为整数1、2、3、4、5或6，
Figure A2007800345640006C3
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
Figure A2007800345640007C2
其中a、b和c独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而d、e和f独立地为整数1、2、3、4、5或6，
Figure A2007800345640007C3
Figure A2007800345640008C1
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6，
Figure A2007800345640008C2
其中a、b、c和d独立地为整数1、2、3、4、5或6，
Figure A2007800345640008C3
其中a、b、c和d独立地为整数0、1、2、3、4、5或6；而e、f、g和h独立地为整数1、2、3、4、5或6。
8.根据权利要求6的大分子，其中所述的三氨基化合物或四氨基化合物选自：
Figure A2007800345640008C4
其中a、b和c可以相同或不同，并且为整数1至2，
Figure A2007800345640009C1
其中a、b和c独立地为整数0、1或2；而d、e和f独立地为整数1或2，
或者四胺化合物
Figure A2007800345640009C2
其中a、b、c和d独立地为整数0或1，
Figure A2007800345640009C3
其中a、b、c和d独立地为整数1或2，
Figure A2007800345640009C4
其中a、b、c和d独立地为整数0、1或2；而e、f、g和h独立地为1或2。
9.根据权利要求1-8的任意一项中的大分子，其包含1、2、3、4或5层构造单元。
10.根据权利要求9所述的大分子，其包含2、3或4层构造单元。
11.根据权利要求1-10的任意一项中的大分子，其在所述的表面上进一步包含至少一个第三功能部分。
12.根据权利要求1-11的任意一项中的大分子，其中每个表面氨基氮原子均与功能部分连接。
13.根据权利要求1-12的任意一项中的大分子，其中所述的第一功能部分为靶向分子，而所述的第二功能部分为信号传导实体。
14.根据权利要求13的大分子，其进一步包含第三功能部分，该第三功能部分为与所述的第一靶向分子相同或不同的靶向分子。
15.根据权利要求1-14的任意一项中的大分子，其中所述的靶向分子为抗体。
16.根据权利要求15的大分子，其中所述的抗体能够与活化的血小板、活化的白细胞、血纤蛋白或活化的内皮细胞结合。
17.根据权利要求16的大分子，其中所述的靶向分子靶向Mac-1。
18.根据权利要求17的大分子，其中所述的抗体为单链抗体，其包含一个或多个以下区域：HCDR1、HCDR2、HCDR3、LINKER、LCDR1、LCDR2或LCDR3。
19.根据权利要求1-18的任意一项中的大分子，其中所述的信号传导实体包括顺磁实体。
20.根据权利要求19所述的大分子，其中所述的顺磁实体为Fe3+，Mn2+或Gd3+。
21.根据权利要求20所述的大分子，其中所述的顺磁实体为Gd3+。
22.根据权利要求19所述的大分子，其中所述的顺磁实体通过螯合掩蔽剂与氮原子连接。
23.根据权利要求1-22的任意一项中的大分子，其中一个或多个功能部分通过连接体与所述的核心或表面氨基氮原子连接。
24.根据权利要求23所述的大分子，其中所述的连接体为具有1-100个重复单元的聚乙二醇连接体。
25.根据权利要求1-24的任意一项中的大分子，其中第一核心或表面氮原子和/或任何连接体和/或所述的功能部分通过改性基团改性，从而有助于连接。
26.根据权利要求25所述的大分子，其中所述的改性基团选自：马来酰亚胺、卤代乙酰胺、酰肼、烷氧基胺或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯。
27.一种组合物，其包含根据权利要求1-26的任意一项中的大分子，及其至少一种可药用的赋形剂、载体或佐剂。
28.根据权利要求1-27的任意一项中的大分子作为成像剂的用途。
29.一种用于在哺乳动物中对细胞靶物成像，例如核磁共振成像的方法，该方法包括以下步骤：
(a)向哺乳动物给药根据本发明的成像剂；
(b)使所述的成像剂与所述的细胞靶物结合；以及
(c)对所述的哺乳动物进行成像，从而生成图像。
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