CN101631553A

CN101631553A - 转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物及其生物和治疗应用

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Publication number: CN101631553A
Application number: CN200780020761A
Authority: CN
Inventors: P·纽伯格; A-L·博尔卡托·贝勒曼; J-P·贝尔; P·埃尔巴谢尔
Original assignee: Polyplus Transfection SA
Current assignee: Polyplus Transfection SA
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-04-05
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2027-04-05
Also published as: JP2009532056A; US20100048672A1; CA2648520A1; WO2008004058A2; CA2648520C; ATE496625T1; IL194552A; US8399422B2; WO2008004058A3; KR20090074689A; DE602007012213D1; JP5270531B2; DK2004156T3; ES2360449T3; EP2004156B1; EP2004156A2; KR101414392B1; EP1844772A1; IL194552A0; CN101631553B

Abstract

本发明涉及转染组合物，其包括寡核苷酸和式(I)所示的两亲性阳离子分子，其中－X是N－R₁、S或者O，R₁是C1－C4烷基或者羟基化的C3－C6烷基，R₂和R₃相同或者不同，代表H或者C1－C4烷基，或者R₂和R₃被连接到一种起形成饱和的或者非饱和的5元或6元的环或者杂环，E是C1－C5烷基间隔基，R₄和R₅相同或者不同，代表饱和的或者不饱和的、线性的或者分支的C10－C36烃或者氟烷链，任选包括C3－C6环烷基，A^－是生物相容的阴离子。本发明涉及能够在培养物中、离体或者体内将寡核苷酸输送入真核细胞的组合物。本发明涉及包括具有RNA干扰活性的寡核苷酸的转染组合物。这种组合物可用作生物研究工具或者治疗药物。

Description

转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物及其生物和治疗应用

本发明涉及离体或者体内输送寡核苷酸尤其是导致RNA干扰(RNAi)的小干扰RNA(此后命名为siRNA)到培养的真核细胞的手段、组合物和方法。

RNA干扰(RNAi)是在mRNA水平有效让基因沉默的技术(Fire，1999)(Tuschl等，1999)，提供序列特异性的mRNA降解并抑制蛋白产生(Yang等，2000)(Zamore等，2000)(Hammond等，2000)(Parrish等，2000)。由于短dsRNA活性序列的可预测设计和对特异mRNA的靶向性，RNAi是一种卓有成效的生物化学方法。已经证明当利用输送载体转染导入细胞的细胞质时，siRNA在各种哺乳动物细胞中有效沉默外源或者内源基因(Elbashir等，2001)。

小干扰RNA是短双链RNA(dsRNA)，长度优选从19到29个核苷酸(参见专利WO 0244321，WO 01/075164 A3，EP20010985833和参考文献(Siolas等，2005)(Kim等，2005))，尤其是19-23个核苷酸，并且在哺乳动物细胞培养系统中具有RNAi活性(Parrish等，2000)(Elbashir等，2001)(Tuschl，2001)。当与不配对的3′突出端碱基配对时，短dsRNA的作用是指导序列特异性的mRNA降解。最有效的短dsRNA由两条21个核苷酸长的链组成，它们如此配对使得dsRNA的两端存在1-3个、尤其是2个核苷酸的3′突出(Elbashir等，2001)。

RNAi的成功依赖于dsRNA的长度、序列和化学结构以及细胞输送系统。与反义或者核酶技术相比，对于siRNA的基因表达抑制来说靶mRNA的二级结构不是很强的限制因素。许多siRNA序列对于给定的mRNA靶是有效的。因此，siRNA双链的稳定性和生物利用率以及dsRNA被输送到细胞尤其是细胞质的量仍然是有效沉默的限制性因素，而siRNA的靶可及性则不是。

许多输送系统可用于将寡核苷酸导入细胞。目前，市场上已经有用于siRNA输送的基于阳离子脂质-介导转染的非病毒载体，例如Oligofectamin，TRANSIT-TKO，LipofectAmine2000，SiGuide，RNAiFect，HiperFect或者jetSi。与基于阳离子聚合物的系统相反，阳离子脂质显示在早期内体破裂以及与磷脂酰丝氨酸形成复合物后在细胞质释放核酸(Zelphati和Szoka，1996)。

非病毒载体系统有利地包括基于阳离子脂质或者聚合物或者肽的输送试剂。所述非病毒系统是至少包括一种输送试剂和其他组分的制剂，所述其他组分用于稳定所述制剂、靶向细胞、组织或者器官或者提高转染效率。

本发明描述一类新的非病毒转染剂，其属于阳离子脂质，尤其适合于小的寡核苷酸的转染。特别是小分子与寡核苷酸的特异相互作用促使我们设计一类新的转染剂。

许多分子结合双链寡核苷酸(dsON)。根据结合模式它们可以被分成三类：

1)在堆积碱基对之间的插入，例如奎吖因或者溴化乙啶；

2)就像从聚胺类精胺或者亚精胺观察到的与寡核苷酸骨架上杂原子的静电和H-键相互作用，

3)小沟结合剂(MGB)：延伸的杂环结构，填充DNA的深小沟，主要通过范德华和H-键相互作用而相互作用。这类寡-杂环分子最好的例子就是抗生素纺锤菌素(包含N-甲基吡咯的寡肽)和其类似物偏端霉素A(Cho和Rando，2000)。

核糖核苷酸螺旋显示一些独特的特征：当仍然存在插入的可能性时，范德华和静电结合模式优选在深的大沟发生，有时在浅的大沟。

特别地，三咪唑结合剂例如AR-1-144，其被设计为含咪唑的纺锤菌素类似物(Yang等，1999)，吸引了我们的注意。这里鸟嘌呤N2氨基与并行的Im/Im对形成分叉氢键(Yang等，1999)。所述分子的其余部分看起来在小沟内具有更高的疏水性相互作用，如母体分子偏端霉素A所示(Yang等，1999)。

双苯并咪唑染料Hoechst33258同样是一种已知的小沟结合剂，它对DNA的AT富集序列显示选择性。它还在“凸起(bulge)”区结合RNA，在那里它正好适合由连续碱基对形成的口袋，就像在TAR RNA中一样(Dassonneville等，1997)。

发明人发现通过将感兴趣的寡核苷酸与特异的两亲性阳离子分子组合可以获得高效的转染，所述两亲性阳离子分子作为小分子脂质体与中性共脂质(co-lipids)稳定地配制。

因此本发明的一个目的是提供可用作转染剂的新分子。

本发明的另一个目的是提供可用于转染的这些分子的组合物。

另一个目的是提供所述两亲性分子的合成途径和有效纯化方法。

根据另一个目的，本发明涉及在培养物和体内转染细胞的方法。

本发明还涉及用作用于诱导对一或多种靶蛋白表达的调节作用的药物组合物的组合物，所述靶蛋白导致或者参与遗传疾病。

本发明还涉及治疗患有这类疾病的患者的方法。

根据本发明，所述用作寡核苷酸转染组合物、更特别地用于RNA干扰的试剂的新分子包括能够结合寡核苷酸的阳离子部分，所述阳离子部分与亲脂性部分结合使分子可以穿过细胞膜的脂双层。

因此本发明涉及式(I)所示的两亲性阳离子分子

其中：

-X是N-R₁、S或者O，R₁是C1-C4烷基或者羟基化的C3-C6烷基，

-R₂和R₃相同或者不同，代表H或者C1-C4烷基，或者R₂和R₃连接到一起形成饱和的或者不饱和的5元或6元的环或者杂环，

-E是C1-C5烷基间隔基，

-R₄和R₅相同或者不同，代表饱和的或者不饱和的、线性的或者分支的C10-C36烃或者氟烷链，所述链任选包括C3-C6环烷基，

-A^-是生物相容的阴离子。

当R₂和R₃连接到一起时形成的杂环是不饱和或者饱和的5元或6元杂环，包括C和作为杂原子的N、S或者O。

根据本发明优选的实施方案，式(I)中的R₄和R₅是C14-C36烃基，E是C1-C4烷基间隔基。

在优选的组中，R₄和R₅是相同的。

在有利的分子中，R₄和R₅是C18烷基，E是C1烷基。

在其他有利的分子中，R₄和R₅是C16烷基，E是C4烷基。

在另一个优选的组中，R₄和R₅是不同的。

在感兴趣的分子中，R₄和R₅分别是C18和C17烷基，E是C2烷基。

在其他感兴趣的分子中，R₄和R₅分别是C32和C18烷基，E是C1烷基。

优选地，在上述组中，R₂和R₃是H或者共同形成芳环，尤其是苯并基，或者杂环例如吡啶基或者吡嗪基。

特别地，X是N-R₁，R₁例如是甲基。

或者，X是S或者O。

有利地，平衡离子A^-是Cl^-或者OH^-。

本发明还涉及用于转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物。根据一个实施方案，本发明涉及组合物，其中上述限定的两亲性分子与中性共脂质一起配制，所述中性共脂质在延长的储存期是稳定的。

合适的共脂质是磷脂酰基-乙醇胺，例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，脂-PEG缀合物或者胆固醇。

在另一个实施方案中，本发明涉及没有添加共脂质的活性两亲性分子，尤其是具有分支的R₄或者R₅的那些分子。

本发明更具体地涉及转染组合物，所述组合物除了与中性脂质一起配制的两亲性分子部分外，还至少包括一种产生所需生物学作用的寡核苷酸。

本发明因此提供一种适于向活细胞导入dsON(ds＝双链；ON＝寡核苷酸)特别是siRNA的非病毒输送系统。

可以利用合适的基团分别稳定所述寡核苷酸或者siRNA以防止降解，所述基团选自嘌呤核苷酸，用修饰的类似物例如脱氧核苷酸取代的嘧啶核苷酸，和/或修饰的核苷酸类似物例如糖-或者骨架修饰的核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸。寡核苷酸序列可以含有脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸或者核苷酸类似物(Verma和Eckstein，1998)，例如甲基膦酸酯(Miller，1991)、吗啉代二氨基磷酸酯(morpholino phosphorodiamidate)、硫代磷酸酯(Zon和Geiser，1991)、PNA(Jepsen和Wengel，2004)、LNA、2′烷基核苷酸类似物(Kurreck，2003)。

本发明还涉及获得式(I)所示分子的方法，包括通过在甲醇/水/酸中自反应介质中选择性沉淀而纯化中性形式的式(I)所示两亲性分子和将其向盐衍生物转化的步骤。

有利地，式(I)所示分子的合成方法包括：

-建立一个分支长链，其烃部分通过标准的C-C偶联方法获得，所述偶联方法例如对酯或者醛的Grignard偶联反应所述。合成的疏水性部分含有伯醇或者仲醇，如式IV所示：

HO-E-R4(R5)(IV)

-通过转化成式(V)MsO-E-R4(R5)所示的甲基磺酰衍生物和/或其他典活化衍生物例如卤代衍生物来活化醇功能团；

-在特定条件下将所述活化衍生物尤其是甲基磺酰衍生物与式(VI)所示的杂环反应

其中X是N-R1、S或者O

获得(I)

或者在特定条件下将所述甲基磺酰衍生物(V)与式(VII)所示的杂环反应

获得式(VIII)所示的杂环

在所述式中，取代基是按照上文式(I)所限确定的。

当X表示-N-R1时，所述方法还包括X的烷化步骤，例如用碘甲烷甲基化N。

通过将醇HO-E-R₄(R₅)(IV)转化成它的甲基磺酰酯对其进行活化。有利地在像吡啶这样的溶剂中制备高浓度的醇悬浮液，以便与甲基磺酰氯反应。

优选通过以下方式向磺酸衍生物Ms-O-E-R₄(R₅)添加杂环：在大约50-100℃的温度有利的在大约80℃加热反应混合物。

有利地通过特异性沉淀方法从反应混合物纯化所述两亲性分子以及实现其向生物相容性盐形式的转化。这类沉淀包括用甲醇加水的混合物稀释，然后利用酸HA控制酸化产生相应A^-盐(I)的沉淀物。

所述沉淀也可以用其他的醇/水混合物来完成，例如异丙醇/水混合物，它们用酸性水溶液酸化以便得到相应的盐，例如用盐酸酸化得到盐酸盐。

通过将共脂质和式(I)所示的衍生物溶于有机溶剂并将该溶液注入水中制备脂质体。

合适的有机溶剂是乙醇。所获于水中的脂质体制剂有利地具有大约110nm的大小，其大小分布较窄。

然后合适的siRNA或者寡核苷酸与所述脂质体制剂复合。

如实施例显示，本发明的分子对于将寡核苷酸特别是siRNA输送到培养的真核细胞是特别有效的系统。

本发明因此还涉及用介导基因沉默的寡核苷酸尤其是诱导RNAi的siRNA转染细胞的方法，包括向细胞导入如上文限定的组合物。

所述组合物在非常低的siRNA浓度尤其是在纳摩和低至皮摩的siRNA浓度下持续很多天提供选择性和高内源性的基因沉默功效。如此获得的高基因沉默通过许多靶得到例证，例如荧光素酶、人GAPDH、人核纤层蛋白A/C或者鼠波形蛋白基因，并且没有副作用或者脱靶(off-target)作用或者细胞毒性。

所述方法可以在培养的真核细胞(粘附或者非粘附细胞)中使用，用于功能基因组学、靶确认或者体内或者离体治疗应用。

利用转染方案可以在血清存在的条件下实施本发明的方法。

当进行反向转染(reverse transfection)方案时，本发明的方法尤其可用于介导siRNA或者寡核苷酸的基因沉默或者HTS应用。

有利地，上述限定的组合物能够诱导对一或多种靶蛋白表达的调节作用，所述靶蛋白导致或者参与遗传疾病。

本发明因此还涉及上文限定的转染组合物用作药物。

所述组合物有利地采用适于通过口服、全身或者局部途径给药的形式，并且可以与药学上可接受的惰性载体组合。

所述组合物尤其可用于癌症、病毒感染或者寄生虫感染的治疗。

本发明的其他特征和优点将在下列实施例中给出，参考图1至10，它们分别代表：

图1：通过用制剂MOM/DOPE(1mM/1mM，乙醇中)转染GL3LucsiRNA，A549-GL3Luc细胞稳定表达的荧光素酶基因(pGL3)的选择性和有效RNA干扰。

用GL3Luc siRNA转染(以24孔组织培养板形式)稳定表达所述荧光素酶基因的A549-GL3Lu细胞，所述GL3Luc siRNA浓度范围从100-2000pM，并与2μl由MONI/DOPE(1mM/1mM，乙醇中)组成的等摩尔制剂复合。作为非特异性的siRNA对照，与GL2荧光素酶序列匹配的siRNA在相同的条件下进行转染。保温48h后检测荧光素酶基因表达。实验重复三次，利用细胞裂解产物中的蛋白含量(蛋白的mg数)归一化后，荧光素酶活性可以表示为相对光单位(Relative Light Unit，RLU)。

图2：通过用制剂MONBI/DOPE(1mM/2mM，乙醇中)转染GL3LucsiRNA，A549-GL3Luc细胞稳定表达的荧光素酶基因(pGL3)的选择性和有效RNA干扰。

用GL3Luc siRNA转染(以24孔组织培养板形式)稳定表达所述荧光素酶基因的A549-GL3Lu细胞，所述GL3Luc siRNA浓度范围从250-5000pM，并与2μl由MONBI/DOPE(1mM/2mM，乙醇中)组成的制剂复合。作为非特异性的siRNA对照，与GL2荧光素酶序列匹配的siRNA在相同的条件下进行转染。保温48h后检测荧光素酶基因表达。实验重复三次，利用细胞裂解产物中的蛋白含量(蛋白的mg数)归一化后，荧光素酶活性可以表示为相对光单位(RLU)。

图3：通过用制剂MONI/DOPE(1mM/1mM，乙醇中)转染GL3Luc siRNA沉默荧光素酶基因(pGL3)，甚至皮摩水平的siRNA也是有效的。

用GL3Luc siRNA转染(24孔板)稳定表达所述荧光素酶基因的A549-GL3Lu细胞，所述siRNA浓度范围从10-5000pM并与由MONI/DOPE(1mM/1mM，乙醇中)组成的等摩尔制剂复合。保温48h后检测荧光素酶基因表达。实验重复三次，根据未转染的A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平计算GL3荧光素酶沉默效率，所述内源性荧光素酶水平被细胞裂解产物的蛋白含量归一化。

图4：粒径的DLS测量显示脂质体的相对单分散群，大小为100+/-10nm。

按照上文描述，在milliQ水中制备1毫摩两亲性分子与不同浓度DOPE的脂质体制剂。利用Zetamaster(Malvern Instrument，Orsay，France)通过光散射确定这些脂质体制剂的粒径，参数如下：取样时间，30s；每个样品测量3次；介质粘度，1.0cP；介质折射率(RI)，1.335；RI颗粒，1.47；温度：25℃，633nm激光波长。从于水中的1mM MONI和1.5mM DOPE(脂质体在5℃保存1个月后的稳定性)脂质体制剂获得该图显示的粒径测量。测量重复三次。

图5：通过用于水中的制剂MONI/DOPE(1mM/2mM)和许多商品化siRNA转染试剂转染GL3Luc siRNA，比较它们对荧光素酶基因(pGL3)的沉默效率。

用与2μl于水中的脂质体制剂复合的GL3Luc siRNA以及许多商品化转染试剂转染(24孔板)稳定表达荧光素酶基因的A549-GL3Luc细胞，所述siRNA浓度范围从1-10000pM，所述脂质体制剂由于乙醇中的MONI/DOPE(1mM/2mM)组成。按照制造商推荐的最佳条件施用商品化转染试剂(参见材料和方法)。保温48h后检测荧光素酶基因表达。实验重复三次，根据未转染的A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平计算GL3荧光素酶沉默效率，所述内源性荧光素酶水平被细胞裂解产物的蛋白含量归一化。

图6：用于水中的MONI/DOPE制剂(1mM/2mM)转染siRNA后，不同细胞系中的有效GAPDH基因沉默。

用与于水中的制剂MONI/DOPE(1mM/2mM)复合的GAPDH siRNA转染粘附HeLa、Caski和SiHA细胞以及非粘附K562和THP-1细胞。保温48h后通过分支DNA分析测量GAPDH mRNA水平。作为非特异性的对照，与无关序列(核纤层蛋白A/C)匹配的siRNA在相同条件下进行转染。实验重复三次，根据未转染细胞的内源性GAPDH水平计算GAPDH沉默效率。

图7：MONI/DOPE制剂在3T3细胞中介导有效的波形蛋白基因沉默。

利用与MONI/DOPE制剂复合的波形蛋白siRNA转染3T3细胞，所述siRNA浓度范围从20nM-1nM。保温48h后通过Western印迹测定波形蛋白水平。还检测了GAPDH蛋白作为细胞裂解物中蛋白水平的对照。

图8：脂质体MONI/DOPE制剂在HeLa细胞中介导有效的核纤层蛋白A/C基因沉默。

在包含血清的培养基中(24孔板)利用与2μl于水中的脂质体制剂复合的核纤层蛋白A/C siRNA(5nM)转染HeLa细胞，所述脂质体制剂由于乙醇中的MONI/DOPE(1mM/2mM)组成。转染后48h通过免疫荧光染色检测核纤层蛋白A/C蛋白，并利用显微镜观察(C和D)，将其与未转染细胞进行比较(A和B)。

图9：与于水中的制剂MONI/DOPE(1mM/2mM)复合的siRNA的反向转染诱导选择性和高效的基因沉默。

将于50μl无血清培养基中稀释的GL3Luc siRNA与1μl于水中的由MONI/DOPE(1mM/2mM)组成的制剂复合(在96孔组织培养板中，n＝6)5分钟。然后，每孔添加于125μl含有血清中的10000个稳定表达荧光素酶基因的A549-GL3Luc细胞。保温48h后检测荧光素酶基因表达。作为非特异性siRNA对照，与GL2荧光素酶序列匹配的siRNA在相同的条件下进行转染。保温48h后检测荧光素酶基因表达，荧光素酶活性可以表示为相对光单位(RLU)，其用细胞裂解产物中的蛋白含量(蛋白的mg数)归一化。根据未转染的A549-GL3Luc细胞的内源性荧光素酶水平计算GL3荧光素酶沉默效率(图3B)，所述内源性荧光素酶水平用细胞裂解产物中的蛋白含量归一化。

图10：与于水中的制剂MONI/DOPE(1mM/2mM)复合的siRNA的反向转染有效的使MCF-7细胞的内源性GAPDH沉默。

利用100pM至10nM浓度范围的siRNA和1μl脂质体MONI/DOPE制剂，使用优化的siRNA反向转染步骤沉默MCF-7细胞的GAPDH基因。转染后48h通过

Branched DNA分析来检测GAPDH mRNA水平。作为非特异性对照，与无关序列(核纤层蛋白A/C)匹配的siRNA在相同条件下进行转染。根据未转染细胞(每个条件n＝6)的内源性GAPDH水平计算GAPDH沉默效率。

材料和方法：

化学物和寡核苷酸

寡核苷酸由Eurogentec(Belgium)化学合成和PAGE纯化。寡核苷酸在95℃在1×退火缓冲液(50mM醋酸钾，50mM醋酸镁)(Eurogentec)中退火2分钟，然后在室温下保温2-4小时。HiperFect和SilentFect试剂分别购自Qiagen和BioRad(美国)。TransIT-TKO和Saint-Red试剂分别购自MirusCorporation和Synvolux。GAPDH SMART

试剂购自Dharmacon。

使用的SiRNA双链：

GL3Luc siRNA双链(SEQ ID N°1和SEQ IDN°2)	5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA(dT)₂-3’3’-(dT)₂GAAUGCGACUCAUGAAGCU-5’
GL3Luc siRNA双链(SEQ ID N°1和SEQ IDN°2)		GL2Luc siRNA双链(SEQ ID N°3和SEQ ID N°4)	5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA(dT)₂-3’3’-(dT)₂GCAUGCGCCUUAUGAAGCU-5’
波形蛋白siRNA双链(SEQ ID N°5和SEQ ID N°6)	5’-GAAUGGUACAAAUCCAAGdTdT-3’3’-dTdTCUUACCAUGUUUAGGUUC-5’	GL2Luc siRNA双链(SEQ ID N°3和SEQ ID N°4)
波形蛋白siRNA双链(SEQ ID N°5和SEQ ID N°6)	5’-GAAUGGUACAAAUCCAAGdTdT-3’3’-dTdTCUUACCAUGUUUAGGUUC-5’	核纤层蛋白A/C siRNA双链(SEQIDN°7和SEQ IDN°8)	5’-CUGGACUUCCAGAAGAACAdTdT-3’3’-dTdTGACCUGAAGGUCUUCUUGU-5’

所有的化学试剂和原始材料均购自Sigma-Aldrich(France)，在使用前都没有进行纯化。溶剂购自SDS-Carlo Erba(France)。用二苯甲酮钠干燥二乙醚并蒸馏。专用于Grignard试剂的镁屑(Magnesium turnings)购自FisherScientific(France)。二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)购自Fluka(Sigma-Aldrich)。

下文实施例1至7涉及表1所示的两亲性分子的合成。

表1

MONI的合成：

二级长链醇19-羟基三十七烷S3的合成：

将镁屑(583mg，24毫摩，MW＝24.31)加入配备有制冷柱的烘干双颈反应器。用注射器将先前溶于无水二乙醚(20ml，用二苯甲酮钠蒸馏)的1-碘代十八烷(7.608mg，20毫摩，MW＝380.39)滴加到金属屑中。在添加期间，用风扇(吹风机)轻微加热反应物，以便保持乙醚的恒定回流。当反应混合物变成浅灰色时，有机镁试剂(Grignard试剂)开始形成。在碘代烷溶液添加完成后，将反应器置于油浴中1小时来加热反应混合物以保持乙醚回流，促进碘代烷转化成相应的Grignard试剂。

将反应混合物冷却至室温；在20℃向Grignard试剂滴加溶于无水蒸馏二乙醚(25ml)的甲酸乙酯(444.5mg，6毫摩，MW＝74.04)。在添加时只轻微加热反应物。室温下搅拌反应混合物18小时以便完成该长链Grignard试剂与酯的偶联反应。

将反应物倒入冰甲醇(200g+100ml)并用浓盐酸酸化至酸性pH。过滤所得固体，并用甲醇和丙酮洗涤，真空干燥。用二氯甲洗涤时固体将形成聚结物，然后其在四氢呋喃(THF)中溶解和重结晶：1.5g粗醇在60℃溶于250mlTHF。该溶液在仍然热的时候在真空下经过滤纸盘过滤。向滤液中添加丙酮(200ml)以沉淀终产物仲醇，所述仲醇被滤出并用丙酮洗涤。将这种通过THF/丙酮沉淀的纯化方法应用于全部的粗醇。

总共制备和纯化了3.18g醇，相当于5.9毫摩(MW＝537.00)。根据消耗的碘代烷，反应产率是60％(根据甲酸乙酯是98％)。

通过¹H NMR谱分析终产物19-羟基三十七烷的特征来证实其纯度。

19-羟基三十七烷S3的分析：

CDCl₃中的1H-NMR(质子核磁共振)：0.90ppm(三重峰，J＝7.0Hz，6H，两条链的末端甲基)；1.27ppm(大的多重峰，64H，脂肪烷基链的CH₂)；1.45ppm(宽的多重峰，4H，醇β位的CH₂)；1.58ppm(来自羟基和痕量水的宽信号)；3.60ppm(多重峰，1H，醇α位的CH)。

9-十八烷基-十九烷基甲磺酸酯S4的合成(＝通过甲磺酰化活化仲醇)：

C₃₈H₇₈O₃S；MW＝615.09

在100ml反应器中的45ml无水吡啶中制备仲醇悬浮液(2.42g，4.5毫摩)(高浓度是正确转化的关键)。用注射器向反应器中少量添加3.5ml甲磺酰氯(5.15g，45毫摩)。反应混合物不用特别加热，所以可以在室温下完成添加。当接触甲磺酰氯时，白色悬浮液变成淡黄色。1小时后反应物变得更均匀，并且变成米色。24小时后反应物变成深褐色。

将反应混合物倒入250ml甲醇，其中产物以及没有反应的醇将沉淀。

通过过滤分离该沉淀物，并用甲醇洗涤，真空干燥。将所述固体溶于500ml二氯甲烷，其中只有甲磺酰化的产物是可溶的；可以用纸滤掉其余没有反应的醇。

完全蒸发掉二氯甲烷后得到终产物9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯，产率为69％(1.63g；2.65毫摩：MW＝615.09)。

通过¹H NMR谱分析其特征。

9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯的分析：

CDCl₃中的1H-NMR(质子核磁共振)：0.90ppm(三重峰，J＝7.0Hz，6H，两条链的末端甲基)；1.27ppm(大的多重峰，60H，脂肪烷基链的CH₂)；1.40ppm(先前信号内的宽多重峰，4H，甲磺酸酯γ位的CH₂)；1.69ppm(宽的多重峰，4H，甲磺酸酯β位的CH₂)；3.01ppm(单峰，3H，甲磺酸酯的CH₃)；4.72ppm(五重峰，J＝6.1Hz，1H，甲磺酸酯α位的CH)。

1-甲基-3-(1-十八烷基-十九烷基)-3H-咪唑-1-鎓氯化物(＝MONI)的合成：

Cl^- ；C₄₁H₈₁ClN₂；MW＝637.55

该反应是仲碳原子上芳香碱对甲磺酸的直接取代。因为反应缓慢，所以用大大过量的甲基咪唑作为溶剂。

将9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯(1.63g，2.65毫摩；MW＝615.09)加入顶部装有制冷柱的100ml反应器。添加80ml甲基咪唑，甲磺酸酯形成悬浮液。将反应物在80℃加热6天。然后所述反应混合物变成橙黄色和均匀的。

冷却至室温后，将所述反应混合物倒入更大的烧瓶，用150ml甲醇溶解。该混合物经过纸过滤。用80ml甲醇洗涤滤液。小的不溶部分主要是未反应的甲磺酸酯，这可以通过NMR分析证实。在纯化前将该滤液分成三等分以便于处理。

100ml混合物用600ml甲醇溶解，再次经过纸过滤。然后添加300ml水。所述混合物仍然是均匀的，然后通过添加少量浓盐酸逐步酸化，并控制pH。持续添加直到pH降至2-3。该混合物在室温下静置形成凝胶状沉淀物。为了促进沉淀，将混合物置于5℃ 18小时。将最终的悬浮液倒在滤纸上，用醇混合物(700ml甲醇，包含1ml浓盐酸的300ml无菌水)洗涤所获固体，并再次过滤。对剩余的甲醇相使用相同的步骤。

采用这种方法获得了517mg粗制3-[9-(十八烷基)十九烷基]-1-甲基-3H-咪唑鎓氯化物。

NMR谱监测显示该固体被甲基咪唑轻微污染。使用第二纯化步骤。

将所述固体溶于70ml甲醇并在60℃搅拌，然后将甲醇溶液从剩余固体中倒出。用温甲醇再次洗涤该固体残渣。所述不溶部分不同于NMR谱显示的产物。将甲醇溶液与之前已经用0.2ml浓盐酸酸化的60ml无菌水混合。该溶液在室温下形成凝胶，置于5℃ 18h以完成沉淀。所述胶状溶液经过纸过滤。所述干燥固体重新溶于等分甲醇和二氯甲烷(250ml)的混合物，然后溶于纯的二氯甲烷(250ml)。溶剂蒸发后获得481mg白色固体。对剩余的反应混合物重复该步骤两次(2.26毫摩；85％产率；MW＝637.55)。

NMR分析显示没有先前的杂质，并且对所述终产物的元素微量分析证实其纯度。

分析：

MONI在CDCl₃中的¹H-NMR(质子核磁共振)：

0.90ppm(三重峰，J＝6.9Hz，6H，两条链的末端甲基)；1.09ppm(多重峰；咪唑鎓环γ’2H)；1.27ppm(大的多重峰，62H，脂肪烷基链的CH₂)；1.85ppm(多重峰，4H，咪唑鎓β位的CH₂)；4.18ppm(单峰，3H，咪唑鎓环上的甲基)；7.02ppm(单峰，1H，咪唑鎓的C4H或者C5H)；7.13ppm(单峰，1H，咪唑鎓的C5H或者C4H)；11.17ppm(单峰，1H，咪唑鎓的C2H)。

CDCl₃中的间接¹³C-NMR(DEPT135；DEPT90)：

CH和CH₃是(-)；CH₂是(+)

123.1ppm(-)(咪唑鎓的C2)；119.2ppm(-)(咪唑鎓的C4和5)；62.8ppm(-)(咪唑鎓N3上的甲基)；36.9ppm(-)(咪唑鎓N1上的CH)；35.5ppm(+)(脂肪链的C)；31.9ppm(+)(脂肪链的C)；29.72ppm(+)(脂肪链的C)；29.67ppm(+)(脂肪链的C)；29.65ppm(+)(脂肪链的C)；29.60ppm(+)(脂肪链的C)；29.53ppm(+)(脂肪链的C)；29.38ppm(+)(脂肪链的C)；29.35ppm(+)(脂肪链的C)；29.15ppm(+)(脂肪链的C)；25.94ppm(+)(脂肪链的C)；22.71(+)(脂肪链的C)；14.15ppm(-)(脂肪链的CH₃末端基团)。

MONI的红外吸收(IR)光谱：

吸光度峰值的特征在于其波长(cm^-1)和相应的吸光度，被分为强(s)、中(m)或者弱(w)：3130(m)；3035(s)；2955(s)；2920(s)；2850(s)；1570(s)；1560(m)；1470(s)；1430(w)；1375(w)；1160(s)；750(w)；725(m)。

该IR吸收谱符合1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯化物的报告谱，与其化学结构一致。

实施例2：1-甲基-3-(1-十八烷基-十九烷基)-3H-苯并-咪唑-1-鎓氯化物 (MONBI)的合成：

在0.6毫摩苯并咪唑存在的条件下，将溶于7ml的甲基-乙基酮(MEK)的9-(十八烷基)十九烷基甲磺酸酯(0.1毫摩)加热3天。在溶剂蒸发后，利用甲醇/二氯甲烷梯度通过硅胶层析法纯化粗产物。分离0.015毫摩中性N1取代的苯并咪唑产物，所述产物在MEK中用大大过量的碘甲烷甲基化并加热1天。所述甲基化反应是定量的，在利用甲醇/二氯甲烷梯度通过硅胶层析法纯化后获得10mg MONBI。

MONBI在CDCl₃中的1H-NMR(质子核磁共振)：

0.89ppm(三重峰，J＝6.9Hz，6H，两条链的末端甲基)；1.27ppm(大的多重峰，64H，脂肪烷基链的CH₂)；2.1ppm(大的多重峰，4H，苯并咪唑鎓氮β位的CH₂)；4.39ppm(单峰，3H，苯并咪唑鎓环N3上的甲基)；4.65ppm(与苯并咪唑鎓N1连接的CH)；7.72ppm(多重峰，4H，苯并环质子)；11.37ppm(单峰，1H，苯并咪唑鎓的C2H)。

反应示意图如下：

实施例3：HEIC的合成：

2-十七烷基-花生酸(Y1)的合成：

C₃₇H₇₄O₂；MW＝550.98

向含有15ml THF(用二苯甲酮钠蒸馏过)的100ml烘干反应器中添加二异丙胺(2.56ml；1.85g；18.26毫摩；MW＝101.19)，并在氩气中冷却至-78℃。滴加11.4ml丁基锂(于THF中1.6M；18.26毫摩)，在-78℃搅拌10分钟然后加热至0℃，以形成LDA试剂。

在0℃向所述反应混合物中滴加于20ml THF中的十九烷酸(2.5g；8.37毫摩；MW＝298.51)。添加1.2ml干DMPU(1.246g；9.72毫摩；MW＝128.18)，加热至室温以形成二价阴离子中间物。

在-5℃通过添加1-碘十八烷(3.15g；8.28毫摩；MW＝380.4)实现选择性的C烷化。反应在室温下持续18小时。

处理(work-up)将反应混合物倒入100ml冰水中，并添加4ml浓盐酸进行酸化。通过减压蒸发溶剂THF；利用乙酸乙酯萃取所述混合物并用Na₂SO₄(无水)干燥。减压浓缩所述有机相，在丙酮中重结晶所获固体产生白色粉末(4.271g；7.75毫摩，在下一步中无需进一步纯化即可使用)。

羧酸Y1的分析：

TLC分析：Rf＝0.5；溶剂：溶于庚烷的20％乙酸乙酯；检测：香草醛/硫酸(Merck TLC板硅胶60F254)。

¹H-NMR(CDCl₃)&(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，62H，烃链的CH₂)；1.50(大的多重峰，2H，酸β位的CH₂)；1.63(大的多重峰，2H，酸β’位的CH₂)；2.38(多重峰，1H，酸α位的CH)。

2-十七烷基-二十烷-1-醇(Y2)的合成：

C₃₇H₇₆O；MW＝537.00

酸Y1(847mg；1.537毫摩；W＝550.98)溶于20ml无水THF(用二苯甲酮钠蒸馏过)。在0℃滴加于THF中的BH₃溶液(于THF中1M；10ml；10毫摩)。通过TLC分析(溶剂：于庚烷中的10％乙酸乙酯)筛选所述反应物。反应平稳进行2天。将所述反应混合物注入100ml甲醇以沉淀醇(1.135g粗产物)。硅胶层析(梯度：于庚烷中的乙酸乙酯：6％-10％)产生518g纯的Y2(62％)。

醇Y2的分析：

TLC：Rf＝0.4；溶剂：于庚烷中的10％乙酸乙酯；通过香草醛/硫酸(蓝色)(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；1.46(大的多重峰，1H，醇β位的CH)；3.56(J＝5.5Hz，双峰，2H，醇α位的CH₂)。

甲磺酸2-十七烷基酯(Y3)的合成：

C₃₈H₇₈O₃S；MW＝615.09

溶于10ml CH₂Cl₂(用CaH2蒸馏过)的醇Y2(600mg；1.11毫摩；MW＝537.0)被冷却至0℃。向所述反应混合物中添加甲磺酰氯(0.5ml；740mg；6.46毫摩；MW＝114.55)，并在0℃滴加1ml三乙胺(728mg；7.19毫摩；MW＝101.19)，室温下搅拌。通过TLC分析证实所述反应在2小时后完成。减压浓缩所述反应混合物，并用甲醇洗涤固体以去除过量的试剂。过滤获得的固体通过NMR分析证实是纯的，相当于570.6mg Y3(0.928毫摩；82.9％产率)。

甲磺酸酯Y3的分析：

TLC：Rf＝0.6；溶剂：于庚烷中的50％二氯甲烷；通过香草醛/硫酸(深蓝色斑点)(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

NMR ¹H(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；1.72(多重峰，1H，甲磺酸酯β位的CH)；3.01(单峰，3H，甲磺酸酯的CH₃)；4.10(J＝5.5Hz，双峰，2H，甲磺酸酯α位的CH₂)。

1-(2-十七烷基-二十烷基)-3-甲基-3H-咪唑-1-鎓氯化物(HEIC)的合成：

C₄₁H₈₁ClN₂；MW＝637.55

在80℃甲磺酸酯Y3(150mg；0.243毫摩；MW＝615.09)和N-甲基咪唑(200mg；2.43毫摩；MW＝82.10)于2-丁酮(10ml)中加热5天。TLC分析允许检测甲磺酸酯的转化。

处理：通过降低压力从反应混合物中去除溶剂。所获粗产物溶于12ml异丙醇，经过纸过滤以去除未反应的甲磺酸酯，然后用8ml纯水稀释。所述混合物用盐酸酸化至pH＝2。在5℃两亲性分子沉淀为盐酸盐。按照关于其他感兴趣两亲性分子的描述，通过使用异丙醇-水混合物、酸化、然后利用甲醇-水混合物可以极大地促进HEIC分子的沉淀。在14000rpm离心(0℃15分钟)获得产物。通过硅胶柱层析法(于二氯甲烷中的甲醇梯度)纯化所获沉淀物，获得66mg纯的HEIC，相当于0.103毫摩(产率：42％)。

两亲性分子HEIC的分析：

TLC：Rf＝0.25；溶剂：于二氯甲烷中的10％甲醇；通过碘蒸气检测(Merck TLC板硅胶60 F254)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.89(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；1.88(多重峰，1H，咪唑鎓β位的CH)；4.16(单峰，3H，甲基咪唑鎓的CH₃)；4.20(J＝7.2Hz，双峰，2H，甲基咪唑鎓α位的CH₂)；7.14(单峰，1H，甲基咪唑鎓的CH)；7.34(单峰，1H，甲基咪唑鎓的CH)；10.74(单峰，1H，甲基咪唑鎓的CH)。

¹³C-NMR：dept 135(CDCl₃)δ(ppm)：

CH和CH₃产生负峰(-)

检测到CH₂是正峰(+)

dept135检测不到季碳

139.2((-)，甲基咪唑鎓的C)；122.9((-)，甲基咪唑鎓的C)；121.5((-)，甲基咪唑鎓的C)；54.04((+)，咪唑鎓α位的C))；38.8((-)，甲基咪唑鎓的甲基C)；36.8((-)，咪唑鎓β位的C)；31.9(+)；30.8(+)；29.7(+)；29.2(+)；26.2(+)；22.7(+)(烃链上的不同C)；14.1(-)，烃链的C末端甲基。

实施例4：HEMB的合成：

1-(2-十七烷基-二十烷基)-1H-苯并咪唑(B1)的合成：

C₄₄H₈₀ClN₂；MW＝637.12

在287mg苯并咪唑(2.43毫摩；MW＝118.14)存在的条件下，溶于10ml2-丁酮的甲磺酸酯Y3(150mg；0.243毫摩；MW＝615.09)在80℃加热23天。通过TLC分析检测所述偶联反应物，检测到甲磺酸酯Y3的缓慢转化。

减压蒸发溶剂后获得的粗固体通过硅胶柱层析法(于二氯甲烷中的甲醇梯度：1-4％)纯化。UV阳性级分产生31mg量的纯化合物B1(0.048毫摩；20％产率)。

苯并咪唑化合物B1的分析：

TLC：Rf＝0.65；溶剂：于二氯甲烷中的5％甲醇；UV检测和/或碘蒸气(Merck TLC板硅胶60F254)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，两条烃链的末端CH₃)；1.25(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；1.89(多重峰，1H，苯并咪唑β位的CH)；4.1(J＝7.2Hz，双峰，2H，苯并咪唑α位的CH₂)；7.32(多重峰，2H，芳香环系统中的CH＝CH)；7.41(多重峰，1H，芳香环系统中的CH)；7.84(多重峰，1H，芳香环系统中的CH)；7.93(单峰，1H，苯并咪唑环中的CH)。

3-(2-十七烷基-二十烷基)-1-甲基-3H-苯并咪唑-1-鎓氯化物(HEMB)的合成：

C₄₅H₈₃ClN₂；MW＝687.61

向B1(19.1mg；0.0299毫摩，MW＝637.12)添加溶于15ml 2-丁酮的碘代甲烷(0.5ml；7.85毫摩；MW＝141.94)，并在60℃加热24小时。减压蒸发溶剂后获得24.1mg粗产物。为了转化成氯盐，将所述固体溶于2.8ml甲醇，并用1.2ml HCl(18％)酸化。所述氯盐在5℃形成沉淀物，通过离心(14000rpm，20分钟)分离。利用于二氯甲烷中的甲醇梯度通过硅胶柱层析法进一步纯化所述残渣，产生17.7mg的纯产物HEMB(0.0257毫摩；86％产率)。

两亲性分子HEMB的分析：

TLC：Rf＝0.2；溶剂：于CH₂Cl₂中的10％甲醇；UV检测和/或碘蒸气(Merck TLC板硅胶60F254)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.26(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；2.14(多重峰，1H，甲基苯并咪唑鎓β位的CH)；4.35(单峰，3H，甲基苯并咪唑鎓的CH₃甲基)；4.49(J＝7.2Hz，双峰，2H，甲基苯并咪唑鎓α位的CH₂)；7.73(多重峰，4H，苄基部分的CH＝CH)；11.43(单峰，1H，咪唑鎓部分的CH)。

¹³C-RMN：dept 135(CDCl₃)δ(ppm)：

CH和CH₃显示为负峰(-)。

CH₂产生正峰(+)。

Dept 135不显示季原子。

127.1((-)，苯并部分的2C)；112.8((-)，苯并部分的C)；113.0((-)，苯并部分的C)；51.9((+)，甲基咪唑鎓部分α位的C)；38.1((-)，甲基咪唑鎓部分的CH₃)；33.7((-)，甲基咪唑鎓β的C)；31.9(+)；31.2(+)；29.7(+)；26.3(+)；22.7(+)：烃链的C；14.1((-)，烃链的末端甲基)

实施例5：HET的合成：

18-碘甲基-三十六烷(T1)的合成：

C₃₇H₇₅I；MW＝646.90

将溶于15ml无水DMPU的甲磺酸酯Y3(560.6mg；0.911毫摩；MW＝615.09)与682.5mg碘化钠(4.55毫摩，MW＝149.85)在70℃一起加热20小时。

所述反应混合物用10ml水稀释，并用二乙醚萃取3次。所述有机相用MgSO₄干燥，过滤，减压去除溶剂。利用庚烷通过硅胶柱层析法纯化所获固体，得到360.5mg纯的T1(0.557毫摩；61.1％产率)。

碘代烷T1的分析：

TLC：Rf＝0.95；溶剂：庚烷；通过香草醛/硫酸(蓝色斑点)(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，两条链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；2.01(多重峰，1H，碘代β位的CH)；3.28(J＝4.5Hz，双峰，2H，碘代α位的CH₂)。

3-(2-十七烷基-二十烷基)-噻唑-3-鎓氯化物(HET)的合成：

C₄₀H₇₈ClNS；MW＝640.57

向于10ml 2-丁酮的T1(136.9mg；0.211毫摩，MW＝646.9)溶液中添加噻唑(180mg；2.11毫摩；MW＝85.13)，并在80℃加热所述反应混合物27天。减压蒸发溶剂，将粗固体溶于甲醇；过滤掉未反应的碘代烷。向甲醇溶液中添加稀释的盐酸(5ml 4％HCl到10ml的MeOH溶液)，置于5℃以沉淀两亲性分子，通过14000rpm(30分钟)离心收集。利用于二氯甲烷中的甲醇梯度通过硅胶柱层析法进一步纯化所述粗产物。阳性级分产生21mg纯的HET(0.033毫摩；15％产率)。

两亲性分子HET的分析：

TLC：Rf＝0.4；溶剂：于二氯甲烷中的10％甲醇；通过碘蒸气检测(MerckTLC板硅胶60F254)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.89(J＝6.7Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，66H，烃链的CH₂)；2.03(多重峰，1H，噻唑β位的CH)；4.67(J＝7.4Hz，双峰，2H，噻唑α位的CH₂)；8.22(J＝1.2Hz，J’＝3.7Hz，双二重峰，1H，噻唑环的CH)；8.40(J’＝3.7Hz，J”＝2.5Hz，双二重峰，1H，噻唑环的CH_c)；10.82(小的双二重峰，1H，噻唑环的CH)。

¹³C-NMR：dept 135(CDCl₃)δ(ppm)：

CH和CH₃显示负峰(-)。

CH₂产生正峰(+)。

160((-)，噻唑环的C)；136.7((-)，噻唑的C)；127.3((-)，噻唑的C)；60.7((+)，噻唑α位的C)；39.4((-)，噻唑β位的C)；32.2(+)，30.7(+)，29.8(+)，29.7(+)，29.7(+)，29.6(+)，29.5(+)，29.4(+)，26.1(+)，22.7(+)，烃链的C；14.1((-)，烃链的C末端甲基)。

实施例6：HEMI的合成：

4-十六烷基-二十烷-1，4-二醇(L1)的合成：

C₃₆H₇₄O₂；MW＝538.97

向顶部配有制冷柱的烘干双颈颈反应器中添加金属镁屑(1.618g；66.6毫摩；MW＝24.31)，并置于氩气中。然后向镁屑中滴加溶于10ml无水二乙醚的碘代十六烷(19.55g；55.48毫摩；MW＝352.34)，同时加热回流30分钟。再加热所述反应混合物60分钟，其变成浅灰色，提示Grignard试剂的形成。

在0℃向所述有机镁试剂中滴加溶于5ml无水二乙醚的丁内酯(800mg；9.29毫摩；MW＝86.09)。加热所述反应物至室温并搅拌18小时。

处理：将所述反应混合物倒入200g碎冰中，所述水相通过添加浓盐酸酸化。用CH₂Cl₂萃取所获混合物，再用纯水洗涤所述有机相。减压浓缩所述有机层并干燥。将所获固体溶于温的THF。当冷却浓缩的混合物时，不溶性的副产物沉淀。THF蒸发后，所获固体在温的丙酮中重结晶。所述二醇选择性地沉淀。获得4.357g纯的二醇L1，基于丁内酯的产率相当于87％。

二醇L1的分析：

TLC：Rf＝0.35；溶剂：于庚烷中的30％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，56H，烃链的CH₂)；1.45(大的多重峰，4H，叔醇β位的CH₂)；1.55(多重峰，2H，伯醇γ位的CH₂)；1.66(多重峰，2H，伯醇β位的CH₂)；3.68(J＝6Hz，三重峰，2H，伯醇α位的CH₂)。

4-十六烷基-二十-3-烯-1-醇(L2)的合成：

C₃₆H₇₂O；MW＝520.96

在50mg对甲苯磺酸(0.29毫摩；MW＝172)存在的条件下，在130℃加热溶于100ml二甲苯的醇L1(1.5g；2.78毫摩；MW＝538.97)50分钟。利用于庚烷中的乙酸乙酯10％混合物通过硅胶层析法纯化烯醇产生202.4mg的烯醇L2，相当于0.389毫摩异构体(14％产率)。主要的副产物是5元环醚(1.177g，2.2毫摩，79％)。

烯醇L2的分析：

TLC：Rf＝0.52和0.54(不同异构体的2个斑点)；溶剂：于庚烷中的20％乙酸乙酯；利用香草醛/硫酸(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

4-十六烷基-二十烷-1-醇(L3)的合成：

C₃₆H₇₄O；MW＝522.97

在1个大气压的氢中，溶于5ml乙酸乙酯的烯醇L2(202.4mg，0.389毫摩，MW＝520.96)用60mg炭上钯(10％Pd/C)氢化3天。通过TLC分析检测所述转化。过滤去除催化剂，通过蒸发溶剂以定量产率获得纯的醇L3。

醇L3的分析：

TLC：Rf＝0.52；溶剂：于庚烷中的20％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-RMN(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，63H，在烃链上)；1.56(多重峰，2H，醇β位的CH₂)；3.68(J＝6.7Hz，三重峰，2H，醇功能团α位的CH₂)。

4-十六烷基-二十烷基甲磺酸酯(L4)的合成：

C₃₇H₇₆O₃S；MW＝601.06

通过连续添加0.24ml甲磺酰氯(355mg；3.1毫摩；MW＝114.55)和0.48ml三乙胺(346mg；3.42毫摩；MW＝101.19)将溶于10ml二氯甲烷(用氢化钙蒸馏过)并冷却至0℃的醇L3(165.2mg；0.316毫摩；MW＝522)甲磺酰化。在室温下4小时后，溶剂被蒸发，用甲醇洗涤所述固体以萃取过量的试剂和三乙胺盐，产生119mg L4(0.198毫摩；63.6％产率)。

甲磺酸酯L4的分析：

TLC：Rf＝0.6；溶剂：于庚烷中的50％CH₂Cl₂；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，63H，在烃链上)；1.73(多重峰，2H，甲磺酸酯β位的CH₂)；3.02(单峰，3H，甲磺酸酯的CH₃)；4.22(J＝6.6Hz，三重峰，2H，甲磺酸酯α位的CH₂)。

1-(4-十六烷基-二十烷基)-3-甲基-咪唑-1-鎓氯化物(HEMI)的合成：

C₄₀H₇₉N₂Cl；MW＝623.52

在162.5mg甲基咪唑(1.98毫摩；MW＝82.10)存在的条件下，将溶于10ml 2-丁酮的甲磺酸酯L4(119mg；0.197毫摩；MW＝601.06)在80℃加热6天。通过TLC分析(甲磺酸酯消失)检测反应。

处理：减压蒸发溶剂。产物溶于甲醇，并通过过滤将其与未反应的甲磺酸酯分离。可溶性部分溶于17ml甲醇，添加8ml 3.7％盐酸。在5℃保存时两亲性分子沉淀。在0℃以14000rpm离心分离所述固体，沉淀得到170.6mg粗产物。硅胶层析法纯化(于二氯甲烷中的甲醇梯度：1％-15％)产生纯的产物，产率为43％(53mg；0.085毫摩)。

两亲性分子HEMI的分析：

TLC：Rf＝0.28；溶剂：于CH₂Cl₂中的10％甲醇；用碘蒸气(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.87(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.23(大的多重峰，63H，在烃链上)；1.85(多重峰，2H，甲基咪唑鎓β位的CH₂)；4.12(单峰，3H，甲基咪唑鎓的CH₃)；4.27(J＝7.4Hz，三重峰，2H，甲基咪唑鎓α位的CH₂)；7.28(单峰，1H，甲基咪唑鎓环的CH)；7.49(单峰，1H，甲基咪唑鎓环的CH)；10.65(单峰，1H，甲基咪唑鎓环的CH)。

¹³C-NMR：dept 135(MeOD-4d)δ(ppm)：

CH和CH₃产生负峰(-)。

检测到CH₂为正峰(+)。

dept135检测不到季碳。

136.5((-)，甲基咪唑鎓的C)；123.6((-)，甲基咪唑鎓的C)；122.3((-)，甲基咪唑鎓的C)；49.8((+)，咪唑鎓α位的C))；36.9((-)，甲基咪唑鎓的甲基-C)；35.1((-)，侧链分支点的C；33.0(+)；31.7(+)；30.0(+)；29.7(+)；29.4(+)；29.35(+)；29.3(+)，29.1(+)；27.2(+)；26.2(+)；22.4(+)(烃链上不同的C)；13.2(-)，烃链的C末端甲基。

实施例7：BIA的合成：

5-十四烷基-十九烷基-1，5-二醇(W1)的合成：

C₃₃H₆₈O₂；MW＝496.89

在30分钟内将溶于120ml二乙醚(用二苯甲酮钠蒸馏过)的1-溴十四烷(44.58g；160.8毫摩；MW＝277.28)滴加至4.7g镁屑(193.3毫摩；MW＝24.31)，同时加热回流。回流持续1小时，然后将温度降低到5℃，再滴加溶于20ml二乙醚的戊内酯(4.024g；40.2毫摩；MW＝100.12)。在室温下搅拌所述反应混合物16小时以完成反应。

处理：将所述反应混合物倒入500ml碎冰中，用浓盐酸酸化，并用二氯甲烷萃取。将蒸发有机层后获得的固体溶于温的THF，这可以将其与不溶性的副产物分离。THF蒸发后的可溶性组分在温的丙酮中重结晶，产生17.6g的纯二醇W1(35.4毫摩；基于戊内酯是88.1％)。

二醇W1的分析：

TLC：Rf＝0.27；溶剂：于庚烷中的30％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.27(大的多重峰，50H，烃链的CH₂)；1.42(大的多重峰，6H，叔醇β位的CH₂)；1.59(多重峰，2H，伯醇β位的CH₂)；3.68(J＝6.4Hz，J’＝5.3Hz，三重峰的双峰，2H，伯醇α位的CH₂)。

5-十四烷基-十九-4-烯-1-醇(W2)的形成：

C₃₃H₆₆O；MW＝478.88

将溶于200ml甲苯的二醇W1(5g；10.1毫摩；MW＝497)与137.6mg对甲苯磺酸加热回流2.5小时。利用于庚烷中的乙酸乙酯梯度(5％至10％)通过硅胶柱层析法纯化减压蒸发溶剂后获得的粗固体。

获得2.25g纯的烯醇W2(异构体的混合物)(47.1毫摩；46.5％产率)。烯醇W2的分析：

TLC：Rf＝0.44；Rf′＝0.48；溶剂：于庚烷中的20％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，48H，烃链的CH₂)；1.4-1.6(大的多重峰，2H，醇β位的CH₂)；2.00(多重峰，6H，烯丙基位的CH₂)；3.66(J＝6.4Hz，三重峰，2H，伯醇α位的CH₂)；5.13(J＝7.0Hz，三重峰，1H，乙烯位的CH)。

5-十四烷基-十九烷-1-醇(W3)的形成：

C₃₃H₆₈O；MW＝480.89

在1个大气压的氢气中，溶于12ml乙酸乙酯的烯醇异构体W2(2.207g，4.6毫摩)用炭上钯(Pd/C 10％，400mg)氢化。

经过纸过滤并减压蒸发掉溶剂后可以定量获得纯的醇(2.045g，4.25毫摩，92.4％产率)。

醇W3的分析：

TLC：Rf＝0.38；溶剂：于庚烷中的20％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-RMN(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，57H，在烃链上)；1.56(多重峰，2H，醇β位的CH₂)；3.67(J＝6.6Hz，三重峰，2H，醇功能团α位的CH₂)。

5-十四烷基-十九醛(W4)的形成：

C₃₃H₆₆O；MW＝478.88

通过连续添加284mg草酰氯和之前于20ml无水二氯甲烷中并冷却至-78℃的265μl DMSO来制备Swern试剂。5分钟后添加醇W3(900mg；1.869毫摩；MW＝480.88)，并将其置于-78℃30分钟；添加1ml无水三乙胺(用氢化钙蒸馏过)。将所述反应混合物加热至室温30分钟。

处理：所述反应混合物用30ml水急冷，并用二氯甲烷萃取3次。用1％盐酸和5％碳酸钠水溶液洗涤有机相。用无水硫酸钠干燥所述有机层，并过滤。利用于庚烷中的乙酸乙酯梯度(3％至5％)通过硅胶层析法进一步纯化溶剂蒸发后获得的粗制醛，产生658mg纯的醛(1.375毫摩，73.5％产率)。

醛(W4)的分析：

TLC：Rf＝0.32；溶剂：于庚烷中的5％乙酸乙酯；用于水中的0.5％KMnO₄作为喷雾剂(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-RMN(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，6H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，57H，在烃链上)；1.62(多重峰，2H，醛β位的CH₂)；2.42(J＝7.3Hz，三重峰，2H，醛功能团α位的CH₂)；9.79(单峰，醛的CHO)。

15-十四烷基-三十七烷-19-醇(W5)的形成：

C₅₁H₁₀₄O；MW＝733.37

在20分钟内将溶于10ml二乙醚(用二苯甲酮钠蒸馏过)的1-碘代十八烷(2.044g；5.37毫摩；MW＝380.40)滴加至196mg镁屑(8.064毫摩；MW＝24.31)，同时加热回流。回流持续1小时，然后将温度降低到5℃，再滴加溶于20ml二乙醚的醛W4(426mg；0.89毫摩；MW＝478.88)。在室温下继续搅拌18小时以完成反应。

处理：将所述反应混合物倒入100ml碎冰中，用浓盐酸酸化，并用二氯甲烷萃取3次。将蒸发有机层后获得的固体溶于温的THF；结晶后通过过滤可以分离副产物。THF蒸发后，粗制固体在温的丙酮中重结晶，并利用乙酸乙酯庚烷梯度(1％至5％)通过硅胶层析法纯化，得到293mg(0.4毫摩；基于醛产率为45％)。

醇(W5)的分析：

TLC：Rf＝0.37；溶剂：于庚烷中的10％乙酸乙酯；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，9H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，89H，在烃链上)；1.43(大的多重峰，4H，仲醇β位的CH₂)；3.61(多重峰，1H，伯醇α位的CH₂)。

甲磺酸1-十八烷基-5-十四烷基-十九酯(W6)的合成：

C₅₂H₁₀₆O₃S；MW＝811.46

溶于20ml CH₂Cl₂(用CaH₂蒸馏过)的醇W5(435.8mg；0.594毫摩；MW＝733.37)被冷却至0℃。向所述反应混合物中添加甲磺酰氯(0.46ml；680.7mg；6.43毫摩；MW＝114.55)，并在0℃滴加0.9ml三乙胺(661mg；6.53毫摩；MW＝101.19)，所述混合物在室温下再搅拌20小时。溶剂蒸发后，所述残渣用甲醇洗涤，并通过过滤分离，产生纯的甲磺酸酯(450.5mg；0.515毫摩；93％产率)。

甲磺酸酯W6的分析：

TLC：Rf＝0.59；溶剂：于庚烷中的50％二氯甲烷；用香草醛/硫酸(MerckTLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝5.6Hz，三重峰，9H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，89H，在烃链上)；1.69(大的多重峰，4H，甲磺酸酯β位的CH₂)；3.01(单峰，3H，甲磺酸酯的CH₃)；4.72(多重峰，1H，甲磺酸酯α位的CH)。

《分支咪唑鎓两亲性分子》(BIA)(1-甲基-3-(1-十八烷基-5-十四烷基-十九烷基)-3H-咪唑-1-鎓氯化物)的合成：

C₅₅H₁₀₉ClN₂；MW＝833.92

在221.6mg甲基咪唑(2.7毫摩；MW＝82.10)存在的条件下，将溶于10ml2-丁酮的甲磺酸酯W6(224mg；0.27毫摩；MW＝811.46)在80℃加热6天。通过TLC分析(甲磺酸酯消失)检测反应。

处理：减压蒸发溶剂。产物溶于甲醇，并通过过滤将其与未反应的甲磺酸酯分离。可溶性部分溶于17ml甲醇，添加8ml水。所述甲醇溶液用浓盐酸酸化至pH＝2。在-20℃保存时两亲性分子沉淀。在0℃以14000rpm离心分离所述固体，沉淀得到220mg粗产物。硅胶层析法纯化(于二氯甲烷中的甲醇梯度：1％-12％)产生纯的产物，产率为43％(198.7mg；0.238毫摩)。

BIA的分析：

TLC：Rf＝0.33；溶剂：于二氯甲烷中的10％甲醇；用碘蒸气(Merck TLC板硅胶60F254)检测。

¹H-NMR(CDCl₃)δ(ppm)：0.90(J＝6.8Hz，三重峰，9H，烃链的末端CH₃)；1.28(大的多重峰，89H，在烃链上)；1.84(大的多重峰，4H，咪唑鎓β位的CH₂)；4.18(单峰，3H，咪唑鎓的CH₃)；4.44(五重峰，J＝5.6Hz，1H，咪唑鎓α位的CH)；7.15(单峰，1H，咪唑鎓环的CH)；7.33(单峰，1H，咪唑鎓环的CH)；11.19(单峰，1H，咪唑鎓环的CH)。

¹³C-NMR：dept 135(CDCl₃)δ(ppm)：

CH和CH₃产生负峰(-)。

检测到CH₂为正峰(+)。

dept135检测不到季碳。

138.7((-)，甲基咪唑鎓的C)；123.0((-)，甲基咪唑鎓的C)；119.3((-)，甲基咪唑鎓的C)；62.8((-)，咪唑鎓α位的C))；37.2((-)，烃链的CH)，36.7((-)，甲基咪唑鎓的甲基-C)；35.9(+)；35.4(+)；33.5(+)；33.4(+)；33.3(+)；31.9(+)；30.1(+)；29.7(+)；29.65(+)；29.6(+)；29.5(+)；29.4(+)；29.1(+)；26.65(+)；26.6(+)；25.9(+)；23.2(+)；22.7(+)：(烃链的不同C)；14.1((-)，烃链的C末端甲基)

两亲性分子的质量分析：

分子溶于甲醇(0.1mg/ml)；直接注入；通过Bruker HCTultra装置的电喷ESI+Mass Analysis检测。

从1-甲基-3-(1-十八烷基-十九烷基)-3H-咪唑-1-鎓氯化物(MONI)和DOPE制备脂质体：

利用DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)作为共脂质形成脂质体。通过超声水浴的温和超声处理，将6.3mg MONI与不同量的DOPE一起溶于1ml乙醇。将这种浓的醇溶液注入9ml无菌水。所获溶液是澄清并且稍带蓝色的。该溶液用超声仪(Bioblock Scientific)超声处理，11W 2秒脉冲，5分钟。

所获脂质体大小为大约110nm，其尺寸分布较窄。它们在5℃的保存条件下是稳定的，大小没有增加也没有沉淀。

在下列MONI制剂中，选择浓度恒定为1mM的两亲性分子与不同毫摩尔量的二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组合。为了清楚起见，将它们简化为MONI(1+n)，n是DOPE的毫摩尔浓度。

两亲性分子MONI，但也包括本发明的其他两亲性分子，尤其是实施例2到7的那些分子，可以与共脂质DOPE一起非常容易的溶于乙醇。正如脂质体制剂一样，在存在不同摩尔比例的DOPE时浓度为1mM的两亲性分子最利于比较它们各自的生物活性。这些醇溶液与脂质体制剂一样进行体外转染实验。

通过动态光散射测量粒径：

按照上述，在milliQ水中制备1毫摩两亲性分子与不同浓度DOPE的脂质体制剂。利用Zetamaster(Malvern Instrument，Orsay，France)通过光散射确定这些脂质体制剂的粒径，参数如下：取样时间，30s；每个样品测量3次；介质粘度，1.0cP；介质折射率(RI)，1.335；RI颗粒，1.47；温度：25℃，633nm激光波长。

NMR实验：

利用Carex SA(Illkirch，France)的Bruker 400MHz分光光度计记录NMR谱。

元素分析(C、H、N)和红外光谱学：

最终产物的元素分析和红外光谱学(Vertex 70in KBr)在斯特拉斯堡的“Institut Charles Sadron UPR22”完成。

质量分析：

在Faculty of Pharmacy in Illkirch(IFR85，ULP，University Louis Pasteur，Strasbourg)的HCTultra装置(Bruker，France)上通过电喷射离子化法(ESI+)完成质量分析。

细胞培养

K562(人慢性髓性白血病，CCL-243)和THP-1(人外周血单核细胞白血病，TIB-202)细胞在RPMI-1640(Eurobio)中生长，所述RPMI-1640添加有10％胎牛血清(FBS，Perbio)、2mM glutamax(Eurobio)、100单位/ml青霉素(Eurobio)、100μg/ml链霉素(Eurobio)。HeLa(人宫颈上皮腺癌，CCl-2)、Caski(人宫颈癌)、SiHa(人宫颈鳞状癌，HTB-35)、MCF-7(人乳腺上皮腺癌，HTB-22)细胞在MEM(Eurobio)中生长，所述MEM添加有2mM glutamax、Earle′s BSS、1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％FBS。NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞，CRL-1658)细胞在DMEM(Eurobio)中生长，所述DMEM添加有4mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、4.5g/l葡萄糖、抗生素(Peni/Strepto)和10％FBS。

稳定转染pGL3Luc质粒(Clontech)后获得稳定表达GL3荧光素酶(SV40元件控制下的北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶)的A549(人肺癌，ATCC N°CCL-185)细胞。A549-GL3Luc细胞在RPMI-1640中生长，所述RPMI-1640添加有10％胎牛血清、2mM glutamax、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.8μg/ml G418(Promega)。所有的细胞均在37℃5％CO₂的湿润环境中维持。

转染实验

24孔组织培养板中的转染

转染前1天，将2.5×10⁴个细胞种入24孔组织培养板的1ml含10％FBS的新鲜完全培养基中。转染前，制备siRNA/转染试剂复合物。将所需量的siRNA稀释到100μl无血清培养基中。用涡旋振荡器混合所述溶液10秒。然后，向siRNA溶液中添加0.5μl至3μl的基于两亲性分子的制剂。用涡旋振荡器混合最终的混合物10秒，在室温下静置10分钟。然后，每孔添加100μl复合物溶液，并在37℃保温所述板。

96孔组织培养板中的转染

转染前1天，将1×10⁴个细胞种入96孔组织培养板的0.15ml含0.150％FBS的新鲜完全培养基中。转染前，制备siRNA/转染试剂的复合物。将所需量的siRNA稀释到20μl无血清培养基中。用涡旋振荡器混合所述溶液10秒。然后，向siRNA溶液中添加0.5μl至3μl的基于两亲性分子的制剂。用涡旋振荡器混合最终的混合物10秒，在室温下静置10分钟。然后，每孔添加20μl复合物溶液，并在37℃保温所述板。

96孔组织培养板中的反向转染

首先制备siRNA/转染试剂复合物。将所需量的siRNA稀释到50μl无血清培养基中，并将其添加到96孔组织培养板的孔中。然后，向siRNA溶液中添加0.5μl至3μl的基于两亲性分子的制剂。在室温下将所述板置于定轨摇床5分钟。然后，在96孔组织培养板的每孔125μl含10％FBS的新鲜完全培养基中添加1×10⁴个细胞，然后所述板在37℃继续保温。

转染试剂的比较(以24孔组织培养板形式)

对于HiperFect试剂，将所需量的siRNA稀释到300μl无血清培养基中(实验重复三次)。然后，向siRNA混合物中添加9μl转染试剂。用涡旋振荡器混合所述溶液10秒，在室温下静置10分钟。转染前，去除完全培养基并用每孔0.5ml含10％FBS的完全培养基替换。每孔添加100微升转染溶液。

对于SilentFect试剂，将所需量的siRNA稀释到75μl无血清培养基中(实验重复三次)。将SilentFect试剂(2.25μl)稀释到75μl无血清培养基，并将所述溶液添加到siRNA的稀释溶液中，然后混合，在室温下静置20分钟。转染前，去除完全培养基，用每孔0.5ml含10％血清的完全培养基替换。每孔添加50微升转染溶液。因为观察到细胞毒性，所以去除转染培养基并用每孔1ml含10％血清的完全培养基替换。

对于Saint-Red试剂，将所需量的siRNA稀释到75μl HBS中(实验重复三次)。将Saint-Red试剂(1nM siRNA为0.42μl)稀释于75μl HBS，并将所述溶液添加到siRNA的稀释溶液中，然后混合，在室温下静置15分钟。然后，将600μl无血清培养基添加到转染溶液中。在添加到细胞前，去除完全培养基并用每孔0.5ml含10％血清的完全培养基替换，然后每孔添加250μl转染溶液。

对于TransIT-TKO，将所述试剂(6μl)稀释于150μl无血清培养基，并混合所述溶液，在室温下静置15分钟。向转染试剂稀释溶液中添加所需量的siRNA。轻轻混合溶液并在室温下静置15分钟。在添加到细胞前，去除完全培养基并用每孔0.25ml含10％血清的完全培养基替换。每孔添加50微升转染溶液。保温24h后，去除培养基，用0.5ml含10％FBS的完全培养基替换。

对于所有的转染方案，所述板还在37℃继续保温48h。

荧光素酶和蛋白分析

利用商品化试剂盒(Promega，France)测量荧光素酶基因表达。在去除完全培养基后，用1ml PBS溶液洗涤3次。然后，每孔添加100μl 1×裂解缓冲液，板在室温下保温30分钟。收集裂解产物，并在14000g离心5分钟。在注射100μl荧光素溶液后对5μl裂解物进行荧光素酶分析。利用光度计(LB960，Berthold，France)通过超过10秒的积分来监测发光(RLU)。结果表示为利用BCA分析(Pierce，France)测定的每mg细胞蛋白积分超过10秒的光单位(RLU)。

mRNA水平的测量

通过对全细胞裂解物进行的并且不需要靶扩增的

Branched DNA分析(GenoSpectra)测定信使RNA水平。

转染48h后，细胞用1mL PBS 1×(Cambrex)洗涤，并在50℃0.6mL1×Genospectra裂解缓冲液中裂解30分钟。然后，将板在-80℃保存至少30分钟。将裂解物解冻，并向捕获板中添加2-20μl裂解物。向板中添加10μl裂解工作试剂(对于48个反应，通过添加25μl CE(capture extender)、25μl LE(label extender)和25μl BL(封闭探针)和425μl 3×裂解混合物制备裂解工作试剂，全部化合物均购自Genospectra)并利用1×裂解混合物补足体积至100μl。用盖子将板覆盖并在50℃保温16h。板用300μl 1×洗涤缓冲液(Genospectra)洗涤3次，每孔添加100μl Amplifier工作溶液(0.116μl amplifier稀释于116μl Amplifier稀释剂，均购自Genospectra)。板在50℃保温1小时。用1×洗涤缓冲液洗涤3次后，每孔添加100μl标记探针工作试剂(Label ProbeWorking Reagent)(0.116μl标记探针稀释于116μl Amplifier稀释剂，均购自Genospectra)并在50℃保温1小时。然后用1×洗涤缓冲液洗涤板3次，每孔添加100μl底物工作试剂(Substrate Working Reagent)(0.348μl 10％十二烷基硫酸锂溶于116μl底物，均购自Genospectra)。保温30分钟后，用分光光度计(Berthold)测量每孔的发光。

SDS-PAGE和Western印迹分析

转染后，用1ml PBS 1×(Cambrex)洗涤细胞，每孔再用100μl胰蛋白酶/EDTA(Euromedex)进行胰蛋白酶消化。添加含10％血清的0.5mL完全培养基终止胰蛋白酶作用。将一式三份的孔集中，离心，用1×PBS洗涤沉淀。离心后，沉淀在4℃在100μl RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4，150mMNaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解20分钟。用涡旋振荡器匀浆所述裂解物，并在14000rpm离心5分钟。通过BCA试剂盒(Pierce)测定蛋白含量。将5μg蛋白上样于10％丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore)。利用1/3000稀释的豚鼠抗波形蛋白多克隆抗体(RDI)检测波形蛋白表达。用小鼠抗GAPDH单克隆抗体(Ambion)检测GAPDH用于归一化蛋白水平。按照制造商的说明书，利用偶联辣根过氧化物酶的抗豚鼠或者抗小鼠抗体和BioRad的Amplified Opti-4CN底物试剂盒显色免疫活性蛋白。

免疫荧光染色

转染后48-72小时回收培养基。用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液洗涤细胞。在4℃用甲醇溶液(甲醇/丙酮：1/1，冷却至-20℃)透化和固定细胞15分钟。再用1ml PBS-BSA 1％洗涤细胞两次，然后在4℃用含1％山羊血清的1ml PBS保温细胞15分钟以封闭非特异性结合位点。再用1mlPBS-BSA 1％洗涤细胞。

在50μl PBS和50μl小鼠抗核纤层蛋白A/C抗体(IgG 1型，ResearchDiagnostic Inc，Flanders，NJ)存在的条件下，在4℃保温细胞1小时。用1mlPBS-BSA 1％洗涤细胞两次。

细胞在4℃在PBS中保温1小时，所述PBS含50μl偶联荧光素的抗小鼠IgG的山羊抗体(Calbiochem，La Jolla，CA)。然后再用1ml PBS-BSA1％洗涤细胞，最终每孔添加1ml PBS-BSA1％。通过荧光显微镜(ECLIPSETE2000-S，Nikon)观察免疫染色。

结果

作为内源性报道基因的靶模型，使用稳定表达GL3荧光素酶的A549细胞(SV40元件控制下的北美萤火虫荧光素酶)。明确定义和常用的siRNA(化学制备的)以及SEQ ID N°1和2的序列特异性GL3Luc siRNA(由与GL3Luc mRNA匹配的19个核苷酸的短dsRNA组成，包括2个脱氧核糖核苷酸(dT)的3′突出)用于转染实验。制备于乙醇中的1mM阳离子两亲性分子MONI组合1mM中性磷脂DOPE的制剂。然后将于无血清培养基(100μl)中稀释的siRNA与2μl MONI/DOPE制剂(1mM/1mM，于乙醇中)复合。向在含血清的培养基中生长的细胞添加所得的转染复合物溶液，最终细胞暴露于浓度为100-2000pM的siRNA(图1)。转染48h后通过标准发光分析确定沉默效率，所述分析经过细胞裂解物蛋白含量归一化。当用2000pMsiRNA进行转染时，荧光素酶活性(表示为RLU/mg蛋白)被抑制达到90％。在相同条件下，当细胞用无关序列GL2Luc siRNA转染时，荧光素酶活性不受影响，证实了这是一种序列特异性的RNA干扰。向细胞单独添加相同浓度(100-2000pM)的GL3Luc siRNA时也没有显示荧光素酶活性的抑制(未显示)。

于乙醇中制备1mM基于MONBI分子的阳离子两亲性分子组合2mMDOPE的第二制剂。使用2μl这种制剂与GL3Luc siRNA(浓度范围从250pM-5nM)在无血清培养基中复合，并将所获溶液添加到A549-GL3Luc细胞中。转染48h后通过测量荧光素酶活性评估沉默效率。利用250pMsiRNA观察到显著的荧光素酶抑制(70％)，而用5nM siRNA转染更达到90％的荧光素酶抑制(图2)。当在相同的转染条件下使用无关序列GL2Luc siRNA时，荧光素酶水平不受影响，证实了利用GL3Luc siRNA获得选择性沉默。

如图2所示，当利用制剂MONI/DOPE转染时，基因沉默在siRNA的皮摩范围都是有效的。1000和100pM时荧光素酶基因沉默分别是95％和80％。当分别转染25和10pM siRNA时，仍然观察到50和20％的沉默(图3)。

通过在乙醇或者水中混合阳离子两亲性分子和中性磷脂DOPE制备基于咪唑鎓两亲性衍生物例如MONI或者MONBI的制剂。对于脂质体制品，两亲性分子首先与DOPE溶于乙醇，提供10×浓缩液。然后，将该溶液注射到10倍体积的水中并立即混合。然后用超声仪对所获溶液进行超声。通过动态光散射测定形成脂质体的粒径，显示平均大小为100nm，多分散性低(图4)。在4℃保存该脂质体制剂，发现其随时间是稳定的(数周至数月)，并且没有聚集形成(1个月，如图4所示)。我们制备了许多脂质体制剂，颗粒平均大小为100+/-10nM，突出显示了这种脂质体制备方法的实用性。

将MONI/DOPE脂质体制剂与许多上一代的专门用于将siRNA输送入细胞的商品化转染试剂进行比较(图5)。转染条件参照制造商的方案，这些条件描述于“材料和方法”。使用的siRNA浓度范围从1pM-10nM。Saint-Red和TransIT-TKO试剂显示最低的沉默效率(在1nm低于50％)。HiperFect和SilentFect试剂在100pM-10nM的siRNA范围内显示较好的沉默效率，但它们在siRNA的最低浓度(10pM-1pM)下是完全无效的。在所有被检测的siRNA浓度下MONI/DOPE转染系统均优于所有其他被检测的转染试剂。在10pM仍然观察到显著的基因沉默，大约50％。

为了证实MONI/DOPE制剂介导有效内源性基因沉默的功效，我们在各种细胞系包括粘附和非粘附细胞中靶向了GAPDH基因。我们选择

Technologies(Dharmacon)的GAPDH siRNA，其提供一组靶向相同mRNA上多个位点的4种siRNA，可确保有效的敲低(knockdown)。转染后48h利用bDNA技术(Genospectra)在mRNA水平评价基因沉默。向所有被检测的细胞(HeLa、Caski、SiHa、MCF-7、K562和THP-1)中添加单独的GAPDH SMART

试剂在250pM-10nM的浓度范围在mRNA水平不能提供有效的敲低。当用脂质体MONI/DOPE制剂(1/2mM)转染时，在250pM-10nM的siRNA浓度下，GAPDH SMART

试剂显示高效的GAPDH mRNA敲低，对于粘附细胞超过80％(HeLa、Caski、SiHa和MCF-7)(图6)。作为选择性的对照，添加核纤层蛋白A/C siRNA，但其对GAPDH mRNA水平没有影响。此外，当利用脂质体MONI/DOPE制剂和低浓度(5-20nM)siRNA转染时，对于非粘附细胞K562和THP-1也获得了选择性和有效的GAPDH沉默(图6)。其他内源性基因也被用作RNA干扰的靶，包括波形蛋白和核纤层蛋白A/C基因。通过鼠成纤维细胞3T3细胞波形蛋白基因的western印迹(图7)和人HeLa细胞核纤层蛋白A/C基因的免疫荧光染色(图8)在蛋白水平确定沉默效率。两个实验均显示在低siRNA浓度(1-5nM)下，利用脂质体MONI/DOPE制剂(1/2mM)转染siRNA48h后对这两种高丰度蛋白的高沉默效率。核纤层蛋白A/C实验还证实所有转染细胞均含完全消除靶基因表达的生物活性siRNA(图8)。

转染方案最初被用于在含血清培养基存在的条件下在24孔组织培养板中生长的粘附和非粘附细胞的有效siRNA输送。还检测了其他细胞培养支持物，例如6孔板、T25和T75培养瓶，对于用脂质体MONI/DOPE(1/2mM)制剂转染的浓度范围为100pM-10nM的siRNA，显示基因沉默效率＞80％。在96孔组织培养板中利用反向转染方案说明了适合HTS条件的siRNA输送能力。经过优化后，提出一种常规有效的方案。首先向孔中添加用25μl无血清培养基稀释的siRNA。然后，每孔添加1μl脂质体MONI/DOPE(1/2mM)制剂。混匀后，将板在室温放置10分钟以便转染复合物形成。然后向孔中添加用125μl含血清培养基稀释的细胞(10000个细胞/孔)，将板在37℃继续保温48h。当siRNA浓度≥1nM时，A549GL3Luc细胞的荧光素酶基因沉默超过80％，并且当转染无关的GL2Luc siRNA时，不存在荧光素酶抑制证明了选择性(图9)。皮摩水平的siRNA沉默也是显著的(＞50％，图9)。在优化的反向siRNA转染方案后，对于浓度为100pM和5nM的siRNA，MCF-7细胞中选择性GAPDH沉默效率分别为70-90％(图10)。

在下表2中列出了关于通过用基于式(I)所示两亲性阳离子分子的制剂转染GL3Luc siRNA的荧光素酶基因(pGL3)沉默的结果。

由两亲性阳离子分子/DOPE(1mM/2mM，于10％乙醇和水中)组成的制剂与siRNA复合，并转染A549-GL3Luc细胞。保温48h后检测荧光素酶基因表达。每个实验重复三次，利用对照GL2-Luc siRNA并用细胞裂解物的蛋白含量归一化，根据转染细胞的荧光素酶水平计算GL3荧光素酶沉默效率。

两亲性分子	siRNA浓度(nM)	沉默(％)+/-SD
两亲性分子	siRNA浓度(nM)	沉默(％)+/-SD	MONI	101	95+/-392+/-4
MONBI	101	94+/-1093+/-11	MONI	101	95+/-392+/-4
MONBI	101	94+/-1093+/-11	HEIC	101	83+/-273+/-6
HEMB	101	88+/-476+/-9	HEIC	101	83+/-273+/-6
HEMB	101	88+/-476+/-9	HET	101	23+/-222+/-1
HEMI	101	67+/-1957+/-8	HET	101	23+/-222+/-1
HEMI	101	67+/-1957+/-8	BIA	101	75+/-1459+/-6
BIA(无DOPE)	101	87+/-468+/-5	BIA	101	75+/-1459+/-6

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序列表

<110>宝利普拉斯生物转染公司

<120>转染具有基因沉默活性的寡核苷酸的组合物及其生物和治疗应用

<130>CP/BB 61838-2472

<140>PCT/IB2007/001774

<141>2007-04-05

<150>EP 06 290 563.3

<151>2006-04-06

<150>US 60/789575

<151>2006-04-06

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<220>

<221>modified_base

<222>(20)..(21)

<223>Desoxythymidine

<400>1

cuuacgcuga guacuucgat t 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<220>

<221>modified_base

<222>(1)..(2)

<223>Desoxythymidine

<400>2

ttgaaugcga cucaugaagc u 21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<220>

<221>modified_base

<222>(20)..(21)

<223>Desoxythymidine

<400>3

cguacgcgga auacuucgat t 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Oligonucleotide

<220>

<221>modified_base

<222>(1)..(2)

<223>Desoxythymidine

<400>4

ttgcaugcgc cuuaugaagc u 21

<210>5

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<212>DNA

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gaaugguaca aauccaagtt 20

<210>6

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ttcuuaccau guuuagguuc 20

<210>7

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<212>DNA

<213>Artificial sequence

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cuggacuucc agaagaacat t 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial sequence

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<223>Oligonucleotide

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<222>(1)..(2)

<223>Desoxythymidine

<400>8

ttgaccugaa ggucuucuug u 21

Claims

1、转染组合物，包括具有基因沉默活性的寡核苷酸和式(I)所示的两亲性阳离子分子

其中

-X是N-R₁、S或者O，R₁是C1-C4烷基或者羟基化的C3-C6烷基，

-R₂和R₃相同或者不同，代表H或者C1-C4烷基，或者R₂和R₃连接到一起形成饱和的或者非饱和的5元或6元的环或者杂环，

-E是C1-C5烷基间隔基，

-R₄和R₅相同或者不同，代表饱和的或者不饱和的、线性的或者分支的C10-C36烃或者氟碳链，任选包含C3-C6环烷基，

-A^-是生物相容的阴离子。

2、如权利要求1所述的组合物，其中R₂和R₃连接到一起形成的所述杂环是不饱和或者饱和的5元或6元杂环，包括C和作为杂原子的N、S或者O。

3、如权利要求1或者2所述的组合物，其中R₄和R₅是C14-C36烃链，E是C1-C4烷基间隔基。

4、如权利要求3所述的组合物，其中R₄和R₅是相同的。

5、如权利要求3所述的组合物，其中R₄和R₅是C18烷基，E是C1烷基。

6、如权利要求3所述的组合物，其中R₄和R₅是C16烷基，E是C4烷基。

7、如权利要求3所述的组合物，其中R₄和R₅是不同的。

8、如权利要求7所述的组合物，其中R₄和R₅是C18和C17烷基链，E是C2烷基。

9、如权利要求7所述的组合物，其中R₄和R₅分别是C32和C18烷基，E是C1烷基。

10、如权利要求3-9任一项所述的组合物，其中R₂和R₃是H或者连接在一起形成芳香环。

11、如权利要求1-10任一项所述的组合物，其中X是N-R₁，R₁是CH₃。

12、如权利要求1-10任一项所述的组合物，其中X是S或者O。

13、如权利要求1-12任一项所述的组合物，其中A^-是Cl^-或者OH^-。

14、如权利要求1-13任一项所述的组合物，与中性共脂质一起配制。

15、如权利要求14所述的组合物，其中所述共脂质是磷脂酰乙醇胺衍生物例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)或者胆固醇。

16、如权利要求1-15任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸是RNA干扰活性的。

17、如权利要求16所述的组合物，其中所述寡核苷酸是siRNA。

18、如权利要求1-17任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸或者siRNA分别包括起抗降解稳定作用的基团，所述基团选自包括嘌呤核苷酸，用修饰的类似物例如脱氧核苷酸取代的嘧啶核苷酸，和/或修饰的核苷酸类似物例如糖修饰的或者骨架修饰的核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸的组中。

19、如权利要求17或者18所述的组合物，其中所述寡核苷酸或者siRNA分别含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或者核苷酸类似物例如甲基膦酸酯、吗啉代二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、PNA、LNA、2′烷基核苷酸类似物。

20、一种体外或者离体转染活细胞的方法，包括向细胞中导入如权利要求1-19任一项所述的组合物。

21、如权利要求20所述的方法，包括利用纳摩和低至皮摩的siRNA或者寡核苷酸浓度介导基因沉默。

22、如权利要求20或者21所述的方法，其用于粘附或者非粘附细胞的细胞培养、用于功能基因组学、靶确认和治疗应用。

23、如权利要求20-22任一项所述的方法，使用在存在血清条件下的转染方案。

24、如权利要求20或者21所述的方法，当进行反向转染方案时介导HTS应用。

25、如权利要求1-19任一项所述的组合物，其用作药物。

26、如权利要求25所述的组合物，采用适于通过口服、全身或者局部途径给药的形式，其中所述组合物与药学上可接受的惰性载体结合。

27、如权利要求25或者26所述的组合物，其用于诱导对一或多种靶蛋白表达的调节作用，所述靶蛋白导致或者参与基因遗传性疾病或者复杂遗传疾病。

28、如权利要求27所述的组合物，其用于癌症、病毒感染或者寄生虫感染的治疗。

29、一种通过在甲醇/水/酸中自反应介质选择性沉淀而纯化中性形式的式(I)所示两亲性分子和将其转化成盐衍生物的方法。

30、一种合成如权利要求1-19任一项所述的式(I)所示两亲性阳离子分子的方法，包括

-建立一个分支长链，其烃部分通过标准的C-C偶联方法例如用对酯或者醛的Grignard偶联反应的方法获得，合成的疏水性部分含有式IV所显示的伯醇或者仲醇：

HO-E-R4(R5)(IV)

-通过转换成式(V)MsO-E-R4(R5)的甲基磺酰衍生物和/或其他典型的活化衍生物例如卤代衍生物来活化醇功能团；

其中X是N-R₁、S或者O

获得(I)

获得式(VIII)所示的杂环