CN101628051A - 一种鱼腥草注射剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鱼腥草注射剂及其制备方法，鱼腥草注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草进行水蒸气蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加入4－25g羟丙基－β－环糊精及7－9g氯化钠，按常规方法制成注射剂。本发明以鱼腥草注射液为研究对象，寻找导致其发生不良反应的有害成分/致敏源，探讨致敏机制；改进生产工艺，研制成功安全的新鱼腥草注射剂。

Description

一种鱼腥草注射剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种注射剂的制备方法，特别是涉及一种含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射剂的制备方法，属于医药技术领域。

背景技术

中药注射剂是将现代制剂工艺与传统中医药理论相结合而发展起来的中药新剂型，具有注射剂起效快、作用强的优点，又在一定程度上保留了中医药特色，因此在临床上得到了广泛应用。从1985年我国《药品管理法》颁布执行以来，经国家正式批准生产使用的中药注射剂已有134种。近20年来，随着现代科学技术的发展和应用，中药注射剂的研发和工艺优化得到了进一步发展，形成了一批受欢迎的中药注射剂品种，如清开灵注射液、复方丹参注射液等，它们在一些急重症，尤其是病毒性感染，心血管疾病以及肿瘤等方面显示出了独特的优势。由于目前临床使用的中药注射剂多数是二十世纪80年代以前开发的品种，受当时的研发技术条件等多因素制约，中药注射剂仍存在很多问题没有解决，如成分复杂、生产工艺落后、质量标准要求低、过敏试验不敏感以及临床用药不合理、缺乏上市后再评价等等。在1960～1993年的780篇报道3009例中药引起的药物不良反应(Adverse Drug Reaction，ADR)中，中药注射剂引起的仅占6.3％；然而1990～1999年的460篇报道1291例中药不良反应中，中药注射剂引起的就已经高达55.62％。因此，对中药注射剂进行全面、系统的研究，解决安全性的共性及个性问题迫在眉睫。

鱼腥草注射液是上世纪七十年代研制开发的清热解毒类中药注射剂，是由鱼腥草鲜品经双蒸馏提取后加入适量增溶剂吐温80制成，主要成分为甲基正壬酮、癸酰乙醛、癸醛、月桂醛等，药理研究表明具有抗病毒、抗菌、抗炎、解热、镇咳，增强机体免疫力等多种功效，临床广泛用于呼吸系统、泌尿系统等感染性疾病。然而，2006年的“鱼腥草事件”使鱼腥草注射液的安全性问题暴露出来。国家药品不良反应监测中心监测数据显示：含鱼腥草的7个注射剂品种，1988～2006年发生不良反应病例5000多例，其中严重不良反应222例，死亡35例，引起的不良反应主要为过敏性休克、全身过敏反应和呼吸困难等。因此2006年6月1日，国家药品食品监督管理局发布紧急通告，在全国范围内暂停使用和审批7类鱼腥草注射剂。在此之前，我国有近200家鱼腥草注射剂生产企业，年产量达6亿支，患者使用量达1.8亿人次，年产值接近百亿元。据不完全统计，此次叫停已导致大部分以鱼腥草注射剂产品为主的生产企业面临倒闭，数万名员工已经或正在面临失业，数十万种植鱼腥草的农民将失去经济来源。鱼腥草的种植、加工、提取、成药等整个产业链的价值近百亿元的损失正在形成。因此，对鱼腥草注射液导致临床不良反应的原因进行全面分析研究，改进工艺，消除其中有害成分，从而使其重新恢复生产和使用是目前亟待解决的重大问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼腥草注射剂及其制备方法；本发明的第二个目的是提供一种含β-环糊精衍生物的，无吐温-80，无溶血作用，稳定性好的鱼腥草注射剂的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

取鲜鱼腥草进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加入适量羟丙基-β-环糊精(优选4-25g羟丙基-β-环糊精)及适量渗透压调节剂(优选7g-9g氯化钠)，按常规方法制成注射剂。其中每1000ml重蒸馏液加入羟丙基-β-环糊精的量可以是4g、5g、10g、15g、20g。注射剂包括但不限于注射液、冻干粉针等注射用剂型。

本发明以鱼腥草注射液为研究对象，寻找导致其发生不良反应的有害成分/致敏源，探讨致敏机制；改进生产工艺，研制成安全的新鱼腥草注射剂，并进行系统药效学评价，为鱼腥草注射剂的恢复生产提供了科学依据和技术资料。

鱼腥草注射液的致敏性研究表明：①对鱼腥草双蒸馏液和鱼腥草简单水取物进行小鼠急性毒性的比较试验。结果表明鱼腥草双蒸馏液的安全性大于鱼腥草简单水提物，生产工艺不规范是鱼腥草注射液发生不良反应的原因之一。②采用Beagle犬全身主动过敏试验方法对鱼腥草双蒸馏液和增溶剂吐温80的致敏性进行比较。结果表明鱼腥草注射液中的主要致敏物质是其中的吐温80。③通过使用不同浓度的吐温80溶液与RBL-2H3细胞体外共孵育的方法，观察吐温80对RBL-2H3细胞的直接诱导脱颗粒作用，发现吐温80可以导致RBL-2H3细胞组胺和β-氨基己糖苷酶的释放率呈浓度依赖性增加；Annexin-V荧光染色检测(流式细胞仪检测和荧光显微镜观察)发现吐温80可以导致RBL-2H3细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻呈浓度依赖性增加；使用含钙与不含钙缓冲体系进行孵育，发现β-氨基己糖苷酶释放率没有显著性差异。结果表明吐温80的致敏机制与其不依赖于IgE抗体和细胞外游离钙离子的情况下直接诱导肥大细胞脱颗粒、释放过敏性介质有关。④通过吐温80与健康人血清体外孵育、ELISA方法测定反应体系中SC5b-9 C4d、Bb含量的方法，观察吐温80对人补体系统的激活作用及可能的激活途径。结果显示，吐温80可以激活人补体系统，该作用通过激活旁路途径实现。

优选鱼腥草注射液药用辅料的研究表明：①对国内外已知的四种增溶剂——吐温-80(Tween 80)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(Solutol HS15)和泊洛沙姆188(Poloxamer 188)进行小鼠急性毒性、豚鼠致敏性、BN大鼠致敏性、beagle犬致敏性、体外溶血性和血管刺激性的比较，发现HP-β-CD静脉用药安全、增溶效果好，是比较理想的鱼腥草注射液增溶剂。②通过比格犬过敏试验对更换辅料HP-β-CD的新鱼腥草注射液(中试产品)进行致敏性评价，结果显示，Tween-80及含有Tween-80的原鱼腥草注射液组均出现明显的类过敏及过敏反应，主要表现是给药后出现严重的行为异常及血液组胺的升高；而不含Tween-80鱼腥草双蒸馏液组以及含有HP-β-CD的新鱼腥草注射液组均未出现明显的行为异常及血液组胺的升高，即新鱼腥草注射液的安全性明显提高。

新鱼腥草注射液的药效学研究表明：干酵母致大鼠发热试验、内毒素致家兔发热试验、二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验以及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透亢进试验的结果显示，新鱼腥草注射液具有显著的解热、抗炎作用，其作用强度与同原鱼腥草注射液相当。

下面实验例用于进一步说明本发明。

实验例1吐温80与鱼腥草蒸馏液对Beagle犬致敏性的比较

材料、药品、试剂、动物、器材

吐温-80：Tween-80，德国Welding公司生产，药用级，生产批号：OE61206A；鱼腥草鲜品(地上部分)：购自中国医学科学院药用植物研究所，鉴定为Houttuynia cordataThunb；鱼腥草双蒸馏液的制备：本研究室自制，严格按照部颁标准鱼腥草注射液生产工艺，取鱼腥草鲜品5000g进行水蒸气蒸馏，收集初馏液5000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2500ml(加入17.5g氯化钠)，即得2∶1鱼腥草双蒸馏液，调pH值至4～6，灌封，灭菌，冷藏备用；犬组胺ELISA试剂盒，美国USCNLIFE公司生产，产品编号：E0927c；犬总IgE ELISA试剂盒，美国USCNLIFE公司生产，产品编号：E0545c；天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D03-04；丙氨酸氨基转移酶试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D01-02；肌酐试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D42；尿素试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D37-38；总胆红素试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D40。

Beagle犬6只，体重8～13kg，雄性，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，实验动物许可证号SCXK-(军)2002-001。实验环境室温25～30℃，相对湿度55～65％，通风良好。

全自动酶标仪，BIO-RAD Model 550，美国伯乐公司；电脑微量注射泵，ANGEL AJ-5803，上海安洁电子设备有限公司；全自动生化分析仪，TECHNICON RA-1000，美国拜耳公司；全自动血球计数仪，MEK 6318K，日本光电公司。

动物分组

将6只犬按体重随机分为2组，每组3只，分别为①鱼腥草双蒸馏液组②1％Tween80+鱼腥草双蒸馏液组，其中鱼腥草双蒸馏液用量均为10g生药·kg^-1。

给药和指标检测

实验开始前，从犬前肢静脉抽取空白血样，用于检测给药前血清组胺、总IgE水平及肝肾功能、血常规。根据全身主动过敏试验的方法^[4]，致敏给药三次，即于实验开始后第1、3、5天分别给予各组犬相应药液致敏，各组给药体积均为5.0ml·kg^-1，给药途径为犬前肢静脉注射(使用注射泵，注射速度为5ml·min^-1)，连续观察从药液进入血管至给药4h内各犬的反应，是否出现流涎、恶心、呕吐、腹泻以及面部和腹部皮肤潮红、丘疹、水肿，及行为烦躁等过敏反应；症状出现时间，消失时间，并根据症状的轻重评分(过敏反应评级标准见表1)。首次给药后15min抽取各组犬静脉血样，用于检测首次给药后血清组胺水平。于实验第14天进行激发给药，给药前抽取各组犬静脉血样测定肝肾功，血常规，血清总IgE和组胺水平，抽血后各组采用如前方式进行激发给药，给药体积为致敏量的2倍，即10ml·kg^-1。给药后15min抽血检测给药后血清组胺水平。连续观察从药液进入血管至给药4h内各组犬的反应，是否出现流涎、恶心、呕吐、腹泻以及面部和腹部皮肤潮红、丘疹、水肿，及行为烦躁等过敏反应；症状出现时间，消失时间，并根据症状的轻重评分。每次给药前及给药后测定犬的肛温及体表心电图。若实验过程中出现动物死亡，则立即进行解剖，肉眼观察各主要脏器有无明显异常，并对心、肝、脾、肺、肾、胸腺进行病理学检查。

表1比格犬过敏反应评级标准

数据处理

所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，各组之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’sT²检验。P＜0.05为有统计学意义。

结果

行为学评分

给药的第1、3、5天(3次致敏给药)及第14天(激发给药)，鱼腥草双蒸馏液组的Beagle犬均未出现过敏反应，而Tween80+鱼腥草组的3只Beagle犬均出现了明显的过敏反应，过敏率100％，过敏平均级数均在3级以上，各动物均在给药5～10min开始出现过敏反应，主要表现为皮肤粘膜潮红，流涎，恶心呕吐，烦躁，软弱无力等，未予抗过敏治疗，60～180min基本恢复正常。

鱼腥草双蒸馏液组动物的心率给药前后没有明显变化，而Tween80+鱼腥草组的动物给药后心率明显增快，给药前后心率变化有显著性差异(P＜0.05)。各组动物给药前后的体温变化没有显著性差异(P＞0.05)(见表2)。

表2给药后Beagle犬出现过敏反应的情况(n＝3，x±s)

与鱼腥草双蒸馏液比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

血液学指标

血常规：第一次给药前及最后一次激发给药前抽血检测血常规各项指标，结果显示两组动物的血常规指标均基本在正常范围内，且给药前后没有明显变化(P＞0.05)(见表3)。

表3给药前后Beagle犬血常规指标的变化情况(n＝3，x±s)

注：RBC代表红白细胞，Hb代表血红蛋白，WBC代表白细胞，Plt代表血小板，L代表白细胞分类计数中淋巴细胞所占的百分比，N代表白细胞分类计数中中性粒细胞所占的百分比肝肾功：第一次给药前及最后一次激发给药前抽血检测肝肾功主要指标，结果显示两组动物的肝肾功基本在正常范围内，且给药前后没有明显变化(P＞0.05)(见表4)。

表4给药前后Beagle犬肝肾功指标的变化情况(n＝3，x±s)

注：ALT代表丙氨酸氨基转移酶，AST代表天门冬氨酸氨基转移酶，BIL代表胆红素，CRE代表肌酐，BUN代表尿素氮。

组胺：第一次致敏给药及最后一次激发给药的给药前后抽取两组Beagle犬静脉血以比较给药前后组胺释放情况。结果显示鱼腥草蒸馏液组Beagle犬在首次给药及激发给药后血清组胺水平均较给药前有不同程度的下降，而Tween80+鱼腥草组的Beagle犬在两次给药后血清组胺水平均有不同程度的升高(见表5)。

表5给药前后Beagle犬血清组胺变化情况(n＝3，x±s，ng·ml^-1)

*P＜0.05，**P＜0.01vs鱼腥草双蒸馏液组

血清总IgE：比较两组第一次给药前及14天后血清总IgE水平，本试验未观察到规律性变化(见表6)。

表6给药前后Beagle犬血清总IgE指标的变化情况(n＝3，x±s，IU·ml^-1)

结论

吐温80是鱼腥草注射液中的主要致敏原；由于首次静脉给药即可导致犬明显过敏反应，因此其过敏类型属于类过敏反应。

实验例2不同增溶剂与鱼腥草双蒸馏液配伍的Beagle犬致敏性比较

由于急性毒性实验发现HP-β-CD和Poloxamer 188静脉给药急性毒性小，安全范围较大，而Solutol HS15的静脉急性毒性较大，不适合做为静脉用增溶剂，因此致敏性比较中对HP-β-CD和Poloxamer 188的致敏性与Tween80进行比较，以进行进一步安全性筛选。

材料、药品、试剂、动物、器材

吐温-80：Tween-80，德国Welding公司生产，药用级，生产批号：OE61206A；羟丙基-β-环糊精：HP-β-CD，西安德立生化有限公司，注射级，生产批号：20061020；泊洛沙姆188：Poloxamer188，Pluronic，德国BASF公司生产，注射级，生产批号：20050519；鱼腥草鲜品(地上部分)：购自中国医学科学院药用植物研究所，鉴定为Houttuyniacordata Thunb；鱼腥草蒸馏液的制备：严格按照部颁标准鱼腥草注射液生产工艺，取鱼腥草鲜品5000g进行水蒸气蒸馏，收集初馏液5000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2500ml(加入17.5g氯化钠)，即得2∶1鱼腥草双蒸馏液，调pH值至4～6，灌封，灭菌，冷藏备用；犬组胺试剂盒，美国USCNLIFE公司生产，产品编号：E0927c；犬总IgE试剂盒，美国USCNLIFE公司生产，产品编号：E0545c；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D03-04；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D01-02；肌酐(CREA)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D42；尿素氮(BUN)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D37-38；总胆红素(BIL)试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司生产，产品编号：D40。

Beagle犬12只，体重8～13kg，雄性，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK-(军)2002-001。实验环境室温25～30℃，相对湿度55％～65％。

全自动酶标仪，型号：BIO-RAD Model 550，美国伯乐公司；电脑微量注射泵，型号：ANGEL AJ-5803，上海安洁电子设备有限公司；全自动生化分析仪，型号：TECHNICONRA-1000，美国拜耳公司；全自动血球计数仪，型号：MEK 6318K，日本光电公司。

动物分组

将12只犬按照体重层次随机分为4组，每组3只，分别为鱼腥草蒸馏液组，1％Tween80+鱼腥草蒸馏液组，10％HP-β-CD+鱼腥草蒸馏液，6％Poloxamer 188+鱼腥草蒸馏液组，各组中鱼腥草蒸馏液的剂量以生药计均为10g生药·kg^-1。

给药和指标测定

实验开始前，从犬前肢静脉抽取空白血样，用于检测给药前血清组胺、总IgE水平及肝肾功能、血常规。根据全身主动过敏试验的方法，致敏给药3次，于实验开始后1、3、5天分别给予各组犬相应药液致敏，各组给药体积均为5.0mL·kg^-1，给药途径为犬前肢静脉注射(使用注射泵，注射速度为5mL·min^-1)，连续观察从药液进入血管至给药4h内各组犬的反应，是否出现流涎、恶心、呕吐、腹泻以及面部和腹部皮肤潮红、丘疹、水肿，及行为烦躁等过敏反应；症状出现时间，消失时间，并根据症状的轻重评分。第1次给药后15min抽取各组犬静脉血样，用于检测给药后血清组胺水平。于实验第14天进行激发给药，给药前抽取各组犬静脉血样测定肝肾功、血常规、血清总IgE和组胺水平，抽血后各组采用如前方式再进行激发给药，给药体积为致敏量的2倍，即10mL·kg^-1。给药后15min抽血检测给药后血清组胺水平，观察各组犬的过敏反应，并进行症状评分。过敏反应评分标准如下：0分无明显反应；1分烦躁；2分皮肤潮红、红斑、眼红；3分流涎、恶心、唇耳眼水肿、动物极度不安；4分痉挛、抽搐、大小便失禁、无力、休克、死亡。每次给药前及给药后测定犬的肛温及体表心电图。若实验过程中出现动物死亡，则立即进行解剖，肉眼观察各主要脏器有无明显异常，并对心、肝、脾、肺、肾、胸腺进行病理学检查。

数据处理

所有数据均用均数±标准差(x±s)表示，各组之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法，方差齐性用Student-Newman-Keuls检验，方差不齐用Tamhane’sT2检验。P＜0.05为有统计学意义。

结果

过敏表现

给药第1、3、5天(3次致敏给药)及第14天(激发给药)，鱼腥草蒸馏液组、鱼腥草蒸馏液加Poloxamer 188及鱼腥草蒸馏液加HP-β-CD组的Beagle犬均未出现过敏反应，而鱼腥草蒸馏液加Tween 80组的Beagle犬在给药后5～10min均出现了明显过敏反应，过敏率100％，过敏平均级数均在3级以上，主要表现为皮肤黏膜潮红、流涎、恶心呕吐、烦躁、软弱无力等，未予抗过敏治疗，60～180min基本恢复正常；鱼腥草注射液及加用Poloxamer 188组和HP-β-CD组的动物的心率给药前后没有明显变化，而加用Tween 80组给药后心率明显增快(P＜0.05)。各组动物给药前后的体温变化没有显著性差异(P＞0.05)。结果见表7。

表7给药后Beagle犬出现过敏反应的情况(x±s，n＝3)

*p＜0.05，**p＜0.01vs鱼腥草蒸馏液组

血液学指标：

血常规：第1次给药前及最后1次激发给药前抽血检测血常规各项指标，结果显示各组动物的血常规指标均基本在正常范围内，且各组给药前后没有明显变化(p＞0.05)。结果见表8。

表8给药前后Beagle犬血常规指标的变化情况(x±s，n＝3)

RBC代表白细胞，Hb代表血红蛋白，WBC代表白细胞，Plt代表血小板，L代表白细胞分类计数中淋巴细胞所占的百分比，N代表白细胞分类计数中中性粒细胞所占的百分比

肝肾功：第1次给药前及最后1次激发给药前抽血检测肝肾功主要指标，结果显示各组动物的肝肾功基本在正常范围内，且各组给药前后没有明显变化(p＞0.05)。结果见表9。

表9给药前后Beagle犬肝肾功指标的变化情况(x±s，n＝3)

ALT代表丙氨酸转氨酶，AST代表天门冬氨酸转氨酶，BIL代表胆红素，CRE代表肌酐，BUN代表尿素氮。

组胺：第1次致敏给药及最后1次激发给药的给药前后抽取各组动物静脉血以比较给药前后组胺释放情况。YXC蒸馏液对照组、Poloxamer 188组和HP-β-CD组这3组动物在首次给药及激发给药后血清组胺水平均较给药前有不同程度的下降，而Tween 80组的动物在两次给药后血清组胺水平均有不同程度的升高，与对照组比较，差异有显著性统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。结果见表10。

表10给药前后Beagle犬血清组胺指标的变化情况(n＝3，x±s，ng·ml^-1)

*p＜0.05，**p＜0.01 vs YXC蒸馏液组

总IgE：比较各组第1次给药前及第14天后血清总IgE水平，未观察到规律性变化。结果见表11。

表11给药前后Beagle犬血清总IgE指标的变化情况(n＝3，x±s，IU·mL^-1)

结论：Poloxamer 188和HP-β-CD与鱼腥草蒸馏液配伍后对Beagle犬没有明显的致敏作用；而吐温80与鱼腥草蒸馏液配伍后则有明显致敏作用。

实验例3不同增溶剂体外溶血性比较试验

前期实验发现Poloxamer 188和HP-β-CD静脉用药的急性毒性远低于Tween80，且未发现致敏性，因此考虑作为较理想的静脉用增溶剂进行进一步安全性评价。但是目前大量文献表明Poloxamer 188有明确的药理活性，如抑制神经损伤、预防血栓形成等，而且可能有激活人体补体系统的副作用，考虑其可能存在安全隐患，且不符合惰性辅料的基本要求，因此将不再列入本研究的增溶剂筛选范围。本试验的目的是体外比较不同浓度Tween80和HP-β-CD对兔红细胞的溶血作用。

材料、药品、试剂、动物、器材

吐温-80：Tween-80，德国Welding公司生产，药用级，生产批号OE61206A，使用前用生理盐水配制成0.5％、1.0％、2％Tween-80溶液；羟丙基-β-环糊精：HP-β-CD，西安德立生化有限公司，注射级，生产批号20061020，使用前用生理盐水配制成0.5％、1.0％、2％HP-β-CD溶液；鱼腥草蒸馏液：由四川雅安三九药业集团有限公司提供，严格按照鱼腥草注射液部颁标准进行提取，生产批号：F080101。

新西兰白兔，1只，普通级，雄性，体重2～2.5kg/只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)2005-0002。

台式离心机：型号CL31-CL31R，Thermo IEC公司；电热恒温水浴锅：型号HH S，江苏省台东市电器厂；紫外可见分光光度计：型号UV-120-02，日本Shimadzu公司。

方法

取新西兰白兔1只，清醒状态下从心脏取血约20mL，置洗净干燥的玻璃杯中，用玻璃棒搅拌以除去纤维蛋白，然后将去纤维蛋白血移入离心管内，加入适量0.9％生理盐水，摇匀，1200r·min^-1离心10min，弃上清液后，沉淀的红细胞再用生理盐水洗涤和离心3次，至上清液呈无色透明。然后将所得红细胞按其容积，用0.9％生理盐水稀释成2％的混悬液，备用。将Tween-80和HP-β-CD用0.9％生理盐水分别配成0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％浓度的受试液。

取13只玻璃试管(编号1～13号)，每管分别加入2.5mL 2％红细胞混悬液，然后1号管加入2.5mL生理盐水，2号管加入2.5mL蒸馏水，3号管加入2.0mL生理盐水和0.5mL鱼腥草蒸馏液，4～8号管分别加入2.0mL生理盐水和0.5mL不同浓度的Tween-80溶液，5～13号管分别加入2.0mL生理盐水和0.5mL不同浓度的HP-β-CD溶液。置37℃恒温水浴箱中，观察4h内各试管的溶液是否有溶血或红细胞凝集现象，开始每15min观察一次，1h后每1h观察一次(判断标准见表3-10)。4h后，1200r·min^-1离心5min，吸取上清液，在590nm波长处测定其吸收度(A)。溶血度％＝(A样品-A阴性)/(A阳性-A阴性)×100％。溶血反应的判断标准见表12。为确保试验的准确性，本试验重复进行3次，使用同一只动物，3天抽血一次。

表12溶血反应的判断标准

结果：肉眼观察生理盐水管、鱼腥草蒸馏液管、各剂量HP-β-CD管在37℃孵育4h后，均未发生溶血，上清液基本为无色透明；而蒸馏水管和各剂量Tween80管均发生明显溶血，管内液体为澄明红色，个别管底有少许细胞碎片。试验重复三次，得到相同结果。三次测定的溶血度求均值，结果与肉眼观察相符。各组溶血情况见表13。

表13溶血情况统计

结论：0.5％～2.5％浓度的Tween80溶液均可以导致兔红细胞溶血，而相同浓度的HP-β-CD溶液则不会导致溶血，说明HP-β-CD的溶血性明显低于Tween80。

实验例4含新辅料(HP-β-CD)的新鱼腥草注射液比格犬过敏试验

本研究旨在采用Beagle犬全身主动过敏实验研究来评价不同给药剂量的新鱼腥草注射液(以HP-β-CD为增溶剂的新鱼腥草注射液的中试产品)的致敏性。

材料、药品、试剂、动物、器材

原鱼腥草注射液(YYI)：含0.5％Tween80，药厂提供的中试产品，生产批号：K080501；新鱼腥草注射液(XYI)：含0.4％HP-β-CD，不含ween80，生产批号为K080907，均由某制药集团提供；Tween80，英国Croda公司，注射级，生产批号：20060906。电脑微量注射泵AJ-5803型，上海安洁电子设备有限公司；IEC CL31R离心机，美国Thermo FisherScientific公司；OMRON电子体温计MC-141W型号，由大连欧姆龙有限公司生产；全自动酶标仪，THERMO MULTISKAN MK3，美国热电公司。犬组胺(His)ELISA试剂盒，96T批号为12120811；犬IgE ELISA试剂盒，96T批号为12120952，购自SUNBIO公司，美国RB(Rapidbio)分装。Beagle犬48只，体重10～14kg，雌雄兼有，由军事医学科学院动物实验中心提供，实验动物许可证：SCXK(军)2007-004。实验环境室温度10～16℃，相对湿度为50～60％。

分组及给药剂量

将Beagle犬18只按体重随机分为6组(每组3只，雌雄兼有)，分别为：生理盐水对照组、1％Tween-80组、原鱼腥草注射液组(YYI组)、新鱼腥草注射液高剂量组(XYI-H组)，新鱼腥草注射液中剂量组(XYI-M组)，新鱼腥草注射液低剂量组(XYI-L组)。给药剂量如表14所示。

表14各组Beagle犬过敏试验及类过敏实验分组及给药剂量表

注：致敏阶段给药量：原鱼腥草注射液和新鱼腥草注射液低剂量组用量相当于临床成人用药量的3.5倍；新鱼腥草注射液中剂量组用量相当于临床成人用药量的7倍；新鱼腥草注射液高剂量组用量相当于临床成人用药量的14倍。

类过敏试验方法

给药前观察各组犬眼睑、嘴、颈、腹部、四肢皮肤等情况，以及行为表现、步态、机体协调能力。把Beagle犬固定于控制架上，前肢静脉恒速(5ml·min^-1)注射给药(无菌操作)其中NS对照组、1％Tween80组、YYI组和XYI-L组给药剂量5.0ml·kg^-1，XYI-M组给药剂量是10.0ml·kg^-1，XYI-H组给药剂量为20.0ml·kg^-1。观察给药中和药后15min内各每组犬的行为学变化，并记录症状出现时间，消失时间，根据症状的轻重评分。给药前、后10min抽取静脉血，双抗夹心ELISA法检测His和IgE含量，并测量肛温。

若实验过程中出现动物死亡，则立即进行解剖，肉眼观察各主要脏器有无明显异常，并对心、肝、脾、肺、肾、胸腺等重要器官进行病理学检查。

过敏试验方法

按无菌操作和致敏剂量，隔日每组犬静脉恒速给予相应的受试药液，共致敏3次，给药剂量同类过敏试验。于首次注射后的第14d，各组犬加倍用量激发给药，观察注射后动物有无烦躁不安、瘙痒、皮肤潮红、眼内巩膜充血、痉挛、抽搐、大小便失禁、精神萎靡不振、休克，甚至死亡等过敏反应症状。观测指标同类过敏试验，并对实验结果进行评价。

数据处理

过敏反应评价方法：按表15、16要求计算动物过敏反应级数；血液组胺和IgE含量数据用x±s表示，各组之间的比较采用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法。P＜0.05为有统计学意义。

表15犬行为异常评级标准

表16类过敏反应和过敏反应判定标准

类过敏试验结果

行为学评分：首次给药后，Tween80组及含有Tween80的原鱼腥草注射液组Beagle犬在给药后3～5min均出现烦躁，口唇、耳根发红，巩膜充血，呼吸喘促，流涎、瘙抓不停、大便失禁、肛温明显上升等症状。含HP-β-CD的新鱼腥草注射液各剂量组动物均无明显异常表现。根据各组行为异常表现，评分见下表17。

表17新、老鱼腥草注射液的Beagle犬类过敏试验中行为异常比较(n＝3)

血浆中His和IgE含量：Tween80组及含有Tween80的原鱼腥草注射液组动物药后血浆组胺的含量均显著升高，IgE也有上升趋势；而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液高、中、低剂量组动物药后血浆组胺和IgE的含量均无明显升高。结果如表18、19所示。

表18新、老鱼腥草注射液的Beagle犬类过敏试验血液组胺含量比较(x±s，n＝3)

注：与生理盐水对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

表19新、老鱼腥草注射液的Beagle犬类过敏试验血液IgE含量比较(x±s，n＝3)

类过敏反应综合判定结果：首次给药后Tween80及含Tween80的原鱼腥草注射液组Beagle犬出现明显的行为异常、肛温升高及血液组胺的升高，血液IgE含量也呈上升趋势，根据表16的判定标准，属于类过敏强阳性反应。而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液高、中、低剂量组的犬均未出现明显行为异常，血液组胺和IgE含量均无明显升高，根据表16的判定标准，属于类过敏阴性反应。判定结果见表20。

表20新、老鱼腥草注射液对Beagle犬类过敏反应综合判断的比较(x±s，n＝3)

注：与生理盐水组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

过敏实验

给药前后犬行为学变化

激发给药后，Tween80及含有Tween80的原鱼腥草注射液组Beagle犬均发生明显行为异常，为强阳性反应；而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液高、中、低剂量组动物均未发生明显行为异常。结果见下表21。

表21新、老鱼腥草注射液的Beagle犬过敏试验中行为异常比较(n＝3)

各组Beagle犬血浆中His、IgE含量

激发给药后，Tween80及含有Tween80的原鱼腥草注射液组血液中组胺和IgE含量显著升高；而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液高、中、低剂量组血液中组胺和IgE含量均未见明显升高。结果见表22、43所示。

表22新、老鱼腥草注射液的Beagle犬过敏试验血液组胺含量比较(x±s，n＝3)

注：与生理盐水组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

表23新、老鱼腥草注射液的Beagle犬过敏试验血液IgE含量比较(x±s，n＝3)

注：与生理盐水组比较，**p＜0.01。

过敏反应综合判定结果

激发给药后Tween80及含有Tween80的原鱼腥草注射液组的Beagle犬均出现明显的行为异常、血液组胺和IgE含量的显著升高；而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液高、中、低剂量组未见明显行为异常，亦未见血液组胺和IgE含量明显升高。综上判定：Tween80及含有Tween80的原鱼腥草注射液引发了过敏强阳性反应；而含HP-β-CD的新鱼腥草注射液无明显的过敏反应。结果见表24。

表24新、老鱼腥草注射液对Beagle犬过敏反应综合判断的比较(x±s，n＝3)

注：与生理盐水对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。

结论

Tween-80及含有Tween-80的原鱼腥草注射液具有明显的类过敏及过敏反应，主要表现是给药后出现严重的行为异常及血液组胺及IgE水平的升高；含有HP-β-CD的新鱼腥草注射液则未见明显类过敏和过敏反应，安全性明显提高。

实验例5增溶剂种类的筛选：

目前用作中药注射剂增溶剂的辅料有吐温-80、丙二醇、聚乙二醇400、羟丙基-β-环糊精、泊洛沙姆等，对上述增溶剂进行筛选，在原提取工艺不变的基础上，将重蒸馏液分成五分，分别加入上述增溶剂进行试验，设计5个处方，考察其溶解情况、含量，确定增溶剂。再进行增溶剂用量的考察。考察其溶解情况、含量，确定增溶剂。设计的5个处方见表25，考察结果见表26。

表25设计的5个处方

考察指标：

性状：由于原鱼腥草芳香水有乳光，故观察辅料对其溶解情况，是否澄清透明，溶解性最好者为佳。

含量测定：考察增溶前后甲基正壬酮含量变化。

可见异物检查法：照可见异物检查法(中国药典2005年版一部附录XI C检查)。

表26增溶剂种类的筛选的考察结果

注：鱼腥草重蒸馏液甲基正壬酮含量为25.36ug/ml。

结果：从上述结果来看，增溶效果从大到小顺序为：吐温-80，羟丙基-β-环糊精，泊洛沙姆，聚乙二醇400，丙二醇。除吐温-80外，羟丙基-β-环糊精增溶效果较号，故选择羟丙基-β-环糊精作为增溶剂。

实验例6增溶剂用量的考察：

将重蒸馏液分成五份，分别加入0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％羟丙基-β-环糊精作增溶剂进行试验，考察其溶解情况、pH值、含量及稳定性，确定羟丙基-β-环糊精的用量。设计的5个处方见表27，考察结果见表28。

表27设计的5个处方

表28增溶剂用量的考察结果

结果：上表结果表明，羟丙基-β-环糊精的用量增加，增溶效果也增加，当羟丙基-β-环糊精用量大于0.4％后，增溶效果不再增加，故羟丙基-β-环糊精用量定为0.4％。

实验例7稳定性考察

取按确定的处方工艺制备一批样品，按稳定性考察要求进行影响因素考察，分别置于强光(4700Lx)、高温(60℃)、低温(4℃)条件下放置10天，并于5、10天分别取样，考察样品的性状、含量、可见异物、PH值变化情况，并与0天样品的数据比较，结果见表29。

表29影响因素考察结果

结果：稳定性影响因素考察结果表明，本品在强光(4700Lx)、高温(60℃)、低温(4℃)条件下，质量稳定。

具体实施方式

实施例1：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入4g羟丙基-β-环糊精及7g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

实施例2：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草5000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液5000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2500ml，加入12g羟丙基-β-环糊精及17.5g氯化钠，混匀，加注射用水使成2500ml，滤过，灌封，灭菌即得。

实施例3：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入10g羟丙基-β-环糊精及7g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

实施例4：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草4000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液4000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2000ml，加入30g羟丙基-β-环糊精及14g氯化钠，混匀，加注射用水使成2000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

实施例5：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草4000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液4000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2000ml，加入8g羟丙基-β-环糊精及14g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。

实施例6：含β-环糊精衍生物的鱼腥草注射液的制备方法

取鲜鱼腥草4000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液4000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液2000ml，加入30g羟丙基-β-环糊精及14g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。

Claims (16)

1、一种鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鱼腥草进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加适量羟丙基-β-环糊精及适量渗透压调节剂，按常规方法制成注射剂。

2、如权利要求1所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鲜鱼腥草进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加入4-25g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，按常规方法制成注射剂。

3、如权利要求2所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法中每1000ml重蒸馏液加入羟丙基-β-环糊精的量是5g、10g、15g或20g。

4、如权利要求1、2或3所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法中注射剂是指注射液或冻干粉针。

5、如权利要求1、2或3所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入4g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

6、如权利要求1、2或3所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入5g、10g、15g或20g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

7、如权利要求4所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入4g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。

8、如权利要求4所述的鱼腥草注射剂的制备方法，其特征在于该方法为：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入5g、10g、15g或20g羟丙基-β-环糊精及7g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。

9、一种鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鱼腥草进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加适量羟丙基-β-环糊精及适量渗透压调节剂，按常规方法制成注射剂。

10、如权利要求9所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液，每1000ml重蒸馏液加入4-25g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，按常规方法制成注射剂。

11、如权利要求10所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该方法中每1000ml重蒸馏液加入羟丙基-β-环糊精的量是5g、10g、15g或20g。

12、如权利要求9、10或11所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该方法中注射剂是指注射液或冻干粉针。

13、如权利要求9、10或11所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入4g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

14、如权利要求9、10或11所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入5g、10g、15g或20g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，加注射用水使成1000ml，滤过，灌封，灭菌即得。

15、如权利要求12所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入4g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。

16、如权利要求12所述的鱼腥草注射剂，其特征在于该注射剂由如下方法制成：取鲜鱼腥草2000g进行水蒸汽蒸馏，收集初馏液2000ml，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液1000ml，加入5g、10g、15g或20g羟丙基-β-环糊精及7g-9g氯化钠，混匀，常规方法制成冻干粉针剂。