CN101611152B - 用于调控set的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于通过使SET与结合剂(诸如ApoE肽衍生物)接触来调控SET活性的方法。在本发明的一个实施方案中，给患者施用能够调控SET活性的药用组合物以治疗炎性或神经学疾患。在本发明的另一个实施方案中，通过筛选能够竞争或抑制ApoE衍生物对SET的结合的结合剂来鉴定有效用于治疗炎性和神经学疾患的化合物。

Description

用于调控SET的方法及其用途

交叉引用的相关申请

本申请要求2006年12月21日提交的美国临时申请流水号60/876,153和2007年7月11日提交的美国临时申请流水号60/929,750的优先权，本文通过提及而将它们完整收录。

发明领域

本发明提供了用于通过使SET与结合剂接触来调控SET活性的方法。在一个实施方案中，结合剂是ApoE肽衍生物。本发明提供了用于通过调控SET来治疗炎性和神经学疾患(neurological condition)的方法。本发明还提供了用于鉴定有效用于治疗炎性和神经学疾患的化合物的方法。

序列表

本文通过提及而完整收录依据37C.F.R.§1.821(c)和1.821(e)的、本文在光盘上所提交的序列列表。

发明背景

SET(也称为蛋白质磷酸酶2A抑制剂2蛋白(I₂ ^PP2A)、推定的HLA-DR相关蛋白II(PHAPII)、粒酶A抑制剂活化的蛋白II(IGAAD)和模板活化因子(TAF1β))首次记载为患有急性未分化性白血病(acute undifferentiatedleukemia)的患者中的SET-CAN融合基因的一部分，这显然是由于基因易位(Von Lindern等，1992，Mol.Cell.Biol.12：3346-3355)所造成的。后来，SET已经被表征为一种多功能性蛋白质，其保护组蛋白免于受到组蛋白乙酰基转移酶的乙酰化，调控HuR mRNA结合，经由对p21CIP1的结合来调控G2/M转换，并起到用于P450c17活化的转录因子的作用(Seo等，2001，Cell.104：119-130；Brennan等，2000，J.Cell Biol.151：1-14；Canela等，2003，J.Biol.Chem.278：1158-1164；Compagnone等，2000，Mol.Endocrinol.14：875-888)。

新近，已经有提示SET在阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)和其它神经变性性疾病(degenerative disease)中起作用(Madeira等，2005，FASEB J.19：1905-1907；Tsujio等，2005，FEBS Letters.579：363-372)。此SET活性的证据包括AD患者的海马中SET表达升高的发现，所述SET表达升高与神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle)正相关而与迷你精神状态测验(Mini-Mental StatusExam)负相关(Blalock等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：2173-2178)。还已经发现SET在由淀粉样前体蛋白(APP)(AD患者的脑中所看到的蛋白质)的促凋亡域诱导的细胞死亡的调控中起重要的作用(Madeira等，2005，FASEBJ.19：1905-1907)。在过表达时，APP中称为“Jcasp”的短的胞质域活化胱天蛋白酶-3，并诱导神经元死亡。SET特异性结合Jcasp，并且SET的下调减少Jcasp诱导的细胞死亡。反之，SET功能获得增加细胞死亡。

虽然仍需要进行许多工作来阐明SET在神经学疾病(neurological disease)中的作用，但是已经发现SET是蛋白质磷酸酶2A(PP2A)(不同细胞过程的调控中牵涉的磷酸酶)的有效抑制剂(Li等，1996，J.Biol.Chem.271：11，059-11，062)。SET对PP2A的抑制表现为底物特异的。已经证实，SET抑制使用磷酸化髓磷脂碱性蛋白作为底物时的PP2A，但是不抑制使用磷酸化酪蛋白作为底物时的PP2A活性(Guo等1995，Biochemistry，34，1988)。PP2A表现为通过磷酸化而灭活，并且通过其C亚基的甲基化而活化(Chen等，1992，Science.257，1261-1264；Guo和Damuni，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2500-2504；Favre等，1994，J.Biol.Chem.269：16311-16317)。

PP2A在体外使tau和MAP2脱去磷酸(Yamamoto等，1988，J.Neurochem.50：1614-1623)。Tau蛋白属于微管相关蛋白家族。它们主要在神经元中表达，在那里它们在微管蛋白单体装配成微管中起重要作用，并且稳定神经元微管网络。微管牵涉维持细胞形状，并充当轴突运输的轨道。Tau蛋白还在微管和其它细胞骨架元件或蛋白质之间建立一些连接。它们的表达在发育过程中受到可变剪接机制调节，而且6种不同同等型存在于成人脑中。此外，tau蛋白是阿耳茨海默氏病和许多称为tau病(tauopathy)的神经变性性病症中所述的神经元内的和胶质细胞原纤维损害的主要要素。分子分析已经揭示，tau的异常磷酸化可能是导致其与微管的脱离，聚集成丝状结构和/或丝状结构的稳定化的过程中的重要事件之一，所述丝状结构包含成对的螺旋丝和/或神经原纤维缠结(Buee等，2000，Brain Res.Re v.33：95-130)。

据信PP2A的活性在阿耳茨海默氏病脑中受到损害。在AD脑中，已经推测PP2A缺乏容许tau的过度磷酸化，导致神经原纤维缠结形成和神经元变性。支持此假设的证据包括如下发现，即用冈田酸对在代谢方面有活性的大鼠脑切片的体外处理导致PP2A活性的抑制和tau的异常过度磷酸化，导致tau丧失结合微管的能力(Gong等，1995，J.Neurochem.65：732-738)。如上文所述，相对于正常人，阿耳茨海默氏患者的海马中过表达SET。所观察到的体内过表达会导致PP2A的抑制(以与冈田酸类似的方式)，而且预期会导致过度磷酸化的tau和神经原纤维缠结形成。还已经有报道，由PP2A识别的位点处的磷酸化对于β-分泌酶向细胞表面的运输是需要的，在细胞表面上其在对淀粉样前体蛋白(APP)的切割中是有活性的(Walter等2001，J Biol Chem.276，14634)。β-分泌酶对APP的切割启动导致淀粉样-β(Aβ)蛋白的生成的蛋白水解途径。此外，如上文所述，PP2A的甲基化对于完全的活性是需要的。用S-腺苷高半胱氨酸进行的处理导致PP2A的甲基化减少，降低PP2A活性，并且已经显示出导致Aβ的生成增加，这是由于导致β切割的对可溶性APP的磷酸化的增加(Sontag等，2007，J.Neurosci.27：2751-2759)。因此，PP2A的活化可通过阻止分泌酶向表面的运输或通过减少朝向Aβ形成所需要的β切割的靶向APP的磷酸化来降低阿耳茨海默氏患者脑中的Aβ水平。

还已经显示，PP2A与传播炎性信号传导过程的信号转导级联中牵涉的许多蛋白质相互作用，并使这些蛋白质脱去磷酸。一种此类蛋白质是NFκB激酶的抑制剂(IκK)。IκK通过磷酸化而活化，继而使NFκB的抑制剂(IκB)磷酸化(Hong等2007J.Biol.Chem.)。IκB的磷酸化导致核因子κB(NFκB)从非活性IκB:NFκB复合物的释放和IκB的降解。这让NFκB游离，以便变为磷酸化的，并移位至细胞核，在那里其起控制促炎性细胞因子的基因表达的转录因子的作用。还已经显示，抗原呈递的过程(对于先天免疫和自身免疫病症是不可或缺的过程)中需要NFκB的活化(Yoshimura等Scan.J.Immunol.58，165)。

还已经有报道，PP2A结合p38促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)，并使其脱去磷酸，如此使其失活(Sundaresan和Farndale 2002FEBS Letters 528，139)。p38和其它MAPK的活化对于促炎性细胞因子的生成和T细胞增殖是需要的。炎性信号传导中牵涉的可由PP2A脱去磷酸的另一种蛋白质是IL-1β受体相关激酶(IRAK)。IRAK在白介素信号传导和源于Toll样受体家族蛋白的信号传导级联中是不可或缺的。

载脂蛋白E(ApoE)是已经显示在神经学疾病中起重要的作用而且具有免疫调节性质的另一种蛋白质。已经证实ApoE在体外具有免疫调节效应，包括促有丝分裂冲击后对淋巴细胞增殖和免疫球蛋白合成的抑制。周围神经损伤(peripheral nerve injury)后由巨噬细胞大量分泌ApoE，而在CNS损伤后由小神经胶质细胞，星形胶质细胞和少突胶质细胞(神经胶质细胞)大量分泌ApoE。

已发现人ApoE有三种主要的同等型：ApoE2、ApoE3和ApoE4；这些同等型的不同之处在于第112位和第158位的氨基酸替代。最常见的同等型是ApoE3，其含有残基112处的半胱氨酸和残基158处的精氨酸；ApoE2是最不常见的同等型，并且含有残基112和158处的半胱氨酸；ApoE4含有残基112和158处的精氨酸。人ApoE的别的罕见的序列突变是已知的(参见例如Weisgraber，1994，Advances in Protein Chemistry 45：249，268-269)。

已经观察到，ApoE影响晚发性和家族性AD的形成。此效应是强烈的(robust)和剂量依赖性的，这样使得相对于在最常见的APOE3/3基因型上纯合的患者，APOE4/4基因型的纯合个体具有增加约20倍的形成AD的风险，而具有APOE3/4基因型的杂合个体具有增加4倍的风险(Strittmatter等，1993；Corder等，1993；reviewed by Laskowitz等，1998a)。此观察已经导致对ApoE在哺乳动物中枢神经系统(CNS)中的功能的兴趣的再起。由于其与AD的关联，多个实验室已经检查了ApoE与据信对AD发病机制起特定作用的蛋白质之间的相互作用。此外，数个实验室已经描述了ApoE和Aβ或ApoE和tau之间的同等型特异性相互作用(Strittmatter等1994；Gallo等1994；Fleming等1996；reviewed by Laskowitz等，1998a)。然而，ApoE在CNS中的作用仍然不明确，而且不清楚这些相互作用中的哪一些或哪一个在人神经变性性疾病中是相关的。

先前已经发现，某些ApoE肽衍生物对于治疗炎症和神经学病症包括创伤性脑损伤(traumatic brain injury)(TBI)是有用的。在这点上，2002年9月23日提交的美国申请No.10/252,120(本文通过提及而将其完整收录)披露了使用ApoE类似物(包括COG 133)来治疗或改善脑缺血(脑缺血)或脑炎症(cerebral inflammation)的神经学效应的方法。COG 133是由ApoE蛋白质的残基133-149组成的小肽。2004年9月2日提交的美国申请No.60/606,506和2004年9月9日提交的美国申请No.60/608,148(本文通过提及而将它们完整收录)披露了COG 133、COG 1410和其它ApoE衍生物用于治疗创伤性脑损伤和牵涉炎症的疾病的用途。COG 1410是COG 133的突变衍生物，其与COG 133相比展现出治疗窗的4倍增益和治疗指数的7.4倍增益。

尽管目前努力阐明SET在神经学疾病中的作用，但是先前尚未有鉴定出的SET和ApoE之间的联系。本发明令人惊讶地发现了COG 133和其它ApoE衍生物肽结合SET蛋白，并调控其活性。如此，本发明提供了通过使用外源剂(诸如ApoE衍生物)来阻断SET结合PP2A从而调控PP2A活性的新方法。本发明还提供了调控SET的其它活性(包括Cdk5活性增强和Jcasp诱导的神经元凋亡增加)的方法，这通过干扰SET结合那些相应的靶物实现。此类新方法可用于治疗神经学疾病、炎性疾病和其它疾病，以及根据在神经学疾病、炎性疾病和其它疾病的治疗中的功效筛选对药物候选物。

发明概述

本发明提供了一种调控SET活性的方法，其包括使SET或SET变体与能够结合SET或SET变体的外源药剂接触。根据SET的活性，可通过用依照本发明的药剂结合SET来提高或降低SET的活性。例如，通过与本发明的药剂接触进行的SET调控可引起p38MAP激酶的磷酸化的减少、LPS诱导的氧化氮的减少、PP2A磷酸酶活性的提高或降低、Jcasp诱导的细胞死亡的减少和/或神经元细胞死亡的减少。用本发明的药剂结合SET还可导致对异常的tau过度磷酸化的抑制、白血病表型的回复突变、对抗原呈递的抑制或对T-细胞增殖的抑制。

本发明的药剂可以是肽，诸如ApoE类似物。在本发明的一个实施方案中，所述药剂是COG 133(SEQ ID NO：1)。在另一个实施方案中，所述药剂是COG 133衍生物诸如COG 1410(SEQ ID NO：2)，其为治疗提供更长的治疗窗(therapeutic window)、增强的功效、改善的血脑屏障运输和/或更大的治疗指数。在本发明中有用的其它ApoE类似物记载于美国专利No.60/606,506和60/608,148，本文通过提及而将它们完整收录。

在一个实施方案中，ApoE类似物可含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或美国申请No.60/606,506和60/608,148中所述的在N端或C端或N端和C端两者处连接有1至5个额外的氨基酸或氨基酸类似物的任何衍生物，其中此类额外的氨基酸对所述肽调控SET活性的能力没有不利的影响。包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的药剂肽或其它ApoE衍生的肽可包含12个或更多个氨基酸，13个或更多个氨基酸，17个或更多个氨基酸，18个或更多个氨基酸，20个或更多个氨基酸，30个或更多个氨基酸或40个或更多个氨基酸。在一个实施方案中，所述药剂肽基本上由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2组成。

本发明包括与包含COG 133(SEQ ID NO：1)的序列的肽竞争对SET的结合的药剂。此类药剂包括但不限于蛋白质、其它肽、小分子、抗体和抗体衍生物。例如，包含COG 1410(SEQ ID NO：2)或COG 112(与触角足(antennapedia)相关联的COG 133)的肽可与COG 133竞争对SET的结合。在一个实施方案中，所述药剂抑制COG 133肽对SET的结合。

本发明的方法包括给受试者施用能够调控SET的药剂以治疗炎性、神经学或白血病疾患。可给诊断患有炎性、神经学或白血病疾患的患者施用含有有效量的药剂的药用组合物以治疗多种神经学疾病、炎性疾病或癌性疾病。在本发明的一个实施方案中，对患者治疗与小神经胶质活化(microglialactivation)、神经胶质活化(glial activation)或神经元细胞死亡的增加有关的神经学疾患，其中能够修饰SET的药剂的施用减少神经胶质活化、减少小神经胶质活化、减少tau过度磷酸化、和/或减少神经元细胞死亡。

本发明还包括一种修饰结合SET并调控SET活性的药剂的方法。依照此方法，使SET与至少一种测试药剂接触以鉴定结合SET的一种或多种药剂。根据竞争或抑制包含SEQ ID NO：1的ApoE肽或其它ApoE衍生物对SET的结合的能力进行筛选以对一种或多种药剂鉴定。所述筛选可通过本领域中已知的方法来进行，包括但不限于噬菌体展示、酵母展示或使用配体替换测定法的小分子文库。熟练技术人员可理解的是，此方法可用于筛选针对本文所述任何炎性疾患、神经学疾患和/或其它疾患的药物候选物。

附图简述

图1是考马斯凝胶，其中2个条带与SET相关。

图2是用抗SET抗体探查的Western印迹。

图3是显示在有和没有针对SET的siRNA的两种情况中用COG 133、LPS和LPS+COG 133处理的BV2细胞中所生成的氧化氮量的图形。

图4是指示在存在SET siRNA的情况中所生成的SET量的凝胶图像。

图5是显示在有和没有针对SET的siRNA的两种情况中用COG 133、LPS和LPS+COG 133处理的人THP1细胞中所生成的TNFα量的图形。

图6是通过结合生物素化的-COG 133而分离的人脑SET蛋白的Western印迹。

图7是显示生物素化的COG 133对人脑SET蛋白的结合受到COG 1410或COG 112阻断的Western印迹。

图8是用COG112处理的细胞中的PP2A酶促活性的图形。

图9描绘了COG 133对LPS诱导的p38MAP激酶活化的影响。小图A是来自单独地或在存在COG 133的情况中用LPS处理的小神经胶质细胞的磷酸p38MAPK(phospho p38MAPK)及其上游活化激酶MKK3/6的代表性Western印迹。小图B显示了与小图A中所显示的类似的Western印迹的密度测定法分析。将磷酸p38MAPK信号标准化至针对GAPDH蛋白的信号。

图10显示了COG 133对LPS诱导的c-Jun N端激酶(JNK)(A)、胞外调节型激酶(ERK)1/2(B)和IκBa(C)的磷酸化的抑制。小图D描绘了用COG 133处理的细胞中核NFκB的减少。

图11.(A)小鼠皮质中冈田酸(OA)诱导的Tau磷酸化和(B)通过COG1410的处理引起的磷酸Tau减少。星号指示p＜0.05。

图12.将小鼠脑溶胞产物与50μM每种指示的肽一起温育。随后自1mg经肽处理的溶胞产物免疫沉淀出P35。进行Western印迹以测量SET蛋白的共沉淀(左侧小图)。密度测定法分析(右侧小图)显示了COG 112和COG 1410降低与P35结合的SET的量。COG 056(其是COG 133的反向序列，并且没有生物学活性)对SET结合P35没有影响。将来自SET的信号标准化至针对P35蛋白的信号。使用COG 133的结果没有显示，并且是非结论性的，这可能是由于不相等的蛋白质加载。

图13.将人脑溶胞产物与50μM每种指示的肽一起温育。随后自1mg经肽处理的溶胞产物免疫沉淀出P35。进行Western印迹以测量SET蛋白的共沉淀(左侧小图)。密度测定法分析(右侧小图)显示了COG133、COG 112和COG1410降低与P35结合的SET的量。COG 056(其是COG 133的反向序列，并且没有生物学活性)对SET结合P35没有影响。将来自SET的信号标准化至针对P35蛋白的信号。

发明详述

本发明的发明人在本文中证实可通过使SET与外源剂接触来调控SET的活性。令人惊讶的是，发明人已经发现了可使用ApoE类似物和与此类类似物竞争SET结合的药剂来调控SET的活性。

SET和ApoE在许多与疾病有关的生物学过程中是有活性的。如本文中所示，ApoE衍生物能够调控SET活性。如此，本发明的发明人提出可使用本文所述调控SET的方法来治疗先前仅与ApoE有关的病症。如此，经由与至少一种药剂(诸如ApoE衍生物或其它SET结合剂)接触来调控SET的能力呈现一种用于治疗患有广泛的疾病(包括炎性和神经学疾患)的患者的途径。

在用于本文时，“调控”指在体外或在体内观察到的SET活性变化，包括SET活性的提高或降低。如先前所讨论的，怀疑SET涉及与疾病有关的多个生物学过程。例如，已经将SET活性与疾病(诸如髓细胞性白血病(myeloidleukemia)、阿耳茨海默氏病和与诱导神经元细胞死亡有关的疾病)联系起来。已知的SET生物学活性和SET相关的过程包括但不限于对蛋白质磷酸酶2A活性(细胞周期行进和tau脱磷酸中牵涉的磷酸酶)的抑制、经由SET与p35(细胞周期调控、tau磷酸化和神经丝磷酸化中牵涉的激酶)的结合而增强cdk5/p35活性、AP-1和c-Jun转录活性的提高、与APP的Jcasp域相互作用以调控细胞死亡、对由组蛋白乙酰基转移酶进行的组蛋白乙酰化的抑制、HuRmRNA结合的调控、经由结合p21CIP1而调节G2/M转换、P450c17的活化和对早老蛋白同系物表达的阻抑。外源药剂对SET的调控还可导致SET诱导的神经元细胞死亡的减少。本发明的发明人已经将别的活性与SET联系起来，诸如调节p38MAP激酶的磷酸化和调控氧化氮(LPS诱导的氧化氮和聚肌胞苷酸诱导的氧化氮)。在本发明的一个实施方案中，外源药剂对SET的调控导致p38MAP激酶、ERK、JNK、和/或NF-κB的磷酸化的降低，即活化降低；和/或LPS诱导的氧化氮的减少。此外，SET表现出在经由对PP2A活性的抑制而实现的tau磷酸化中起作用。

SET的活性可以或是直接活性或是间接活性。SET的直接活性在SET与分子直接相互作用时发生，并能够经由所述相互作用来影响所述分子的活性。SET的间接活性在分子受SET影响时发生，虽然所述分子不直接与SET相互作用。例如，磷酸化级联(诸如p38MAP激酶级联)中的下游分子可受到SET间接影响，因为SET活性牵涉所述级联中的上游蛋白质。

在用于本文时，“能够结合”指药剂在开始与SET接触后与SET相互作用的能力。结合可通过本领域中已知的方法来证实，包括实施例部分中所讨论的IP-Western印迹和其它基于杂交的测定法的应用。可通过本领域中已知的方法来对潜在药剂的文库筛选结合SET的能力，包括但不限于噬菌体展示、酵母展示、肽展示(诸如PIN技术)、抗体展示等。药剂抑制肽对SET的结合的能力同样可通过本领域中已知的方法来测定，诸如竞争性结合测定法、荧光偏振等。

在用于本文时，“药剂”指能够结合SET并调控至少一种SET活性的任何物质。药剂包括但不限于核酸分子、肽、融合蛋白、单克隆或多克隆抗体或其片段或化学实体。“外源的”指非体内天然存在的任何物质。例如，美国专利申请10/252,120，11/091,336，60/606,506和60,606,507(本文通过提及而将它们完整收录)中所披露的ApoE类似物是外源剂。

在本发明的一个实施方案中，结合SET的药剂是ApoE类似物。例如，所述药剂可以是COG 133(由ApoE的残基133-149组成的截短的肽)的类似物和衍生物。这种截短的ApoE肽(称为COG 133(LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ.ID.NO.1)))先前已经证明在治疗或减少脑缺血或脑炎症中有用。参见2002年9月23日提交的美国申请No.10/252,120，本文通过提及而将其完整收录。先前创建了大量的ApoE 130-150肽的类似物，并在基于细胞的测定法中(针对阻抑炎性细胞因子和自由基的释放)和受体结合测定法中测试它们的活性。Lynch等，2003，J.Biol.Chem.278(4)，48529-33和2002年9月23日提交的美国申请流水号10/252，120、2001年9月21日提交的09/957,909和1999年3月1日提交的09/260,430(现在被放弃)(其要求1998年3月11日提交的美国临时申请No.60,077,551的权益)，本文通过提及而将每篇完整收录本文。

在本发明的一个实施方案中，COG 133和其它ApoE肽模拟物的功效可通过与2005年9月2日提交的PCT申请PCT/US05/31431(其要求2004年9月2日提交的美国临时申请60/606,506、2004年9月9日提交的60/608,148、2004年9月2日提交的60/606,507的优先权，本文通过提及而将它们完整收录)中所述的蛋白质转导域(PTD)偶联而得到改善。PTD是短的碱性肽，其促进否则将不能或仅最低限度横越细胞膜的货物的细胞内投递。可使用PTD来增强化合物的CNS穿透。例如，可进行PTD的经验测试以鉴定能够运输货物越过血脑屏障的PTD。

COG 133的一些衍生物诸如COG 1410(Ac-AS-Aib-LRKL-Aib-KRLL-NH2(SEQ ID NO：2)能够为治疗和预防神经学和炎性疾病提供较宽的治疗窗。治疗窗指在神经学或炎性疾患发作后可有效施用本发明的化合物的时间期限。通过增加治疗窗，本发明的药剂可在疾患发作后以更大的时间间隔施用。

另外，诸如COG 1410等药剂具有增强的功效，而且展示出较大的治疗指数。在用于本文时，“治疗指数”指没有动物死亡的最高限度耐受剂量除以损伤后的表现显著好于盐水对照的最低限度有效剂量。

本发明的药剂还可为治疗和预防神经学疾患提供增加的CNS穿透或增加治疗窗。在用于本文时，“CNS穿透”指化合物(包括肽)越过血脑屏障并且进入中枢神经系统(CNS)的能力。

不限于任何理论，本发明的发明人有理由相信COG 133及其衍生物抑制SET抑制PP2A的能力，即COG 133是PP2A的活化剂。因而，在本发明的一个实施方案中，可使用与所披露的ApoE肽竞争SET结合的ApoE类似物或其它药剂来抑制SET抑制PP2A的能力。

本发明还包括加强SET结合PP2A而导致PP2A活性降低的药剂。因而，在本发明的一个实施方案中，可使用本发明的药剂来增强SET对PP2A的结合。

在另一个实施方案中，本发明为本文所述方法提供了化合物和用于鉴定该化合物的方法。一方面，本发明提供了是ApoE类似物的药剂。一方面，本发明提供了是α-螺旋肽的药剂。此类药剂可包括COG 133(序列LRVRLASHLRKLRKRLL的肽(SEQ.ID.NO.1))的类似物和衍生物。

本发明的药剂可通过本领域中已知的标准技术来生成。本发明的药剂可具有附着的供检测和示踪用的多种标记模块，诸如放射性标记物、重原子标记物和荧光标记物。荧光标记物包括但不限于萤光素、荧光素、曙红、AlexaFluor、俄勒冈绿(Oregon Green)、罗丹明绿、四甲基罗丹明、罗丹明红、德克萨斯红(Texas Red)、香豆素和NBD荧光团、QSY 7、Dabcyl和Dabsyl生色团、BODIPY、Cy.sup.5等。

在本发明的一个实施方案中，能够修饰SET的药剂是肽。本领域技术人员可容易地实现对本文所公开的肽药剂的修饰以增强与这些肽有关的功能活性。例如，本发明方法中所使用的肽可进行化学修饰或偶联至其它分子以增强诸如溶解度、血清稳定性等参数，同时保留功能活性。具体地，本发明的肽可在N端进行乙酰化和/或在C端进行酰胺化，或与增强血清稳定性的分子进行偶联、复合或融合，所述分子包括但不限于清蛋白、免疫球蛋白及其片段、转铁蛋白、脂蛋白、脂质体、α-2-巨球蛋白和α-1-糖蛋白、PEG和右旋糖苷。此类分子详细记载于US 6,762,169，本文通过提及而将其收录。

本发明的肽药剂的另一种变化是将1-15个氨基酸或类似物连接至治疗用的肽的N端或C端氨基酸。还可如下制备本发明的肽的类似物，即将1-15个额外的氨基酸添加至活性肽的N端、C端或N端和C端两者，其中此类氨基酸添加对所述肽在本发明的肽所结合的位点处结合受体的能力没有不利的影响。例如，可通过将1-15个额外的氨基酸添加至活性肽的N端、C端或N端和C端两者来创建COG 133和COG 1410变体。活性肽是能够结合SET并调控SET活性的任何肽。

本发明的肽药剂进一步包括本文所述肽的保守变体。在用于本文时，保守变体指未不利地影响肽的生物学功能的氨基酸序列变化。认为在如下情况中替代、插入或删除不利地影响肽，即改变后的序列阻止或破坏与所述肽有关的生物学功能时。例如，可在没有不利地影响生物学活性的情况中改变肽的总电荷、结构或疏水/亲水性质。因而，可在没有不利地影响肽的生物学活性的情况中改变氨基酸序列，例如以便使所述肽变得更疏水或更亲水。通常，肽的保守替代变体、类似物和衍生物会具有至少约55％、至少约65％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约96％至99％的与所公开的序列SEQ ID NO：1和2的氨基酸序列同一性。关于此类序列的同一性或同源性在本文中定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比同源性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端或内部的延伸、删除或插入肽序列不应当解释为影响同源性。

如此，本发明的肽药剂包括具有SEQ ID No.1或2中所公开的氨基酸序列的分子和与这些肽竞争SET结合的结合剂；其片段，它们具有治疗用肽的至少约3、4、5、6、10、15个或更多氨基酸残基的保守序列；此类肽的氨基酸序列变体，其中已经将氨基酸残基插入所公开的序列的N端或C端或插入所公开的序列内；和已经由另一种残基替换的所公开序列的氨基酸序列变体，或上文所限定的其片段。包含本发明肽序列的肽化合物可以在约15、20、25、30、35、40、45和50个氨基酸或更多个氨基酸。所涵盖的变体进一步包括那些含有预定突变(例如通过同源重组、定点或PCR诱变来实现)的变体和其它动物物种(包括但不限于兔、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人灵长类物种)的相应肽、和如下衍生物，其中所述肽已经通过用除天然存在氨基酸之外的模块(例如可检测的模块，诸如酶或放射性同位素)进行的替代、化学的、酶促的或其它合适的手段来共价修饰。

能够调控SET的药剂(包括但不限于COG 133及其衍生物)可以处于游离形式或盐形式，其中所述盐是药学可接受的。这些包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰等的无机盐。也可用有机酸来制备药剂的多种有机盐，所述有机酸包括但不限于乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。

在一个实施方案中，本发明的药剂与药学可接受载体联合使用。如此，本发明还提供了适于给受试者施用的药用组合物。此类组合物包含与药学可接受载体组合的有效量的本发明药剂。载体可以是液体，使得组合物适宜胃肠外施用，或可以是固体，即为口服而配制的片剂或丸剂。此外，载体可以处于可雾化的液体或固体形式以使得组合物适宜吸入。在胃肠外施用时，组合物应当是无热原的，而且在可接受的胃肠外载体中。或者，可使用已知的方法来配制活性剂，封装在脂质体中。另外，鼻内施用肽来治疗CNS疾患在本领域中是已知的(参见例如关于鼻内施用肽T来治疗AD的美国专利No.5,567,682，本文通过提及Pert而将其收录)。可使用本领域中已知的技术来实施供鼻内施用用的本发明药剂的制备。

本发明药剂的药用制品可任选地包括药学可接受的稀释剂或赋形剂。

本发明药剂的有效量是调控受试者中的SET活性的量。在一个实施方案中，药剂肽的有效量减少小神经胶质活化(与在没有所述药剂的情况中会发生的相比)；换言之，减少由小神经胶质细胞生成神经毒性和神经调制化合物(与在没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量。神经调制的指神经元功能非致死的变化。有效量(和施用方式)会根据个体基础进行确定，而且会基于所使用的特定药剂和对受试者的考虑(尺寸、年龄、一般健康)、所治疗的疾患(AD、急性颅脑损伤(acute head injury)、脑炎症等)、有待治疗的症状的严重程度、所寻求的结果、所使用的特定载体或药用配制剂、施用路径和本领域技术人员会显而易见的其它因素。本领域普通技术人员可使用本领域已知的技术来确定有效量。可体外测试、动物模型或本领域中已知的其它剂量-响应研究来确定本文所述药剂的治疗有效量。

如下实施施用本发明的肽药剂的备选方法，即给受试者施用携带编码肽的核酸序列的载体，其中所述载体能够进入身体的细胞(诸如脑细胞)以使得所述肽被表达和分泌。如此，肽药剂在脑中的表达使小神经胶质细胞可获得所述药剂。合适的载体通常是病毒载体，包括DNA病毒、RNA病毒和逆转录病毒。用于利用载体投递系统和实施基因疗法的技术是本领域中已知的。疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和慢病毒载体是可在施用本发明的化合物中所采用的特定类型的载体。

本发明的药剂可单独使用以调控SET的活性或与具有据信与SET调控不相关的作用机制的其它治疗剂联用，诸如例如氧自由基清除剂(诸如超氧化物歧化酶(SOD))或抗炎剂(诸如皮质类固醇、氢化可的松(hydrocortisone)、泼尼松(prednisone)等；止泻剂(诸如洛哌丁胺(loperamide)等)、抗细菌剂(诸如青霉素、头孢菌素、杆菌肽等)；抗寄生虫剂(诸如奎纳克林(quinacrine)、氯喹等)；抗真菌剂(诸如制霉菌素、庆大霉素等)；抗病毒剂(诸如阿昔洛维(acyclovir)、更昔洛维(gancyclovir)、利巴韦林(ribavirin)、干扰素等)；止痛剂(诸如水杨酸、对乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吗啡等)；局部麻醉药(诸如利多卡因(lidocaine)、布比卡因(bupivacaine)、苯佐卡因(benzocaine)等)；生长因子(诸如集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等)；抗组胺剂(诸如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorphencramine)等)；止恶心药物，营养添加剂(诸如亚叶酸(leukovorin)和其它类似的物质。

本发明方法的药剂还可与抗炎性细胞因子、生长因子或白细胞迁移抑制化合物联用。有用的细胞因子包括但不限于IL-4、IL-10、IL-11和IL-13，特别是IL-4和IL-10，已经它们抑制炎性细胞因子的生成，并涉及修复免疫系统。生长因子包括GM-CSF等。这些细胞因子和生长因子可以纯化的蛋白质(天然获得的或获自重组来源的)施用，或以表达这些肽(特别作为融合蛋白)的核酸的形式施用。

本发明的药剂可急性施用(即在导致炎性或神经学疾患的事件发作期间或之后不久)，或可预防地施用(例如预定的外科手术之前，或出现炎性和/或神经学迹象或症状之前)，或在变性性疾病(degenerative disease)的病程期间施用以降低或改善否则会发生的症状进展。施用的时间选择和间隔依照受试者的症状而有所变化，而且可在数小时、数天、数周或更长的时程里以数小时至数天的间隔施用，如本领域技术人员会确定的。

典型的日常方案可以是自每天约0.01μg/kg体重起，自每天约1mg/kg体重起，自每天约10mg/kg体重起，自每天约100mg/kg体重起，自每天约1,000mg/kg体重起。剂量可在每天约0.01μg/kg和约10mg/kg体重之间(这取决于所述药剂)，或在每天约1mg/kg和约10mg/kg体重之间。

在用于本文时，术语“向受试者的脑施用”指使用本领域中所知的向所治疗受试者的中枢神经系统组织(并且具体是脑)提供化合物的施用路径。

血脑屏障对物质从血流向CNS的多个区域中的被动扩散造成屏障。然而，已知某些药剂的主动运输以越过血脑屏障的任一方向发生。可有限地从血流进入脑的物质可直接注射入脑脊液中。还知道脑缺血和脑炎症改变血脑屏障，并导致对血流中的物质的通过增加。

药剂直接向脑的施用是本领域中已知的。鞘内注射直接向脑室和脊髓液施用药剂。可通过外科手术植入的输注泵可用于直接向脊髓液中提供药剂的持续施用。含有药用剂向脑脊髓液中注射(“脊柱注射(spinal injection)”)的腰椎穿刺是本领域中已知的，并适于本药剂的施用。

用于规避血脑屏障的基于药理学的规程也是本领域中已知的，包括亲水化合物转变成脂溶性药物。活性剂可封装在脂囊泡或脂质体中。

高渗物质的动脉内输注短暂打开血脑屏障并容许亲水药物通入脑中也是本领域中已知的。Kozarich等的美国专利No.5,686,416披露了受体介导的透化剂(permeabilizer)(RMP)肽与有待投递至脑间质液区室的化合物的共同施用，以引起血脑屏障的通透性增加，并招致所述化合物向脑的投递增加。

运输活性剂越过血脑屏障的一种方法是将活性剂连接或偶联至第二分子(“载体”)，其是针对其穿透血脑屏障和运输活性剂越过血脑屏障的能力而进行选择的肽或非蛋白质性质的模块。可使用此方法，只要第二药剂不干涉所述药剂对SET的结合。合适载体的例子包括吡啶盐、脂肪酸、肌醇、胆固醇，和葡萄糖衍生物，还添加维生素C。载体可以是经由脑内皮细胞中的特定运输系统而进入脑的化合物。适宜通过穿过血脑屏障的受体介导的胞转作用而投递神经药用剂至脑中的嵌合肽披露于美国专利No.4,902,505(Pardridge等)中。这些嵌合肽包含与能够通过胞转作用而越过血脑屏障的可运输肽偶联的药用剂。由Pardridge等所披露的特定的可运输肽包括组蛋白、胰岛素、转铁蛋白等。化合物与载体分子的偶联物(以越过血脑屏障)也披露于美国专利No.5,604,198中。所披露的特定载体分子包括血红蛋白、溶菌酶、细胞色素c、血浆铜蓝蛋白、钙调蛋白、泛蛋白和物质P。还可参见美国专利No.5,017,566，本文通过提及而将其完整收录。

本发明还提供了通过给诊断患有炎性疾患、神经学疾患或其它疾患的哺乳动物受试者施用上文所述能够调控SET的药剂来进行治疗的方法。例如，可使用本发明的化合物来治疗如下疾病，其包括但不限于多发性硬化(multiple sclerosis)、白血病(leukemia)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、银屑病(psoriasis)、脊髓发育不良综合征(myelodysplastic syndrome)、结节性硬化症(tuberous sclerosis)、血管炎(vasculitis)、急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminated encephalomyelitis)、格-巴二氏综合征(Guillain-Barre syndrome)或脓毒病(sepsis)、急性CNS损伤(acute CNS injury)诸如创伤性脑损伤(traumatic brain injury)、中风(stroke)、闭合性头部损伤(closed head injury)、全脑缺血(global cerebral ischemia)、脑水肿(cerebral edema)、病灶性缺血(focalischemia)、蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage)或颅内出血(intracranialhemorrhage)，或慢性神经学疾病(chronic neurological disease)诸如阿耳茨海默氏病、与tau病有关的疾病(a disease associated with tauopathy)、HIV相关脑病(HIV-associated encephalopathy)、山黧豆中毒(neurolathyrism)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington’s chorea)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、癫痫(epilepsy)、d-2-羟基戊二酸尿(d-2-hydroxyglutaric aciduria)或精神分裂症(schizophrenia)。在一个实施方案中，可使用本发明的方法来改善与中枢神经系统(CNS)病症和损伤有关的症状，包括但不限于创伤性脑损伤、阿耳茨海默氏病(AD)、与tau病有关的疾病、脑缺血、脑水肿或神经胶质或小神经胶质活化减少。本发明还提供了用于改善与CNS创伤、炎症或脑缺血有关的症状的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于减少神经元细胞死亡或抑制巨噬细胞活化的方法。

在治疗CNS病症和损伤中，血脑屏障(BBB)急剧地限制急性分子(诸如肽)向脑中的运输。体内的初步资料指明COG 133和其它ApoE肽模拟物的功效可通过偶联至蛋白质转导域(PTD)而得到显著改进。PTD是短的碱性肽，其促进否则将不能或仅最低限度横越细胞膜的货物的细胞内投递。然而，PTD在细胞内运输货物的能力并不保证其能够运输穿过BBB，这显然是更复杂的过程，而且针对货物越过BBB的运输而进行体内测试的PTD的数目一直相对很少。因此，适于BBB运输的PTD需要凭经验确定，和/或通过对已知PTD的修饰来创建。

本发明还提供了在外周组织(诸如关节炎关节、肺和心脏)中使用本文所述药剂来治疗、预防或改善中枢神经系统(CNS)损伤和病症等的方法。在一个实施方案中，本发明还提供了用于减少神经元细胞死亡或抑制巨噬细胞活化的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗动脉粥样硬化或减少动脉粥样硬化斑块的方法。在又一个实施方案中，本发明提供了用于治疗、预防或改善细菌性脓毒病的症状的方法。

本发明的一方面提供了用于通过施用至少一种上文所述能够调控SET的ApoE类似物来或是在体外或是在哺乳动物受试者中抑制神经胶质或小神经胶质活化的方法。在一个实施方案中，所述方法提供化合物可以减少神经胶质或小神经胶质活化的量施用。

本发明的一方面提供了通过施用至少一种能够调控SET活性的药剂来治疗或改善与CNS创伤、CNS炎症、脑缺血或脑水肿有关的症状的方法。所述至少一种药剂可以减少CNS创伤、CNS炎症、脑缺血或脑水肿(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用。在某些实施方案中，本发明的方法减少创伤性脑损伤之后的CNS创伤、CNS炎症、脑缺血或脑水肿。在某些实施方案中，所述方法加速从创伤性脑损伤的恢复。在某些实施方案中，所述方法改进创伤性脑损伤之后的功能恢复或认知功能。

在发明的另一方面，提供了用于通过给诊断患有与炎症有关的疾病或病症的受试者施用至少一种能够调控SET活性的药剂来治疗或改善炎症症状的方法。所述至少一种药剂可以减少一种或多种与疾病有关的症状(诸如疼痛)(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用。在某些实施方案中，所述方法加速从创伤性损伤的恢复。在某些实施方案中，所述方法改进与慢性炎性疾病(诸如克罗恩氏病(Crohn’s disease))有关的症状。

还可使用本发明的方法来改进与自身免疫炎性疾病有关的症状。自身免疫疾病的一些非限制性例子包括类风湿性关节炎、银屑病、狼疮(lupus)、多发性硬化、结肠炎(colitis)和糖尿病(1型)。发明人在下文实施例中已经显示了，本发明的肽对SET的调控导致p38MAP激酶磷酸化减少，如此活化减少。已经显示了p38MAP激酶活性的抑制剂是用于治疗类风湿性关节炎的重要治疗用化合物(参见综述Westra和Limburg(2006)Mini-Reviews in MedicinalChemistry 6：867-874)。因此，ApoE类似物对SET的调控可通过减少p38MAP激酶活化来改善与类风湿性关节炎有关的症状。另外，已经有报道，p38MAP激酶以及胞外调节型激酶(ERK)1/2的某些同等型在银屑病皮肤病损(psoriaticskin lesions)中是活性过度的(Johansen等(2005)British Journal ofDermatology  152：37-42)。如此，ApoE肽也可通过减少这两种MAP激酶级联的活化来有效治疗银屑病。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过施用至少一种能够调控SET的药剂来抑制哺乳动物受试者中的巨噬细胞活化的方法。所述至少一种药剂可以抑制巨噬细胞活化(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用。

在一个实施方案中，本发明提供了通过施用能够调控SET的药剂来治疗或改善与炎症有关的疾病的症状的方法。例如，本发明提供了治疗或改善关节炎和风湿性疾病的症状的方法。在某些实施方案中，所述方法提供类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎(ankylosing spondilitis)等的症状的治疗或改善。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或改善多发性硬化(MS)的症状的方法。在某些实施方案中，所述方法提供复发性/缓解性(remitting)MS、继发性进行性MS、进行性复发性MS或原发性进行性MS的症状的治疗或改善，其包括施用至少一种本文所述化合物。

本发明进一步提供了用于炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的新治疗，其包括给有所需要的受试者施用能够调控SET的药剂。可给诊断患有，即患炎性疾病诸如炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的患者施用ApoE模拟肽(诸如COG 133或COG 1410)以减少所述疾病的症状(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)。

在另一个实施方案中，本发明提供了治疗动脉粥样硬化或减少动脉粥样硬化斑块形成的方法，其包括施用至少一种本文所述能够调控SET的药剂。所述至少一种药剂可以减少动脉粥样硬化斑块形成(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用。在某些实施方案中，所述方法提供通过施用至少一种本文所述药剂来预防动脉粥样硬化斑块形成。

在又一个实施方案中，本发明提供了用于通过施用至少一种本文所述能够调控SET的药剂来预防或改善细菌性脓毒症的症状的方法。所述药剂可以减少脓毒症相关炎症(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用。

本发明还提供了用于治疗白血病诸如慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocyteleukemia，CLL)的方法，其包括以会减少疾病症状(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)的量施用至少一种能够调控SET的药剂。SET在白血病中过表达并抑制PP2A，如此维持致癌性BCR/ABL激酶途径的活化(Neviani等(2005)Cancer Cell.8：355-368)。因此，ApoE模拟肽(诸如COG 133、COG 1410或任何其它ApoE类似物)的施用会结合SET，解除其对PP2A的抑制。然后PP2A会游离，从而使细胞增殖和存活的调节剂脱去磷酸以及抑制BCR/ABL激酶的致癌活性，如此减少白血病生成。

已经有报道，PP2A负调节内皮细胞运动性，这对癌症中的血管发生和肿瘤转移是需要的(Gabel等，1999，Otolaryngol Head Neck Surg.121：463-468；Young，MR.，1997，Adv Exp Med Biol.407：311-318)。冈田酸(okadaic acid)对PP2A的抑制通过破坏细胞骨架网络来增加细胞运动性，由此增强肿瘤细胞的侵入性质。这些结果提示，活化PP2A的药理方法会减少肿瘤细胞转移和癌症相关的血管发生。如此，本发明的肽通过结合SET来增加细胞内的活性PP2A集合从而在多种癌症的治疗中是有用的。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗脊髓发育不良综合征(MDS)(其中由骨髓产生的血细胞生成受到破坏的疾病组)的方法。该方法包括施用如下量的至少一种能够调控SET的药剂，其会导致MDS症状的减少(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)。症状包括但不限于无力、疲劳、频繁感染、容易青肿(easy bruising)、出血、发热和体重减轻。已经有报道，p38MAP激酶在MDS中具有组成型活性，并且对p38MAP激酶活性的抑制导致造血增强(Navas等(2006)Blood  108：4170-4177)。因为发明人已经显示了外源剂对SET的调控导致p38MAP激酶活性降低，ApoE模拟肽和类似物(其结合并调控SET活性)在治疗MDS中会是有用的。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗结节性硬化症的方法，其包括施用如下量的至少一种能够调控SET的药剂，其会导致结节性硬化症的症状减少(与没有所述药剂的情况中会发生的相比)。结节性硬化症是引起许多器官(包括脑、肾、心脏、皮肤和眼睛)中良性错构瘤形成的遗传性病症。错构瘤的严重临床并发症可导致智力低下(mental retardation)、癫痫发作(seizures)、和孤独症、肾功能障碍(renal dysfunction)、皮肤病学异常和心脏问题。此病症中突变的基因产物通常在抑制核糖体S6激酶活性中起作用，如此抑制蛋白质合成。S6激酶活性在此病症中似乎被上调(参见美国专利No.7,169,594)。已经声称，雷怕霉素(Rapamycin)(经由对S6激酶活性的抑制来抑制蛋白质合成的化合物)经由PP2A依赖性机制来施加其抑制效应(参见美国专利No.7,169,594)。此外，可经由对PP2A的活化来降低S6激酶活性(Cho等(2006)American Journal of Physiology-Cell Physiology  291：C317-326)。本发明的药剂对SET的调控可提高PP2A活性(参见实施例5)。因此，抑制SET继而活化PP2A的药剂会降低与结节性硬化症有关的异常S6激酶活性，而且可减少该疾病的症状。

阿耳茨海默氏病特有的神经病理学特征之一是受该疾病折磨的个体的脑中的神经原纤维缠结的形成。Tau蛋白(其是微管相关蛋白家族的成员)是原纤维损害的主要要素之一。在阿耳茨海默氏病中，神经原纤维损害由成对的螺旋丝(PHF)和直丝组成，这两者由异常地过度磷酸化的Tau蛋白组成(Goedert等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4051-4055；Kondo等，1988，Neuron 1：827-834；Kosik等，1988，Neuron 1：817-825；Wischik等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4506-4510；及Lee等，1991，Science 251：675-678)。

在阿耳茨海默氏病之外，其它神经变性性病症也以丝状tau病理学为特征，所述丝状tau病理学表现出导致染病脑区的神经元损失。这些病症共同称为tau病(tauopathies)，并且包括如下疾病，诸如进行性核上性麻痹(progressivesupranuclear palsy，PSP)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration，CBD)、皮克氏病(Pick’s disease，PiD)、嗜银颗粒疾病(argyrophilic grain disease，AGD)和兼有与染色体17有联系的帕金森病的额颞痴呆(frontotemporal dementiawith parkinsonism linked to chromosome 17，FTDP17)。与阿耳茨海默氏病中的神经原纤维缠结类似，PSP、CBD和PiD中的原纤维损害含有过度磷酸化的tau蛋白(Sergeant等，1997，FEBS Lett.412：578-582；Sergeant等，1999，J.Neurochem.72：1243-1249；Schmidt等，1996，J.Neuropathol.Exp.Neurol.55：534-539；Buee-Scherrer等，1996，Acta Neuropathol.91：351-359；及Probst等，1996，Acta Neuropathol.92：588-596)。

已经有报道，数种激酶和磷酸酶调节tau蛋白的磷酸化状态(关于综述，参见Billingsley and Kincaid，1997，Biochem.J.323：577-591和Buee等，2000，Brain Res.Rev.33：95-130)。一种认为促成tau蛋白的异常过度磷酸化的激酶是细胞周期蛋白依赖性激酶5(cdk5)。Cdk5活性依赖于活化蛋白p35。由钙活化型蛋白酶钙蛋白酶将p35切割成p25导致cdk5活性的组成型活化(关于综述参见Camins等，2006，Drug News and Perspectives 19：453-460)。已经有报道，截短的p25蛋白在阿耳茨海默氏病患者的神经元中积累，而且p25积累与cdk5活性的提高相关(Patrick等，1999，Nature，402：615-622)。此外，数种细胞系中的cdk5/p25复合物表达导致tau蛋白的磷酸化增加和细胞骨架网络的去稳定化。其它研究已经显示了cdk5/p25活性和tau蛋白的过度磷酸化之间的关联(关于综述，参见Giese等，Neuroreport 16：1725-1730和Kesavapany等，2007，Biotechnology Journal 2：978-987)。Cdk5/p25活性还可使神经丝蛋白磷酸化，这引起帕金森氏病和肌萎缩侧索硬化中的病理学损害(Kesavapany等，2007，Biotechnology Journal 2：978-987)。已经有报道，SET结合皮层神经元中的cdk5/p35复合物，由此增强cdk5/p35激酶活性(Qu等，2002，J.Biol.Chem.277：7324-7332)。本发明的肽可降低SET对cdk5/p35复合物的结合(实施例8)。如此，本发明的肽对SET的调控会起降低cdk5激酶活性的作用，继而降低tau和神经丝蛋白的磷酸化，预防原纤维损害。

磷酸酶活化是调控tau磷酸化的另一种机制。PP2A可使tau和MAP2在体外脱去磷酸(Yamamoto等，1988，J.Neurochem.50：1614-1623)。认为PP2A的活性在阿耳茨海默氏病脑中是受损的。编码催化性和调节性PP2A亚基的mRNA的表达在来自阿耳茨海默氏患者的海马中是减少的，提示PP2A活性在该疾病中可能受到抑制(Vogelsberg-Ragaglia等，2001，Experimental Neurology 168：402-412)。对PP2A活性的抑制可导致tau蛋白的过度磷酸化、神经原纤维缠结的形成和神经元变性。SET(也称为蛋白质磷酸酶2A抑制剂2蛋白(I₂ ^PP2A))的信使RNA表达在阿耳茨海默氏患者的新皮质中是增加的(相对于年龄相一致的对照)(Tanimukai等，2005，Am J.Pathol.166：1761-1771)。另外，还观察到I₂ ^PP2A从细胞核至细胞质的细胞定位的位移。最后，I₂ ^PP2A在来自阿耳茨海默氏患者的神经元中与PP2A和异常地过度磷酸化的tau蛋白共定位。如此，SET对PP2A活性的抑制促成tau的过度磷酸化和神经原纤维缠结的形成。

本发明的肽可结合和调控SET活性。已经显示了本发明的肽在体内提高PP2A活性(实施例5)并降低tau蛋白的磷酸化(实施例7)。如此，本发明的SET调控剂对于治疗与神经元内和胶质细胞原纤维损害有关的疾病(诸如阿耳茨海默氏病及上文所述其它tau病)是有用的。施用调控SET的药剂会具有两路效应(two-pronged effect)。通过结合并抑制SET与其靶蛋白的相互作用，本发明的药剂会降低cdk5激酶活性并提高PP2A活性，这两者都会导致tau蛋白磷酸化的降低，由此阻止或减少原纤维损害的形成。

本发明还涵盖联用本发明的肽与其它SET抑制剂、PP2A活化剂和/或cdk5/p35活性抑制剂来达到增强的或协同的治疗效应。例如，本发明的肽可与cdk5/p35抑制剂联合来降低tau磷酸化。合适的cdk5抑制剂的一些非限制性例子包括aloisine-A、靛玉红-3’-肟(indirubin-3’-oxime)、N4-(6-氨基嘧啶-4-基)-磺胺(N4-(6-aminopyrimidin-4-yl)-sulfanilamide)、3-氨基-1H-吡唑[3，4-b]喹喔啉(3-amino-1H-pyrazolo[3，4-b]quinoxaline)、丁内酯I、aminopurvalanol A、alsterpaullone和roscovitine。别的合适的SET和cdk5/p35活性抑制剂和PP2A活化剂包括肽、小分子、抗体及其片段和核酸(包括但不限于反义的、siRNA、shRNA、miRNA和适体)。

在某些实施方案中，本发明提供了药用组合物，其包含至少一种能够调控SET的药剂。在某些实施方案中，本发明提供了药用组合物，其包含至少一种能够调控SET的药剂及另一种用于治疗、预防或改善炎性疾病或疾患(诸如CNS或神经病学损伤、风湿性疾病、多发性硬化、CABG外科手术、动脉粥样硬化或细菌性脓毒症)的药物。本发明药剂的药用组合物可以这样的方式提供以使得便于给有所需要的受试者施用，包括例如通过静脉内、肌肉内、皮下或穿皮施用。参见Remingtons Pharmaceutical Sciences，第19版Remington和Gennaro，编Mack Publishing Co.，Easton，PA，本文通过提及而将其收录。本发明的方法进一步提供多种剂量给药日程表、施用次数、间隔和持续时间以治疗、预防或改善本文所述病症。还包括的是使用本发明中所披露的和本领域中已知的测定法鉴定的所披露药剂和变体的功能性变体，其中此类药剂能够调控SET。与此相一致，本发明还包括所披露药剂及其功能性变体在制备用于治疗本文所讨论的多种疾病和疾患的药物的方法中的用途。

在本发明的一个实施方案中，可鉴定能够结合SET并调控SET活性的药剂。可通过本领域中已知的方法根据结合SET的能力来对药剂进行筛选。例如，可通过使用噬菌体展示、酵母展示或配体替换测定法等方法来筛选文库从而鉴定药剂。可根据竞争或抑制包含COG 133(SEQ ID NO：1)的肽的结合的能力对能够结合SET的药剂进一步筛选。能够竞争或抑制包含COG 133的肽的结合的药剂在调控SET活性方面可能比COG 133更有效。例如，上文和下文实施例中所述比COG 133更有效的药剂(诸如COG 1410)能够与COG133竞争结合SET。

可分离所发现的结合SET的药剂，并进一步测试其调控PP2A活性或cdk5活性的能力。测量磷酸酶和激酶活性的方法是本领域中已知的，并且包括但不限于监测磷酸向肽底物中的释放或掺入的体外磷酸化测定法和检测内源底物在细胞溶胞产物中的磷酸化状态的Western印迹方法。

可使用本发明中所提供的筛选方法来筛选能够调控SET的药剂以治疗神经学、炎性和增殖性疾病，包括但不限于多发性硬化、血管炎、急性播散性脑脊髓炎、格-巴二氏综合征或脓毒病、急性CNS损伤诸如创伤性脑损伤、中风、闭合性头部损伤、全脑缺血、脑水肿、病灶性缺血或颅内出血，或慢性神经学疾病诸如阿耳茨海默氏病、tau病、HIV相关脑病、山黧豆中毒、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈症、帕金森氏病、癫痫、d-2-羟基戊二酸尿、精神分裂症，白血病、脊髓发育不良综合征(MDS)或结节性硬化症。

提出以下实施例以阐明本发明，并且不解释为其为限制性的。

实施例

实施例1：SET的鉴定

将COG 133-生物素或生物素对照添加至来自BV2小神经胶质细胞的总蛋白质。通过用链霉亲合素珠的免疫沉淀来收集结合至Cog-生物素或生物素的蛋白质。广泛地清洗珠子以除去非特异性结合的蛋白质。用Laemmli样品缓冲液对特异性结合至链霉亲合素的蛋白质进行洗脱和变性，并在SDS/PAGE凝胶上进行电泳。电泳之后，通过考马斯/银染色来对凝胶染色以显现蛋白质条带。

图1提供了经银染色的SDS/PAGE凝胶图像和该实验的结果。标记A和B的COG-生物素泳道含有两条条带，但它们在生物素对照泳道中不存在。自凝胶切出经银染色的含有COG 133结合蛋白的条带，并自凝胶薄片提取蛋白质，用蛋白酶(如胰蛋白酶)进行消化，并通过质谱术来分析蛋白水解片段。通过MS/MS方法来实现选定蛋白水解片段的测序。通过本领域中已知的方法将蛋白水解片段的序列及其分子量针对NCBI GenBank中的已知序列的氨基酸序列和分子量进行比较。分析显示了凝胶上的两条条带对应于SET的已知变体(SEQ ID NO：3和4)。

实施例2：COG-生物素直接与SET蛋白相互作用

培养BV2小神经胶质细胞，并与经生物素标记的COG 133接触。自经处理的BV2细胞制备总蛋白质提取物，并用链霉亲合素-琼脂糖珠来分离含有生物素的复合物。清洗珠子之后，通过在Laemmli样品缓冲液中煮沸来洗脱蛋白质，并在SDS-PAGE凝胶上将变性的蛋白质分开。将通过SDS-PAGE将所分开的蛋白质转移至硝酸纤维素，并用抗SET抗体进行Western印迹探查。清洗印迹以除去非特异性结合的初次抗体(primary antibody)。然后将印迹与经山羊-抗兔/辣根过氧化物酶偶联的再次抗体(secondary antibody)一起温育1小时，接着清洗，并用化学发光的HRP抗体检测试剂盒(Denville Scientific)显影。将印迹暴露于X射线胶片不同时段。免疫反应性条带在胶片上显现为黑色条带。

图2提供了印迹图像和图例。印迹的第1道对应于生物素对照。第2道对应于来自总蛋白质的生物素化的COG 133。两条独特地结合生物素-COG 133的蛋白质条带与两种SET剪接变体相关联。第3道对应于生物素化的COG 133和20x COG 133。印迹的第4道对应于生物素化的COG 133和pep96。Pep96没有生物学活性，但是在结构上类似于COG。第5道对应于生物素化的COG 133和COG 1410。COG 1410是更有效力的COG 133变体。与SET相关联的微弱条带指示在结合SET方面COG 1410与COG 133竞争。

实施例3：用针对SET的siRNA处理的BV2细胞中的亚硝酸盐/MTT

先前已经显示了COG 133降低LPS诱导的氧化氮生成(Lynch等2005)。参见PCT申请PCT/US05/31431，其要求2004年9月2日提交的美国临时申请60/606,506，2004年9月9日提交的60/608,148和2004年9月2日提交的60/606,507的优先权，本文通过提及而将它们完整收录。用针对SET的siRNA转染BV2细胞。用COG 133、LPS或LPS和COG 133处理用siRNA转染的BV2细胞和没用siRNA转染的BV2细胞，如上文提及的专利申请中所述的。未处理的BV2细胞作为对照使用。图3是该结果的图形。柱形3和7分别对应于没有针对SET的siRNA的情况中和具有针对SET的siRNA的情况中的LPS。与柱形3相比，柱形7显示了氧化氮的显著降低，如此证明在SET的量减少时LPS诱导的氧化氮生成减少。类似地，与用LPS和COG 133处理但没用siRNA转染的组相比，用LPS和COG 133处理且用针对SET的siRNA转染的组中有氧化氮的减少(分别为第8道和第4道)。然而，第7道和第8道(分别为LPS+siRNA和LPS+COG 133+siRNA)之间的氧化氮量没有显著性差异，证明SET的除去阻断COG 133对LPS诱导的NO的效应。

图4是阴性和阳性对照的凝胶图像。凝胶图像显示了针对SET的siRNA能够有效地使SET沉默。

图5是来自人THP1细胞中类似实验的结果的图形，其证明在通过基于siRNA的沉默而除去SET后，COG 133在减少LPS诱导的TNFα生成中的功效得以消除。与SET作为蛋白质磷酸酶2A(PP2A)的抑制剂的机制相一致，在自细胞除去SET后观察到LPS诱导的TNFα应答的降低以及COG 133效应的消除。

实施例4：COG肽竞争对来自人脑的SET的结合

在含蛋白酶混合物片剂的PBS缓冲液中使人脑均浆化，并离心以除去细胞碎片。将100ng生物素化的COG 133(在N端附着有生物素的COG 133肽)添加至1mg澄清的上清液。在室温温育4小时后，添加50μL 50％链霉亲合素琼脂糖珠浆。再温育1小时后，通过离心来沉淀珠子。用含有0.1％Tween 20去污剂的PBS缓冲液将珠子清洗3次。将50μL 2x SDS PAGE加载缓冲液(含有DTT)添加至经清洗的珠子，并将样品煮沸2分钟。向聚丙烯酰胺凝胶加载或是每道40μL提取物或是10μg总脑提取蛋白质(对照道)，并在SDS缓冲液中运行。将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后用10％脱脂奶粉封闭所述硝酸纤维素膜。然后用抗SET抗体对膜进行探查。用增强的化学发光底物(Enhanced Chemiluminescence substrates，GE healthcare)来显影印迹，并通过暴露于胶片而显现。图6中所示的印迹证明生物素化的COG 133结合并下拉(pull down)来自人脑提取物的SET。

在相关的实验中，对COG 133肽的衍生物测试SET结合。如上文所述的那样制备人脑提取物。将10倍过量的COG 1410或COG 112肽添加至脑提取物，并一起温育10分钟。接着，将100ng生物素化的COG 133添加至提取物，并在室温一起温育4小时。将链霉亲合素琼脂糖珠添加至混合物，并进行处理，正如上文所述的。制备样品以进行SDS-PAGE和Western印迹分析。针对SET蛋白进行探查的印迹(图7)显示了过量的COG 1410或COG 112肽减少用生物素化的COG 133下拉的SET蛋白量。这些结果提示这两种COG 133衍生物与COG 133竞争对SET的结合。

实施例5：COG 112活化PP2A

将小鼠巨噬细胞RAW细胞与100ng/mL LPS、1μM COG 112(与触角足关联的COG 133(COG 133conjugated to antennapedia))、LPS和COG 112、10nM冈田酸(PP2A的抑制剂)或冈田酸和COG 112一起温育。1小时后，溶解细胞，并通过添加靶向PP2A中催化性C亚基的抗体来免疫沉淀PP2A。通过SDS-PAGE将一半免疫沉淀物分开，印迹至硝酸纤维素上，并用抗PP2AC抗体进行探查。通过将125μL含有磷酸-苏氨酸底物肽的测定混合物添加至免疫沉淀的酶来对剩余的部分测定活性。在37℃在摇动的情况中温育后，取出25μL等分试样，并添加至钼酸铵溶液(Upstate)，所述钼酸铵溶液螯合游离的磷酸根，并在螯合物形成后改变颜色。在多个时间间隔取出等分试样，并通过与磷酸盐标准曲线进行比较来测定自肽释放的游离磷酸根的量。通过与时间过程数据的线性拟合来测定磷酸根释放的速率，并标准化至相对PP2A浓度。根据磷酸根释放的速率所测量的PP2A活性在存在COG 112的情况中是提高的(图8)，就象通过COG112对SET的结合来消除SET对PP2A的抑制会预期的。此结果提示活性PP2A和结合至SET的无活性PP2A之间存在平衡，并且可移动此平衡以调控活性PP2A酶的量。为了测试这种假设，将巨噬细胞与单独冈田酸或在存在COG 112的情况中的冈田酸一起温育。未结合至SET的PP2A的集合会受到冈田酸抑制，如此产生基线PP2A活性的降低(图8)。依照上文的假设，会预期用COG 112处理细胞会通过结合至SET和自SET抑制释放磷酸酶来增加活性PP2A的集合，由此产生PP2A活性的总的提高。图8中所示的结果证明COG 112在存在冈田酸的情况中事实上确实提高PP2A活性。如此，可通过用ApoE肽调控SET活性来调节PP2A在细胞中的活性集合。

实施例6：COG 133抑制p38MAP激酶、JNK、ERK 1/2和NFκB的活化

将小鼠BV2小神经胶质与阴性对照、LPS或LPS和COG 133(SEQ ID NO：1)肽一起温育30分钟。溶解细胞，并通过离心来制备澄清的提取物。向聚丙烯酰胺凝胶加载每道30μg提取物，并在SDS缓冲液中运行。将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，随后用10％脱脂奶粉封闭所述硝酸纤维素膜。然后用磷酸特异性p38MAP激酶、MKK 3/6、JNK、ERK和IκB抗体对膜进行探查。用增强的化学发光底物(GE healthcare)来对膜进行显影，并通过暴露于胶片而显现。然后对膜进行剥离，并使用非磷酸特异性抗体来再次探查总的p38、JNK、Erk或IκB，如先前所述的。图9A中显示了描绘对p38MAP激酶的磷酸化的代表性Western印迹。在一些实施方案中，对膜探查GAPDH蛋白。进行Western印迹的密度测定法分析，并将来自磷酸化的p38MAP激酶的信号标准化至那些来自GAPDH的。图9B中显示了密度测定法分析。这些结果指明用COG 133进行的处理引起磷酸化的降低，并由此引起p38MAP激酶的失活。已经有报道，PP2A结合p38MAP激酶，并使其脱去磷酸(Sundaresan和Farndale2002FEBS Letters 528，139)。假设COG肽可提高PP2A活性(实施例5)，可能的是p38MAP激酶的脱去磷酸经由通过COG结合SET来活化PP2A而发生。

图10显示了针对磷酸JNK(小图A)、ERK(小图B)和IκB(小图C)的来自上文所述实验的代表性Western印迹。这些实验的结果显示了COG 133肽降低LPS诱导的对这些信号传导蛋白的磷酸化，证明COG 133抑制这些信号传导级联的活化，推测是经由对SET的抑制和随后的PP2A活化而实现的。

在脱去磷酸的状态中，IκB结合转录因子NFκB，并阻止其移位至细胞核而活化促炎性细胞因子的转录。为了确定COG 133是否还减少NFκB向细胞核的移位，单独地或在存在COG 133的情况中用LPS刺激结肠上皮细胞，并自经刺激的细胞制备核提取物。将经放射性标记的含有NFκB结合位点的寡核苷酸添加至来自核提取物的蛋白质，随后通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来将蛋白质分开。通过放射自显影术来检测核提取物中存在的NFκB量(图10D)。核NFκB在存在COG 133的情况中是降低的，这进一步提供了如下证据，即此信号转导级联在用ApoE肽处理的细胞中受到抑制。

实施例7：COG 1410降低Tau磷酸化

给C57B1/6小鼠静脉内注射递增浓度的冈田酸(OA)(通过施用足够量的OA以在2mL血液体积中产生指定的μM浓度所计算出的)。施用OA后1小时，通过断头术将小鼠处以安乐死，并取出脑。分离皮质，用液氮进行瞬时冷冻，研磨成细微的粉末，并通过在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的提取缓冲液中将该粉末均浆化来制备提取物。通过SDS-PAGE将蛋白质提取物分开，转移至硝酸纤维素膜，并使用识别tau中Ser202和Thr205磷酸化的AT-8抗体来探查磷酸-tau。将磷酸-tau信号标准化至来自GAPDH蛋白的信号。此实验的结果显示了OA对PP2A的抑制产生皮质中磷酸-tau的浓度依赖性增加(图11A)，这指明PP2A调节体内tau蛋白的磷酸化状态。为了确定COG肽对tau蛋白的磷酸化状态的影响，通过皮下注射给小鼠施用5mg/kg COG 1410，15分钟之后施用OA。图11B描绘了此系列实验的结果。COG 1410减少了由OA诱导的磷酸化的tau蛋白的量。可能的是，COG 1410对磷酸-tau的效应经由COG 1410结合至SET蛋白由此活化PP2A来介导。

实施例8：COG肽降低SET与p35的相互作用

Cdk5需要活化蛋白p35以实现激酶活性。虽然cdk5无所不在地进行表达，p35表达限于中枢神经系统的神经元，如此将cdk5相关的激酶活性限制于这些神经元。p35至p25的切割使cdk5激酶活性失调(disregulate)，引起该激酶变为组成型活性。已经将cdk5/p25的组成型激酶活性与tau蛋白的异常过度磷酸化和随后在阿耳茨海默氏病和其它tau病中发现的神经变性联系起来。已经显示了SET蛋白结合cdk5/p35复合物，并增强激酶活性(Qu等，2002，J.Biol.Chem.277：7324-7332)。因此，通过干扰SET和cdk5/p35复合物之间的相互作用来降低cdk5激酶活性可能是有可能的。为了测试这种可能性，检查COG肽对SET与p35结合的影响。将小鼠脑溶胞产物(图12)或人脑溶胞产物(图13)与50μM COG 056(COG133的反向序列)、COG 112、COG133或COG 1410一起温育。用抗p35抗体和蛋白A琼脂糖珠自1mg经肽处理的脑溶胞产物免疫沉淀活化蛋白p35。通过SDS-PAGE将经P35免疫沉淀的蛋白分开，转移至硝酸纤维素，并用针对SET和P35的抗体进行探查。将来自SET的信号标准化至那些来自P35的信号以控制蛋白质加载的微小差异。图12中显示了来自小鼠脑溶胞产物实验的结果，而图13中显示了来自人脑溶胞产物实验的结果。密度测定法分析证明虽然COG 056(其在生物学测定法中是没有活性的)没有减少与P35结合的SET的量，但是COG 112、COG 1410和COG 133有效地抑制了SET对P35的结合。

可使用先前所述以组蛋白肽作为底物的体外磷酸化测定法来对来自用COG肽处理的细胞的细胞溶胞产物测定cdk5活性(Qi等，1995，J.Biol.Chem.270：10847-10854)。可预期的是，用COG 112、COG 133或COG 1410处理的细胞会比未处理的细胞或用COG 056处理的细胞展现出较小的cdk5活性。这些结果提示，SET是神经元中cdk5活性的体内调节剂，并且此调节可由COG肽调控。

实施例9：通过噬菌体展示来分离SET结合剂

噬菌体展示首次记载于1985年，并且是基于表型(即噬菌体颗粒表面上展示的肽)和基因型(即编码该肽的DNA)之间的物理联系。在George Smith的开拓性工作中，他将DNA片段插入丝状噬菌体的基因III中，并显示由该DNA片段所编码的多肽展示为噬菌体表面上的pIII外壳蛋白的融合物¹。可使用亲和纯化，用针对重组多肽的抗体在普通的噬菌体里选择这些“融合噬菌体”。噬菌体展示技术的这种起始演示后，在噬菌体展示系统中产生随机肽文库，并用于对抗体进行表位作图和鉴定模拟肽²。后来，肽文库的噬菌体展示已经证明是有力的工具，用以分离可用于亲和层析的肽、用以研究蛋白质-蛋白质相互作用、作为替代配体用于药物发现、和用以鉴定针对器官或组织的肽^3-12。这还已经被延伸至创建如下多肽材料，其拥有独特的胶凝性质，是液晶的前体，并且模拟细胞外基质^13-16。

在用于分离这些肽的亲和选择方法中，通常将靶物固定化在微量滴定板的表面上，并且添加噬菌体文库的等分试样。在容许由展示出具有针对靶物的亲和力的肽的噬菌体进行结合的温育步骤之后，清洗平板以除去未结合的噬菌体颗粒。然后通过导致靶物变性而不阻碍噬菌体生存力的处理来洗脱结合的噬菌体。然后将所洗脱的噬菌体添加至细菌培养物，并进行扩增¹⁷。一轮这种亲和选择循环导致展示出结合靶物的肽的噬菌体的富集。如下实现完全富集，即重复此方法达数个循环，之后铺于细菌菌苔之上以分离单独的噬菌体噬菌斑。这些噬菌斑之每个中的噬菌体是同质的，并在其表面上表达单种肽。使用ELISA测定法来对同质的噬菌体测试对靶物的结合，并通过对所插入的DNA进行测序来测定同质的噬菌体群体的肽序列。

最初，开发如下噬菌体展示，其中肽融合至噬菌体外壳蛋白pIII的氨基端。这导致与噬菌体颗粒上存在的3-5拷贝pIII之每拷贝融合的肽，并提供皮摩尔(picomolar)至低微摩尔(micromolar)的亲和力范围的肽¹。可使用在主要外壳蛋白pVIII的N端展示的短肽(小于10个氨基酸)来获得较低亲和力的肽¹⁸。这产生每个噬菌体颗粒约2700拷贝的肽，并且这么大量的所展示的肽容许分离具有高微摩尔亲和力的肽。pIII和pVIII系统的效用已经通过为每种噬菌体外壳蛋白开发C端展示系统来延伸。Fuh等记载了将接头添加至pVIII的羧基端，由此容许展示与pVIII蛋白末端融合的肽。此C端pVIII噬菌粒系统成功用于鉴定与PDZ域相互作用的肽¹⁹。对pIII蛋白的修饰也已经容许展示与pIII C端融合的多肽²⁰。

噬菌体展示文库

使用噬菌体展示来鉴定结合靶物的高亲和力肽的能力高度依赖于噬菌体表面上的肽呈现和用于亲和选择方法的肽文库的设计。完全随机的7种或12种氨基酸文库和CX₇C二硫键连接的文库可购自New England BioLabs。自这些文库鉴定出结合肽的成功率是约20％，而使用具有添加的设计特征的文库并针对每种靶物筛选数种噬菌体文库可获得接近90％的成功率。例如，可使用New England BioLabs PhD M13KE gIII载体系统来产生具有如下设计的噬菌体文库：X₁₁、X₆FX₆其中F是任意的固定氨基酸、CX11和CX16。将所有的文库构建为具有以NNK，其中N＝A、C、G或T和K＝G或T编码的简并密码子的简并寡核苷酸。密码子摆动位置的限制改进但不消除遗传密码固有的密码子偏爱，其中各6种密码子编码丝氨酸、精氨酸和亮氨酸，仅一种密码子编码甲硫氨酸和色氨酸。NNK构建还消除了3种终止密码子中的两种。会在构建时测量每种文库的复杂性，并且可常规地构建具有10⁸至10⁹种单一序列复杂性的文库。用1x10¹¹个噬菌体进行典型的亲和选择实验以使得对每个实验使用文库中平均100-1000拷贝的每种肽。

蛋白质生成

自组织匀浆、所培养的细胞中或通过有报道的方法通过重组表达来制备供噬菌体展示实验用的蛋白质。或者，表达如下重组SET，其具有与SET的N或C端融合的附着的生物素化序列(称为AviTag^TM(Avidity Systems))。在此情况中，在过表达生物素连接酶的细菌细胞中进行重组表达以使得所得的SET在表达过程中被生物素化。以饱和浓度将生物素化的SET固定化在经链霉亲合素包被的、经BSA封闭的微量滴定板上，通常20-80pmol/孔，用于噬菌体选择。

在亲和选择之前通过SDS-PAGE对SET蛋白分析纯度和在抑制PP2a中的活性以确保生物化学活性是完整的。对于生物素化的SET，在生物素化之前和之后进行活性测定法。在经链霉亲合素包被的96孔平板上捕获生物素化的SET，并通过对微量滴定板中的SET蛋白进行滴定来测定向每个孔所添加的SET量。清洗平板以除去未结合的SET后，将过量的经化学方法生物素化的碱性磷酸酶添加至每个孔。在SET以亚饱和(subsaturating)浓度存在时，碱性磷酸酶结合平板上可用的生物素结合位点，并使用碱性磷酸酶活性的检测来为生物素化的SET测定饱和点。对于亲和选择方法，用生物素封闭过量的生物素结合位点，之后添加噬菌体文库。

噬菌体亲和选择

基本上如Hyde-deRuyscher等²¹所述的那样进行肽的亲和选择。如下进行亲和选择，即将先前所述噬菌体展示文库之一添加至经链霉亲合素包被的、经BSA封闭的不含固定化SET的聚苯乙烯微量滴定板的每个孔。在将噬菌体溶液转移至含有固定化的SET蛋白的平板时，此平板中的温育容许聚苯乙烯、链霉亲合素和BSA结合肽自噬菌体原料除去。此预清除步骤降低背景结合。可通过在每轮选择过程交替封闭剂来进一步降低背景。使用脱脂奶粉和BSA作为封闭剂，其中BSA在奇数的选择轮次中使用而牛奶在偶数的选择轮次中使用。在噬菌体与SET一起温育后，清洗平板以除去未结合的噬菌体并选择具有高亲和力的噬菌体。为了选择高亲和力噬菌体，进行多次清洗步骤，并在每次清洗步骤之间将平板在清洗缓冲液中温育数分钟。以这种方式进行清洗容许回收保持结合的具有非常慢的释放率(k_off)的噬菌体。

清洗平板之后，或是如Sparks等²²所述的那样洗脱结合的噬菌体或是通过将大肠杆菌(E.coli)细胞的培养物添加至孔中并在37℃温育来直接感染从而扩增结合的噬菌体。在获得具有高结合亲和力的肽的方面，这种直接感染方法可证明是优于噬菌体洗脱方法的。扩增选定的噬菌体，并在每轮亲和选择之后使用下文所述用抗M13抗体进行的标准ELISA测定法来测试对想要的靶物和对照的结合。在3或4轮选择后，对来自阳性文库的噬菌体进行铺板，扩增单独的噬菌斑，并进行测试以鉴定结合SET的单独噬菌体。通过在ELISA测定法中评估对SET和数种不相关的蛋白质的结合来对结合SET的噬菌体测试特异性。分离所扩增的单独的结合噬菌体的DNA，并进行测序以测定负责结合SET的肽的序列。

噬菌体ELISA测定法

亲和选择之后，在2xYT中扩增所洗脱的噬菌体，并将直接感染的噬菌体原位扩增过夜。如先前所述的那样在噬菌体ELISA中测试所扩增的噬菌体²²。简言之，在微量滴定孔中固定化SET和对照蛋白质，添加噬菌体并容许结合，清洗平板，并使用连接有辣根过氧化物酶(HRP)的针对噬菌体主要外壳蛋白的抗体来检测与SET结合的噬菌体。可使用2，2’-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)(ABTS)或TMB作为底物并在读板仪中读取吸光度来检测HRP。产生依赖于SET存在的强烈信号的噬菌体是经过纯化的、扩增的并在噬菌体ELISA中针对对靶蛋白质和一系列不相关的蛋白质的结合进行测试以证实结合特异性的噬菌斑。通过使用Qiagen M13单链制备试剂盒(single-strand prep kit)来制备单链DNA从而实现对噬菌体展示肽的测序。由Duke University的测序实验室(Sequencing Facility)进行自动化DNA测序。

噬菌体亲和滴定

通过在单一靶蛋白浓度使用连续稀释的噬菌体来进行噬菌体ELISA从而测定选定的噬菌体的相对亲和力。在滴定中使用自50μL的11个点、两倍稀释系列。从每个数值中减去暴露于抗体而非噬菌体的SET的背景信号。通过稀释、铺板和对单独的噬菌斑进行计数来测定噬菌体滴度，并将来自噬菌体ELISA的吸光度读数绘制为每次测定的噬菌斑形成单位的函数。

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应当理解的是，所公开的发明不限于所述具体的方法、方案和试剂，因为它们可以有所变化。还可理解的是，本文所使用的术语是仅仅出于描述具体实施方案的目的，并不意图限制会仅由所附的权利要求书所限制的本发明的范围。

必须注意到，在用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数称谓，除非另有明确说明。如此，例如提及“宿主细胞”包括多个或多种此类宿主细胞，提及“所述抗体”是提及本领域技术人员已知的一种或多种抗体及其等同物等。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与所公开发明所属领域中技术人员通常理解相同的含义。虽然与那些本文中所述的方法和材料类似的或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但是例示性的方法、装置和材料如描述的。通过提及而明确且完整收录本文中所引用的所有专利、专利申请及其它出版物和引用它们的材料。

本领域技术人员会认可或仅使用常规实验便能确定本文所述发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物意图由下列权利要求书所涵盖。

Claims (9)

1.一种鉴定结合SET并调控SET活性的药剂的方法，其包括

使SET与一种或多种测试药剂和包含SEQ ID NO：1的肽接触，并

鉴定竞争或抑制所述肽对SET的结合的所述一种或多种药剂，其中所述鉴定的药剂是结合SET并调控SET活性的药剂。

2.权利要求1的方法，其进一步包括

分离竞争或抑制包含SEQ ID NO：1的肽对SET的结合的一种或多种药剂。

3.权利要求2的方法，其进一步包括

根据提高PP2A的磷酸酶活性的能力对所述一种或多种药剂进行筛选。

4.权利要求2的方法，其进一步包括

根据降低cdk5的激酶活性的能力对所述一种或多种药剂进行筛选。

5.权利要求1的方法，其中所述测试药剂选自下组：核酸分子，蛋白质，肽，小分子，抗体和抗体衍生物。

6.权利要求5的方法，其中所述测试药剂是肽。

7.权利要求6的方法，其中所述测试药剂是与由序列SEQ ID NO：1组成的肽相比具有氨基酸替代、插入或删除的α-螺旋肽。

8.权利要求6的方法，其中所述测试药剂是由与序列SEQ ID NO：1具有至少55％序列同一性的氨基酸序列组成的肽。

9.权利要求5的方法，其中所述测试药剂是小分子。

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