CN101603032A - 表达猪β干扰素的CHO细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达脊椎动物β干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达猪β干扰素的CHO细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产脊椎动物β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的猪β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作猪β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于猪传染性疾病的预防和治疗，具有重要的应用前景和市场前景。

Description

表达猪β干扰素的CHO细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及表达脊椎动物β干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达猪β干扰素的CHO细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产猪β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的的猪β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作猪β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于猪传染性疾病的预防和治疗。

背景技术

I型干扰素是脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分，为现代医学的重要研究领域。如今，病毒感染宿主时逃避干扰素等天然免疫的机制成为研究热点^[1-3]，这为病毒防治在理论上提供有力支持。猪生殖与呼吸综合症病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)^[4，5]、伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)^[6，7]、猪动脉炎病毒(swine arterivirus，PoAV)^[8]、猪瘟病毒(swine fever virus)^[9-11]和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)^[12]等病毒在感染宿主时，破坏I型干扰素系统都为它们突破宿主免疫系统的一个重要的机制。

I型干扰素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B)^[13，14]、慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C)^[15]、多发性硬化症(multiple sclerosis)^[16]、肿瘤疾病^[17，18]及其它疾病^[19，20]的治疗中发挥了重要作用。猪I型干扰素对TGEV^[21]、猪瘟病毒^[22]、PRV^[23，24]等常见病毒病的治疗具有良好的前景。目前，国内猪I型干扰素的生产主要采用原核^[25，26]和酵母表达系统^[27，28]。

因此，不管是I型干扰素相关的基础研究还是临床使用，都需要高活性、天然的I型干扰素样品，此外还需要对其生物学活性进行准确、便捷的定量。干扰素的定量需要稳定的标准品，目前农业部颁布的兽用生物制品质量标准中的脊椎动物天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性较低，约为10000AU·mL^-1。哺乳动物细胞表达的脊椎动物干扰素是与其它表达系统相比能够正确折叠、糖基化和翻译后修饰，因此更稳定、比活性更高、更适合作为标准品，尤其对于IFN-β，而目前缺乏源于哺乳动物细胞的脊椎动物猪的IFN-β标准品。综上，获得高水平哺乳动物细胞表达的脊椎动物猪I型干扰素具有重要的基础研究和应用研究意义。

发明内容

本发明的目的为建立高效表达猪IFN-β的CHO-K1细胞表达系统。

具体地，本发明涉及如下各项：

1.一种表达猪β干扰素的CHO细胞系，其含有编码猪β干扰素的基因。

2.根据以上1所述的CHO细胞系，其中所述猪β干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据以上1所述的CHO细胞系，其中所述编码猪β干扰素的基因如SEQ ID NO：1所示。

4.根据以上1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码猪β干扰素的基因之前加入了Kozak序列。

5.根据以上1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No.2412的CHO细胞系。

6.一种生产猪β干扰素标准品的方法，该方法包括：

1)培养根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系；

2)从所述的CHO细胞系的培养液中提取β干扰素，用作猪β干扰素的标准品。

7.根据以上6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No.2412的CHO细胞系。

8.根据以上6或7的方法生产的猪β干扰素标准品。

9.一种试剂盒，其包含根据以上6或7的方法生产的猪β干扰素标准品。所述试剂盒可以用于猪传染性疾病的预防和治疗。

10.根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的猪β干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于猪传染性疾病的预防和治疗。所述疾病例如是猪生殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病毒、猪动脉炎病毒、猪瘟病毒和猪传染性胃肠炎病毒等病毒引起的疾病。

更具体地，在本发明的一个实施方案中，把猪β干扰素(PoIFN-β)的ORF基因克隆至真核稳定表达载体pCI-neo(PoIFN-β在高效启动子CMV控制下表达)，并稳定转染至CHO-K1细胞，经G418压力筛选和2次单克隆，筛选出可稳定表达重组PoIFN-β的CHO-K1细胞克隆(CHO-PoIFN-β)。本发明的一株阳性CHO细胞克隆(CHO-PoIFN-β，分类命名：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell))于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2412。在25cm²的细胞瓶(5ml培养液)中，重组PoIFN-β的累积表达水平达到7.7×10⁵AU(antiviral units)/ml，每天的表达量可达4.6×10⁵AU/ml或0.46AU/个细胞。CHO-PoIFN-β细胞可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。表达的重组PoIFN-β可以诱导PK15细胞表达猪Mx蛋白。此外，其还可以完全保护PK15细胞抵抗1000TCID₅₀的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和伪狂犬病毒(PRV)的感染。综上，本研究中CHO-PoIFN-β细胞稳定、高效表达的重组PoIFN-β具有天然猪I型干扰素的生物学活性，具有良好的基础和应用研究价值。

本发明的专利性

新颖性：

与已经使用的表达脊椎动物猪β干扰素的技术相比(目前干扰素表达所采用的表达系统主要是原核、酵母表达系统，使用CHO表达脊椎动物猪β干扰素的国内外未见报道)，表达的技术路线完全不同。表达的产物在折叠、糖基化、翻译后修饰、稳定性、比活性上要大大优于已有的技术手段(原核、酵母)。

创造性：

1、与已有的原核和酵母表达系统比较，本发明CHO表达系统表达出的干扰素在蛋白的折叠、糖基化等翻译后修饰上最接近于天然干扰素，比活性更高，约是原核的10倍；

2、由于我们的目的是表达最接近天然活性的干扰素，而农业部颁布的兽用生物制品质量标准中的天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU·mL^-1。与此相比较，本发明的表达系统的PoIFN-β的表达水平是其70倍或以上，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。

综上：因此以CHO表达的猪β干扰素与原核和酵母表达的相比较具有极大的优越性和创造性。

附图简述

图1.pCA-PoIFN-β(A至D)和pCAGGS(E)转染BHK-21上清的抗病毒活性滴定。表达pCA-PoIFN-β和pCAGGS的转染的BHK-21的上清分别被命名为PoIFN-β_pCA和mock_pCA，PoIFN-β_pCA稀释10⁴倍(A)，10⁵倍(B)，10⁶倍(C)，10⁷倍(D)，mock_pCA稀释10¹倍(E)，并且不含IFN但加入病毒对照的孔被设定为病毒对照(F)；

图2.重组PoIFN-β在CHO-PoIFN-β细胞中的表达；

图3.传代次数对CHO-PoIFN-β细胞表达重组PoIFN-β的影响；

图4.免疫印迹检测PoIFN-β_CHO诱导MDBK细胞Mx蛋白的表达。在用PoIFN-β_CHO刺激后在MDBK细胞中的Mx蛋白的表达是剂量依赖型的。在缺少(0)或存在(0.37至3.67×10⁴AU/ml，A至F)的PoIFN-β_CHO下刺激MDBK细胞，并通过Western blotting分析。A，0.37；B，3.67；C，36.7；D，3.67×10²；E，3.67×10³；F，3.67×10⁴；

图5.CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β体外抗病毒活性；用10倍稀释的PoIFN-β_CHO(366745AU/ml)处理PK15细胞24小时，用1000TCID50 TGEV(A至D)和PRV(W至Z)攻击，当病毒对照孔(D和W)形成90-100％CPE时，稀释10⁴倍的PoIFN-β_CHO(A)可以完全抵抗TGEV的感染，但10⁵(B)和10⁶(C)倍稀释不能。稀释10³倍的PoIFN-β_CHO(X)可以完全抵抗PRV的感染，但是10⁴(B)和10⁵(C)倍稀释不能。不含干扰素和病毒的孔被设定为空白孔(O)；

图6.猪β干扰素的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；

图7.编码猪β干扰素的基因(SEQ ID NO：1)；

图8.质粒pCN-PoIFN-β的核苷酸序列，其中1171-1728位(斜体部分)是PoIFN-β基因，1165-1170(双下划线标记部分)是Kozak序列。

具体实施方式

下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例.高效稳定表达重组猪β干扰素的CHO表达系统的构建及生物活性检测

1材料与方法

1.1质粒、细胞株和毒株

PK15细胞(ATCC No.CCL-33)由本实验室保存，于含有5％FBS的DMEM培养基中培养。猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)商购自中国农科院哈尔滨兽医研究所，并于PK15细胞上滴定半数组织培养感染剂量(TissueCulture Infectious Dose₅₀，TCID₅₀)。

稳定真核表达载体pCI-neo(pCN)购自Promega公司，neo在SV40早期启动子的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC(ATCC No.CCL-61)，CHO-K1细胞于含10％FBS的DMEM-Ham’s F12(DF12)培养基(invitrogen)中培养。pMD18-T载体购自TaKaRa公司；原核表达质粒pET-32a(+)(Novagen公司)、传代牛肾细胞系(MDBK)(ATCC No.CCL-22)和BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)均由本实验室保存；原代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts，CEFs)采用10日龄的SPF鸡胚常规方法^[29]制备；表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)由本实验室参考文献通过反向遗传技术构建^[29]；MDBK细胞系滴定PFU(plaque forming unit)后-70℃保存；新城疫LaSota株病毒(CCVC NO.AV1615)商购自中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统(CCCCM)下属的兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)，由本实验室保存，CEFs滴定PFU后-70℃保存备用。

1.2试剂与仪器

T4 DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维素膜购自Pierce公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自Sigma公司；高亮萤光素酶检测试剂(Bright-Glo Luciferase assay system)购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司；转染试剂Fugene6购自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)购自Corning公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；MicroplateFluorescence Reader(FLx800)为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光；CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。Grace’s培养基、DMEM培养基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。DAB显色试剂盒购自博士德公司。

1.3干扰素基因克隆和质粒构建

从GenBank获取PoIFN-β的ORF序列(Genbank Accession No.S41178)，设计引物。上游引物为5’-TGC CAC CAT GGC TAA CAA GTGCAT C，下游引物为5’-AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上游引物在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列。

PK15细胞生长至密度为90％左右时，按感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒。8h后收细胞，用Trizol提取总RNA，以上述引物进行RT-PCR。扩增的PoIFN-βPCR产物亚克隆到pMD18-T载体获得质粒pMD18-PoIFN-β，测序鉴定。

从质粒pMD18-PoIFN-β以EcoR I/Sal I双酶切下PoIFN-β的ORF片断，分别亚克隆至以Xho I/Nhe I双酶切的质粒pCAGGS^[30，31]，或以T4 DNA聚合酶平滑化末端后亚克隆至Sma I酶切的质粒pCN，获得瞬时真核表达质粒pCA-PoIFN-β和稳定真核表达质粒pCN-PoIFN-β。

1.4抗病毒活性滴定

IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献^[29]，具体如下：MDBK细胞于96孔细胞板中生长至密度为90％，弃上清，每孔加10倍梯度稀释IFN样品100μl，每个稀释倍数设3个平行对照孔，37℃及5％CO₂培养条件下处理24h后，弃上清，用含2％FBS的DMEM稀释VSV*GFP，按每孔30000PFU(100μl)加入病毒稀释液，同时设未经转染上清处理，只加病毒液的病毒对照(Virus Control，VC)孔。不加干扰素和病毒的孔，作为空白孔(Blank Control，BC)。接毒后至VC孔的CPE(cytopathic effect)约为100％时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最后所有孔每孔加入50μl细胞裂解液(cell lysis buffer，CLB)[0.15mol/LTris-Cl(pH 8.0)，1.5％Triton X-100]，于摇床上裂解15min释放细胞内的GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性设置为70，激发光485nm，吸收光528nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达水平。判定：以BC孔校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为VC孔50％的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit，AU)，计算具体如下。

基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法如下：若绿色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units，RFU)用F表示，以BC孔校0，则50％病毒复制抑制的荧光值(F50)＝F(VC)/2，按下面公式计算IFN的抗病毒活性单位：log₁₀[每mL中IFN抗病毒活性单位(AU)]＝[F50-F(小于F50孔)]/[F(高于F50孔)-F(小于F50孔)]+log₁₀[小于F50孔的稀释倍数]。

1.5瞬时转染

按照Fugene 6(Roche公司)按操作说明书转染pCN-PoIFN-β和pCAGGS至BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)(于含5％FBS的DMEM中培养，培养条件为37℃及5％CO₂)，于转染后16h换新鲜培养基，继续在相同条件下培养48h收获细胞培养上清，分别命名为PoIFN-β_pCA和mock_pCA，分装并于-70℃保存备用。

1.6稳定转染

首先确定筛选培养基中合适的G418(invitrogen)浓度，方法如下：24孔细胞培养板接种每孔1000个CHO-K1细胞，并加G418使其浓度分别为100、200、300～1200μg/ml，选择能在10-14天把细胞彻底杀死的孔作为G418的筛选浓度。

参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-PoIFN-β至CHO-K1细胞。转染后24小时，按1∶8的比例进行细胞传代，用含有800μg/ml G418的压力筛选培养液筛选培养细胞，10～14天后，用克隆环圈住具有新霉素抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5×10⁶个细胞接种于6孔细胞培养板中生长至密度为100％后24小时，收取细胞培养上清，分别如上用VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克隆按限稀释法再进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常规方法冻存细胞，命名为CHO-PoIFN-β，含有重组PoIFN-β的细胞培养上清命名为PoIFN-β_CHO。将CHO-PoIFN-β于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2412。

1.7鸡Mx蛋白多克隆抗体的制备

I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经由JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter，Mxp)，表达的Mx蛋白(Mxprotein)能够抑制负链RNA病毒复制；Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)等其它细胞因子启动。通过对鸡、猪和牛的Mx蛋白氨基酸序列进行同源性分析，发现有部分同源性，主要位于Mx蛋白的N端，因此设计引物扩增鸡Mx蛋白的N端序列，长810bp，并克隆到原核表达载体pET-32a(+)，表达的原核蛋白经Ni-NTA免疫小鼠制备的多抗，用于这三种动物的Mx蛋白的检测。

新城疫病毒MOI为1.0感染细胞密度为约为100％的CEFs，待细胞病变达60％-80％时收获细胞，用Trizol提取总RNA，并用括号中的引物(上游引物为5’-GGG GAT ATC AGC AAT CAG ATG GCT TTC-3’，引入EcoR V酶切位点；下游引物为5’-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTTTTG-3’引入Sal I酶切位点)进行RT-PCR，扩增鸡Mx蛋白ORF的前半部分基因片段，PCR产物以EcoR V/Sal I双酶切后克隆到同样双酶切的pET-32a(+)上，获得鸡Mx蛋白的原核表达质粒，鸡Mx蛋白表达框架与载体上的His标签融合。质粒转化到大肠杆菌BL21中，用0.5mM IPTG于37℃诱导3小时后，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达。表达产物参照Ni-NTA琼脂糖亲和树脂纯化说明书纯化后，透析除去尿素。

以纯化的鸡Mx蛋白原核表达蛋白按常规方法免疫BALB/C小鼠(商购自维通利华公司)，免疫前断尾采血，分离免疫前小鼠血清，然后按常规程序免疫小鼠并采血分离血清，于-20℃保存备用。

1.8Mx蛋白的诱导表达

MDBK细胞于6孔板中生长至单层汇合，分别加入梯度稀释的重组PoIFN-β_CHO，37℃及5％CO₂孵育24小时后，用胰酶(amresco)消化细胞，3000rpm离心5min后收集细胞，加入1×SDS上样缓冲液100μl混匀，于沸水中煮20min后，进行SDS-PAGE电泳并转印到硝酸纤维素膜，5％鱼皮蛋白(PBST配制)封闭过夜，以PBST 1∶100稀释鸡Mx蛋白小鼠多抗为一抗，PBST 1∶5,000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色3～5分钟后加去离子水终止。

1.9抗病毒活性研究

PK15细胞于96孔板生长至90％密度时，弃去培养液，加入10倍梯度稀释的重组PoIFN-β_CHO 400μl，37℃及5％CO₂孵育24小时后，弃去培养液，每孔分别加入1000TCID₅₀(20μl)的TGEV和PRV感作1h后，去掉病毒液，加入含2％FBS的DMEM继续于37℃及5％CO₂培养，设未用IFN处理而加入同样病毒的病毒对照孔(virus control，VC)，和未加干扰素和病毒的空白对照孔(blank control，BC)，至VC孔的CPE为90％～100％左右时，观察干扰素对TGEV和PRV复制的抑制情况。

2结果

2.1PoIFN-β稳定表达质粒的构建

PCR产物电泳表明扩增出的PoIFN-β片段为587bp，与预期相符，克隆至pMD18-T载体后，经测序鉴定证实获得了PoIFN-β的完整ORF基因。再将PoIFN-β的完整ORF基因亚克隆至真核表达质粒pCAGGS中，构建成pCA-PoIFN-β。以pCA-PoIFN-β和pCAGGS瞬时转染BHK-21细胞，收获的细胞培养上清分别命名为PoIFN-β_pCA和mock_pCA，其抗病毒活性用VSV*GFP于MDBK细胞进行抗病毒活性滴定。结果(图1)显示，PoIFN-β_pCA稀释至10⁶倍仍然有抗病毒活性，结合测序结果可以证实获得了正确的PoIFN-β完整ORF基因，可用于下一步构建重组稳定表达载体。

从质粒pMD18-PoIFN-β以Sal I/Xba I双酶切下PoIFN-β的ORF片断，亚克隆至同样双酶切的质粒pCN，获得稳定真核表达质粒pCN-PoIFN-β，其中PoIFN-β在CMV启动子的控制下表达。

2.2稳定表达重组PoIFN-β的CHO-K1细胞克隆的筛选

为了确定筛选培养基中合适的G418浓度，于24孔板中每接种1000个CHO细胞，G418浓度在700～800μg/ml之间时，细胞于10-14天全部死亡。因此选择800μg/ml作为今后实验中CHO细胞的压力筛选培养基的G418浓度。

转染pCATN-PoIFN-β至CHO-K1细胞后，只有稳定整合的基因才能稳定转录，用含有800μg/ml G418的压力筛选培养基筛选具有新霉素抗性的细胞集落并扩大培养，通过检测各细胞克隆培养上清的抗病毒活性，筛选出表达量最高的克隆。此后再进行一次单细胞克隆筛选，最后获得单纯、稳定表达的细胞克隆，液氮存种，命名为CHO-PoIFN-β。此后CHO-PoIFN-β细胞以含有400μg/ml G418的压力筛选培养基进行传代。将该CHO-PoIFN-β于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.2412。

2.3重组PoIFN-β在CHO-PoIFN-β细胞中的表达

CHO-PoIFN-β(CGMCC No.2412)细胞于含有10％FBS的DF12培养基中培养，按1∶7传代至25cm²底面积的细胞培养瓶(每瓶加培养液5ml，长满后约5×10⁶个细胞)，待细胞长满后，用3ml PBS洗细胞2次，换新鲜培养液，然后分别于24、48和72小时取样，每次取100μl。所取含有重组PoIFN-β的细胞培养上清命名为PoIFN-β_CHO，每次取的样品冻存于-70℃备用。所有样品以VSV*GFP在MDBK细胞上于同一批次进行抗病毒活性滴定，结果如图2所示，最高的累积表达量可达7.7×10⁵AU/ml，24～48h的表达量可达4.6×10⁵AU/ml，此时每个细胞每天能够表达约0.46AU的重组PoIFN-β，此后培养液中的重组PoIFN-β一直维持在约7.5×10⁵AU/ml左右，不再增加。

2.4CHO-PoIFN-β细胞表达水平与传代次数的关系

CHO-PoIFN-β细胞分别在含有G418(400μg/ml)的筛选培养基和不含有G418的培养基培养传代，于25cm²的细胞瓶中、37℃及5％CO₂条件下培养，每3天到4天传一代，基本每周传代2次。分别于第0、5、10、15和20代取样，每种培养条件下的细胞做3个重复。取样前，上述两种培养条件下的CHO-PoIFN-β细胞以相同细胞密度接种，待细胞形成汇合单层时，再继续培养24小时取样，样品保存于-70℃，最后于同一批次进行抗病毒活性滴定。结果表明(图3)，CHO-PoIFN-β细胞的重组PoIFN-β表达量水平非常稳定，无论是否有G418压力存在，可稳定表达至少20代。

2.5重组PoIFN-β的生物学活性研究

把366745AU/ml的PoIFN-β_CHO(以VSV*GFP于MDBK细胞上滴定其抗病毒活性，同上)进行10倍梯度稀释(即0.37、3.67、36.7、3.67×10²、3.67×10³和3.67×10⁴AU/ml)，分别刺激PK15细胞24小时，收获PK15细胞。然后以鸡Mx蛋白小鼠多抗(制备参见“材料与方法”部分)为一抗，羊抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹检测猪Mx蛋白的表达，结果如图4所示：PoIFN-β_CHO能够诱导出可检测到的Mx蛋白(分子量约76kDa)下限为3.67AU/ml，且在3.67～3.67×10⁴AU/ml范围内，诱导出的Mx蛋白量和PoIFN-β_CHO活性单位成正相关，显示了PoIFN-β_CHO具有良好的I型干扰素生物学活性。

抗病毒活性滴定结果和Mx蛋白的诱导结果两者相符合，表明CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β具备天然I型干扰素的生物学功能。

2.6CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β体外抗病毒活性研究

为了研究PoIFN-β_CHO的体外抗病毒的能力，以10倍梯度稀释的PoIFN-β_CHO(366745AU/ml)处理PK15细胞24小时，然后分别感染1000TCID₅₀的TGEV和PRV，待VC孔形成90～100％CPE时，观察PoIFN-β_CHO对处理孔病毒的抑制情况，结果(图5)表明：10⁴稀释倍数(36.7AU/ml)的PoIFN-β_CHO能够完全抑制1000TCID₅₀的TGEV感染PK15细胞(图5A～D)，10³稀释倍数(367AU/ml)能够完全抑制1000TCID₅₀的PRV感染PK15细胞(图5W～Z)。并且即使再培养几天，TGEV和PRV也不能复制产生CPE(数据未显示)，说明PoIFN-β_CHO能够给予PK15细胞充分的保护，以抵御1000TCID₅₀的TGEV和PRV的感染。

3讨论

本实验建立的CHO-PoIFN-β细胞能够稳定高水平表达重组PoIFN-β，累积表达的最大水平可达约7.7×10⁵AU/ml，每天表达水平可达约4.6×10⁵AU/ml，平均每个细胞每天能够表达约0.46AU的重组PoIFN-β。表达重组PoIFN-β的CHO-PoIFN-β细胞是在G418的压力筛选下筛出的，但是经过细胞单克隆筛选出的克隆，无论在有无G418的培养液中传20代，表达能力基本不变，表明PoIFN-β的表达框架已稳定整合至CHO-K1细胞的基因组中。

CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β处理PK15细胞后，以鸡Mx蛋白鼠多抗为一抗进行免疫印迹，检测出猪Mx蛋白被诱导表达，且与重组PoIFN-β的抗病毒活性单位成正相关。这些都表明了CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β具有I型干扰素的生物功能，具有良好的天然猪IFN-β生物学活性。

哺乳动物细胞表达的IFN-β的糖基化和折叠与天然的完全相同，且正确的糖基化对于IFN-β的活性和稳定性至关重要。本研究CHO-K1细胞稳定表达的重组PoIFN-β具有良好的热及振荡等稳定性(数据未显示)，且具有极高的比活性，既使上清浓缩10倍也不能在SDS-PAGE胶上看到表达的重组PoIFN-β条带(数据未显示)。

此外，本研究表达的重组PoIFN-β的完全抑制1000TCID₅₀的TGEV(36.7AU/ml)和PRV(367AU/ml)体外感染PK15细胞，表明了其具有临床治疗应用的价值。此处可以发现，PoIFN-β对TGEV(冠装病毒科，正股单链RNA病毒)抗病毒活性是对PRV(疱疹病毒科，双链DNA病毒)的10倍，表明PoIFN-β对RNA病毒的抗病毒能力更强。

农业部颁布的兽用生物制品质量标准中的天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU/ml。与此相比较，本研究表达系统的PoIFN-β表达水平是其70倍，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。

结论，本发明人建立的CHO-PoIFN-β细胞表达的重组PoIFN-β具有天然猪I型IFN相同的生物学功能，表达水平高，抗病毒活性可达7.7×10^5.0AU/ml，且具有极高的比活性和稳定性，可作为猪IFN-β生物学活性检测时的标准品，在病原-宿主细胞的感染-抗感染天然免疫相关基础研究中具有重要的应用价值，同时具有良好临床应用前景。

参考文献

[1]Weber F，Kochs G，Haller O.Inverse interference：how viruses fight the interferonsystem[J].Viral Immunol，2004，17(4)：498-515

[2]Stetson D B，Medzhitov R.Type I interferons in host defense[J].Immunity，2006，25(3)：373-381

[3]Sen G C.Viruses and interferons[J].Annu Rev Microbiol，2001，55：255-281

[4]Buddaert W，Van Reeth K，Pensaert M.In vivo and in vitro interferon(IFN)studieswith the porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)[J].Adv ExpMed Biol，1998，440：461-467

[5]Lee S M，Schommer S K，Kleiboeker S B.Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes[J].VetImmunol Immunopathol，2004，102(3)：217-231

[6]Dufour V，Chevallier S，Cariolet R，et al.Induction of porcine cytokine mRNAexpression after DNA immunization and pseudorabies virus infection[J].JInterferon Cytokine Res，2000，20(10)：889-895

[7]Brukman A，Enquist L W.Suppression of the interferon-mediated innate immuneresponse by pseudorabies virus[J].J Virol，2006，80(13)：6345-6356

[8]Albina E，Carrat C，Charley B.Interferon-alpha response to swine arterivirus(PoAV)，the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Interferon CytokineRes，1998，18(7)：485-490

[9]Bauhofer O，Summerfield A，Sakoda Y，et al.Classical swine fever virus Nprointeracts with interferon regulatory factor 3 and induces its proteasomal degradation[J].J Virol，2007，81(7)：3087-3096

[10]Rau H，Revets H，Balmelli C，et al.Immunological properties of recombinantclassical swine fever virus NS3 protein in vitro and in vivo[J].Vet Res，2006，37(1)：155-168

[11]Ruggli N，Bird B H，Liu L，et al.N(pro)of classical swine fever virus is anantagonist of double-stranded RNA-mediated apoptosis and IFN-alpha/betainduction[J].Virology，2005，340(2)：265-276

[12]Riffault S，Grosclaude J，Vayssier M，et al.Reconstituted coronavirus TGEVvirosomes lose the virus ability to induce porcine interferon-alpha production[J].VetRes，1997，28(1)：77-86

[13]Zhao L S.[Problems and strategies during interferon therapy for hepatitis B][J].Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2006，14(5)：378-379

[14]Vilar Gomez E，Gra Oramas B，Arus Soler E，et al.[Sequential combination therapywith prednisone，lamivudine and interferon alfa-2b for HBeAg-positive chronichepatitis B][J].Gastroenterol Hepatol，2006，29(9)：534-541

[15]Koyama R，Arase Y，Ikeda K，et al.Efficacy of interferon therapy in elderly patientswith chronic hepatitis C[J].Intervirology，2006，49(3)：121-126

[16]Satoh J.[Interferon-beta therapy in multiple sclerosis][J].Nippon Rinsho，2006，64(7)：1297-1309

[17]Miyake K，Tsuchida K，Sugino H，et al.Combination therapy of human pancreaticcancer implanted in nude mice by oral fluoropyrimidine anticancer agent(S-1)withinterferon-alpha[J].Cancer Chemother Pharmacol，2007，59(1)：113-126

[18]Yoshida J，Mizuno M，Wakabayashi T.Interferon-beta gene therapy for cancer：basicresearch to clinical application[J].Cancer Sci，2004，95(11)：858-865

[19]Kappos L，Hartung H P.10 years of interferon beta-1b(Beta feron therapy[J].JNeurol，2005，252 Suppl 3：iii1-iii2

[20]Mahmutovic S，Beslagic E.Significance of the interferon(IFN)in the therapy[J].Bosn J Basic Med Sci，2004，4(4)：42-44

[21]Overend C，Mitchell R，He D，et al.Recombinant swine beta interferon protectsswine alveolar macrophages and MARC-145 cells from infection with Porcinereproductive and respiratory syndrome virus[J].J Gen Virol，2007，88(Pt 3)：925-931

[22]Xia C，DanW，Wen-Xue W，et al.Cloning and expression of interferon-alpha/gammafrom a domestic porcine breed and its effect on classical swine fever virus[J].VetImmunol Immunopathol，2005，104(1-2)：81-89

[23]Cao R B，Zhou G D，Zhou H X，et al.[Secreted expression of porcine interferon betain Pichia pastoris and its inhibition effect on the replication of pseudorabies virus][J].Wei Sheng Wu Xue Bao，2006，46(3)：412-417

[24]Pol J M，Broekhuysen-Davies J M，Wagenaar F，et al.The influence of porcinerecombinant interferon-alpha 1 on pseudorabies virus infection of porcine nasalmucosa in vitro[J].J Gen Virol，1991，72(Pt 4)：933-938

[25]曹瑞兵，张素芳，蔡梅红，et al.一种新的猪α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达[J].农业生物技术学报，2004，12(03)：278-282

[26]曹瑞兵，包晶晶，周海霞，et al.猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究[J].中国病毒学，2004，19(04)：364-368

[27]葛丽，李震，于瑞嵩，et al.猪α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达[J].中国兽医学报，2005，(03)

[28]曹瑞兵，周国栋，周海霞，et al.猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用[J].微生物学报，2006，46(3)：412-417

[29]Li Z，Jiang Y，Jiao P，et al.The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avianinfluenza viruses[J].J Virol，2006，80(22)：11115-11123

[30]Niwa H，Yamamura K，Miyazaki J.Efficient selection for high-expressiontransfectants with a novel eukaryotic vector[J].Gene，1991，108(2)：193-199

[31]Takada A，Robison C，Goto H，et al.A system for functional analysis of Ebola virusglycoprotein[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(26)：14764-14769

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>表达猪β干扰素的CHO细胞系及其应用

<130>IB083075

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>561

<212>DNA

<213>猪

<400>1

atggctaaca agtgcatcct ccaaatcgct ctcctgatgt gtttctccac cacagctctt   60

tccatgagct atgatgtgct tcgataccaa caaaggagca gcaatttggc atgtcagaag  120

ctcctgggac agttgcctgg gactcctcaa tattgcctcg aagataggat gaactttgag  180

gtccctgagg agattatgca accaccacaa ttccagaagg aagatgcagt attgattatc  240

cacgagatgc tccagcagat cttcggcatt ctcagaagaa atttctctag cactggctgg  300

aatgaaaccg tcattaagac tatccttgtg gaacttgatg ggcagatgga tgacctggag  360

acaatcctgg aggaaatcat ggaggaggaa aatttcccca ggggagacat gaccattctt  420

cacctgaaga aatattactt gagcattctg cagtacctga agtccaagga gtacagaagc  480

tgtgcctgga cagtcgtcca agtggaaatc ctcaggaact tttctttcct taacagactt  540

acagattacc tccggaactg a                                            561

<210>2

<211>186

<212>PRT

<213>猪

<400>2

Met Ala Asn Lys Cys Ile Leu Gln Ile Ala Leu Leu Met Cys Phe Ser

1               5                   10                  15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asp Val Leu Arg Tyr Gln Gln Arg

            20                  25                  30

Ser Ser Asn Leu Ala Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Gly Thr

        35                  40                  45

Pro Gln Tyr Cys Leu Glu Asp Arg Met Asn Phe Glu Val Pro Glu Glu

    50                  55                  60

Ile Met Gln Pro Pro Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Val Leu Ile Ile

65                  70                  75                  80

His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Gly Ile Leu Arg Arg Asn Phe Ser

                85                  90                  95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Val Ile Lys Thr Ile Leu Val Glu Leu

            100                 105                 110

Asp Gly Gln Met Asp Asp Leu Glu Thr Ile Leu Glu Glu Ile Met Glu

        115                 120                 125

Glu Glu Asn Phe Pro Arg Gly Asp Met Thr Ile Leu His Leu Lys Lys

    130                 135                 140

Tyr Tyr Leu Ser Ile Leu Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Arg Ser

145                 150                 155                 160

Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe

                165                 170                 175

Leu Asn Arg Leu Thr Asp Tyr Leu Arg Asn

            180                 185

Claims (10)

1.一种表达猪β干扰素的CHO细胞系，其含有编码猪β干扰素的基因。

2.根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述猪β干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码猪β干扰素的基因如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码猪β干扰素的基因之前加入了Kozak序列。

5.根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No.2412的CHO细胞系。

6.一种生产猪β干扰素标准品的方法，该方法包括：

1)培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；

2)从所述的CHO细胞系的培养液中提取β干扰素，用作猪β干扰素的标准品。

7.根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCCNo.2412的CHO细胞系。

8.根据权利要求6或7的方法生产的猪β干扰素标准品。

9.一种试剂盒，其包含根据权利要求6或7的方法生产的猪β干扰素标准品。

10.根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的猪β干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于猪传染性疾病的预防和治疗。

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