CN101588817A

CN101588817A - 骨髓白血病来源的细胞在抗体表达中的用途

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Publication number: CN101588817A
Application number: CN200780041241.9A
Authority: CN
Inventors: S·戈勒茨; A·丹尼尔奇克; H·鲍迈斯特; R·施塔恩; A·勒夫勒; L·施特克尔
Original assignee: Glycotope GmbH
Current assignee: Glycotope GmbH
Priority date: 2006-09-10
Filing date: 2007-09-10
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2027-09-10
Also published as: CN101588817B; ZA200901912B

Abstract

本发明涉及生产具有确定的糖基化模式的蛋白分子组合物的方法，其包含(a)在永生化人血细胞宿主细胞中引入至少一种核酸，其编码所述蛋白的至少一部分；和(b)在允许生产所述蛋白分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和(c)分离所述蛋白分子组合物。

Description

骨髓白血病来源的细胞在抗体表达中的用途

技术领域

本发明提供了生物技术上有利的生成蛋白分子组合物、尤其具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和人糖基化的抗体分子组合物的方法。另外提供了新颖的宿主细胞、核酸和蛋白分子组合物。

简介

工业上的一个关键特征和挑战是重组蛋白的生产，生产力、成本、同质性和蛋白活性是有待优化的关键问题。糖基化也是同质重组糖蛋白的高产量生产中的一个关键问题，所述同质重组糖蛋白在它们的生产中产生一系列的关键问题。每种现有的生产细胞系具有一系列不同的挑战和问题，它们主要是由于糖基化的复杂性和物种、组织和位点特异性。因此，在糖基化方面优化生产系统，仍然是优化的关键方面之一。这特别是由于糖基化模式的差异经常对蛋白分子的活性、免疫原性、生物利用度和半衰期有显著影响。在Jenkins等人(Getting theglycosylation right：implications for the biotechnologyindustry，Nat Biotechnology，1996，14：975-981)中，给出了源自不同物种和非哺乳动物生产系统的不同细胞系的糖基化性质的详细综述。

抗体是用于诊断和研究的主要工具，可能变成最大的治疗剂家族。有超过十种重组抗体治疗剂面市，数百种处于临床开发中。工业上的一个关键特征和挑战是重组抗体(“rMAbs”)的生产，生产力、成本、同质性和抗体活性是有待优化的关键问题。几乎所有面市的治疗性rMAbs已经在来自仑鼠(CHO)和小鼠(NS0或Sp2/0)的啮齿动物细胞系中生产。在开发中的绝大多数rMABs是在啮齿动物细胞中生产，其它处于开发中，但是，都没有充分优化生产力、成本、同质性和抗体活性。

糖基化也是同质的和有效的rMAbs的高产量生产中的一个关键问题，这在rMAbs的生产中导致一系列关键问题。每种现有的生产细胞系具有一系列不同的挑战和问题，它们主要是由于糖基化的复杂性和物种、组织和位点特异性[综述：Royston Jefferis，CCE IX：Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics；Biotechnol.Prog.2005，21，11-16]。

因此，在糖基化方面优化蛋白、尤其是抗体生产系统，仍然是优化的关键方面之一。

本发明提供了基于永生化人血细胞、尤其基于骨髓白血病起源的细胞的新的表达系统。这些细胞令人惊奇地在活性、产量和/或同质性方面提高了糖基化蛋白、尤其是抗体的生产。

背景技术

蛋白是一个彼此的功能和产生大不相同的集合。在具有治疗潜能的蛋白中，大多数蛋白为糖基化蛋白，例如许多激素(例如生长激素，胰高血糖素，FSH和LH)、生长因子(例如GM-CSF，G-CSF，VEGF和促红细胞生成素)、细胞因子(例如IL-2，IL-7，干扰素-α和-β，TNF-α)、抗凝血剂(例如重组水蛭素，地西卢定)、血液凝固因子(例如因子VII、VIII及IX)、疫苗(例如乙型肝炎抗原)及抗体。已建立的细胞生产系统不能够生产具有原始的人糖基化的蛋白。原核细胞(如细菌)和大多数真核细胞系统(如酵母、昆虫和植物细胞)会合成缺少糖基化或携带与人糖链大不相同的聚糖的蛋白。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种常用的生产系统，它能够以与人细胞相似的方式对蛋白糖基化。但是，仍然存在重要差异，例如，在半乳糖基化、岩藻糖基化、使用N-乙酰葡糖胺的特殊糖基化中，以及尤其在唾液酸化的各个方面。这些差异会影响活性、生物利用度、免疫原性和半衰期。

在建立这些生产系统的时候，生产至少在某种程度上具有活性的治疗蛋白是足够的。但是，目前很大努力集中提高治疗蛋白的活性，其目的是：(i)减少治疗蛋白的使用剂量的数目和浓度，(ii)减少治疗费用，和(iii)减轻副作用。

提高蛋白的生物活性的主要策略是，延长它们的血清半衰期，并因此提高它们的生物利用度。这可通过称为聚乙二醇化(PEG化)的方法完成，其中某些形式的聚乙二醇被化学添加/连接至所生产的蛋白中。PEG会增加分子量，并因此增加血清半衰期。然而，有几个问题与此方法有关。例如，在几乎所有情况下，PEG化通过其细胞效应子功能减小蛋白的活性，作为中和抗体在人体中重复使用常导致不良免疫应答，和/或生产过程需要其它化学修饰，从而导致需要附加成本、损失及时间的多步骤过程。存在具有相当缺点的类似的系统(例如HES化或白蛋白的结合)。

另外，为提高重组表达的蛋白的血清半衰期，糖链的修饰和蛋白的糖基化是焦点。因此，技术集中在使重组糖蛋白的唾液酸化程度最大化。唾液酸是真核细胞表面分布最广的末端单糖，通常认为糖蛋白被唾液酸化程度越大，它在循环中的血清半衰期就越长。这是基于某些受体作为去唾液酸蛋白-受体在肝脏中的存在，该受体结合循环的非唾液酸化的蛋白，并指导它们进入细胞进行降解。

在人和大多数哺乳动物中存在多种类型的抗体，即IgG，IgM，IgE，IgA，IgD。尽管所有抗体类型的分子用于诊断或用作研究工具，面市的和处于开发中的大部分基于抗体的治疗剂是IgG，少数是IgM。人IgG类别进一步分成4个亚类，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。IgG分子的基本结构由2个轻链和2个重链组成，它包含2个Fab区域(每个Fab区域具有一个包含抗原结合位点的可变域和一个恒定域)、一个Fc区域(它包含另外的恒定域和配体相互作用位点)和连接Fab和Fc区域的柔性铰链区。抗体可以作为完整分子或作为抗体片段(例如Fab片段)或单链Fv(它包含通过连接物相连的重链和轻链的2个可变区)存在。图18.显示了IgG抗体。

为了降低它们的免疫原性，用于治疗用途的重组抗体经常是嵌合的、人源化的、或所谓的全人蛋白序列。但是，不能容易地得到真正的全人分子，因为翻译后修饰(例如特别是糖基化)不是人的，这是由于在啮齿动物或CHO细胞中生产，因而不同于在人血清中人抗体上发现的那些修饰。修饰(尤其是糖基化模式)的差异，可以分别对生成的抗体的活性和免疫原性具有严重影响。

抗体的活性可以是由于多种因素或受多种因素的影响。一方面，抗体具有某些特异性，其由位于Fab区域的抗体可变区(“V区域”)介导，其中V区域的某些序列(CDR区域)在抗体的特定特异性和亲和力测定中起关键作用。V区域因而对于表位结合特征是决定性的，且随抗体而不同。抗体的亲和力描述了抗体的单个结合区结合它的表位的强度和动力学。由于不同类别和亚类的抗体携带一个抗体分子中的2至10个相同的可变区，抗体结合的强度和动力学受到可用于结合的结合位点数目和靶抗原或细胞上表位的可达性影响，表达为它的亲合力。

就它用于诊断和尤其是治疗的用途而言，抗体质量的另一个重要因素是它的靶物结构或细胞上抗体的结合位点的数目以及它的内化速率。这些质量会影响抗体用于尤其是治疗的效果和适用性。

另一方面，与抗体的治疗用途有关的效应机理是多种，由此有些抗体仅通过一种机理起作用，其它抗体通过多种效应机理的组合起作用。一种策略是偶联抗体或抗体片段到介导治疗效应的效应分子上，例如偶联到免疫效应分子(例如白细胞介素-2)以征集免疫系统，或偶联到毒素或放射性同位素以杀死靶细胞，例如用于抗肿瘤治疗。放射标记的抗体或抗体片段对于体内诊断也是有价值的。

另一种策略是使用未标记的、所谓的“裸”抗体，其可以具有重要的优点，例如更低的毒性、更少的并发症(complicated logistics)，使用天然免疫效应子臂或在不需要其它效应分子的情况下触发治疗效应。已经进行了大量研究来解释抗体的活性机理和作用模式，以及使用这些活性来开发抗体。最重要的活性和效应是依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性活性(本文中称作“ADCC活性”)，依赖于补体的细胞毒性活性(本文中称作“CDC活性”)，吞噬作用介导的细胞毒性活性(本文中称作“吞噬活性”)，包含一整组不同效应和活性的受体介导的活性(本文中称作“受体介导的活性”)。

受体介导的活性主要是基于抗体对靶细胞上的分子或受体的结合，或通过阻止某些分子对靶细胞的结合，从而诱导或抑制这些细胞上的某些效应，例如拮抗或激动活性或抗体对受体的阻断，导致例如细胞凋亡的诱导或抑制、或靶细胞的增殖、或靶细胞中某些分子的分泌或分泌抑制，或阻断或触发某些其它受体介导的分子和细胞之间或细胞之间的事件例如相互作用。ADCC活性、CDC活性和吞噬活性是由抗体的Fc区域介导的细胞毒性活性(本文中称作“Fc部分介导的活性”)，而受体介导的抗体的活性、亲和力、亲合力和特异性主要是通过Fab区域中包含的抗体的结合区来介导。

通过结合效应配体例如Fc-γRI，Fc-γRII，Fc-γRIII，补体的C1q组分，新生的Fc受体(FcRn)，等，通过免疫效应细胞(例如杀伤细胞、天然杀伤细胞和激活的巨噬细胞或各种补体组分)来介导Fc部分介导的活性。据报道，在人IgG类分子中，人IgG1亚类具有最高的ADCC和CDC活性。就IgM而言，CDC活性是优势的效应机理。ADCC活性和CDC活性包含Fc区域(抗体的恒定区)对效应细胞的Fc-受体(例如Fc-γRI，Fc-γRII，Fc-γRIII)或补体组分(例如C1q)的结合。重要的氨基酸残基是在铰链区、尤其是恒定区的第二域(“Cγ2域”)。结合Cγ2域的糖链对活性而言是重要的。糖链结合在Cγ2的氨基酸天冬酰胺297(Asn-297)(N-糖苷连接的糖链)。结合天冬酰胺的糖链末端称作还原端，相对端称作非还原端。IgG抗体的Fc区域具有2个糖结合位点。图18显示了IgG分子的结构，指出了可以发现典型的糖结构的位置。此外，解释了这些糖结构的化学结构和组成。

从Fc部分介导的活性，假定2种受到抗体糖基化的影响：已经证实，抗体Fc部分中糖链的去除会导致CDC和ADCC活性的消失，这些N-聚糖中半乳糖的减少也会造成CDC活性的降低[Boyd等人，Molecular Immunol.，32，1311，(1995)；US 6946292]。此外，描述了与在仓鼠和大鼠细胞中表达的相同抗体相比，大鼠细胞中抗体的表达会导致其中表达的某些抗体的ADCC活性的增加[Lifely等人，Glycobiology，1995Dec；5(8)：813-22；WO00/61739]。两篇报道都假定，糖基化的变化造成抗体ADCC活性的这些差异，但是，这是不清楚的。Lifely等人1995假定，二等分N-乙酰葡糖胺(“bisecGlcNAc”)引起抗体的ADCC活性增加，而WO00/61739假定，连接到在N-聚糖还原端的N-乙酰葡糖胺上的岩藻糖α1-6(“核心-岩藻糖”)的急剧降低，是增加的ADCC活性的原因。此外，描述了与在未用GnTIII重组转染的CHO细胞中表达的相同抗体相比，当在这些细胞中表达时，CHO细胞中负责将糖bisecGlcNAc结合到N-聚糖上的酶GnTIII的重组表达导致某些抗体的ADCC活性的增加[US 6602684，Umana等人，Nature Biotechn 17：176-180(1999)]。另外，描述了当在这样的FUT8KO CHO细胞中表达时，CHO细胞中导致核心-岩藻糖缺失的基因FUT8敲除可以增加某些抗体的ADCC活性[US 6946292]。这些结果也证实了糖基化模式对抗体活性的重要性和复杂性。

但是，“外源的”和因而未优化的糖基化模式不仅有害于活性，也可能是免疫原性的。现有的蛋白、尤其是抗体的表达和生产系统主要是源自啮齿动物的细胞系，基于来自仓鼠、小鼠或大鼠的细胞系，例如CHO，BHK，NS0，Sp2/0和YB2/0。已知啮齿动物细胞可以在非最佳条件下生成许多异常糖基化的蛋白产物，它们缺少效价或是免疫原性的。另外，已知啮齿动物细胞会表达与人细胞中表达的那些显著不同的、存在非人糖且缺少某些人糖部分的糖结构，这可以使在这些细胞中表达的蛋白具有例如免疫原性、更低的有效性、更低的产量或亚适结构需求或折叠。大多数啮齿动物细胞会表达例如N-乙醇酰基神经氨酸(“NeuGc”)，这是不存在于人中的N-乙酰基神经氨酸(“NeuNAc”)的一种替代物，它在人中是免疫原性的，和/或免疫原性的半乳糖α(1-3)半乳糖修饰(“Galα1-3Gal”)，和/或它们缺少重要的糖例如重要的α2-6连接的NeuNAc，或它们缺少bisecGlcNAc。还存在其它已知的和未知的差异。另外，从啮齿动物生产已知，糖形大部分是异质的，并且在CHO、NS0或Sp2/0细胞的克隆之间不同的克隆特异性的糖形也依赖于生产方式和培养条件。

此外，存在用于生产蛋白的表达系统，它们包括人细胞，例如Hek293细胞，它们源自人胚肾细胞或源自单个人视网膜衍生细胞(使用重组DNA技术使它成为永生化的)的细胞系统

但是，这些细胞系尽管经常优于非人细胞系统，仍然具有一些缺点。它们具有独特的糖基化模式，这可以归因于各个细胞的糖基化机理。但是，根据要生产的蛋白，它们可能不递送优化的糖基化模式，例如关于蛋白的活性和/或血清半衰期。具体地，用这些细胞难以实现唾液酸化的某些程度和模式。例如，本领域已知的细胞系统经常不能提供可检测的α2-6连接的唾液酸化，但是，后者对于血清半衰期是重要的。

从这些事实可以看出，仍然需要可以进一步优化生产力、同质性和/或抗体活性的表达和生产系统，这通过提供替代系统和/或改进的表达系统来实现。此外，从这些事实也可以看出，不能指出哪些糖结构、尤其哪些人糖结构对于提高蛋白、尤其是抗体的活性或同质性是最佳的，以及细胞系、尤其是人细胞系必须提供哪类糖基化模式，以便优化蛋白、尤其是抗体的活性。因此，需要与用本领域已知的表达系统得到的产物相比，会提供具有差异化的糖基化模式的产物的表达系统。

本发明通过提供基于人永生化血细胞系、尤其是骨髓白血病起源的细胞的新表达系统，提供了这些问题的解决方案。与现有技术已知的系统相比，使用永生化人血细胞是有利的，因为这些细胞会提供不同于源自不同组织(例如肾或视网膜)的其它已知人细胞系统的糖基化模式。这些差异在活性、同质性和产物产量方面可能是有利的。此外，可以转染这些细胞，并在无血清条件下悬浮生长。

因此，根据第一个实施方案，提供了生产蛋白组合物的方法，其包含下述步骤：

(a)向宿主细胞(它是永生化人血细胞)中引入至少一种核酸，其编码所述蛋白的至少一部分；和

(b)在允许生成所述蛋白组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和

(c)分离所述蛋白组合物。

使用永生化人血细胞的该方法会在活性、产量和/或同质性方面提高蛋白、尤其是抗体的生产。这是令人惊奇的，因为迄今为止没有证实永生化人血细胞、尤其是骨髓白血病细胞适用于生产蛋白，尤其导致抗体具有各种提高的性质。尽管某些大鼠白血病细胞被用于表达抗体，人和大鼠之间的糖基化机理决定性的不同，由此后者可以表达在人中是免疫原性的糖部分，例如NeuGc和Galα1-3 Gal。据称大鼠YB2/0白血病细胞会产生具有更高ADCC活性的抗体，这是由于更高的bisecGlcNAc存在或由于核心-岩藻糖的急剧下调。

甚至更令人惊奇地，本发明使用永生化人血细胞、尤其是髓样细胞解决了问题，因为以前报道，细胞系K562(一种骨髓白血病细胞)不会表达bisecGlcNAc的酶，通过GnTIII的基因杂交描述和证实了该发现[Yoshimura M等人，Cancer Res.56(2)：412-8(1996)]，且确实表达基因FUT8，它会表达造成核心-岩藻糖的添加的岩藻糖基转移酶，如RT-PCR所证实的[实施例1]。这是令人惊奇的，因为K562不能耐受凝集素处理，因为它会被凝集素LCA强烈结合，这是核心-岩藻糖基化阴性的或强烈下调的细胞的基础。由于关于K 562细胞的糖基化的该信息，不能预见到这些细胞可以提高在其中表达的抗体的活性，因为假定不存在有利的活性模式所必需的糖基化机理。还令人惊奇地，与现有的表达系统的细胞相比，使用本发明的生产方法可以产生和得到具有增加的结合活性、提高的同质性和/或更高的产量的蛋白、尤其是抗体。

本发明的策略是，建立合适的人细胞系，以便得到系统，其可以提供具有与人系统尽可能接近的一整组翻译后修饰、因此在人系统中不具有或具有更少的免疫原性性质和/或具有提高的活性的蛋白产物。其目的是为要表达的每种蛋白/抗体提供定制的糖基化模式。

由于下式事实，糖结构是非常复杂的、细胞的糖基化机理包含数百种参与它们的合成的酶、和这些酶主要物种特异性地和组织特异性地表达，发明人的实现人糖基化的主要策略是，提供合适的生物技术上的人表达系统来表达具有优化的糖基化模式的蛋白、尤其是抗体。由于优化的糖基化模式可以在蛋白之间不同和在抗体之间不同，本发明提供了生产不同糖基化模式的细胞系，从而允许选择生产细胞系，其生产为各种蛋白/抗体产物优化的糖基化模式。

因此，本发明提供了生物技术上有利的生产蛋白组合物、尤其是抗体分子组合物的方法，所述组合物具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化。另外提供了新颖的宿主细胞、核酸和分子组合物。

因此，提供了生产具有确定的糖基化模式的蛋白组合物、优选抗体分子组合物的方法，其包含下述步骤：

(a)向作为宿主细胞的永生化人血细胞中引入至少一种核酸，其编码蛋白或其至少一部分；

(c)分离具有预期的糖基化特征的所述蛋白组合物。

为了得到根据本发明具有提高的性质的蛋白组合物、尤其是抗体组合物，选择宿主细胞来生产具有至少一种下述糖基化特征的蛋白/抗体组合物：

(i)它不含有可检测的NeuGc。

如上所述，NeuGc糖基化在人中可以具有免疫原性性质。因此，希望尽可能避免各个糖基化。通过使用永生化人血细胞、尤其是人骨髓白血病起源的宿主细胞，避免各个糖基化。

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中的相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加的半乳糖基化程度。

发现半乳糖残基主要β1-4连接至抗体的复杂型N-聚糖的触角上的GlcNAc残基，但是也已经发现了β-1，3键。但是，它们通常以三触角结构存在。半乳糖基化程度对活性(尤其是关于抗体)的影响是显著的。已经证实，半乳糖的剥夺会导致降低的CDC活性。因此，可以优选地具有高度的半乳糖基化。就其它蛋白而言，半乳糖基化也可能起重要作用。

当提及蛋白分子的总糖结构时，考虑蛋白分子的所有糖基化。在分析蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构时，焦点在于特定的糖结构，例如结合到抗体分子Fc部分的Asn 297上的糖结构(也请参考图18)。在评价各个特定结构的情况下，测定特定结构的含量/组成。也可以称作总糖单元和决定所述特征的特定糖链(它们是同义词)。

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中的相同量的蛋白分子相比，它具有高至少5％的量的G2结构，该G2结构是在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上。

更具体地，在根据本发明的方法生产抗体的情况下，大量G2结构是有益的。“G2结构”定义了一种糖基化模式，其中半乳糖存在于结合到Fc区域的双触角结构的两端(在抗体的情况下)(也请参考图18)。如果发现了一个半乳糖分子，它称作G1结构，如果没有半乳糖，称作G0结构。经常发现G2糖基化模式会提高抗体的CDC。因此，优选地，至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、95％或甚至超过100％的更高量的G2结构存在于生成的蛋白/抗体组合物中。本文描述了实现各个高G2糖基化模式的合适的细胞系。

由于高总体半乳糖基化程度经常有益于抗体的CDC，经常有益地在总糖结构上或在蛋白、尤其抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上得到60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至超过95％的G2和/或G1结构。

根据另一个实施方案，超过35％(40％、45％、50％、55％、60％、65％或超过70％)的G2结构存在于总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上。

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少5％的量的G0结构。

如上所述，高半乳糖基化程度经常是有利的。因此，优选地选择细胞系，使得避免G0结构。G0结构的量优选地低于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或该量甚至更低。

根据另一个实施方案，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上存在小于22％(20％、18％、15％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、小于5％)的G0结构。

(v)它不含有可检测的末端Galα1-3Gal。

如上所述，Galα1-3Gal糖基化在人中可以是免疫原性的。该糖基化表征了一种模式，其中第二个半乳糖残基在α1，3位置连接至第一个半乳糖残基，产生高免疫原性的Galα1-3Gal二糖。通过使用永生化人血细胞、尤其是人骨髓白血病起源的宿主细胞，避免了各个不利的糖基化。

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含少至少5％的量的岩藻糖。

在N-聚糖树内的不同位点上发现了岩藻糖残基，所以具体地：

-α1，6连接至在氨基酸strain附近的GlcNAc残基；

-α1，3和α1，4连接至触角位置的GlcNAc残基；

-α1，2连接至触角位置的Gal残基。

在抗体结合的N-聚糖上，发现大多数岩藻糖残基1，6连接至邻近的GlcNAc残基(所谓的“核心岩藻糖”)。已经发现，在结合到抗体上的N-聚糖的还原端缺少核心岩藻糖，会使抗体的ADCC活性提高因子(factor)25至100。由于对ADCC的该有益作用，优选地当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，岩藻糖的量少至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、1000％、1500％或超过2000％。本发明也提供了特别构建的细胞系，其实现各个低总岩藻糖基化。

根据另一个实施方案，选择所述宿主细胞来生产糖蛋白，其包含总糖结构或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖结构的糖的至少10％(15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或超过80％)，其缺少岩藻糖。关于抗体，特别优选地，结合到Fc区域上的N-糖苷连接的糖链包含具有GlcNAc的还原端，其中所述糖链不含有结合到糖链还原端的GlcNAc的6位置上的岩藻糖。

(vii)它包含至少一个含有二等分GlcNAc的糖结构。

经常发现二等分N-乙酰葡糖胺(bisGlcNAc)β1，4结合到抗体中存在的N-聚糖的三甘露糖基核心结构的中央甘露糖残基。二等分GlcNAc在抗体Fc-N-聚糖的中央甘露糖残基处的存在，会增加抗体的ADCC活性。

根据另一个实施方案，选择所述宿主细胞，使得与含有二等分GlcNAc且不含有岩藻糖的各个糖结构相比，生成的所述蛋白包含更多的不含有岩藻糖且不含有二等分GlcNAc的所述蛋白分子组合物中的蛋白分子的总糖单元(或在蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链)的糖结构。

根据另一个实施方案，选择所述宿主细胞，使得与含有二等分GlcNAc且不含有岩藻糖的各个糖结构相比，生成的所述蛋白包含更多的含有更多二等分GlcNAc和岩藻糖的所述蛋白分子组合物中的蛋白分子的总糖单元(或在蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链)的糖结构。

(viii)当在其中表达时，具有与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的唾液酸化模式相比改变的唾液酸化模式。

唾液酸化程度/模式对活性、半衰期和生物利用度的影响随不同蛋白/抗体而不同。因此，有益地通过使用根据本发明的筛选方法，提前确定各个蛋白/抗体分子的优化的唾液酸化模式，然后用最合适的宿主细胞进行生产，提供希望的糖基化模式。例如，几篇出版物报道了抗体Fc聚糖上存在的唾液酸残基对下游效应(即CDC和ADCC)的负面影响。但是，发现高唾液酸化会延长唾液酸化的分子的半衰期。因此，根据生产的蛋白/抗体，不同的唾液酸化模式是有利的，本发明提供了具有不同唾液酸化活性的永生化人血细胞系，从而允许得到具有优化的糖基化模式的蛋白/抗体。

根据一个实施方案，选择宿主细胞，使得它生成具有降低的唾液酸化程度的蛋白，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的唾液酸的量低至少10％(优选15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、＞95％)。根据一个实施方案，该产物甚至包含不可检测的NeuNAc。根据生产的蛋白/抗体，唾液酸和具体地NeuNAc的存在可能不促成蛋白/抗体的活性。在这些情况下，可以有利地避免唾液酸糖基化，以便使产物更同质。NeuNAc糖基化模式也可以在得到的蛋白组合物中变化。这可以造成管理当局难以批准产品，因为产品是由于改变NeuNAc含量更不同质。

对于它们的活性不依赖于NeuNAc糖基化的蛋白/抗体，为了增加同质性，可以有益地避免NeuNAc糖基化。但是，“没有可检测的NeuNAc”不一定是指绝对不存在NeuNAc。相反，也包括具有相当低程度的NeuNAc(例如1-10％)的实施方案。各种蛋白的一个示例是FSH。

根据一个实施方案，产物具有降低的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少15％(20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、＞500％)的量的NeuNAc。在假定表达蛋白/抗体的情况下，其中所述唾液酸化对蛋白/抗体的活性具有负面影响，该实施方案是有益的。

通过在无血清培养基中使用唾液酸化缺陷型细胞例如NM-F9和NM-D4，可以实现各个糖基化(不存在或非常低程度的唾液酸或具体地NeuNAc)。

根据另一个实施方案，产物具有增加的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的NeuNAc的量高至少15％(20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或超过500％)。

如上所述，各自增加的唾液酸化程度可以提供对蛋白的血清半衰期的正面影响，这通过延长它来实现。在这些情况下，优选地使用这样的细胞系，它会提供比CHOdhfr-细胞[ATCC No.CRL-9096]更高的唾液酸化程度，且也提供比唾液酸化缺陷型细胞(例如NM-F9和NM-D4)更高的唾液酸化程度，其中需要加入前体，以便发生唾液酸化。但是，当培养这些唾液酸化缺陷型细胞时，即使加入各个前体，这些细胞通常仅达到不具有唾液酸化必需的糖基化机理中的遗传突变/缺陷的永生化人血细胞的约50-60％的唾液酸化程度。因此，对于其中需要更高的唾液酸化程度的实施方案，优选地使用能提供各个高唾液酸化程度的细胞系而不使用NM-F9和NM-D4。

根据另一个实施方案，产物包含α2-6连接的NeuNAc。另外，α2-3连接的NeuNAc可以在一定程度上存在。关于有些蛋白/抗体，NeuNAc糖基化的存在是有益的，尤其关于蛋白/抗体的半衰期。提供α2-6连接的NeuNAc是有益的，因为该糖基化模式类似于人糖基化模式。啮齿动物细胞通常提供α2-3连接的NeuNAc。另外，其它现有的人细胞系不能提供足够的α2-6连接的NeuNAc糖基化。

适用于提供各个糖基化模式的细胞系是例如NM-H9D8和NM-H9D8-E6。

根据另一个实施方案，使用这样的宿主细胞，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，其生产的蛋白包含多至少20％负载的总糖单元或在所述蛋白分子组合物的所述蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链的N-糖苷连接的糖链。

糖链的负载也可能影响性质，因而应当考虑。负载糖链的化学基团是，例如，硫基或唾液酸。

根据一个替代实施方案，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，所述产物包含少至少20％负载的总糖单元或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链的N-糖苷连接的糖链。

根据另一个实施方案，选择所述宿主细胞来生产糖蛋白，其包含总糖单元或含有二等分GlcNAc的所述蛋白分子组合物中的蛋白分子的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链的糖结构的至少2％(5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，或超过45％)。

根据一个实施方案，将宿主细胞用于生产蛋白，其描述了下述性质：

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有增加的活性、增加的产量和/或提高的同质性；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有增加的平均或最大产量，这比来自相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的产量高至少10％；和/或

-它具有提高的同质性，这是提高的糖基化同质性，其中当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，所述抗体分子组合物具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的唾液酸化程度更低的唾液酸化程度；和/或

-在所述蛋白分子是抗体分子的情况下，它具有增加的Fc-介导的细胞毒性，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，这比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍；和/或

-在所述蛋白分子是抗体分子的情况下，它具有增加的抗原介导的或Fc-介导的结合，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，这比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的结合高至少50％。

如上所述，通过优化本文所述的蛋白的糖基化，可以得到各个性质。令人惊奇地发现，使用一些基于糖基化的抗体，也可以改变和提高结合性质。本文也描述了合适的宿主细胞。

根据另一个实施方案，所述蛋白分子组合物的提高的同质性是具有至少一种下述特征的所述蛋白分子组合物的提高的糖基化同质性：

-没有可检测的NeuGc；

-没有可检测的NeuNAc；

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，比来自相同蛋白分子的蛋白分子组合物更多的NeuNAc；

-可检测的α2-6连接的NeuNAc。

根据另一个实施方案，选择所述宿主细胞来生产蛋白组合物，其包含具有下述特征糖基化模式之一的蛋白分子：

(a)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的蛋白组合物相比，或与唾液酸化缺陷型细胞系例如NM-F9和NM-D4相比，它包含增加量的唾液酸。

(b)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的蛋白组合物相比，它包含减少量的唾液酸。

(c)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-它包含2-6NeuNAc。

在表9中描述了导致提高的特征的其它合适的特征组合。

根据本发明，术语“蛋白分子”是指目标蛋白或其活性片段和/或突变体，由此可以使用任意的蛋白，优选人起源的任意糖蛋白。术语“蛋白分子”是指任意的多肽分子或其部分。它可以由一个或多个核酸编码。它可以以分泌形式或其部分或含有融合伴侣的融合蛋白来生产。优选地，将蛋白分泌进上清液。在总生产过程方面，该实施方案是特别有益的，因为例如可以避免脱落步骤(例如使用佛波酯)。

哺乳动物糖蛋白的实例包括以下分子，例如细胞因子及其受体，例如TNF-α和TNF-β；肾素；人生长激素及牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链及B链；促性腺激素，例如促卵胞生成激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)，促甲状腺激素及人绒毛膜促性腺激素(hCG)；降血钙素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、因子VII、组织因子及血管假性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子，例如尿激酶、人尿和组织型纤溶酶原激活剂；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；人巨噬细胞炎症蛋白；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A链及B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A及蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5，神经营养因子-6及神经生长因子-β；血小板源生长因子；成纤维细胞生长因子；表皮生长因子；转化生长因子，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子-II；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白；干扰素，例如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-12；过氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；抗体及免疫粘合素、血型糖蛋白A、MUC1。

前述许多糖蛋白属于“细胞因子”，在本文中是指在免疫系统细胞中存在的一般种类的激素，淋巴因子和单核因子，以及其它细胞因子。该定义旨在包括但不限于那些在局部起作用而不在血液中循环的激素，当用于本发明时，会导致个体免疫应答的改变。其它合适免疫调节细胞因子的实例包括但不限于干扰素(例如IFN-α，IFN-β和IFN-γ)、白细胞介素(例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10和IL-12)、肿瘤坏死因子(例如TNF-α和TNF-β)，促红细胞生成素(EPO)、FLT-3配体、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CD2及ICAM。对于促红细胞生成素，认为该分子促进祖细胞成熟为红细胞，而血小板生成素被认为促进祖细胞经历血小板途径。CSF是指诱导骨髓中发现的祖细胞分化为特定类型成熟血细胞的淋巴因子家族。祖细胞产生的成熟血细胞的具体类型依赖于存在的CSF的类型。相似地，粒细胞-巨噬细胞集落形成依赖于GM-CSF的存在。另外，当被证明对免疫系统显示相似活性时，与IL-2、GM-CSF、TNF-α等的人源形式基本同源的其它哺乳动物细胞因子可用于本发明。

类似地，与特定蛋白基本类似但蛋白序列具有相对较小变化的蛋白也用于本发明。众所周知，蛋白序列的某些小的改变是可能的，不会影响蛋白分子的功能性能力，因此可以制备在本发明中作为与其父本蛋白起作用但与现有已知序列稍有不同的蛋白。因而也包含维持生物学功能的各个变体。

优选的糖蛋白选自：血型糖蛋白A，EPO，G-CSF，GM-CSF，FSH，hCG，LH，干扰素，白细胞介素，抗体和/或其片段。

上述的所有蛋白分子可以与其它肽或多肽序列融合，例如、但不限于，连接物、激活分子或毒素。

在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸编码分泌形式的蛋白或其片段。在一个优选实施方案中，所述分泌形式缺少跨膜域。

根据本发明，术语“蛋白分子组合物”是指根据本发明的方法、尤其是在可以分离的本发明的宿主细胞中表达的任意蛋白分子的分子。所述蛋白分子组合物包含至少一种蛋白分子。所述蛋白组合物包含蛋白分子的至少一种糖形。所述蛋白分子的糖形是指携带在至少一个糖构造块方面不同的特定糖基化的糖链的蛋白分子，例如、但不限于，额外的半乳糖，唾液酸，bisecGlcNAc，岩藻糖，或另一种糖修饰，例如、但不限于，来自相同蛋白分子的另一种糖形的乙酰化或sulfatation的分子。在本发明的另一个实施方案中，蛋白分子组合物可以包含在宿主细胞中表达的超过一种蛋白分子的分子。在一个优选实施方案中，本发明的蛋白分子组合物包含更多百分比的这种糖形的蛋白分子，当在其中表达时，它们介导比从细胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NS0、或SP2/0、或Pe C.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]得到的相同蛋白分子的蛋白分子组合物更高的活性。在另一个优选实施方案中，本发明的蛋白分子组合物包含更多百分比的这种或本发明中所述分子的糖形的蛋白分子，当在其中表达时，它们介导比从细胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NS0、或SP2/0、或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]得到的相同蛋白分子的蛋白分子组合物更高的活性。

根据本发明，术语“抗体分子”是指任意完整抗体或抗体片段或包含抗体片段的分子。所述完整抗体可以是任意抗体或任意类别或子类的免疫球蛋白分子或包含本领域技术人员已知的至少一个免疫球蛋白域的任意分子，包括但不限于，动物起源的IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD，例如、但不限于，人，猿猴，啮齿动物，小鼠，大鼠，仓鼠，兔子，骆驼，鸟，鸡，或鲨鱼起源，且也可以是包含来自源自不同动物的抗体(例如嵌合的或人源化的抗体)的蛋白序列的分子，其中将不同百分比的例如鼠和人序列组合成完整抗体，和/或突变，以例如降低免疫原性或增加亲和力，这是本领域技术人员已知的。在本发明的另一个实施方案中，所述完整抗体也可以是具有至少一个额外的氨基酸或多肽序列的前述完整抗体。

在一个优选实施方案中，所述完整抗体是人、人源化的或嵌合的包含人Fc区域的IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。在本发明的另一个优选实施方案中，所述完整抗体是人、人源化的或嵌合的具有人Fc区域的IgG1、IgG4或IgM。所述人Fc区域包含至少一个20氨基酸序列、更优选至少100个氨基酸的人抗体Fc区域的恒定域，优选地它包含人抗体的至少一个Fc域，更优选它包含人Cγ2域，更优选它包含某些类别或子类的人抗体的Fc区域的所有恒定域。所述人Fc区域也可以包含突变了至少一个氨基酸的人序列。

在本发明的最优选实施方案中，完整抗体分子是：(i)例如从生产人抗体的血细胞或细胞或从转基因小鼠制备的全人抗体，在所述转基因小鼠中，小鼠抗体基因座至少部分地被替换为人抗体序列，或(ii)人源化的完整抗体，其中鼠或大鼠抗体的可变区的至少一部分(例如框架区或框架的至少一个氨基酸)被替换为人序列或被突变以在人中的免疫原性更低，其包含人恒定域，或(iii)嵌合的完整抗体，其中可变区是鼠或大鼠且包含人恒定域。

所述全人抗体、人源化的完整抗体和嵌合的完整抗体或其部分，以及构建、鉴别、测试、优化和选择这些具有或没有合适的其它序列的抗体分子的方法，以及构建、鉴别、测试和选择最合适的编码这些抗体分子的核酸的方法，是本领域技术人员已知的。

所述抗体片段是包含来自所述完整抗体的至少20个氨基酸、优选至少100个氨基酸的抗体的任意片段。在一个优选实施方案中，抗体片段包含抗体的结合区，例如Fab，F(ab)2，包含多个结合域的多体(multibodies)，例如双体、三体或四体，单域抗体或affibodies。在另一个优选实施方案中，抗体片段包含具有全部或一部分恒定域的Fc区域，优选包含第二域(Cγ2域)。在另一个实施方案中，抗体片段是截短的完整抗体，其中至少一个氨基酸、多肽区段或整个域被删除。那些分子可以与其它序列相组合，用于稳定化或提高连接物等分子的结合。

所述包含抗体片段的分子是包含任意所述抗体片段或至少20个氨基酸的其它免疫球蛋白域的任意分子。在一个优选实施方案中，所述包含抗体片段的分子是融合分子，其中抗体片段与其它蛋白序列相融合，例如效应子序列，例如细胞因子，辅助刺激因子，毒素，或来自其它抗体的抗体片段，以便建立具有多种结合特异性的分子，例如双或三特异性的抗体，或用于导致结合域的多聚化的多聚化序列例如MBP(甘露聚糖结合蛋白)域，或用于检测、纯化、分泌或稳定化的序列，例如标记、定位信号或连接物等。在另一个优选实施方案中，所述包含抗体片段的分子是包含完整抗体的Fc区域或其部分的融合分子，优选包含第二个恒定域(Cγ2域)。所述融合分子通过基因方式融合，其中该分子由一种核酸编码，或通过至少2种核酸的共表达来融合，由此通过非共价或共价蛋白相互作用来造成融合，或通过二者的组合来融合。通过基因工程，可以实现抗体片段和另一个多肽序列或蛋白分子之间的基因融合，其中两个部分由单个核酸编码，二者之间有或没有其它氨基酸。在另一个优选的实施方案中，所述融合分子包含至少一个来自抗体片段的结合区，例如单域抗体或Fab或非源自抗体的结合序列，例如凝集素域和Fc区域或其包含第二域(Cγ域)的部分。在另一个优选实施方案中，融合分子包含IL-2，IL-12，IL-15，GM-CSF，肽毒素，或其部分。它们例如通过基因方式来融合，其中分子由一种核酸编码，或通过至少2种核酸的共表达来融合，由此通过非共价或共价蛋白相互作用来造成融合，或通过来自抗体片段的comion来融合，例如单域抗体，Fab或连接至MBP的多聚化序列的Fab。

所有这些抗体分子或其部分，以及构建、鉴别、测试和选择这些有或没有合适的其它序列的抗体分子的方法，以及构建、鉴别、测试和选择最合适的编码这些抗体分子的核酸的方法，是本领域技术人员已知的。

根据本发明，术语“抗体分子组合物”是指在可以分离的本发明的宿主细胞中表达的任意抗体分子的分子组合。所述抗体分子组合物包含至少一种抗体分子。所述抗体分子组合物包含抗体分子的至少一种糖形。所述抗体分子的糖形是指携带特定糖基化或相差至少一个糖构造块的糖链的抗体分子，例如、但不限于，另一半乳糖，唾液酸，bisecGlcNAc，岩藻糖，或另一种糖修饰，例如、但不限于，来自相同蛋白分子的另一种糖形的乙酰化或sulfatation。在本发明的另一个实施方案中，抗体分子组合物可以包含在宿主细胞中表达的超过一种抗体分子。在一个优选实施方案中，本发明的抗体分子组合物包含更多百分比的这种糖形的抗体分子，当在其中表达时，它们介导比从细胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NS0、或SP2/0、或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]得到的相同抗体分子的抗体分子组合物更高的Fc-介导的细胞毒性和/或提高的结合。在另一个优选实施方案中，本发明的抗体分子组合物包含更多百分比的这种糖形的抗体分子，当在其中表达时，它们介导比从细胞系CHO、或CHOdhfr-、或BHK、或NS0、或SP2/0、或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]得到的相同抗体分子的抗体分子组合物更高的Fc-介导的细胞毒性和/或提高的结合。

根据本发明，术语“人骨髓白血病起源的宿主细胞”或等价描述是指人骨髓白血病起源的任意细胞或细胞系，或可以从白血病患者得到的任意人骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系，或可以从人供体得到的任意骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系，或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系，或包含前述这些细胞中的至少一种的细胞或细胞系的混合物。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的所述人骨髓白血病起源的宿主细胞或所述永生化人血细胞也包含通过融合至少一种前述宿主细胞、尤其骨髓白血病起源的那些宿主细胞与人或动物起源的另一种细胞(例如、但不限于，B细胞，CHO细胞)得到的这样的细胞或细胞系。本领域技术人员能鉴别和使用合适的来源和方法得到、建立来自人的合适的细胞和细胞系和/或使其永生化，用作人骨髓白血病起源的合适的宿主细胞。

术语源自所述宿主细胞的细胞或细胞系是指，经过或不经过所述骨髓白血病起源的宿主细胞的预先突变或基因工程，通过任意培养和克隆方式可以得到的任意细胞或细胞系，且包含选择具有希望的性质的那些源自所述宿主细胞的细胞或细胞系。所述培养和克隆是基于下述事实，即通过多轮细胞的传代和克隆，优选使用单细胞克隆方法，例如有限稀释或基于细胞分类的流式细胞术，可以从原代细胞培养物、细胞培养物和甚至细胞克隆培养物得到具有不同性质的细胞克隆。在一个优选实施方案中，通过结合凝集素或结合糖的抗体，选择所述源自所述宿主细胞的细胞或细胞系。通过本领域技术人员已知的处理，使用物理的、化学的或生物的诱变剂，例如、但不限于，辐射、烷化剂或EMS(甲磺酸乙酯)、蛋白例如凝集素或病毒颗粒，可以进行所述突变。通过本领域技术人员已知的方法，例如通过位点特异性的同源重组敲除基因，使用转座子，位点特异性的诱变，某些核酸的转染，或基因沉默，或基因产物，可以进行所述基因工程。所述培养和克隆的方法、所述突变和诱变原和所述基因工程是本领域技术人员已知的，一些实例详细描述在WO2005/017130A2，US 2003/0115614A1，或如本文所述。本领域技术人员能选择和/或采取和/或修改合适的方法或建立从所述本发明的宿主细胞衍生的合适细胞或细胞系的方法的组合。

根据与它们的母细胞或细胞系相比有利的下述细胞性质，选择所述源自所述宿主细胞的细胞或细胞系：例如、但不限于，更短的倍增时间，更快的生长，在更高密度下生长的可能性，产量更高，能在无血清条件下和/或在无蛋白培养基中生长，更高的克隆效率，更高的DNA转染效率，更高的抗体分子组合物表达速率，在其中表达的抗体分子组合物的更高的活性，在其中表达的抗体分子组合物的更高的同质性，和/或更高的放大稳健性。选择具有有利性质的那些细胞的方法是本领域技术人员已知的或如本文所述。本发明提供了制备本发明的宿主细胞的方法，其包含(a)与凝集素或抗体一起温育人骨髓白血病细胞，所述凝集素或抗体识别去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位，但是结合无唾液酸化形式的或显著更少的唾液酸化形式的表位，和(b)分离结合到所述凝集素或抗体上的细胞，和(c)培养分离的细胞合适时间，和(d)选择强烈结合凝集素或抗体的一个或多个细胞或细胞克隆，所述凝集素或抗体结合具有唾液酸的表位。

更优选的是如上所述的方法，其中凝集素或所述识别去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位的抗体是Nemod-TF1，Nemod-TF2，A78-G/A7，或PNA，且其中所述人骨髓白血病细胞是细胞系K562，KG-1，MUTZ-3，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-H9，H9，NM-H10。

制备具有高唾液酸化和有利的生物技术性质(例如快速的细胞生长)的本发明的宿主细胞的方法包含，(i)与凝集素或优选的抗体一起温育作为起始细胞的本发明的人骨髓白血病细胞，优选K562，所述凝集素或优选的抗体识别去唾液酸化的表位或缺少唾液酸的表位，但是结合非唾液酸化形式的或显著更少的唾液酸化形式的表位，例如、但不限于，Nemod-TF1，Nemod-TF2，A78-G/A7，或PNA(来自落花生的凝集素，花生凝集素)，优选是结合到磁珠上的，和(ii)分离结合到所述凝集素或抗体上的细胞，和(iii)培养分离的细胞合适时间，和(iv)选择强烈结合凝集素或抗体的一个或多个细胞或细胞克隆，优选在单细胞克隆后，所述凝集素或抗体结合具有唾液酸的表位，例如SNA(紫云接骨木凝集素)或MAL(櫰槐凝集素)，MAL I(櫰槐凝集素I)，优选SNA。

在一个优选实施方案中，本发明提供了制备具有高唾液酸化和有利的生物技术性质(例如快速的细胞生长)的本发明的宿主细胞的方法，其包含(i)与结合到磁珠上的Nemod-TF1、Nemod-TF2、A78-G/A7或PNA一起温育K562，和(ii)分离结合到所述凝集素或抗体上的细胞，和(iii)培养分离的细胞合适时间约1-6周，和(iv)在单细胞克隆后，选择强烈结合SNA的细胞克隆。在一个优选实施方案中，那些细胞结合SNA比起始细胞更强烈，在另一个优选实施方案中，它们比起始细胞生长得更快。

在本发明的一个优选实施方案中，在步骤(i)之前，用甲磺酸乙酯处理起始细胞。

本领域技术人员能选择合适的条件和方法，并优化它们，以便制备本发明的这些宿主细胞。在WO2005/017130A2和WO2005/080585A1中，可以发现一些步骤的更多细节。

根据一个实施方案，将永生化的人血细胞用作宿主细胞，它们选自下述组1-4：

(a)组1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主细胞，例如K562；

(b)组2，其包含因为遗传缺陷或表达抑制措施(例如RNAi)而具有低或无唾液酸化活性的宿主细胞，包括NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSM ACC2605]和GTX-2；

(c)组3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主细胞，例如NM-H9和NM-H9D8；

(d)组4，其包含具有低或甚至无岩藻糖基化活性的宿主细胞，例如NM-H9D8-E6和NM H9D8-E6Q12。

在一个优选实施方案中，所述制备的细胞系是NM-H9D8。选择NM-H9D8作为通过上述方法制备的最优选的细胞克隆，由GlycotopeGmbH，Robert-

-Str.10，13125 Berlin(Germany)于2006年9月15日在DSM ACC 2806下保藏在Braunschweig(Germany)的“DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH”。如下选择其它细胞克隆例如NM-E-2F9，NM-C-2F5，或NM-H9D8-E6(DSM ACC 2807)：在使用流式细胞术细胞分类单个细胞克隆后，用一种或多种凝集素温育母细胞，由此进行阳性选择操作或阴性和阳性选择的组合。为了得到具有稳定特征的细胞克隆，通过如上所述的有限稀释，将得到的细胞克隆重新克隆至少一次。

在本发明的一个优选实施方案中，所述永生化人血细胞(它优选是骨髓白血病起源的宿主细胞)在无血清条件下生长和生成本发明的蛋白/抗体分子组合物。在另一个优选的实施方案中，所述永生化人血细胞(它优选是骨髓白血病起源的宿主细胞)在无血清条件下生长。此外，也可以将编码蛋白/抗体分子的核酸引入这些细胞，也可以在无血清条件下分离蛋白/抗体分子组合物。当制备治疗性蛋白时，能在无血清条件下工作是特别重要的，因为血清污染在过程控制中是不可接受的。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是细胞或细胞系K562，KG1，MUTZ-3，NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSM ACC2605]，或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系，或包含前述这些细胞中的至少一种的细胞或细胞系的混合物。宿主细胞优选地选自：NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8[DSM ACC 2806]，或NM-H9D8-E6 DSM ACC 2807，或NM H9D8-E6Q12(DSM ACC 2856)，GT-2X(保藏号DSM ACC____________，由Glycotope GmbH，Robert-

-Str.10，13125Berlin(Germany)于2007年9月7日保藏在“DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”inBraunschweig(Germany))或从这些细胞系中的任一种衍生的细胞或细胞系。

细胞NM-F9[DSM ACC2606]和NM-D4[DSM ACC2605]由NemodBiotherapeutics GmbH&Co.KG，Robert-

-Str.10，13125Berlin，Germany保藏，其授权申请人提及本文所述的保藏的生物材料。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是细胞或细胞系K562，NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSMACC2605]，或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是细胞或细胞系K562，例如K562[ATCC CCL-243]，或源自所述宿主细胞的细胞或细胞系。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是细胞或细胞系K562，NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSMACC 2605]，NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，或GT-2X，或NM H9D8-E6Q12或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是一个或多个细胞或细胞系K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，或GT-2X，或NM H9D8-E6Q12，其在无血清条件下生长和生成本发明的抗体分子组合物，更优选地在下文中，一个或多个细胞或细胞系在无血清条件下生长，可以将编码抗体分子的核酸引入这些细胞，并在无血清条件下分离抗体分子组合物。

在本发明的最优选实施方案中，本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞是一个或多个细胞或细胞系NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSMACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，GT-2X，或NM-H9D8-E6，或NM M9D8-E6Q12，其在无血清条件下生长和生成本发明的抗体分子组合物，最优选地在下文中，一个或多个细胞或细胞系在无血清条件下生长，可以将编码抗体分子的核酸引入这些细胞，并在无血清条件下分离抗体分子组合物。

根据一个实施方案，永生化人血细胞和人骨髓白血病起源的宿主细胞不是下述之一：唾液酸化缺陷型细胞系NM-F9和NM-D4，或从具有相同性质的任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系。在以高唾液酸化程度为目的的情况下，该实施方案是有益的。对于这些实施方案，宿主细胞优选地选自：K562，NM H9D8，NM H9D8-E6，NM H9D8-E6Q12和从任一种这些宿主细胞衍生的宿主细胞。

根据本发明的细胞系，与本发明一起相关的细胞系具有14-24小时的倍增时间，这与其它哺乳动物表达系统相比非常快。

此外，不知道用于在人细胞系中高产量抗体表达的普遍合适的高表达载体系统，因为人细胞通常不会缺少DHFR基因，因此不允许使用dhfr/甲氨蝶呤扩增系统。因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一个实施方案，它允许增加产物产量。

根据该实施方案，另外将编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸引入宿主细胞。二氢叶酸还原酶或DHFR会将二氢叶酸还原成四氢叶酸，使用NADPH作为电子供体，其可以转化成在1-碳转移化学中使用的四氢叶酸辅因子类型。抗叶酸剂会抑制DHFR酶，导致细胞死亡。为了提供编码抗叶酸剂抗性的DHFR变体的核酸，提供了一种工具来选择被核酸转染的细胞，此外，允许核酸的扩增在宿主细胞中表达。

例如通过单独的载体，而不是编码要表达的蛋白/抗体的核酸，可以在宿主细胞中引入编码所述抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸。优选地，与包含编码蛋白/抗体的核酸的载体基本上同时，用编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的载体转染。该实施方案支持将编码要表达的所述蛋白/抗体的核酸整合入宿主细胞的基因组中，其在与编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸处于相同的遗传位点，在希望扩增编码所述蛋白/抗体的核酸的情况下，这是有益的。

或者，可以使用载体系统，其包含编码要表达的所述蛋白的至少一部分的核酸，以及编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸。

然后用所述抗叶酸剂培养宿主细胞。其效果是，尽管存在抗叶酸剂，用编码所述抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸成功转染的那些宿主细胞可以生长。由此可以选择成功转染的细胞。

根据另一个实施方案，通过逐步增加培养物中的抗叶酸剂浓度，扩增编码所述蛋白/抗体的至少一部分的核酸序列。培养基中抗叶酸剂浓度的增加，会导致基因组中抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的拷贝数的增加。假定这通过细胞中的重组事件来实现。由此，如果编码所述蛋白的核酸位于基因组中抗叶酸剂抗性的DHFR变体附近，也可以增加编码要表达的蛋白的至少一部分的核酸的拷贝数，这可以通过同时转染单独分开的载体或通过使用包含两个核酸序列的单个载体来促成。通过该机理，得到以更高产量表达蛋白/抗体的宿主细胞。

优选地，所述抗叶酸剂是甲氨蝶呤。

优选地通过用至少2个连续轮回的抗叶酸剂、优选甲氨蝶呤(其中所述抗叶酸剂、优选甲氨蝶呤的浓度在每个连续轮回中增加至少100％)培养所述宿主细胞，扩增编码所述蛋白、优选抗体分子或其一部分的核酸序列。

适用于提供所述抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸会编码序列ID No.1至9的多肽，优选序列ID No 1。

在下面也进一步详细描述了该扩增系统的其它细节和实施方案。

本发明也提供了生产蛋白、优选抗体分子组合物的方法，其包含：

(a)在人骨髓白血病起源的宿主细胞中引入编码蛋白、优选抗体分子或其至少一部分的至少一种核酸，和包含编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的至少一种核酸序列的至少一种核酸；和

(b)通过用甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，优选通过用至少2个连续轮回的甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，从而使甲氨蝶呤的浓度在每个连续轮回中优选增加至少约50％、更优选至少约100％，扩增编码所述蛋白、优选抗体分子或其至少一部分的核酸序列；和

(c)在允许生产所述蛋白组合物、优选抗体分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞，和

(d)分离所述蛋白，它优选是抗体分子组合物。

本发明也提供了生产具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白组合物、优选抗体分子组合物的方法，其包含：

(a)在人骨髓白血病起源的宿主细胞中引入编码蛋白、优选抗体分子或其至少一部分的至少一种核酸；和

(b)在允许生成所述蛋白组合物、优选抗体分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和

(c)分离所述蛋白组合物，其优选地是具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的抗体分子组合物。

此外，本发明提供了生产具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白组合物、优选抗体分子组合物的方法，其包含：

(b)通过用甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，优选通过用至少2个连续轮回的甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，从而使甲氨蝶呤的浓度在每个连续轮回中优选增加至少约50％、更优选至少约100％，扩增编码所述抗体分子或其至少一部分的核酸序列；和

(c)在允许生产所述蛋白组合物、优选抗体分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和

(d)分离所述蛋白组合物，它优选是具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的抗体分子组合物。

所述编码抗体分子或其至少一部分的核酸和所述包含编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的至少一种核酸序列的核酸可以是一个核酸或2个分开的核酸。

为了选择适用于得到具有优化的糖基化特征的蛋白的宿主细胞，有利地进行根据本发明的筛选/选择方法。通过根据本发明的选择方法确定合适的宿主细胞后，然后将所述宿主细胞用于生产权利要求1-20中定义的蛋白。

因此，本发明也提供了选择宿主细胞的方法，所述宿主细胞用于生产具有至少一种下述糖基化特征的蛋白：

(i)它不含有可检测的NeuGc；和/或

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加的半乳糖基化程度；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中所述蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加至少5％的量的G2结构；和/或

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中所述蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有降低至少5％的量的G0结构；和/或

(v)它不含有可检测的末端Galα1-3Gal；和/或

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中所述蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含降低至少5％的量的岩藻糖；

(vii)它包含至少一个含有二等分GlcNAc的糖结构；和/或

(viii)当在其中表达时，它具有与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的唾液酸化模式相比改变的唾液酸化模式；

所述方法包含下述步骤：

(a)在作为宿主细胞的至少2种不同的永生化人血细胞中引入至少一种核酸，其编码蛋白或其至少一部分；和

(b)培养所述至少2种不同的宿主细胞，其中每种不同的宿主细胞生成具有与其它宿主细胞生成的糖基化模式不同的糖基化模式的蛋白组合物；

(c)从所述至少2种不同的宿主细胞分离所述表达的具有不同糖基化模式的蛋白组合物；和

(d)选择生产蛋白组合物的所述宿主细胞，所述蛋白组合物具有在(i)至(viii)中定义的至少一种糖基化特征。

关于糖基化模式和适用于得到所述模式的细胞系的细节如上所述，该细节也可应用于或适用于选择根据本发明的合适宿主细胞的筛选方法。

在建立权利要求1-20所述的生产方法之前执行各个筛选步骤是有利的，因为该实施方案允许选择最适用于生产具有优化的糖基化模式的蛋白/抗体分子组合物的宿主细胞。根据该筛选系统的基本构思，在具有不同糖基化模式的至少2种不同的细胞系中表达目标蛋白。例如，一种细胞系可以具有高唾液酸化程度，另一种可以具有低唾液酸化(或岩藻糖基化和/或半乳糖基化)程度或甚至未知的糖基化特征。从不同细胞系得到的产物因此具有各个细胞系的特征性糖基化模式。

然后可以测定在不同细胞系中生产的蛋白的特征，例如关于它们的活性(例如抗体的ADCC和CDC)，亲和力，血清半衰期和其它重要特征。结果允许选择具有最好糖基化机理的细胞系，以便得到在它的糖基化模式方面优化的蛋白。随着明确特征(例如亲和力，血清半衰期等)的变化，该方法是特别有利的。

优选地，要生产的所述蛋白具有至少一种下述特征：

(a)在它是抗体分子组合物的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍的增加的Fc-介导的细胞毒性；和/或

(b)在它是抗体分子组合物的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的结合高至少50％的增加的抗原介导的或Fc-介导的结合；和/或

(c)当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的产量高至少10％的增加的所述蛋白分子组合物的平均或最大产量。

根据一个实施方案，至少一种所述宿主细胞是永生化的人血细胞，优选人骨髓白血病起源的细胞，例如K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或源自它们的细胞或细胞系。

所述至少一种人骨髓白血病起源的宿主细胞可以选自下述组1-4之一：

(a)组1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主细胞例如K562或从其衍生的细胞或细胞系，

(b)组2，其包含由于遗传缺陷或表达抑制措施(例如RNAi)而具有低或无唾液酸化的宿主细胞，例如NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSM ACC2605]和GTX-2或从其衍生的细胞或细胞系，

(c)组3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主细胞例如NM-H9和NM-H9D8或从其衍生的细胞或细胞系，

(d)组4，其包含具有低或无岩藻糖基化活性的宿主细胞，例如NM-H9D8-E6或从其衍生的细胞或细胞系。

优选地，在筛选过程中使用的至少2种或3种宿主细胞选自上述组。但是，在根据本发明的筛选系统中也可以包含源自另一种起源的其它宿主细胞(例如Hek 293细胞)，以便进一步拓宽分析的不同糖基化模式。

得到的宿主细胞优选地生产具有至少一种表9所示的糖基化模式的蛋白、尤其抗体。

根据本发明，术语引入核酸是指本领域技术人员已知的将一种核酸、或两种或多种核酸引入哺乳动物宿主细胞中的任意方法，例如、但不限于，电穿孔，使用阳离子脂质的转染，磷酸钙，DEAE-葡聚糖，或通过病毒粒子(例如腺病毒或逆转录病毒)或其组合的感染。本领域技术人员能选择和优化用于引入本发明的一种或多种核酸的合适的方法。

根据本发明，编码抗体分子的核酸是编码抗体分子或其至少一部分的任意核酸。本发明的抗体分子因此可以由单个或多个核酸分子编码。

所述由所述核酸编码的抗体分子部分包含抗体分子或该抗体分子的恒定和/或可变域的至少一个20氨基酸序列、更优选至少100个氨基酸。包含的编码抗体分子或其至少一部分的序列可以被至少一个其它序列(例如内含子)隔开。域的序列可以包含至少一个氨基酸突变。

根据本发明，编码蛋白分子的核酸是编码蛋白分子或其至少一部分的任意核酸。本发明的蛋白分子因此可以由单个或多个核酸分子编码。编码蛋白分子或其至少一部分的序列可以被至少一个其它序列(例如内含子)隔开。蛋白分子的序列可以包含至少一个氨基酸突变。

在一个优选实施方案中，编码抗体分子或其至少一部分的核酸包含抗体分子的至少一个可变域和/或至少一个恒定域、更优选二者，更优选至少在恒定域部分或多个域中包含人序列的那些，更优选包含人Cγ2域的那些，最优选包含某些类别或子类的人抗体的Fc区域的所有恒定域和可变域。

根据一个实施方案，蛋白、尤其抗体分子是由单个核酸编码。在另一个优选实施方案中，蛋白、尤其抗体分子由2个核酸或3个核酸编码。

在另一个优选实施方案中，一个核酸编码抗体分子的一个部分，其编码轻链的可变域和/或恒定域，另一个核酸编码抗体分子的另一个部分，其编码重链的可变域和/或至少一个恒定域。

根据本发明，包含编码序列#1至序列#9的至少一种多肽的至少一种核酸序列的核酸是指，所述核酸编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽。这些序列的任意数目是合适的，只要它可以成功地引入本发明的宿主细胞。在一个优选实施方案中，所述核酸编码序列#1至序列#9的一种、两种或三种多肽，更优选编码一种多肽，和最优选编码序列#1的多肽。在本发明中，所述核酸也可以编码序列#1至序列#9、优选序列#1的多肽，其具有至少一个氨基酸突变，只要该突变允许通过如本文别处所述的甲氨蝶呤扩增编码抗体分子或其至少一部分的核酸。

编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的核酸序列，可以是与编码本文别处所述的抗体分子或其至少一部分的核酸相同的核酸分子的部分，或在分开的核酸分子上。

在本发明的另一个优选实施方案中，包含编码选自序列#1至序列#9的序列、最优选序列#1的核酸序列的分开的核酸，可以与编码本发明的抗体分子或其部分的核酸分开地引入本发明的宿主细胞中。这可以如下实现：在引入编码本发明的抗体分子或其部分的核酸之前、之后或同时，引入所述包含编码选自序列#1至序列#9的序列的核酸序列的分开的核酸。在一个优选实施方案中，这平行地进行，在另一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞已经包含含有所述编码选自序列#1至序列#9的序列、最优选序列#1的核酸序列的分开的核酸。

其它优选的实施方案如实施例所述。

可以如本文别处和实施例所述，使用甲氨蝶呤扩增稳定引入的所述核酸或编码所述蛋白(优选地是抗体分子或其一部分)的所述核酸的几个拷贝。

在一个优选实施方案中，编码蛋白(优选地是抗体分子或其至少一部分)的核酸包含至少一个其它的遗传元件，其允许选择其中已经成功引入核酸的那些细胞，例如、但不限于，抗生素抗性基因，例如、但不限于，编码嘌呤霉素或新霉素抗性的遗传元件。此外，这些核酸包含一个或多个用于在本发明的宿主细胞中表达抗体分子的遗传元件，例如启动子、增强子、多腺苷酸化位点和/或内含子，和其它遗传元件，例如细菌复制起点、启动子和用于选择转染的细菌的元件，例如用于在细菌中倍增核酸的抗生素抗性基因。

合适的启动子包括巨细胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子，SV40早期启动子，逆转录病毒的启动子，金属硫蛋白启动子，热休克启动子，SRα启动子，EF-1α启动子，等。人CMV的IE基因的增强子可以与启动子组合使用。

这些和其它遗传元件是本领域技术人员已知的，且本领域技术人员可以选择、组合、优化和引入所述编码蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸中。在本文和实施例中描述了所述编码蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸或所述核酸的组合的优选实施方案以及使用和组合的优选遗传元件，但是，本发明不限于这些应用，且可以由本领域技术人员组合或进一步优化。

本领域技术人员能选择和/或组合合适的遗传元件、构建的相应的核酸载体或元件，以将本发明的一种或多种核酸引入根据本发明的细胞系中。

所述核酸或编码蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸组合，以及所述其它遗传元件，以及引入它们的方法，例如将它们转染进本发明的宿主细胞中来表达抗体分子组合物，或转染进细菌来倍增，是本领域技术人员已知的，而且构建、鉴别、测试、优化、选择和组合这些核酸的方法，将它们与用于选择成功转染的那些细胞的其它合适序列组合的方法，以及构建、鉴别、测试和选择最合适的编码这些抗体分子的核酸的方法，是本领域技术人员已知的。

在实施例中详述本发明的优选实施方案。

在本发明的一个优选实施方案中，编码蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸包含用于选择其中成功引入核酸的本发明的那些宿主细胞的遗传元件，例如、但不限于，新霉素或嘌呤霉素，更优选它另外包含启动子例如EF-1α或CMV启动子、更优选它另外包含CMV增强子、更优选它另外包含允许选择用核酸转染的细菌的遗传元件和用于复制的遗传元件，例如所述核酸在细菌中倍增的ColE1复制起点，和更优选地它另外包含所述核酸在COS细胞中倍增的遗传元件，例如SV40起点。这些元件是本领域技术人员已知的，且可以由本领域技术人员选择、组合、优化和使用。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述的编码蛋白分子或其至少一部分的核酸包含一个核酸序列。

优选地，所述编码蛋白分子或其至少一部分的核酸另外编码赋予嘌呤霉素抗性或新霉素抗性的遗传元件，或编码至少一个选自序列#1至序列#9的序列、最优选序列#1的核酸序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述编码抗体分子或其至少一部分的核酸包含至少一个编码抗体分子的重链和/或轻链的可变域和至少一个恒定域的序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述编码抗体分子或其至少一部分的核酸包含至少一个编码抗体分子轻链的可变域和恒定域的序列或编码完整抗体分子重链的可变域和所有恒定域的序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述核酸之一编码抗体分子的至少一个部分，其包含至少一个编码抗体分子轻链的可变域和恒定域的序列，且上述核酸中的第二个编码抗体分子的至少一个其它部分，其包含至少一个编码抗体分子重链的可变域和和至少一个恒定域、优选所有恒定域的序列，且两个核酸引入同一个本发明的宿主细胞中。优选地，所述核酸之一另外编码赋予嘌呤霉素抗性的遗传元件，且另一个所述核酸另外编码赋予新霉素抗性的遗传元件。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述编码蛋白分子或其至少一部分的核酸包含至少2个核酸序列，它们编码蛋白分子或其至少一部分的2个氨基酸序列。

优选地，所述核酸之一另外编码赋予嘌呤霉素抗性的遗传元件，且另一个所述核酸另外编码赋予新霉素抗性的遗传元件。更优选地，所述核酸之一另外编码赋予嘌呤霉素或新霉素抗性、优选嘌呤霉素抗性的遗传元件，且另一个所述核酸另外包含编码至少一个选自序列#1至序列#9、最优选序列#1的序列的核酸序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述编码蛋白分子或其至少一部分的包含3个核酸序列，它们编码蛋白分子或其至少一部分的3个氨基酸序列。

优选地，所述核酸之一另外编码赋予嘌呤霉素抗性的遗传元件，另一个所述核酸另外编码赋予新霉素抗性的遗传元件，另一个所述核酸另外包含编码至少一个选自序列#1至序列#9、最优选序列#1的序列的核酸序列。

在一个更优选的实施方案中，所述核酸之一另外编码赋予嘌呤霉素或新霉素抗性的遗传元件，另一个所述核酸另外包含编码至少一个选自序列#1至序列#9、最优选序列#1的序列的核酸序列。在一个更优选实施方案中，所述核酸之一包含编码轻链的可变域和恒定域的序列，且另外包含编码至少一个选自序列#1至序列#9、最优选序列#1的序列的核酸序列，另一个所述核酸包含编码抗体分子重链的可变域和至少一个恒定域、优选所有恒定域的序列，且另外包含编码嘌呤霉素或新霉素抗性、优选嘌呤霉素抗性的核酸序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述编码抗体分子或其至少一部分的核酸包含至少一个编码抗体分子轻链的可变域和恒定域的序列，和至少一个编码抗体分子重链的可变域和至少一个恒定域、优选所有恒定域的序列。

在本发明的一个优选实施方案中，由上面或别处所述的本发明的核酸编码的恒定域是IgG或IgM(优选人IgG1、IgG4或IgM)的人恒定域，或一个域或域组合，由此优选地使用包含至少一个内含子的基因组序列或源自基因组序列的序列，其可以由本领域技术人员选择、构建和优化。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述编码本发明的蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸另外包含EF-1α启动子/CMV增强子或CMV启动子衍生的启动子，优选CMV-E。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述编码本发明的蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸另外包含分泌信号肽，优选T细胞受体分泌信号。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述编码本发明的蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸另外包含分泌信号肽，优选序列#10。

所述编码蛋白(它优选是抗体分子或其至少一部分)的核酸或核酸组合，以及所述其它遗传元件，以及引入它们的方法，是本领域技术人员已知的，而且构建、鉴别、测试、优化、选择这些核酸和将它们与适用于选择成功转染的那些细胞的其它序列相组合的方法，以及构建、鉴别、测试和选择最合适的编码这些抗体分子的核酸的方法，是本领域技术人员已知的。

在实施例中详述本发明的优选实施方案。

核酸的引入可以是暂时的或稳定的。

根据本发明，术语“通过用抗叶酸剂、尤其甲氨蝶呤培养所述宿主细胞来扩增编码蛋白或抗体分子或其至少一部分的核酸序列”是指，用至少一种抗叶酸剂、优选甲氨蝶呤浓度引入和培养本文别处所述的本发明的宿主细胞，其中存在至少一种编码要表达的蛋白、例如抗体分子或其至少一部分的核酸，和至少一种核酸，其包含至少一种编码抗叶酸剂抗性的DHFR变体(优选编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽)的核酸序列。典型的培养时间是每轮1-2周，典型浓度是约20nM至3000nM，优选约50nM至2000nM、更优选约100nM至2000nM。本领域技术人员可以优化抗叶酸剂/甲氨蝶呤扩增处理的持续时间以及浓度和本发明的核酸的相应载体，且也描述在实施例的一个优选实施方案中。最佳扩增条件可以随编码的不同的蛋白/抗体分子和前述不同的核酸或核酸构建体或其组合的使用而异。本领域技术人员能选择和优化最合适的条件和本发明的核酸。所述扩增导致与没有抗叶酸剂/甲氨蝶呤培养相比和与没有引入编码至少一种抗叶酸剂抗性的DHFR变体(尤其序列#1至序列#9的多肽)的核酸序列相比更多的编码蛋白/抗体分子或其至少一部分的核酸拷贝掺入宿主细胞基因组中，和/或导致增加的蛋白/抗体分子组合物生产。

在本发明的一个优选实施方案中，所述用于扩增编码蛋白/抗体分子或其至少一部分的核酸(它们引入所述宿主细胞中，在所述宿主细胞中引入了至少一种核酸，后者包含至少一种编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的核酸序列，如本文别处所述，包括它的优选实施方案)的宿主细胞是人骨髓白血病起源，优选细胞或细胞系KG1，MUTZ-3，K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系、更优选细胞或细胞系K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系、更优选细胞或细胞系NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系。

在本发明的一个优选实施方案中，用至少2个连续轮回的抗叶酸剂/甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，其中在每个连续轮回中抗叶酸剂/甲氨蝶呤的浓度优选地增加了至少约50％、更优选至少约100％。在本发明的另一个优选实施方案中，用至少3个、更优选4个、更优选5个、更优选6个连续轮回的抗叶酸剂/甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，其中在每个连续轮回中抗叶酸剂/甲氨蝶呤的浓度优选地增加了至少约50％、更优选至少约100％。更优选地，抗叶酸剂/甲氨蝶呤的浓度是约20nM至3000nM，更优选约50nM至2000nM、更优选约100nM至2000nM，更优选约100nM，200nM，500nM，1000nM，2000nM，它们在优选实施方案中从100nM开始用于连续轮回中。

令人惊奇地，编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体和优选序列#1至序列#9的至少一种多肽的核酸序列的引入，允许通过用抗叶酸剂/甲氨蝶呤培养，在本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞中、尤其在K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系中扩增编码所述蛋白/抗体分子或其至少一部分的核酸序列。

特别令人惊奇地，编码至少一种序列#1的多肽的核酸序列的引入，允许通过用甲氨蝶呤培养，在本发明的宿主细胞中、尤其在K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F 5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系中扩增编码所述抗体分子或其至少一部分的核酸序列。

更令人惊奇地，编码序列#1至序列#9的至少一种多肽的核酸序列的引入，允许通过用至少2个连续轮回的甲氨蝶呤(其中在每个连续轮回中，甲氨蝶呤的浓度增加至少约50％、更优选至少约100％)培养所述宿主细胞，在本发明的宿主细胞中、尤其在K 562，NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系中进一步扩增编码所述抗体分子或其至少一部分的核酸序列。

更令人惊奇地，编码至少一种序列#1的多肽的核酸序列的引入，允许通过用至少2个连续轮回的甲氨蝶呤(其中在每个连续轮回中，甲氨蝶呤的浓度增加至少约50％、更优选至少约100％)培养所述宿主细胞，在本发明的宿主细胞中、尤其在K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8，或NM-H9D8-E6，NM-H9D8-E6Q12，GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系中进一步扩增编码所述抗体分子或其至少一部分的核酸序列。

在一个优选实施方案中，术语“扩增是稳定的”是指，经过至少35代的宿主细胞分裂周期，导致抗体分子组合物的高产量生产。使用甲氨蝶呤，可以如上面和实施例所述扩增编码蛋白/抗体分子或其一部分的稳定引入的所述核酸。

其它优选实施方案如实施例所述。

在本发明的一个优选实施方案中，优选地在至少一轮单细胞克隆和用所述蛋白/抗体组合物的适当表达和分泌选择那些细胞克隆之后，使用含有引入的本发明核酸的本发明的宿主细胞。优选地，在至少一轮本文别处所述的甲氨蝶呤扩增后，进行所述单细胞克隆和用所述蛋白/抗体组合物的适当表达和分泌选择那些细胞克隆。在另一个优选实施方案中，通过至少一个额外的甲氨蝶呤扩增轮回，优选用递增浓度的甲氨蝶呤，优选至少约两个浓度的甲氨蝶呤，进一步扩增所述细胞克隆，更优选地随后进行另一轮单细胞克隆和用所述蛋白/抗体组合物的适当表达和分泌选择那些细胞克隆。使用这些优选实施方案，可以选择具有特别高表达产量的细胞克隆。

根据本发明，术语“在允许生成所述抗体分子组合物或各种蛋白制剂的条件下培养所述宿主细胞”通常是指，在允许以蛋白/抗体分子组合物形式表达蛋白/抗体分子、优选分泌进培养基中、优选以本文别处所述的高产量和/或高活性和/或高同质性的条件下，培养包含至少一种编码蛋白/抗体分子的核酸的本发明的宿主细胞，优选本文别处所述的本发明核酸的优选实施方案。本领域技术人员能选择最合适的培养条件，其中使用合适的培养基和培养条件，例如、但不限于，合适的时间、温度、pH、供气、补料、培养基、培养基添加剂、罐或反应器大小和本领域技术人员已知的原理。本领域技术人员能选择和优化最合适的条件。优选实施方案如实施例所述，但是不限于它们。

通过能有效生产目标抗体分子组合物的一般动物细胞培养方法，例如，批式培养、重复批式培养、补料-批式培养和灌注培养，可以培养本发明的细胞。优选地，采用补料-批式培养或灌注培养，以便提高目标多肽的生产力。

在本发明的另一个优选实施方案中，在无血清条件下进行所述培养，更优选地，用无蛋白的培养基或无动物组分的培养基。

本发明的宿主细胞对根据本发明的无血清培养基的适应，令人惊奇地迅速和有力。适应可以如下进行，例如，将在含有血清的培养基中继代培养的细胞直接放入可商业得到的无血清培养基中，或通过连续适应，其中直接适应无血清培养基是优选的和有利的。在适应无血清培养基的过程中，细胞的生存力暂时降低，这有时会造成细胞消灭。因此，优选地以1×10⁵-5×10⁵细胞/ml、优选2×10⁵细胞/ml的细胞密度，将细胞接种至培养基中以适应无血清培养基，以便恢复和保持较高的细胞生存力。培养4-7天后，选择密度达到5×10⁵至10×10⁵细胞/ml的细胞作为适应无血清培养基的细胞。通过用无血清培养基组合物连续稀释添加了FCS的培养基(连续适应)，也可以实现对无血清培养基的适应。本领域技术人员能选择和优化最合适的条件。优选实施方案如实施例所述，但是不限于它们。

本发明的细胞适应无血清培养基后，可以使用有限稀释方法(使用96孔板)、菌落形成方法等，制备克隆的细胞系，并根据与它们的母细胞或细胞系相比有利的这些细胞的性质，选择细胞或细胞系，所述性质例如、但不限于，更短的倍增时间，更快的生长，在更高密度下生长的可能性，产量更高，更高的克隆效率，更高的DNA转染效率，更高的抗体分子组合物表达速率，在其中表达的抗体分子组合物的更高的活性，在其中表达的抗体分子组合物的更高的同质性，和/或更高的放大稳健性。选择具有有利性质的细胞的方法，是本领域技术人员已知的或如本文所述。

根据本发明，术语“分离所述抗体分子组合物或蛋白的相应制剂”通常是指，使用培养基培养，或通过本领域技术人员已知的方法进一步富集或纯化蛋白/抗体分子组合物或所述蛋白/抗体分子组合物的一部分后，得到由包含编码本文别处所述的蛋白/抗体分子或其一部分的至少一种所述核酸的所述宿主细胞表达的蛋白/抗体分子组合物。在本发明的意义上，所述蛋白/抗体分子组合物也指富集了本文别处所述的某些蛋白/抗体分子的所述蛋白/抗体分子组合物的一部分。

在一个优选实施方案中，通过在培养后从细胞和/或细胞碎片(例如通过离心技术)分离培养基，分离蛋白/抗体分子组合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，分离本发明的蛋白/抗体分子组合物，或通过超滤、沉淀方法或本领域技术人员已知的其它浓缩方法，进一步富集。

在本发明的另一个优选实施方案中，如下分离本发明的蛋白/抗体分子组合物：通过色谱方法纯化蛋白/抗体分子组合物，例如、但不限于，使用相应亲和材料的亲和色谱，例如、但不限于，蛋白A，蛋白G，抗-抗体同种型抗体，凝集素色谱，抗某些引入抗体分子的标记(例如HIS-标记或myc-标记)或抗原的抗体，或通过本领域技术人员已知的离子交换色谱。

纯化或富集蛋白或蛋白的某些糖形的其它方法是本领域技术人员已知的，本领域技术人员可以选择、改进、优化和单独地或与前述方法组合地使用，以分离或进一步纯化、分级或富集本发明的蛋白分子组合物或其级分。

在本发明的一个优选实施方案中，经或不经预先超速离心，通过蛋白A色谱分离主要是IgG的本发明的抗体分子组合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，经或不经预先超速离心，通过抗-IgM抗体色谱分离主要是IgM的本发明的抗体分子组合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，经或不经预先超速离心，通过凝集素亲和色谱分离在抗体分子的某些糖形中富集的本发明的抗体分子组合物。纯化或富集蛋白或蛋白的某些糖形的其它方法是本领域技术人员已知的，本领域技术人员可以选择、改进、优化和单独地或与前述方法组合地使用，以分离或进一步纯化、分级或富集本发明的抗体分子组合物或其级分。

在一个优选实施方案中，使用蛋白A柱分离抗体分子组合物。在另一个优选实施方案中，使用抗-IgM柱分离抗体分子组合物。

根据本发明，术语“增加的活性”是指，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白和/或抗体分子组合物的活性高于在细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种中表达的相同蛋白/抗体分子的至少一种蛋白/抗体分子组合物的活性。在本发明的优选实施方案中，它是指在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白和/或抗体分子组合物的活性高于在CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同蛋白/抗体分子的蛋白/抗体分子组合物的活性。就抗体而言，所述增加的活性是增加的Fc-介导的细胞毒性或增加的结合活性。

在本发明的含义中，“活性”也是生物学背景下蛋白分子实现的功能或功能集合。在本发明的含义中，术语“增加的活性”、其内容的等价描述和语法等价描述应当理解为在选定的应用方面提高的或最佳的活性，其中活性可以接近极限值，例如最小化或最大化，或设定在代表比现有技术生产的对应蛋白分子更高或更低活性的中间值。在本发明的含义中，提高的或增加的活性也是指在它的生物学和/或药学含义上有利的活性，如提高的血清半衰期，药代动力学，稳定性，生物活性，结合，抗原性和/或免疫原性。例如，通过降低不利生物效应，例如通过减少不利免疫效应的刺激或减少免疫原性，可以在一定程度上增加蛋白分子组合物的生物活性。

在能测定蛋白活性的合适生物测定中，可以测定根据本发明的蛋白分子组合物的活性。本领域技术人员能鉴别合适的生物测定或建立合适的生物测定。根据本发明，这样的生物测定包括例如体外生物测定，包括细胞的或分子的或混合的测定，例如增殖测定，细胞凋亡测定，细胞粘连测定，信号传递测定，迁移测定，细胞毒性测定，吞噬作用测定，裂解测定，和结合测定。这样的生物测定也包括使用动物模型或人的体内测定，例如生物分配，药代动力学，药效学的实验，血清半衰期实验，生物利用度实验，功效实验，定位实验，包括临床研究在内的疾病治疗和预防实验。这样的生物测定也包括化学的、物理的、生理化学的、生物物理的、和生化的实验，例如对温度、剪应力、压力、pH、缀合和其它因素的稳定性。这样的生物测定也包括免疫原性和/或抗原性的实验，以便在它的临床应用方面提高蛋白分子组合物的性质。本领域技术人员能测定蛋白分子组合物的活性或所述活性的组合。

在一个优选实施方案中，蛋白分子组合物的更高活性的特征在于，在至少一个体外模型中更高的活性和/或在至少一个体内模型中更高的活性和/或更高的稳定性和/或更长的血清半衰期和/或更长的生物利用度和/或提高的免疫原性和/或提高的抗原性，这通过至少一个生物测定来测得。总活性的提高(在本文中也称作更高的活性)可以导致例如下述提高，如降低的剂量，更长的给药时间间隔，更少的副作用，和当用于人或相应生物时没有或更低的产物毒性，产生大幅提高的药物。

在本发明的一个优选实施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白分子组合物的活性高于来自现有技术生产的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的活性。

所述增加的Fc-介导的细胞毒性是增加的依赖于抗体的细胞毒性(ADCC活性)，依赖于补体的细胞毒性(CDC活性)，和/或由吞噬作用(吞噬活性)造成的细胞毒性。通过本领域技术人员已知的不同方法，可以测定增加的Fc-介导的细胞毒性，包括ADCC活性、CDC活性或吞噬活性，一些方法在实施例中详细描述，但是不限于那些方法，所以在实施例中描述的方法是本发明的优选实施方案。

所述增加的结合活性是增加的对抗体分子表位(例如表位、抗原、另一种包含表位的多肽或包含抗体分子表位的细胞)的结合，或增加的对至少一种Fc受体或另一种效应配体(例如Fc-γRI，Fc-γRII，Fc-γRIII，和来自它们的子类，例如Fc-γRIIa，Fc-γRIIIa，Fc-γRIIIb或补体的C1q组分或FcRn或包含任一种这样的Fc受体或效应配体的分子或细胞)的结合。增加的结合活性可以是更高的亲和力，更高的亲合力，和/或更高的结合位点数或其组合。增加的结合活性可以导致不同的效应和活性，例如、但不限于，在背景技术中所述的受体介导的活性的形式。通过本领域技术人员已知的多种方法中的至少一种，可以测定增加的结合亲和力、亲合力和受体介导的活性，例如、但不限于，Biacore测量，Scatchard分析，基于ELISA或RIA的测量，流式细胞术测量，在合适的靶细胞中测定细胞凋亡诱导的实验，测定合适的靶细胞的增殖的实验，抗体分子组合物的拮抗、激动和/或受体阻断实验，例如、但不限于，细胞-细胞介导的结合的抑制，细胞内部分子事件的触发。本领域技术人员能选择和/或改造和/或修饰适用于测定结合亲和力、亲合力、结合位点数和/或受体介导的活性的方法或方法组合。

本发明的方法可以用于测试抗体的能力以得到增加的Fc-介导的细胞毒性，优选ADCC活性、CDC活性和/或由吞噬作用造成的细胞毒性和/或增加的对抗体分子表位或优选至少一种Fc受体或另一种效应配体的结合活性，通常和/或具体使用本发明的宿主细胞和本文别处所述的它的优选实施方案。

在本发明的一个优选实施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白/抗体分子组合物的活性高于当在其中表达时来自细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS 0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中的至少一种的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的活性。

在本发明的一个优选实施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白/抗体分子组合物的活性比来自细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少50％、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至少5倍、更优选至少7倍、更优选至少10倍、更优选至少15倍、更优选至少23倍、更优选至少30倍、更优选至少50倍、更优选至少75倍、更优选至少100倍、更优选至少150倍、更优选至少150倍、更优选至少230倍、更优选至少300倍、更优选至少500倍、更优选至少750倍、最优选超过1000倍。

因此并非每个生物测定必须显示出更高的活性，但是依赖于特定蛋白分子组合物的应用和特征，有些有利的生物效应可以补偿更少有利的那些，且仍然在本发明意义上导致蛋白分子组合物的总体更高的活性。例如，通过结合它的细胞受体、从而触发第二效应，例如增殖的诱导，某些蛋白分子组合物可以产生高得多的活性，但是显示出稍微降低的血清半衰期。总之，触发更多受体的更高的活性然后补偿总生物活性中更短的生物利用度。在另一个实例中，更短的半衰期和更高的受体触发活性都是有利的。在另一个实例中，没有提高体内活性，但是体外稳定性会提高蛋白分子组合物的生产和储存。在另一个实例中，需要长半衰期、但是更低的活性。

在本发明的一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的ADCC活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的CDC。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是吞噬作用造成的增加的细胞毒性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的对表位的结合活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的对至少一种Fc受体、优选FcγRIIIA的结合活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的Fc-介导的细胞毒性和增加的对表位的结合活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的ADCC活性和增加的对表位的结合活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的ADCC活性、增加的CDC活性、增加的对表位的结合活性和增加的对至少一种Fc受体的结合活性。在另一个优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的ADCC活性、由吞噬作用造成的增加的细胞毒性、增加的对表位的结合活性和增加的对至少一种Fc受体的结合活性。在最优选实施方案中，增加的抗体分子组合物的活性是增加的ADCC、由吞噬作用造成的增加的细胞毒性、增加的CDC活性和增加的对表位的结合活性和增加的对至少一种Fc受体的结合活性。

根据本发明，术语“提高的同质性”是指，与当在其中表达时从细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物相比，在本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白/抗体分子组合物包含更少的不同糖形或更多的有利糖形或或更少的至少一种抗体分子糖形(优选它自己代表至少1％的总抗体分子组合物的那些糖形)。在本发明的一个优选实施方案中，它是指，与当在其中表达时从细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的抗体分子组合物相比，在本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的抗体分子组合物包含更少的不同糖形或更多的有利糖形或更少的至少一种抗体分子糖形。

在生产和人用中特别成为问题的异质性是唾液酸化。在一个优选实施方案中，本发明的蛋白/抗体分子组合物具有提高的同质性，其不包含具有唾液酸N-乙醇酰基神经氨酸(NeuGc)的糖形，因此在该情况下，没有糖形是指没有糖形含有可从纯化的抗体分子组合物得到的所有糖链的超过1％，更优选地，通过本领域技术人员已知的方法根本没有检测到糖链。因为已知NeuGc在人中是免疫原性的，本发明的宿主细胞具有胜过其它生产系统(例如CHO，NS0，SP2/0)的巨大优点。

在一个优选实施方案中，本发明的蛋白/抗体分子组合物在唾液酸化方面具有提高的同质性，其包含小于5％、更优选小于3％、更优选小于1％和最优选没有含有如实施例所述可检测的唾液酸的蛋白/抗体分子组合物的糖形。在另一个优选实施方案中，使用本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞，得到在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物，所述宿主细胞具有糖核苷酸前体途径缺陷，因此是CMP-唾液酸缺陷型或具有减少的CMP-唾液酸，当所述细胞在无血清培养基中生长时，这导致蛋白/抗体分子的糖链没有唾液酸化或具有大幅减少的唾液酸化。在另一个优选实施方案中，使用NM-F9[DSM ACC2606]或NM-D4[DSM ACC2605]作为在无血清培养基中生长的本发明的宿主细胞，可以得到这样的在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物，如实施例中更详细描述的。

在另一个优选实施方案中，使用本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞，得到在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物，所述宿主细胞具有GMP-唾液酸的糖核苷酸运载体缺陷或至少一种唾液酸转移酶缺陷，当所述细胞在无血清培养基中生长时，这导致蛋白/抗体分子的糖链没有唾液酸化或具有减少的唾液酸化。实例是NM-F9，NM-D4和GT-2X。

在本发明的另一个优选实施方案中，使用具有增加的唾液酸化程度的本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞，制备在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物。所述唾液酸化程度是指，所述抗体分子组合物中蛋白/抗体分子上的唾液酸N-乙酰神经氨酸(NeuNc或NeuNAc)的量与相同量的当在其中表达时从细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白/抗体分子的蛋白/抗体分子组合物的蛋白/抗体分子相比，比其蛋白/抗体分子的总糖单元或特定糖基化位点处的特定糖链的唾液酸N-乙酰神经氨酸(NeuNc或NeuNAc)的量高至少5％、更优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、更优选至少35％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少100％、更优选至少3倍、更优选至少5倍、更优选至少10倍、更优选至少25倍、更优选至少50倍，和最优选超过100倍。通过本领域技术人员已知的方法，可以检测唾液酸化程度，例如、但不限于，使用凝集素的免疫印迹分析或ELISA，其结合依赖于糖结构的唾液酸化，例如SNA，MAL，MAL I或PNA，通过化学检测方法例如硫代巴比妥酸方法，通过HPLC或质谱法或其组合。本领域技术人员可以选择最合适的方法，并针对目的进行改造和优化，在实施例中描述了更多细节。优选使用SNA的免疫印迹分析。

在另一个优选实施方案中，使用本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞，优选K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它们的细胞或细胞系，最优选具有高唾液酸化程度的K562，NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X，得到在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物，并产生包含可通过例如SNA结合检测到的α2-6连接的唾液酸的蛋白/抗体分子组合物，在一种更优选方式中，蛋白/抗体分子组合物包含α2-6和α2-3连接的唾液酸。

在另一个优选实施方案中，使用人骨髓白血病起源的宿主细胞，得到得到在唾液酸化方面具有提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物，所述宿主细胞包含至少一种使NeuNAc以α2-3键结合糖基的唾液酸转移酶和至少一种使NeuNAc以α2-6键结合糖基的唾液酸转移酶，例如、但不限于，K562、NM-F9[DSM ACC 2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8- 6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它们的细胞或细胞系，由此产生蛋白/抗体分子组合物的蛋白/抗体分子的更优选糖形组合物。

在本发明的另一个(优选的)实施方案中，所述在唾液酸化方面具有提高的同质性的本发明的抗体分子组合物包含具有至少一个糖链的抗体分子的至少一种糖形，所述糖链结合到抗体分子的除了Fc区域的第二域(Cγ2域)中的氨基酸Asn-297以外的另一个糖基化位点。

在另一个优选实施方案中，所述在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达在唾液酸化方面具有提高的同质性的抗体分子组合物，所述宿主细胞具有增加的唾液酸化程度，且/或包含至少一种使唾液酸以α2-3键结合糖基的唾液酸转移酶和至少一种使唾液酸以α2-6键结合糖基的唾液酸转移酶，例如K562，NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X和源自它们的细胞或细胞系。

在另一个优选实施方案中，所述抗体分子在Fab区域的序列中具有至少一个N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，其中X可以是Pro以外的任意氨基酸)和/或至少一个O-糖基化位点。

在另一个优选实施方案中，当在至少一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠)或优选在人中测量时，与当在其中表达时从细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0，NM-F9，NM-D4或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的抗体分子组合物相比，在唾液酸化方面具有提高的同质性的本发明的抗体分子组合物(其包含具有至少一个结合到除了Fc部分的第二域(Cγ2域)中的氨基酸Asn-297以外的抗体分子的另一个糖基化位点的糖链的抗体分子)具有延长的血清半衰期和/或生物利用度。

使用本发明可以优化抗体的生物利用度。抗体分子具体地在具有高或甚至非常高唾液酸化(上面讨论的组1和3)的细胞中的表达，可以产生具有延长的生物利用度的抗体组合物，同时抗体分子在组2细胞中的表达可以产生具有相对缩短的生物利用度的抗体组合物。使用动物或优选人，可以如本领域技术人员已知的和在实施例中所述测定生物利用度。动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、狗或猴子，但是不限于这些物种。由于人性，具有最接近人的糖基化和最重要的唾液酸化的那些动物是优选的，最优选的是人。

在一个更优选实施方案中，在本发明的人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达在唾液酸化方面具有提高的同质性的抗体分子组合物，所述宿主细胞具有增加的唾液酸化程度，且/或包含至少一种使唾液酸以α2-3键结合糖基的唾液酸转移酶和至少一种使唾液酸以α2-6键结合糖基的唾液酸转移酶，例如K562，NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9，NM-C-2F5，NM-H9D8或NM-H9D8-E6，和源自它们的细胞或细胞系，且在抗体分子的Fab区域序列中包含结合到至少一个N-糖基化位点和/或至少一个O-糖基化位点上的至少一个糖链，且当在至少一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠)或优选在人中测量时，与当在其中表达时从细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的抗体分子组合物相比，具有延长的血清半衰期和/或生物利用度。在另一个优选实施方案中，表达的抗体分子是Erbitux(西妥昔单抗)。

根据本发明，术语“增加的产量”是指，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中生产的本发明的蛋白/抗体分子组合物的平均或最大产量高于当在细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种中表达时来自相同蛋白/抗体分子的至少一种蛋白/抗体分子组合物的各个平均或最大产量。在本发明的优选实施方案中，它是指，在人骨髓白血病起源的宿主细胞中表达的本发明的蛋白/抗体分子组合物的平均或最大产量高于当在CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时(使用鼠dhfr基因和甲氨蝶呤在CHOdhfr-中扩增)来自相同蛋白/抗体分子的蛋白/抗体分子组合物的各个平均或最大产量。在SPR中测量平均和最大产量，其反映了细胞、细胞混合物或细胞系的生产力，这可以由本领域技术人员来测定，且在实施例的优选实施方案中予以描述。

在本发明的另一个优选实施方案中，在人骨髓白血病起源的宿主细胞(优选K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它们的细胞或细胞系)中表达的本发明的蛋白/抗体分子组合物的至少平均或最大产量比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096](使用鼠dhfr基因和甲氨蝶呤在CHOdhfr-中扩增)中表达的相同蛋白/抗体分子的相应蛋白/抗体分子组合物高至少10％、更优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、更优选至少35％、更优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选至少100％、更优选至少3倍、更优选至少4倍、最优选超过5倍。

本发明另外提供了核酸，其包含

(a)编码如本文别处所述的蛋白、优选抗体分子或其至少一部分的序列，和

(b)编码来自序列#1至序列#9的序列的至少一个序列。

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的核酸包含

(b)编码序列#1的序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述本发明的核酸另外包含编码选择标记的序列，优选编码诱导宿主细胞(其中引入了所述核酸)的抗生素(例如、但不限于，新霉素或嘌呤霉素)抗性的多肽的序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，上述本发明的上述核酸另外包含至少一个本文别处所述的遗传元件的至少一个序列。

本发明另外提供了人骨髓白血病起源的宿主细胞，或可以从白血病患者得到的任意人骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系，或可以从人供体得到的任意骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系，或包含至少一种人骨髓白血病起源细胞的细胞或细胞系的混合物，或通过将至少一种人骨髓白血病起源细胞或细胞系、或可以从白血病患者得到的任意人骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系、或可以从人供体得到的任意骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系与另一种人或动物起源的细胞(例如、但不限于，B细胞，CHO细胞)融合得到的细胞或细胞系，其包含引入所述细胞中的至少一种编码蛋白/抗体分子或其部分的核酸。

本发明提供了如上所述本发明的宿主细胞，其包含至少一种编码蛋白/抗体分子或其至少一部分的核酸。

在一个优选实施方案中，本发明提供了宿主细胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系，优选在无血清条件下生长的那些，且在无血清条件下从它们分离蛋白/抗体分子组合物，更优选无血清条件下向其中引入编码抗体分子的核酸的那些，其包含至少一种编码蛋白/抗体分子或其部分的核酸，优选包含编码本文别处所述的蛋白/抗体分子或其至少一部分的序列的核酸。

本发明提供了如上所述的本发明的宿主细胞，其包含至少一种编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的核酸。

本发明提供了如上所述的本发明的宿主细胞，其包含至少一种编码抗体分子或其部分的核酸和至少一种编码序列#1至序列#9、优选序列#1的至少一种多肽的核酸。

在一个优选实施方案中，本发明提供了宿主细胞K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系，优选在无血清条件下生长的那些，且在无血清条件下从它们分离蛋白/抗体分子组合物，更优选无血清条件下向其中引入编码蛋白/抗体分子的核酸的那些，其包含至少一种编码蛋白/抗体分子或其部分的核酸，优选包含编码本文别处所述的蛋白/抗体分子或其至少一部分的序列的核酸，和至少一种编码选自序列#1至序列#9的序列、优选序列#1的序列。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了上述的宿主细胞，其中编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体。

在另一个优选实施方案中，本发明提供了上述的宿主细胞，其中编码的抗体分子是抗体PankoMab[Cancer Immunol Immunother.2006Nov；55(11)：1337-47.Epub 2006 Feb.PankoMab：a potent newgeneration anti-tumour MUC1 antibody.Danielczyk等人]，优选PankoMab与所有人恒定域的嵌合形式，更优选人源化的PankoMab。

本发明另外提供了通过本文别处所述的本发明的任意方法生产的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化的蛋白/抗体分子组合物。

在一个优选实施方案中，本发明提供了通过本发明的任意方法生产的蛋白/抗体分子组合物，当在其中表达时，与从细胞系CHO或CHOdhfr-或BHK或NS0或SP2/0或PerC.6或小鼠杂交瘤中的至少一种、优选CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白/抗体分子的蛋白/抗体分子组合物相比，其具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化。

表达的蛋白分子或其部分可以是任意蛋白或蛋白部分或蛋白片段。表达的抗体分子或其部分可以是任意抗体或抗体部分或抗体片段。

本发明的蛋白分子组合物可用于疾病的预防性和/或治疗性处理，例如白血病、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、癌症、骨髓移植、造血系统疾病、不育症及自身免疫性疾病。本领域普通技术人员已知的蛋白分子组合物的治疗用途范围非常广泛。例如，G-CSF是治疗中性粒细胞减少症的重要治疗剂，中性粒细胞减少症是白血病癌症患者化疗导致的威胁生命的中性粒细胞减少。GM-CSF尤其用于治疗化学治疗后高龄AML患者，以从中性粒细胞减少症的快速恢复。另外，GM-CSF被批准作为治疗剂用于骨髓移植的一些用途及用于动员外周血干细胞。另外，GM-CSF具有一些临床用途，它们目前处于研究中，例如用于治疗HIV和癌症。某些造血系统疾病用EPO治疗，IFN-β是目前用于治疗多发性硬化(一种自身免疫性疾病)的重要治疗剂。另一个实例是广泛用于治疗男性和女性不育症的FSH。hCG也用于治疗不育症，但集中于女性不排卵。hGH具有临床证实的效果，如体脂肪减少和肌肉组织增加。

本发明的蛋白分子组合物还可用于制备用于疾病的预防性和/或治疗性处理的药剂，所述疾病选自白血病、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、癌症、骨髓移植、造血系统疾病、不育症及自身免疫性疾病。

在本发明的一个优选实施方案中，表达的抗体分子是识别下述疾病的抗体分子：银屑病，类风湿性关节炎，克罗恩病，溃疡性结肠炎，自身免疫性疾病，SLE，多发性硬化，自身免疫性血液病，哮喘，变态反应，移植物抗宿主病，同种异体移植物排斥，青光眼手术，心肌梗死，病毒如RSV，HIV，Hep B或CMV，癌症，肉瘤，CLL，AML或NHL。

在本发明的一个优选实施方案中，表达的抗体分子是识别下述疾病的抗体分子：在至少一个人中的癌症、肿瘤或转移灶，至少一种癌症细胞或肿瘤细胞，优选地选自耳鼻喉区域、肺、纵隔、胃肠道、泌尿系统、妇科系统、乳房、内分泌系统、皮肤的癌性疾病或肿瘤疾病、骨和软组织肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、中枢神经系统的赘生物、婴儿期内的癌性疾病或肿瘤疾病、淋巴瘤、白血病、瘤外综合征、具有未知的原发性肿瘤的转移灶(CUP综合征)、腹膜癌扩散、免疫抑制有关的恶性肿瘤和/或肿瘤转移灶。

在本发明的一个优选实施方案中，表达的抗体或其部分是抗MUC1抗体。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是抗体利妥昔单抗，赫赛汀，Erbitux，Campath 1H或源自它们的抗体。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/050707的抗体，更优选WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab[Cancer Immunol Immunother.2006 Nov；55(11)：1337-47.Epub 2006 Feb.PankoMab：a potent new generation anti-tumourMUC1 antibody.Danielczyk等人]，更优选包含所有人恒定域的嵌合形式，更优选人源化的抗体。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是本发明的任意完整抗体，优选利妥昔单抗，赫赛汀，Erbitux，更优选WO2004/065423的抗体，最优选PankoMab，其中从本发明的任意宿主细胞、优选K 562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系分离的抗体分子组合物不包含可检测的NeuGc。这也适用于一般蛋白。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是任意完整抗体分子或包含本发明的Cγ2域的抗体分子，优选利妥昔单抗，赫赛汀，Erbitux，更优选WO2004/065423的抗体，最优选PankoMab，其中从本发明的宿主细胞、优选K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系分离的抗体分子组合物包含至少一种具有α2-6唾液酸的糖形。这也适用于一般蛋白。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是任意完整抗体分子或包含本发明的Cγ2域的抗体分子，优选利妥昔单抗，赫赛汀，Erbitux，Campath 1H，更优选WO2004/065423的抗体，最优选PankoMab，其中从宿主细胞NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系分离的抗体分子组合物包含α2-6唾液酸，其可以通过使用凝集素SNA的免疫印迹分析检测到，如实施例所述。这也适用于一般蛋白。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是任意抗体分子，优选利妥昔单抗，赫赛汀，Erbitux，Campath1H，更优选WO2004/065423的抗体，最优选PankoMab，在无血清的、更优选无蛋白的培养基中培养后从本发明的宿主细胞NM-F9或NM-D4分离的抗体分子组合物具有提高的同质性，没有可检测的唾液酸。这也适用于一般蛋白。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是抗体利妥昔单抗，赫赛汀，Campath 1H或源自它们的抗体，从本发明的宿主细胞分离的抗体分子组合物具有比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性。

在本发明的一个更优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，当在细胞K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X中的至少一种或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系中生产时，从本发明的宿主细胞分离的抗体分子组合物具有比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，从本发明的宿主细胞K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系分离的抗体分子组合物具有比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少50％、优选2倍的增加的结合其表位的活性。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，在无血清的、更优选无蛋白的培养基中培养后从本发明的宿主细胞NM-F9或NM-D4分离的抗体分子组合物具有提高的同质性，没有可检测的唾液酸。这也适用于一般蛋白。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，从宿主细胞K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系分离的抗体分子组合物具有比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物提高的同质性，具有多至少10％的唾液酸。这也适用于一般蛋白。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，当在NM-F9或NM-D4中表达时，从本发明的宿主细胞分离的抗体分子组合物具有比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物提高的同质性，没有可检测的唾液酸的程度更高。这也适用于一般蛋白。

在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab，从本发明的宿主细胞分离的抗体分子组合物具有如上所述提高的同质性和增加的ADCC活性，其比在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少4倍。

在本发明的最优选实施方案中，本发明的核酸编码的抗体分子是WO2004/065423的抗体，更优选PankoMab。

本发明另外提供了用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化的蛋白/抗体分子组合物的宿主细胞，其中所述宿主细胞是任意细胞、人骨髓白血病起源的细胞或细胞系、或可以从白血病患者得到的任意人骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系、或可以从人供体得到的任意骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系、或如本文别处所述包含至少一种人骨髓白血病起源细胞的细胞或细胞系或源自它们的细胞或细胞系的混合物、或包含前述这些细胞中的至少一种的细胞或细胞系的混合物。

本发明也提供了用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化的蛋白/抗体分子组合物的宿主细胞，其中所述宿主细胞是任意细胞，通过将至少一种人骨髓白血病起源细胞或细胞系、或可以从白血病患者得到的任意人骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系、或可以从人供体得到的任意骨髓细胞或骨髓前体细胞或细胞系与另一种人或动物起源的细胞(例如、但不限于，B细胞，CHO细胞)融合得到的细胞或细胞系。

在一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是细胞或细胞系KG1、MUTZ-3、K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或、源自它们的细胞或细胞系、或包含前述这些细胞中的至少一种的细胞或细胞系的混合物。

在另一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是细胞或细胞系K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它们的细胞或细胞系。

在另一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是细胞或细胞系NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或源自它们的细胞或细胞系或如本文别处所述源自它们的细胞或细胞系。

在另一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是源自KG1、MUTZ-3、K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的细胞或细胞系，或如本文别处所述源自它们的细胞或细胞系，它们生长在无血清条件下，优选可以在这些细胞中引入编码蛋白/抗体分子的核酸且在无血清条件下分离抗体分子组合物的那些。

在另一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是源自K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的细胞或细胞系，或如本文别处所述源自它们的细胞或细胞系，它们生长在无血清条件下。

在另一个优选实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是源自K562、NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X的细胞或细胞系，或如本文别处所述源自它们的细胞或细胞系，它们生长在无血清条件下，可以在这些细胞中引入编码蛋白/抗体分子的核酸且在无血清条件下分离抗体分子组合物。

在最优选的实施方案中，本发明提供的用于生产如本文别处所述本发明意义上的具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的蛋白/抗体分子组合物的所述宿主细胞是细胞或细胞系NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12、GT-2X或如本文别处所述源自它们的细胞或细胞系，它们生长在无血清条件下，优选可以在这些细胞中引入编码蛋白/抗体分子的核酸且在无血清条件下分离蛋白/抗体分子组合物的那些。

本发明另外提供了通过本文别处所述的本发明的任意方法分离的蛋白/蛋白组合物。

本发明另外提供了通过本文别处所述的本发明的任意方法分离的蛋白/蛋白组合物，其具有本发明意义上的和本文别处所述的增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性和全人糖基化。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述蛋白分子或其部分的大小是至少10kDa，优选大小是至少15kDa、更优选大小是至少20kDa、更优选大小是至少25kDa、更优选大小是至少30kDa、更优选大小是至少35kDa、更优选大小是至少40kDa、更优选大小是至少45kDa、更优选大小是至少50kDa、更优选大小是至少55kDa、更优选大小是至少60kDa、更优选大小是至少65kDa、更优选大小是至少70kDa、更优选大小是至少75kDa、更优选大小是至少80kDa、更优选大小是至少85kDa、更优选大小是至少90kDa、更优选大小是至少95kDa、更优选大小是至少100kDa、更优选大小是至少105kDa、更优选大小是至少110kDa、更优选大小是至少115kDa、更优选大小是至少120kDa、更优选大小是至少125kDa、更优选大小是至少130kDa、更优选大小是至少135kDa、更优选大小是至少140kDa、更优选大小是至少145kDa、更优选大小是至少150kDa、更优选大小是至少155kDa、更优选大小是至少160kDa、更优选大小是至少165kDa、更优选大小是至少170kDa、更优选大小是至少175kDa、更优选大小是至少180kDa、更优选大小是至少185kDa、更优选大小是至少190kDa、更优选大小是至少195kDa、最优选大小是至少200kDa。

在本发明的一个优选实施方案中，所述蛋白分子组合物源自细胞因子和它们的受体中的任意蛋白分子，例如，肿瘤坏死因子TNF-α和TNF-β；肾素；人生长激素及牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链及B链；促性腺激素，例如促卵胞生成激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)，促甲状腺激素及人绒毛膜促性腺激素(hCG)；降血钙素；胰高血糖素；凝血因子，例如因子VIIIC、因子IX、因子VII、组织因子及血管假性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原活化因子，例如尿激酶、人尿和组织型纤溶酶原激活剂；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；脑啡肽酶；人巨噬细胞炎症蛋白；血清白蛋白，如人血清白蛋白；苗勒氏抑制物质；松弛素A链及B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A及蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5，神经营养因子-6及神经生长因子-β；血小板源生长因子；成纤维细胞生长因子；表皮生长因子；转化生长因子，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I及胰岛素样生长因子-II；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD-3、CD-4、CD-8及CD-19；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白；干扰素，例如干扰素-α，-β，和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF及G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-12；过氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；抗体及免疫粘合素、血型糖蛋白A、MUC1。

在本发明的一个更优选的实施方案中，所述蛋白分子组合物源自下述的任意蛋白分子：血型糖蛋白A，EPO，G-CSF，GM-CSF，FSH，hCG，LH，干扰素，白细胞介素，抗体和/或其片段。

也提供了通过根据本发明的生产方法可得到的糖蛋白或蛋白组合物。所述蛋白优选具有在权利要求27中定义的糖基化特征。

优选地，所述蛋白组合物是抗体分子组合物。本发明另外提供了通过本文别处所述的本发明的任意方法分离的抗体分子组合物，其具有本发明意义上的和本文别处所述的增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性。

这样的抗体的实例包括抗神经节苷脂GD3的抗体，人白介素-5受体α-链，HER2，CC趋化因子受体4，CD20，CD22，神经母细胞瘤，MUC1，表皮生长因子受体(EGFR)。

在本发明的一个优选实施方案中，所述抗体分子组合物源自下述的任意抗体分子：Muromomab，达珠单抗，巴利昔单抗，阿昔单抗，利妥昔单抗，赫赛汀，吉姆单抗，阿仑单抗，Ibritumomab，西妥昔单抗(Erbitux)，贝伐单抗，托西莫单抗，Pavlizumab，英夫利昔单抗，Eculizumab，依帕珠单抗，Omalizumab，Efalizumab，阿达木单抗，Campath-1H，C2B8，Panorex，BrevaRex，Simulect，Antova，OKT3，赛尼哌，ReoPro，Synagis，Ostavir，Protovir，OvaRex，Vitaxin。

在本发明的一个更优选的实施方案中，所述抗体分子组合物源自下述的任意抗体分子：利妥昔单抗，赫赛汀，抗-CC趋化因子受体4抗体KM2160，Campath-1H，C2B8，Erbitux，抗-神经母细胞瘤抗体chCE7。在本发明的一个更优选实施方案中，所述抗体分子组合物源自下述的抗体分子：WO2004/065423的抗体、更优选PankoMab、更优选它的嵌合形式、更优选它的人源化形式。

也提供了通过本发明的生产方法可得到的蛋白或蛋白组合物，其中所述蛋白是结合MUC1表位的抗体，其包含氨基酸序列DTR。

MUC-1是一种确定的在多种上皮肿瘤上表达的肿瘤标志物，且是潜在的肿瘤靶物。MUC-1是一种大的、高度O-糖基化的跨膜糖蛋白。胞外部分由不同数目(20至120)的串联重复序列(TR)组成，其中的每个串联重复序列由20个氨基酸组成，具有5个潜在的O-糖基化位点。MUC1不仅在上皮组织上表达，而且在造血细胞上表达。已知结合MUC1的DTR基序的几种抗体，它们也是在本发明背景下的合适的蛋白/抗体(综述参见Karsten等人，1998)。Karsten也描述了MUC1上的一种新的糖诱导的构象表位(TA MUC)，其具有结构...PDT*RP...，其中T*被O糖基化。在该位点存在的聚糖本身是肿瘤特异性的糖结构。

因此，希望使用可以区分TA MUC肿瘤表位和未糖基化的表位的MUC抗体。一种能特异性地识别糖基化的TA MUC表位的合适的抗体是PankoMab抗体。这里通过参考整体引入的Danielczyk等人2006详细描述了它的生产(PankoMab：a potent new generationanti-tumor MUC-1 antibody)。优选使用竞争性地结合同母PankoMab抗体相同的TA-MUC 1表位的抗体PankoMab或其变体。这样的抗体变体具有至少一种下述特征：

-它结合至少包含氨基酸序列PDTRP的表位；

-当在PDTRP序列处被Gal-NAcα糖基化时，它结合包含1,5TRs的30个氨基酸的短MUC肽，但是如果该肽未被糖基化，则不结合；

-它显示出超过25、优选28(最优选29,5的比例)的额外长度效应；

-它对造血系统细胞的结合较低或甚至不结合(关于检测方法，参见Danielczyk等人2006，通过参考引入)；

-它对肿瘤细胞具有高亲和力，通过斯卡恰特作图分析是大约至少K_ass＝0,2-1×10⁹M^-1。

在实施例中给出了各个变体的合适实例。抗体可以是鼠源的、嵌合的或人源化的。

本文所述的结合TA-MUC 1表位的抗体、优选PankoMab抗体或抗体Panko 1和Panko 2具有至少一种下述糖基化特征：

(i)它具有增加的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的N-乙酰基神经氨酸的量高至少15％；

(ii)它具有更高的半乳糖基化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的G2结构的量高至少5％；

(iii)它包含可检测量的bisecGlcNAc；

(iv)它不具有或具有小于2％的杂种或高甘露糖结构。

各个糖基化模式导致下述令人惊奇的、且有益的活性模式：

(i)比在CHO细胞中表达的相同抗体的活性高超过15％的CDC活性；

(ii)与不具有可检测的唾液酸化的抗体相比延长了因子2(超过1.5)的血清半衰期；

(iii)它具有增加的Fc-介导的细胞毒性，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍。

通过在根据本发明的细胞系中生产，可以得到各个抗体，所述细胞系提供高唾液酸化和半乳糖基化程度，但是优选更低的岩藻糖基化。合适的实例是NM-H9D8和NM-H9D8-E6。

下面的表和附图解释了本发明。

下面的表1和8和附图1至17解释了本发明。

表1：在添加了FCS的培养基中培养的CHOdhfr-和NM-F9表达的嵌合PankoMab的产量。

表2：在无血清培养基中培养的NM-H9D8[DSM ACC2806]表达的嵌合PankoMab的产量。

表3：PankoMab和西妥昔单抗中唾液酸含量的定量：用指定的细胞系生产抗体，并累积通过DMB标记的唾液酸变体的反相色谱得到的峰面积进行定量。使用唾液酸标准品区分NeuGc和NeuAc。

表4：Panko1和PankoMab中带不同电荷的结构的定量：对2-AB标记的N-聚糖进行阴离子交换色谱(Asahi-PAK-column)，通过积分定量与带不同电荷的结构相对应的峰。

表5：通过2-AB标记的聚糖的aminophase HPLC(Luna-NH2-柱)，测定抗体Panko1和PankoMab的半乳糖基化程度。通过积分定量峰，通过质谱法分析潜在的聚糖结构。

表6：Panko1和PankoMab中三触角和双触角+平分结构的定量。收集来自aminophase-HPLC的含有潜在二等分GlcNAc的级分，并进行反相色谱(RP18-column)。由此可以区分开三触角和双触角+平分结构。通过2-AB标记的聚糖的aminophase HPLC(Luna-NH2-柱)，测定抗体的岩藻糖基化程度。通过积分定量峰，通过质谱法分析潜在的聚糖结构。测定岩藻糖基化的和未岩藻糖基化的结构，并定量累积的峰面积。

表7：在添加了FCS(CHOdhfr-)的培养基中或在无血清培养基中培养的CHOdhfr-和GT-2x表达的hFSH的产量。

表8：在无血清培养基中培养的NM-H9D8[DSM ACC2806]表达的hFSH的产量。

表9：用根据本发明的方法可得到的合适的糖基化和活性组合。

表10：在不同细胞系中得到的bisecGlcNAc和岩藻糖的值。

图1：NM-F9，NM-D4，和NM-H9D8[DSM ACC2806]细胞的fut8 mRNA表达。HepG2细胞用作对照。

图2：使用从NM-H9D8-E6细胞、CHOdhfr-细胞或SP2/0细胞分离的西妥昔单抗进行的铕释放测定，LS174T细胞用作靶细胞。

以效应物∶靶细胞＝50∶1的比例，进行温育测定4h，抗体浓度为0至100ng/ml。

图3：从NM-F9分离的嵌合PankoMab的ADCC活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab高约5倍。

图4：使用从NM-H9D8-E6细胞、CHOdhfr-细胞和NM-H9D8细胞分离的嵌合Panko1进行的铕释放测定，ZR-75-1细胞用作靶细胞。

以效应物∶靶细胞＝80∶1的比例，进行温育测定4h，抗体浓度为0至1μg/ml。

图5：以效应物∶靶细胞＝50∶1的比例，每孔5000个靶细胞，温育过夜(o.n.)后，在铕释放测定中嵌合Panko2抗ZR-75-1细胞的ADCC活性。一式三份地温育样品。

图6：以效应物∶靶细胞＝50∶1的比例，每孔10,000个靶细胞，温育过夜(o.n.)后，在铕释放测定中嵌合Panko2抗ZR-75-1细胞的ADCC活性。一式三份地温育样品。

图7：嵌合PankoMab抗ZR-75-1的CDC测定。

图8：从NM-F9分离的嵌合PankoMab对合成的糖基化的MUC130-聚体肽的结合活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab的结合活性高约50％。

图9：从GT-2x和NM-H9D8分离的嵌合Panko2对合成的糖基化的MUC130-聚体肽的结合活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合Panko2的结合活性高约50％。

图10：进行蛋白印迹分析来鉴别在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSM ACC2806]中表达的抗体分子组合物的有差别地唾液酸化的重链。将蛋白转移至硝酸纤维素，用第二抗-人IgG抗体(图10A)或检测2-6唾液酸化的SNA(图10B)显影。

图11：进行蛋白印迹分析来鉴别在CHOdhfr-或NM-H9D8中表达的抗体分子组合物的有差别地唾液酸化的重链。将蛋白转移至硝酸纤维素，用检测2-6唾液酸化的SNA显影。

图12：进行ELISA分析来鉴别在CHOdhfr-、GT-2x、NM-H9D8或NM-H9D8-E6中表达的有差别地唾液酸化的抗体分子组合物。

图13：进行ELISA分析来鉴别在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8中表达的西妥昔单抗的有差别地唾液酸化的抗体分子组合物。如下分析唾液酸化：(A)经或不经神经氨酸酶处理，用检测α2-6唾液酸化的SNA，和(B)用检测α2-3唾液酸化的MAL I。

图14：从CHOdhfr-、NM-F9、NM-H9D8或NM-H9D8-E6细胞分离的嵌合抗体Panko1和Panko2的SNA染色的斑点印迹。

图15：从NM-H9D8细胞分离的嵌合PankoMab比从NM-F9分离的嵌合PankoMab在裸鼠血清中的可利用时间更久。

图16：在NM-H9D8(泳道1)和GT-2x(泳道2)中生产的hFSH的SDS-PAGE分析。在还原条件下，每个泳道通过SDS-PAGE分离5μg纯化的hFSH，并通过考马斯亮蓝染色。标志物指示21-108kD的范围。

图17：进行蛋白印迹分析来鉴别有差别地唾液酸化的hFSH分子组合物。在还原条件下，通过10％丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE，分离来自CHO(泳道1)、NM-H9D8(泳道2)和GT-2x(泳道3)的1μg hFSH分子组合物。将蛋白转移至硝酸纤维素，用检测2-6唾液酸化的SNA显影。

图18：显示了IgG抗体，其中N-聚糖共价结合在Fc的C_H2域的保守Asn 297残基。如指出的，在Fab域中可以存在其它的N-连接的寡糖，其甚至可以影响抗体的结合活性。仅显示了在一半抗体上的聚糖结构。Fc糖是分支的链结构，其主要存在于2个C_H2域内，每个寡糖具有一个与C_H2域的疏水区相互作用的臂/触角。多克隆和骨髓瘤人IgG的结构分析已经证实，Fc含有不同量的基础双触角核心结构，如图18所示。标识的含义显示在对应的表中。所述核心结构可以含有0个(G0)、1个(G1)或2个(G2)末端半乳糖残基和/或二等分GlcNAc和/或在邻近GlcNAc的岩藻糖残基。其它岩藻糖分子也可以存在于其它GlcNAc残基或半乳糖残基。多样性甚至增加，因为可以存在或不存在末端唾液酸，这取决于抗体的性质，据报道唾液酸对ADCC具有负面影响。

实施例1

细胞中fut8表达的分析

根据标准操作(RNeasy-Mini-Kit，Qiagen)，从NM-F9[DSMACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-H9、K562、NM-H9D8[DSMACC2806]、GT-2x[DSM ACC_______]和HepG2(对照)细胞提取RNA。根据生产商的说明书(

Oligo(dT)25H，Invitrogen)，使用磁珠技术分离mRNA。对于第一链P^PcDNA合成，根据生产商的说明书，使用每种样品和Omniscript反转录酶(Qiagen)的50μl珠悬浮液。对于随后的P^PRT-PCR反应，使用5μl cDNA产物P^P和特异性的fut8引物，产生212bp片段。使用肌动蛋白特异性的引物作为对照，产生240bp片段。在1.5％凝胶上分析得到的PCR-产物P^P。

NM-F9，NM-D4，NM-H9，K562，NM-H9D8和GT-2x都表达fut8的mRNA。

图1显示了NM-F9、NM-D4和NM-H9D8的fut8 mRNA表达作为一个实例

实施例2

K562细胞的糖工程化

在EP1654353中描述了K562细胞的糖工程化和NM-D4和NM-F9细胞系的建立。

如下制备NM-H9细胞，和从它衍生的具有高唾液酸化潜力的细胞或细胞系。通过使用烷化剂甲磺酸乙酯处理K562细胞，进行随机诱变。使用PBS洗涤每样品K562细胞，并以10P^6P细胞/ml细胞培养基接种于添加EMS(0.1mg/ml，甲磺酸乙酯，Sigma-Aldrich)的培养基，在37℃及5％COB_2B培养过夜。洗涤细胞并添加新鲜培养基。每隔一天通过台盼蓝染色测定细胞活力，并通过免疫细胞化学染色分析细胞。

随后，使用TF特异性的抗体筛选暴露高TF表达的新表型的细胞。在B-PBS(0.5％BSA，在PBS中)中洗涤K562细胞，使用50μl单克隆抗体A78-G/A7或PankoMab的杂交瘤培养物上清液和950μl B-PBS于4℃培养30分钟。洗涤后，使用50μl MicroBeads(Miltenyi Biotec，Germany)缀合的大鼠-抗-小鼠-IgM-抗体或大鼠-抗-小鼠-IgG-抗体重复上述操作。洗涤后，按操作手册所述，通过MiltenyiBiotec(

Germany)提供的两个连续柱分离磁标记的TF阳性的K562细胞。培养9天后，重复分离操作共3次。以抗体染色开始FACS分析(流式细胞术)：使用第一单克隆抗体(A78-G/A7(IgM)的杂交瘤培养上清液，PankoMab(IgG1)，均在细胞培养基中1∶2稀释)于4℃培养约3×10⁵细胞1.5小时，然后使用第二Cy3缀合的山羊抗小鼠IgM或IgG抗体(在PBS中1∶200稀释)于4℃培养30分钟，并再次洗涤。通过流式细胞术(流式细胞器：Coulter Epics，Beckman Coulter，Krefeld，Ger)检测重悬细胞(200μl PBS)。使用Expo32软件(BectonCoulter)进行定量分析，对于抗体标记的细胞使用下列参数：前向散射(FS)：26V，gain 1(放大1)，侧向散射(SS)：807V，放大5，FL2：740V，放大1，对于凝集素标记的细胞使用下列参数：FS：26V，放大1，SS：807V，放大5，FL1：740V，放大1)。

分离三轮后，得到含有93％TF阳性细胞的K562细胞群。然而，TF阳性的K562细胞的百分比随时间而减少，在分离程序之后14天期间达到约20％TF阳性细胞的基础水平。为了稳定表达TF阳性表型，第四次分离K562细胞，最后通过在96孔培养板中有限稀释(1个细胞/100μl)，克隆所分离的TF阳性的K562细胞。在所获得的30个K562细胞克隆中，17个细胞克隆表达少量的TF抗原，或不表达TF抗原。在流式细胞术中分析这些细胞克隆的SNA结合和增殖速率(倍增时间的分析参见下面)。选择表现出高SNA结合和高增殖速率的细胞克隆。选择稳定的NM-H9克隆，用于通过单细胞克隆进行进一步克隆开发，并在无血清条件下优化生长。选择NM-H9D8[DSM ACC2806]作为最优选的细胞克隆，由Glycotope GmbH，Robert-

-Str.10，13125 Berlin(Germany)于2006年9月15日保保藏在Braunschweig(德国)的“DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”，保藏号为DSM ACC2806。

实施例3

K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12和GT-2x细胞系和CHOdhfr-细胞的培养和无血清细胞系的建立

在添加了10％FCS和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中或在无血清的X-Vivo 20培养基中，培养K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSM ACC2806]、NM-H9D8-E6[DSM ACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSM ACC2856](由Glycotope GmbH，Robert--Str.10，13125 Berlin(Germany)于2007年8月8日保保藏在Braunschweig(德国)的“DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH”)或GT-2x[DSM ACC____]，在8％控湿气氛下在37℃生长。

在添加了10％FCS、2mM谷氨酰胺和2％HT添加剂的DMEM中或在无血清的CHO-S-SFM II培养基中，培养CHOdhfr-细胞(ATCC No.CRL-9096)，在8％控湿气氛下在37℃生长。

通过彻底更换细胞培养基，可以使K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSM ACC2806]、NM-H9D8-E6[DSMACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSM ACC2856]或GT-2x[DSM ACC____]和源自所述宿主细胞的细胞或细胞系容易地适应无血清条件。以1×10⁵至5×10⁵细胞/ml、优选2×10⁵细胞/ml的密度，将根据本发明的细胞和细胞系接种进无血清培养基X-Vivo 20，并通过普通的动物细胞培养方法进行培养。培养4至7天后，选择密度达到5×10⁵至10×10⁵细胞/ml的细胞作为适应无血清培养基的细胞。通过用添加了FCS的培养基连续稀释无血清培养基组合物，也可以实现对无血清培养基的适应(连续适应)。极大保留了本发明的生产抗体组合物的宿主细胞的改造的FCS生产克隆在无血清条件下的生产力。

必须逐步进行CHOdhfr-(ATCC No.CRL-9096)对无血清条件的适应，这需要几周，所以损失至少一半生产力是常见的。

实施例4

用于在真核细胞中表达嵌合抗体PankoMab、Panko1、Panko2或西妥昔单抗的载体的克隆

使用来自生产PankoMab的鼠杂交瘤细胞的特异性引物，PCR扩增PankoMab的可变序列[HCancer Immunol Immunother.H 2006Nov；55(11)：1337-47.Epub 2006 Feb.PankoMab：a potent newgeneration anti-tumour MUC1 antibody.Danielczyk等人]。

Panko1和Panko2的可变序列VH和VL如WO2004/065423所述，其通过参考引入。

Panko1的可变重链：

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVS

Panko1的可变轻链：

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKR

Panko2的可变重链：

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYTTHYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVS

Panko2的可变轻链：

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKR

从http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/cgi-bin/getCar d.cgi？CARD＝BTD00071.txt得到西妥昔单抗VH和VL的可变氨基酸序列，并使用VectorNTI逆向翻译成cDNA编码序列。

西妥昔单抗的可变重链：

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYN

TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVS

西妥昔单抗的可变轻链：

DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS

RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR

在VL的情况下，用NcoI/NheI延伸cDNA序列，在VH的情况下用NcoI/SalI，产生cDNA。将NcoI/XhoI-切割的可变重链片段VH克隆进NcoI/SalI-切割的如WO2004/065423所述的BS-Leader载体。BS-Leader载体包括一个克隆盒，用于将T细胞受体信号肽序列引入5’末端，将拼接供体序列引入可变域的3’末端。用另外编码拼接供体位点的3’末端特异性引物扩增对应抗体的可变轻链VL，通过NcoI/NheI克隆进类似消化的BS-Leader载体。此后，将来自BS-Leader载体的每个HindIII/BamHI片段克隆进对应的真核表达载体。这些载体(pEFpuroCγ1VB_HB，pEFdhfrCκVB_LB，pEFdhfrB_mutBCκVB_LB)包含EF-1α-启动子和HCMV增强子，SV40起点，多腺苷酸化信号，在载体中的嘌呤霉素抗性基因(对于重链)和鼠二氢叶酸酶基因(dhfr)(用于CHO细胞表达)或用于载体的选择和基因扩增的SEQ ID 1(序列1#)(用于K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSM ACC2806]、NM-H9D8-E6[DSM ACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSM ACC2856]或GT-2x[DSM ACC____]表达)(对于轻链)，以及人重链恒定γ1区域或人轻链恒定κ区域的基因组序列(扩增引物来自基因组人DNA，载体图谱参见WO2004/065423)。

实施例5

用于表达嵌合抗体PankoMab、Panko1、Panko2或西妥昔单抗的真核细胞的转染，和在有血清存在下制备高产细胞克隆的基因扩增操作

为了表达嵌合抗体，通过使用DMRIE-C的脂转染，或电穿孔(对于悬浮细胞NM-F9)和lipofectamin或电穿孔(对于贴壁细胞系CHOdhfr-)，用上述重链和轻链的载体的混合物(1∶1至1∶3)共转染NM-F9[DSM ACC2606]或CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]细胞。转染后2天，将生长培养基更换成选择培养基(NM-F9：RPMI 1640+10％FCS+2mM L-谷氨酰胺+0.75μg/ml嘌呤霉素+50nM甲氨蝶呤；CHOdhfr-：DMEM+10％透析的FCS+2mM L-谷氨酰胺+5μg/ml嘌呤霉素+50mM甲氨蝶呤)1周。通过将甲氨蝶呤浓度升高至100nM另外2周，进行第一次扩增。扩增的细胞群体的一部分是在没有添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤的培养基中克隆的单个细胞，通过升高甲氨蝶呤浓度，对其它细胞进行新一轮的基因扩增。以此方式，进行4-6轮基因扩增(100，200，500，1000，2000，3000nM甲氨蝶呤)。另外，类似地进一步扩增通过克隆筛选和分析鉴别出的最好的生产克隆。

在96-孔培养板中有限稀释(0.5细胞/孔)单个细胞克隆后，培养平板2-3周，显微镜分析生长中的细胞克隆，测定克隆效率％(含有生长中的细胞克隆的孔的数目×100/接种细胞的理论数目)。对于贴壁CHOdhfr-细胞或NM-F9悬浮细胞，使用不同方法筛选生长中的克隆的生产力。

CHOdhfr-：用PBS洗涤生长中的克隆的细胞，通过Accutase处理来收获。将一半重新悬浮的细胞接种进96-孔实验板，将另一半接种进24-孔平板，用于进一步培养。将实验平板培养20-24h。如比生产率(specific productivity rate，SPR)和倍增时间(g)的测定所述(参见下面)，分析每个孔的上清液的抗体滴度。使用MTT测定，测量相对细胞密度。详细地，用MTT溶液温育细胞2h，抛弃溶液，用在2-丙醇中的0.04M HCl溶液裂解细胞。2小时后，适度混合平板，使用微量滴定板光度计测量，其中使用570nm双模式过滤器和630nm参照过滤器。

NM-F9：离心96-孔培养板，抛弃上清液。将细胞重新悬浮于200μl新鲜培养基中。将一半重新悬浮的细胞接种进96-孔实验板，用100μl培养基稀释，将另一半保留在克隆平板中，用于进一步培养。培养2天后，离心实验平板，如比生产率(SPR)和倍增时间(g)的测定所述(参见下面)，分析20μl上清液的抗体滴度。通过在每个孔中加入10μl WST-1溶液(Roche)，使用WST-1测定，测量相对细胞密度。温育1-3小时后，使用微量滴定板光度计进行测量，其中使用450nm双模式过滤器和630nm参照过滤器。

选择具有高抗体滴度：细胞密度比率的细胞克隆，培养，并进一步分析。

K562、NM-D4和NM-H9的条件都相同。

比生产率(SPR)和倍增时间(g)的测定

对于每个克隆，在24-孔组织培养板的每个孔中的500μl生长培养基中接种2×10P^4P细胞。使细胞生长3天，收获条件培养基用于分析，如果必要，用Accutase取出细胞，并计数。通过ELISA，从培养基样品定量测定比抗体滴度。给测定平板覆盖人κ链特异性的抗体(BD)。用抗-人IgG(H+L)辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(JacksonImmunoresearch Laboratories)检测结合的重组抗体。对于定量，使用纯化的重组嵌合抗体作为标准品。

以皮克特定蛋白/细胞/天(pcd)为单位测量的SPR是生长速率和生产力的函数，用下面的方程来计算：

用下面的方程来计算倍增时间：

g＝log 2x(培养小时数)/log(最终细胞数/起始细胞数)

细胞系的平均产量和最大产量的测定

如上所述有限稀释(0.5细胞/孔)96-孔培养板中的来自200个理论涂布的单个克隆的单个细胞后，为生长中的细胞克隆测定SPR，并测定平均值和偏差，以及不同细胞系和不同条件的最大产量。表1对比了在含有血清条件下开发的生产嵌合PankoMab的CHOdhfr-和NM-F9细胞克隆的数据。

实施例6

生产抗体分子组合物的无血清高产细胞克隆的建立

使用DMRIE-C或电穿孔(Nucleofector，Amaxa)，转染适应了无血清培养基X-Vivo 20的NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12或GT-2x。转染后2天，将生长培养基换成选择培养基(X-Vivo 20+0.75μg/ml嘌呤霉素+50nM甲氨蝶呤)1周。通过将甲氨蝶呤浓度升高至100nM另外2周，进行第一次扩增。扩增的细胞群体的一部分是在没有添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤的X-Vivo中克隆的单个细胞，通过升高甲氨蝶呤浓度，对其它细胞进行新一轮的基因扩增。以此方式，进行4-6轮基因扩增(100，200，500，1000，2000，3000nM甲氨蝶呤)。另外，类似地进一步扩增通过克隆筛选和分析鉴别出的最好的生产克隆。

在96-孔培养板中有限稀释(0.5细胞/孔)单个细胞克隆后，培养平板2-3周，显微镜分析生长中的细胞克隆，测定克隆效率％(含有生长中的细胞克隆的孔的数目×100/接种细胞的理论数目)。在有血清存在下，使用与NM-F9悬浮细胞相同的操作(参见上面)，筛选生长中的克隆的生产力。

细胞克隆的平均产量和最大产量的测定

如上所述有限稀释(0.5细胞/孔)96-孔培养板中的来自200个理论涂布的单个克隆的单个细胞后，为生长中的细胞克隆测定SPR，并测定平均值和偏差，以及不同条件的最大产量。表2显示了完全在无血清条件下开发的生产嵌合PankoMab的NM-H9D8[DSM ACC2806]细胞克隆的数据。

本发明的细胞系中扩增后的比生产速率(SPR)高于CHOdhfr-，在无血清条件下开发的生产嵌合PankoMab的NM-H9D8[DSM ACC2806]细胞中最高。

在没有选择压力下，大多数克隆的生产速率在至少6周中是非常稳定的。最好的克隆稳定超过6周(SPR为30pcd)，倍增速率是24h。

数据反映了小实验室规模克隆的生产力，具有通过过程开发、培养基优化和发酵来进一步提高生产力的潜力。

在无血清条件下开发的生产克隆的更高的生产力和产量是有利的，所有其它抗体和所有细胞系(如适应了无血清条件的K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8-E6[DSM ACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSM ACC2856]或GT-2x[DSM ACC____])的条件都相同。

实施例7

抗体分子组合物的分离

为了生产和分离根据本发明的抗体分子组合物，在无血清培养基中培养分泌嵌合抗体PankoMab、Panko1、Panko2或西妥昔单抗的稳定转染的细胞，直到达到约1-2×10P^6P细胞/ml的细胞密度。通过离心(400xg，15min)从细胞培养上清液去除细胞后，使用蛋白A柱(HiTrapr-蛋白A FF，Amersham Pharmacia Biotech)纯化嵌合抗体。将通过突然pH变化洗脱的纯化的抗体级分重新悬浮于PBS，使用Centriprep离心试管(截止值50kDa，Millipore)浓缩。

实施例8

根据本发明的抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性的测定

从供血者分离的PBMC作为效应细胞

通过Ficoll-Hypaque(Biochrom)密度离心，从健康供血者的血液分离PBMC。用添加了5％FCS的RPMI 1640洗涤细胞3次，将分批的5×10⁷细胞冷冻保藏。融化PBMC，直接使用，或在添加了10％FCS(RPMI/FCS)的RPMI 1640中保藏过夜，直到用于流式细胞术或用作细胞毒性测定中的效应细胞。

在体外模型中检测依赖于抗体的细胞毒性

在铕释放测定中，研究了根据本发明的重组抗体的依赖于抗体的细胞毒性(ADCC)。在800μl铕缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，93mMNaCl，5mM KCl，2mM MgCl₂，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM醋酸铕(III))中，在冰上温育靶细胞(ZR-75-1，5×10⁶)6分钟，在Multiporator(eppendorf)中电穿孔(710V，1脉冲，30μs)，随后在冰上温育另外6min。此后，在RPMI 1640/5％FCS中洗涤细胞5次，接种至96-孔圆底板(Nunc；每孔100μl，1×10⁴细胞)。加入不同浓度(0.5-25μl/ml终浓度，200μl温育体积)的20μl重组抗体或对应对照(培养基，同种型对照人IgG)后，加入人外周血细胞(80μl/孔)作为效应细胞，使用50∶1的效应/靶细胞比。加入不含有效应细胞的80μl RPMI/FCS，以测定自发释放。用乙醇完全裂解靶细胞后，测定最大释放。在37℃培养箱中培养4小时后，在500xg离心平板5分钟，将25μl每种样品吸量进200μl/孔的增强溶液(Perkin-ElmerWallac)。在室温温育15min后，测定荧光(VictorP^2P荧光计，Perkin-Elmer Wallac)。从方程(实验裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)*100得到比细胞毒性。

或者，在100μl铕缓冲液(50mM HEPES，pH 7.4，93mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl₂，10mM二乙烯三胺五乙酸，2mM醋酸铕(III))中，在冰上温育靶细胞(LS174T或ZR-75-1，3×10⁶细胞)6分钟，在使用program A-011的Nucleofector II(Amaxa)中电穿孔，随后在冰上温育另外6min。此后，在RPMI 1640/5％FCS中洗涤细胞4次，接种进96-孔圆底板(Nunc；每孔100μl，5-10×10³细胞)。加入不同浓度(对于西妥昔单抗，0.001-100ng/ml终浓度，200μl温育体积；对于嵌合PankoMab、Panko1或Panko2，0,16-5μg/ml)的20μl重组抗体或对应对照(培养基，同种型对照人IgG)后，加入人外周血细胞(80μl/孔)作为效应细胞，使用100∶1至50∶1的效应/靶细胞比。加入不含有效应细胞的80μl RPMI/FCS，以测定自发释放。用1％Triton X-100完全裂解靶细胞后，测定最大释放。在37℃培养箱中培养4小时或过夜后，在500xg离心平板5分钟，将25μl每种样品吸量进200μl/孔的增强溶液(Perkin-Elmer Wallac)。在室温温育10min后，测定荧光(VictorP^2P荧光计，Perkin-Elmer Wallac)。从方程(实验裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)*100得到比细胞毒性。

从fut8^-细胞系NM-H9D8-E6分离的西妥昔单抗的ADCC活性显著高于从CHOdhfr-细胞或SP2/0细胞分离的西妥昔单抗的ADCC活性。如图2所示，在比从CHOdhfr-或SP2/0细胞分离的西妥昔单抗(Erbitux，从Merck得到)低约30倍的抗体浓度，从NM-H9D8-E6分离的西妥昔单抗诱导相同的LS174T细胞特异性裂解(specificlysis)。这指示比可商业得到的产品高30倍的ADCC活性。使用本发明的生产方法得到该结果，产生优化的糖基化模式。

从NM-F9[DSM ACC2606]、K562、NM-H9、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-H9D8-E6[DSM ACC2807]、NM-H9D8-E6Q12[DSM ACC2856]，GT-X2[DSM ACC____]或NM-H9D8[DSM ACC2806]分离的嵌合PankoMab的ADCC活性也比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab的ADCC活性高约5倍。约1/5的嵌合PankoMab浓度产生与在CHOdhfr-细胞中表达的嵌合PankoMab相同的ADCC活性。图3显示了用于对比目的的使用NM-F9细胞系得到的各个结果。

从NM-H9D8-E6或NM-H9D8-E6Q12分离的嵌合Panko1的ADCC活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合Panko1的ADCC活性高约8倍。约1/8的嵌合Panko1浓度产生与在CHOdhfr-细胞中表达的嵌合Panko1相同的ADCC活性。图4显示了各个结果。

从NM-H9D8或GT-2x分离的嵌合Panko2的ADCC活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合Panko2的ADCC活性高约6倍。约1/6的嵌合Panko2浓度产生与在CHOdhfr-细胞中表达的嵌合Panko2相同的ADCC活性。图5显示了各个结果。

从NM-H9D8-E6分离的嵌合Panko2的ADCC活性比从NM-H9D8细胞分离的嵌合Panko2的ADCC活性低。图6显示了各个结果。

在体外模型中检测依赖于补体的细胞毒性

在铕释放测定中研究抗体的依赖于补体的细胞毒性(CDC)。如上所述制备Eu³⁺-装载的靶细胞(ZR-75-1，3×10⁶)。

此后，将细胞接种进96-孔圆底板(Nunc；每孔100μl，5×10³细胞)。加入不同浓度(0.5至50μg/ml终浓度，200μl温育体积)的20μl抗体或对应对照(培养基，同种型对照人IgG)后，在室温温育细胞半小时。此后，加入10μl/孔幼兔补体(Cedarline，1∶5至1∶10稀释)。加入不含有补体的10μl RPMI/FCS，以测定自发释放。用乙醇或1％TritonX-100完全裂解靶细胞后，测定最大释放。在37℃培养箱中培养3-3.5小时后，在500xg离心平板5分钟，将25μl每种样品吸量进200μl/孔的增强溶液(Perkin-Elmer Wallac)。在室温温育10min后，测定荧光(VictorP^2P荧光计，Perkin-Elmer Wallac)。从方程(实验裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)*100得到比细胞毒性。

从NM-F9细胞分离的嵌合PankoMab的CDC活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab的CDC活性高约8倍。从NM-F9分离的嵌合PankoMab在比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab低8倍的浓度诱导相同的特异性裂解(specific lysis)。图7显示了各个结果。

分析抗体分子组合物的吞噬活性的缀合物形成测定(CFA)

用PKH26对肿瘤细胞染色：

在PBS中洗涤1×10P^7P-2×10P^7P肿瘤细胞2次，重新悬浮于1ml稀释剂C，对于ZR-74-1，ZR-74-1TF，MCF-7和MT-3，加入浓度为12×10P^-6PM的1ml PKH26。

在室温温育3min后，通过在室温加入2ml FCS 1min，停止染色。加入培养基(4ml，添加了1％L-谷氨酰胺、10％FCS的RPMI)，旋转，用培养基洗涤4次。在37℃，5％COB_2B温育肿瘤细胞过夜，以允许释放多余的PKH-26。

用半数细胞和体积，进行PKH-26染色的优化。

CFA：

用胰蛋白酶/EDTA收获PKH-26标记的肿瘤细胞，用PBS洗涤一次，在有或没有重组抗体分子组合物存在下，以0.8×10P^6P细胞/ml重新悬浮于MAK细胞培养基(Invitrogen)。将肿瘤细胞(250μl，0.2×10P^6P细胞)接种进非粘性的聚丙烯试管。

根据Boyer等人，Exp.Hematol.27，751-761(1999)，制备MAK细胞，洗涤，以1.6×10P^6P细胞/ml重新悬浮。将250μl MAK细胞(0.2×10P^6P细胞)加入PKH-26标记的肿瘤细胞(E∶T比2∶1)。在4℃和37℃/5％COB_2B一式两份地温育单个样品3h或过夜(18-20h)。

温育3h或过夜后，用PBS洗涤细胞，用在PBS/10％FCS中的CD11c-FITC(1∶18,5)+7-AAD(1∶500)染色，用PBS洗涤细胞，重新悬浮于400μl PBS。在Epics XL(Beckman Coulter)中采集10.000细胞。

将colocalized MAK细胞的百分比测定为PKH-26阳性细胞在所有存活的CD11c-FITC阳性细胞的细胞群体中的百分比。

实施例9

在ELISA中分析抗体分子组合物结合活性

为了分析在不同细胞系中表达的抗体分子组合物的抗原结合，在具有序列APPAHGVTSAPDT[GalNAcα]RPAPGSTAPPAHGVTSA的合成的糖基化的MUC1 30-聚体肽上，在ELISA中测量嵌合PankoMab和Panko2的纯化的抗体分子组合物。未糖基化的MUC1肽用作对照。

使用在-20℃分份储存的母液(1mg，在1ml bidest.HB_2BO)，制备在PBS中的1μg/ml稀释液。将50μl/孔吸量进NUNC Immuno plateF96 MaxiSorp，在4℃温育实验平板过夜。次日，用PBS/0.2％Tween-20洗涤实验平板3次。随后，用在PBS中的2％BSA封闭非特异性的结合位点，在室温温育至少1h，应用50μl重组PankoMab(1-400ng/mlPBS/1％BSA)。用PBS/0.2％Tween-20洗涤3步后，采用过氧化物酶偶联的第二抗-人Fcγ1抗体来检测特异性地结合的抗体。为了检测结合的第二抗体，用TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)进行颜色反应。15分钟后，通过加入2.5N H B_2BSOB_4B，猝灭反应。使用微量滴定板光度计进行测量，使用450nm双模式过滤器和630nm参照过滤器。

从NM-F9分离的嵌合PankoMab的结合活性比从CHOdhfr-细胞分离的嵌合PankoMab的结合活性高约50％(图8)。

在ELISA中从高唾液酸化克隆NM-H9D8表达和克隆的嵌合Panko2的结合活性与GT-2x相当，比CHOdhfr-细胞更高(图9)。

实施例10

在NM-F9、NM-和CHOdhfr-细胞中表达的抗体分子组合物的聚糖分析

通过酸水解，切割至少100μg纯化的抗体的聚糖。通过缀合荧光染料DMB，特异性地标记唾液酸。通过HPLC进行分析，例如在Asahipak-NH2柱上，以分离糖。通过适当的唾液酸标准物质，进行唾液酸的鉴别和计算。

在CHOdhfr-或NM-F9细胞中表达的嵌合PankoMab抗体分子组合物的分析揭示了CHOdhfr-产物的＜10％单唾液酸化和NM-F9或GT-2x产物的几乎没有唾液酸化。后者仅含有不带电荷的聚糖。

更详细地，通过酸水解，切割至少100μg纯化的抗体的聚糖。通过缀合荧光染料如DMB，特异性地标记唾液酸。通过HPLC进行分析，例如通过RP-18柱上的反相色谱。通过适当的唾液酸标准物质，进行唾液酸的鉴别和计算。

对于带电荷的聚糖结构和半乳糖基化状态的测定，用胰蛋白酶消化100μg抗体，通过PNGaseF处理得到N-聚糖。用2-氨基苯酰胺(2-AB)标记纯化的聚糖，进行阴离子交换色谱HPLC(Asah -PAK-柱)，用于测定带电荷的N-聚糖结构。对于半乳糖基化状态的测定，用神经氨酸酶处理N-聚糖，以消除唾液酸含量，并通过Aminophase HPLC(Luna-NH2-柱)进行分离，通过质谱法分析峰。

通过反相色谱(RP18-柱)，在第二步中分离含有携带聚糖的潜在二等分GlcNAc的峰。由此，可以区分开三触角和双触角+平分结构。通过2-AB标记的聚糖的aminophase HPLC(Luna-NH2-柱)，测定抗体的岩藻糖基化程度。通过积分来定量峰，通过质谱法来分析潜在的聚糖结构。测定岩藻糖基化的和未岩藻糖基化的结构，并定量累积的峰面积。

分析了在NM-F9、GT-2x、NM-H9D8、NM-H9D8-E6或CHOdhfr-细胞中表达的西妥昔单抗、PankoMab和Panko1的不同抗体分子组合物，结果总结在表3-4中。

通过ELISA或蛋白印迹分析，使用优先结合α2-6(SNA)或α2-3(MAL-I)连接的唾液酸的凝集素来表征抗体唾液酸化。

进行蛋白印迹分析来鉴别在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSMACC2806]中表达的抗体分子组合物的有差别地唾液酸化的重链。在还原条件下，通过10％丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE，分离5μg每种抗体分子组合物。将蛋白转移至硝酸纤维素，通过凝集素和/或通过第二抗-人IgG抗体显影。图10显示了通过检测2-6唾液酸化的第二抗-人IgG抗体(图10A)或SNA(图10B)，在CHOdhfr-、NM-F9或NM-H9D8[DSMACC2806]中表达的嵌合PankoMab的抗体分子组合物的有差别地唾液酸化的重链。图11显示了通过SNA结合观察到的在CHOdhfr-或NM-H9D8中表达的西妥昔单抗的抗体分子组合物的有差别地唾液酸化的重链。

使用ELISA实验来分析从NM-F9、NM-H9D8或NM-H9D8-E6细胞的上清液分离的抗体的唾液酸化。将在PBS中的2μg/ml纯化的抗体以50μl/孔覆盖到96孔微量滴定板(Maxisorp)上在4℃过夜，封闭(PBS/BSA)，洗涤，用生物素化的SNA(2μg/ml，PBS/1％BSA)温育1小时，再次洗涤。然后用POD-抗生蛋白链菌素温育细胞，洗涤，用TMB显影。通过加入2.5N H₂SO₄来终止反应，在450nm测量光密度，630nm作为参照。图12显示了在NM-H9D8或NM-H9D8-E6细胞中表达的抗体发生的SNA结合，但是在CHOdhfr-或GT-2x细胞中表达的抗体不结合。各个抗体的结合强度是不同的，这指示由各个抗体的精细结构或在使用的条件下糖的可用性造成的不同唾液酸化程度。

如下进行ELISA实验：将纯化的在不同细胞系中表达的抗体包被到微量滴定板的孔中(2μg/ml，50μl/孔)，通过适当的生物素化的凝集素SNA和MAL I进行检测。通过神经氨酸酶处理(0.1U/ml，在室温温育1小时)，检查唾液酸化对凝集素结合的依赖性。在图13A和13B中解释了西妥昔单抗的结果。

进行斑点印迹分析来鉴别在CHOdhfr-、NM-F9、NM-H9D8和NM-H9D8-E6细胞中表达的抗体的唾液酸化差异。将3μg纯化的抗体分别点到硝酸纤维素上，用PBS/BSA封闭，洗涤，通过检测2，6-唾液酸化的SNA显影。图14显示了从CHOdhfr-、NM-F9、NM-H 9D8或NM-H9D8-E6细胞分离的嵌合抗体Panko1和Panko2的印迹。仅在从NM-H9D8或NM-H9D8-E6细胞分离的抗体上可检测到2，6-唾液酸化。

实施例11

在NM-F9、NM-H9D8和CHOdhfr-细胞中表达的抗体分子组合物的生物利用度的检测

与在NM-F9细胞中表达的未唾液酸化的抗体PankoMab相比，在裸鼠中测得在NM-H9D8中表达的唾液酸化的抗体PankoMab具有更长的生物利用度。给每只小鼠静脉内注射5μg纯化的抗体，每组至少3只小鼠。在注射后的不同时间点(注射后5分钟，2，5，8，24，48，72，和144小时)，收集血样。分离血清，在分析之前在-80℃保存样品。通过ELISA，测定这些样品中的抗体滴度。图15表明，从NM-H9D8细胞分离的嵌合PankoMab比从NM-F9细胞分离的嵌合PankoMab的可利用时间更长，这可能是由于抗体的不同唾液酸化。

实施例12

在真核细胞中克隆表达hFSH的载体

使用从德国RZPD得到的BAC克隆RZPDB737B122053D(FSHα基因组)、IRAUp969E0752D(FSHαcDNA)和RZPDB737H0619D6(FSHβ基因组)，用特异性引物PCR扩增FSHα和FSHβ链的编码序列。

FSHα链的引物：

FSHa-wt-f-KpnI：AAAGGTACCATGGATTACTACAGAAAATATG/

FSHa-b-BamHI：AAAGGATCCTTAAGATTTGTGATAATAAC；

FSHβ链的引物：

FSHb-wt-f-HindIII：TTTAAGCTTATGAAGACACTCCAGTTTTTC/

FSHb-b-BamHI：TTTGGATCCTTATTCTTTCATTTCACC

扩增后，通过HindIII/BamHI(FSH基因组β)和KpnI/BamHI(FSH基因组α或FSHcDNAα)，将产物克隆进对应的真核表达载体。通过编码与TCR-先导序列融合的FSHβ链的Genesynthesis，生产cDNA序列，并克隆进真核表达载体(FSHcDNAβ)。

序列FSHcDNAβ(TCR-先导序列标有下划线)：

atggcctgccccggcttcctgtgggccctggtgatcagcacctgcctggaattct ccatggctaacagctgcgagctgaccaacatcaccatcgccatcgagaaagaggaatgccggttctgcatcagcatcaacaccacctggtgcgccggctactgctacacccgggacctggtgtacaaggaccccgccaggcccaagatccagaaaacctgcaccttcaaagaactggtgtacgagaccgtgcgggtgcccggctgcgcccaccacgccgacagcctgtacacctaccccgtggccacccagtgccactgcggcaagtgcgacagcgacagcaccgactgcaccgtgaggggcctgggccccagctactgcagcttcggcgagatgaaagagtga

表达载体(pEFpuro和pEFdhfrB_mutB)包含EF-1α-启动子和HCMV增强子，SV40起点，多腺苷酸化信号，在载体中的嘌呤霉素抗性基因(对于α链)和用于CHO细胞表达的鼠二氢叶酸酶基因(dhfr)或用于载体的选择和基因扩增的SEQ ID 1(序列1#)(用于NM-F9，GT-2x，K562、NM-H9、NM-D4或NM-H9D8表达)(对于β链)。

实施例13

转染真核细胞以表达人重组hFSH，和在无血清条件下(GT-2x和NM-H9D8)或含有血清条件下(CHOdhfr-)制备高产细胞克隆的基因扩增操作

为了表达hFSH，通过使用DMRIE-C的脂转染，或电穿孔(Nucleofector；Amaxa)(对于悬浮细胞GT-2x(FSHcDNAα/FSH基因组β)和NM-H9D8(FSHcDNAα/FSHcDNAβ))和lipofectamin或电穿孔(对于贴壁细胞系CHOdhfr-(FSH基因组α/FSH基因组β))，用上述α和β链的载体的混合物(1∶1至1∶3)共转染GT-2x[DSMACC____]、NM-H9D8(DSM ACC2806)和CHOdhfr-(ATCC No.CRL-9096)。这些是在该方案中使用的示例性组合。hFSHα和hFSHβ链表达质粒的每种其它组合，产生相当的结果。

转染后2天，将生长培养基更换成选择培养基(GT-2x和NM-H9D8：X-Vivo20培养基+0.75μg/ml嘌呤霉素+50nM甲氨蝶呤；CHOdhfr-：DMEM+10％透析的FCS+2mM L-谷氨酰胺+5μg/ml嘌呤霉素+50mM甲氨蝶呤)1周。通过将甲氨蝶呤浓度升高至100nM另外2周，进行第一次扩增。200nM甲氨蝶呤用于另外2周。扩增的细胞群体的一部分是在没有添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤的培养基中克隆的单个细胞。通过升高甲氨蝶呤浓度，对其它细胞进行新一轮的基因扩增。以此方式，进行2-3轮基因扩增(100，200，500nM甲氨蝶呤)。另外，类似地进一步扩增通过克隆筛选和分析鉴别出的最好的生产克隆。

CHOdhfr-：用PBS洗涤生长中的克隆的细胞，通过Accutase处理来收获。将一半重新悬浮的细胞接种进96-孔实验板，将另一半接种进24-孔平板，用于进一步培养。将实验平板培养20-24h。如比生产率(SPR)和倍增时间(g)的测定所述(参见下面)，分析每个孔的上清液的抗体滴度。使用MTT测定，测量相对细胞密度。详细地，用MTT溶液温育细胞2h，抛弃溶液，用在2-丙醇中的0.04M HCl溶液裂解细胞。2小时后，适度混合平板，使用微量滴定板光度计测量，使用570nm双模式过滤器和630nm参照过滤器。

GT-2x和NM-H9D8：离心96-孔培养板，抛弃上清液。将细胞重新悬浮于200μl新鲜培养基中。将一半重新悬浮的细胞接种进96-孔实验板，用100μl培养基稀释，将另一半保留在克隆平板中，用于进一步培养。培养2天后，离心实验平板，如比生产率(SPR)和倍增时间(g)的测定所述(参见下面)，分析20μl上清液的抗体滴度。通过在每个孔中加入10μl WST-1溶液(Roche)，使用WST-1测定，测量相对细胞密度。温育1-3小时后，使用微量滴定板光度计进行测量，使用450nm双模式过滤器和630nm参照过滤器。

比生产率(SPR)和倍增时间(g)的测定

对于每个克隆，在24-孔组织培养板的每个孔中的500μl生长培养基中接种2×10P^4P细胞。使细胞生长3天，收获条件培养基用于分析，如果必要，用Accutase取出细胞，并计数。通过ELISA，从培养基样品定量测定比抗体滴度。给测定平板覆盖对hFSHβ(ab22473)特异性的小鼠mAB。用对hCGα(ab20712)特异性的山羊多克隆抗体温育结合的重组hFSH，并用驴抗山羊IgG H+L-POD(JacksonImmunoCat.No 305-035-003)检测。对于定量，使用纯化的重组hFSH作为标准品。

用下面的方程来计算倍增时间：

g＝log 2x(培养小时数)/log(最终细胞数/起始细胞数)

细胞系的平均产量和最大产量的测定

如上所述有限稀释(0.5细胞/孔)96-孔培养板中的来自200个理论涂布的单个克隆的单个细胞后，为生长中的细胞克隆测定SPR，并测定平均值和偏差，以及不同细胞系和不同条件的最大产量。表7和表8对比了在含有血清条件下(CHOdhfr-)和无血清条件下(GT-2x和NM-H9D8)开发的生产hFSH的CHOdhfr-、GT-2x和NM-H9D8细胞克隆的数据。

实施例14

hFSH分子组合物的分离

为了生产和分离根据本发明的hFSH分子组合物，在无血清培养基中培养分泌hFSH的稳定转染的细胞，直到达到约1-2×10P^6P细胞/ml的细胞密度。通过离心(400xg，15min)从细胞培养上清液去除细胞后，使用亲和色谱纯化嵌合抗体，其中使用偶联到NHS活化柱(Hi TrapNHS-活化的HP；GE Healthcare)上的抗hCGα的多克隆抗体。将通过突然pH变化洗脱的纯化的FSH级分重新悬浮于PBS，使用Centriprep离心试管(截止值10kDa，Millipore)浓缩，并通过SDS-PAGE进行分析(参见图16)。

实施例15

根据本发明的FSH分子组合物的活性的测定

根据后面所述的方法，可以测定携带不同糖基化模式的FSH分子的活性。为了用根据本发明的筛选方法选择合适的细胞系(其提供优化的糖基化)，在不同细胞系中表达FSH分子，从而从在例如唾液酸化程度、半乳糖基化和/或岩藻糖基化程度方面具有不同糖基化模式的单个细胞系得到FSH组合物。通过至少一种下述方法，可以测定具有最有利的活性和糖基化模式的FSH分子/组合物：

大鼠粒层细胞测定：

从DES处理过的切除垂体的大鼠得到粒层细胞。制备细胞的方法在Jia和Hsueh 1985中详细描述。

在含有100nM DES、0.125M 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、2mM谷氨酰胺、1μM雄烯二酮、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、1μg/ml牛胰岛素和源自GT-2x和NM-H9D8细胞的递增浓度的rFSH制品(0-1μg/ml)的McCoy’s 5A培养基中，以～160000细胞/孔，在24孔板中培养得到的细胞高达72小时。温育后72h，收集培养基，在通过ELISA(Calbiotech#ES071S)定量雌二醇之前保存在-20℃。

293HEK测定：

在37℃，在有0.125mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤存在下，将用hFSH-受体转染的HEK293细胞(2×10⁵细胞/35mm培养皿)暴露于递增剂量的从GT-2x和NM-H9D8细胞得到的每种FSH蛋白分子组合物(其范围是0-1μg/ml FSH)24h，最高达72小时。温育后，根据生产商的说明书，通过cAMP Direct Biotrak^TM EIA(GE Healthcare，Cat.no.：RPN225)测定总(细胞内的和细胞外的)cAMP浓度。

GFSHR-17细胞测定：

用含有5％胎牛血清(Biochrom KG，Berlin，Germany)的Dulbecco改良的Eagle培养基Ham F12(1∶1 v∶v；Biochrom KG，Berlin，Germany)，培养细胞。以2×10⁵细胞/24孔板涂布细胞，用从GT-2x和NM-H9D8细胞得到的FSH蛋白分子组合物温育24h，范围是0-1μg/ml 1-24小时。温育后，收集培养基，在根据生产商的说明书使用孕酮ELISA测定(Biochem Immuno系统，Freiburg，Germany)定量孕酮之前，保存在-20℃。

人粒层细胞测定

如Khan等人，1990所述，富集从参与Münster大学的体外受精方案的妇女得到的来自卵泡抽吸物的粒层-叶黄质细胞，接种进6-孔培养板(1-1.5×10⁵活细胞/孔)。在37℃，在5％CO₂气氛下，在添加了10％热灭活的胎牛血清(FCS；Gibco，Eggenstein，Germany)、青霉素(50units/ml)、链霉素(50pg/ml)、庆大霉素(100pg/rnl)和两性霉素(0.6pg/ml)的HAM’s F12/Dulbecco氏改良的基本培养基(DMEM)(1∶1；ICN Biomedicals，Meckenheim，Germany)中培养细胞。在37℃，在有0.125mM 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤存在下，将细胞暴露于递增剂量的从GT-2x和NM-H9D8细胞得到的每种FSH蛋白分子组合物(其范围是0-1μg/ml FSH)24h，最高达72小时。温育后，根据生产商的说明书，通过cAMP Direct Biotrak^TM EIA(GEHealthcare，Cat.no.：RPN225)测定总(细胞内的和细胞外的)cAMP浓度。

实施例16在GF-2X和CHO细胞中表达的FSH组合物的聚糖分析

进行蛋白印迹分析来鉴别在CHOdhfr-、GT-2x[DSM ACC____]或NM-H9D8[DSM ACC2806]中表达的有差别地唾液酸化的FSH分子组合物。在还原条件下，通过10％丙烯酰胺凝胶中的SDS-PAGE，分离5μg每种抗体分子组合物。将蛋白转移至硝酸纤维素，通过检测2-6唾液酸化的SNA显影(图17)。

根据实施例10进行详细的聚糖分析，以测定唾液酸含量、电荷分布、岩藻糖含量、半乳糖基化状态和二等分GlcNAc含量。

结果显示在GT-2X中可高产量地生产FSH(见图17)。其中，产物没有显示任何可检测的2-6连接的NeuNAc(见图17的泳道1)。相反，在NM-H9D8中产生的FSH显示量相当高的可检测的2-6连接的NeuNAc。活性可用通过实施例15所述的方法检测。

根据IUPAC-IUBMB推荐(1996)的定义：

Neu5Gc：5-N-羟乙酰基-α-神经氨酸

Neu5Ac和NeuNAc：5-N-乙酰基-α-神经氨酸

Gala1，3Gal和Galα1，3Gal：α-D-吡喃型半乳糖基-(1→3)-吡喃型半乳糖基-邻近的糖

2，3连接的神经氨酸：5-N-乙酰基-α-神经氨酰基-(2→3)-邻近的糖

2，6连接的神经氨酸：5-N-乙酰基-α-神经氨酰基-(2→6)-邻近的糖

*****

应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和/或试剂，它们可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，无意限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书来限定。

SEQ ID：

序列#1

SEQ ID 1

MVRPLNCIVAVSQDMGIGKNGDLPWPPLRNEWKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGRKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVGGSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYKFEVYEKKD

序列#2

SEQ ID 2

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNESRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#3

SEQ ID 3

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNEARYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#4

SEQ ID 4

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNEGRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#5

SEQ ID 4

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDYPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#6

SEQ ID 6

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDRPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#7

SEQ ID 7

MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGKKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIVGGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKYKFEVYEKND

序列#8

SEQ ID 8

MVRPLNCIVAVSQNMGIGKNGDRPWPPLRNEFKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGRKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVGGSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYKFEVYEKKD

序列#9

SEQ ID 9

MVRPLNCIVAVSQNMGIGKNGDYPWPPLRNEFKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMGRKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVGGSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYKFEVYEKKD

序列#10

SEQ ID 10

MWLGSLLLLGTVACSISA

表1

	CHOdhfr-	NM-F9
	CHOdhfr-	NM-F9	生产速率(cIgG1)第一轮至第四轮基因扩增(甲氨蝶呤)后测得的pcd和来自理论上200个接种的克隆的单细胞克隆(有限稀释)	第一轮(100nM MTX)平均：2+/-1pcd；最大：3pcd第二轮(200nM MTX)平均：5+/-1pcd；最大：7pcd第三轮(500nM MTX)平均：9+/-5pcd；最大：17pcd第四轮(1000nM MTX)平均：13+/-5pcd；最大：22pcd	第一轮(100nM MTX)平均：5+/-1,5pcd；最大：13pcd第二轮(200nM MTX)平均：7.5+/-4.5pcd；最大：19pcd第三轮(500nM MTX)平均：12.5+/-4.5pcd；最大：19pcd第四轮(1000nM MTX)平均：16.5+/-6pcd；最大：27pcd

表2

	NM-H9D8
	NM-H9D8	生产速率(cIgG1)第一轮至第五轮基因扩增(甲氨蝶呤)后测得的pcd和来自理论上200个接种的克隆的单细胞克隆(有限稀释)	第一轮(100nM MTX)平均：7+/-4pcd；最大：14pcd第二轮(200nM MTX)平均：14+/-4pcd；最大：23pcd第三轮(500nM MTX)平均：13+/-6pcd；最大：31pcd第四轮(1000nM MTX)平均：23+/-8pcd；最大：34pcd第五轮(2000nM MTX)平均：23+/-9pcd；最大：38pcd

表3

	pmolNeu5Gc	pmolNeu5Ac	pmolNeu5Gc/μg蛋白	pmolNeu5Ac/μg蛋白
	pmolNeu5Gc	pmolNeu5Ac	pmolNeu5Gc/μg蛋白	pmolNeu5Ac/μg蛋白	Erbitux(Merck；SP2/0)	0,149	0,000	1,784	0,000
西妥昔单抗GT-2x	0,000	0,278	0,000	3,335	Erbitux(Merck；SP2/0)	0,149	0,000	1,784	0,000
西妥昔单抗GT-2x	0,000	0,278	0,000	3,335	西妥昔单抗NM-H9D8	0,000	1,156	0,000	12,003
cPankoMab CHOdhfr-	0,000	0,477	0,000	4,921	西妥昔单抗NM-H9D8	0,000	1,156	0,000	12,003
cPankoMab CHOdhfr-	0,000	0,477	0,000	4,921	cPankoMab GT-2x	0,000	0,248	0,000	2,990
cPankoMab NM-H9D8	0,000	0,776	0,000	13,856	cPankoMab GT-2x	0,000	0,248	0,000	2,990

表4

	A0	A1	A2	A3	A4
	A0	A1	A2	A3	A4	Panko1 CHOdhfr-	75	9	11	4	1
Panko1 NM-H9D8	43	14	32	10	1	Panko1 CHOdhfr-	75	9	11	4	1
Panko1 NM-H9D8	43	14	32	10	1	Panko1 NM-H9D8-E6	40	16	33	10	1
c-PankoMab CHOdhfr-	93	7	0	0	0	Panko1 NM-H9D8-E6	40	16	33	10	1
c-PankoMab CHOdhfr-	93	7	0	0	0	c-PankoMab NM-F9	99	1	0	0	0
c-PankoMab NM-H9D8	62	26	11	1	0	c-PankoMab NM-F9	99	1	0	0	0

表5

	G0[％]	G1[％]	G2[％]	G3[％]
	G0[％]	G1[％]	G2[％]	G3[％]	Panko1 CHOdhfr-	22	45	33	0
Panko1 NM-H9D8	7	8	66	14	Panko1 CHOdhfr-	22	45	33	0
Panko1 NM-H9D8	7	8	66	14	Panko1 NM-H9D8-E6	5	18	58	19
cPankoMab CHOdhfr-	28	36	35	1	Panko1 NM-H9D8-E6	5	18	58	19
cPankoMab CHOdhfr-	28	36	35	1	cPankoMab NM-F9	7	26	65	2
cPankoMab NM-H9D8	7	32	59	0	cPankoMab NM-F9	7	26	65	2

表6

	岩藻糖基化的	未岩藻糖基化的	双触角+二等分GlcNAc
	岩藻糖基化的	未岩藻糖基化的	双触角+二等分GlcNAc	Panko1 CHOdhfr-	100	0	0
Panko1 NM-H9D8	45	55	5	Panko1 CHOdhfr-	100	0	0
Panko1 NM-H9D8	45	55	5	Panko1 NM-H9D8-E6	21	79	2

	双触角	双触角+二等分GlcNAc	未岩藻糖基化的
	双触角	双触角+二等分GlcNAc	未岩藻糖基化的	cPankoMab-CHO	99	0	0
cPankoMab-NM-F9	68	29	6	cPankoMab-CHO	99	0	0
cPankoMab-NM-F9	68	29	6	cPankoMab-NM-H9D8	59	39	1

表7

	CHOdhfr-	GT-2X
	CHOdhfr-	GT-2X	生产速率(FSH)第三轮基因扩增(甲氨蝶呤)后测得的pcd和来自理论上200个接种的克隆的单细胞克隆(有限稀释)	第三轮(500nM MTX)平均：＜1pcd；最大：0,05pcd	第二轮(200nM MTX)平均：2.5+/-2.0pcd；最大：6pcd第三轮(500nm MTX)平均：2.5+/-1.3pcd；最大：12pcd

表8

	NM-H9D8
	NM-H9D8	生产速率(FSH)第二轮基因扩增(甲氨蝶呤)后测得的pcd和来自理论上200个接种的克隆的单细胞克隆(有限稀释)	第二轮(200nM MTX)平均：2.2+/-1.2pcd；最大：4pcd

表9

-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属

权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-2-6 NeuNAc
		权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-2-6 NeuNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端	-没有NeuGc-没有可检测的末端	-没有NeuGc-没有可检测的末端

Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-2-6 NeuNAc
			-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc


			-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc
			-没有NeuGc	-没有NeuGc	-没有NeuGc

-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-bisecGlcNAc-高产量-6 NeuNAc
			-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳糖-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的高半乳

糖-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	糖-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	糖-高产量-2-6 NeuNAc
糖-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	糖-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	糖-高产量-2-6 NeuNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-更高的亲和力-高产量-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc

-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-高活性，尤其Fc活性-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc
	-高活性，尤其Fc活性-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高产量-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-如权利要求2和从属权利要求所定义的低岩藻糖-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc

-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	要求所定义的低唾液酸
-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	要求所定义的低唾液酸		-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-高产量-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc
			-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高产量	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高产量	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-bisecGlcNAc-高产量

-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-2-6 NeuNAc
-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-2-6 NeuNAc	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高活性，尤其Fc活性-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc
-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高产量-2-6 NeuNAc-2-3 NeuNAc-如权利要求2和从属权利要求所定义的更多唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高产量-如权利要求2和从属权利要求所定义的低唾液酸	-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高产量-2-6 NeuNAc			-没有NeuGc-没有可检测的末端Galα1-3Gal-高活性，尤其Fc活性-2-6 NeuNAc

表10

Panko 1

Fuc neg+BisGlcNAc neg.H9D8＝54％ H9D8-E6＝79％

Fuc pos+BisGlcNAc pos H9D8＝5％ H9D8-E6＝2％

Fuc neg+BisGlcNAc pos H9D8＝0％ H9D8-E6＝0％

Panko 2

Fuc neg+BisGlcNAc neg.H9D8＝～0％ F9和GT-2X＝-5-6％

Fuc pos+BisGlcNAc pos H9D8＝36％ F9和GT-2X＝29％

Fuc neg+BisGlcNAc pos H9D8＝0％ F9和GT-2X＝0％

PCT/RO/134表

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSM ACC2606的PCT/RO/134表格的标识

申请人在此向有各自规定的那些国家请求：本申请所涉及的保藏的生物材料样品只提供给独立的指定的专家(“专家方案”请求(适用时)，尤其是澳大利亚、加拿大、克罗地亚、丹麦、芬兰、德国、冰岛、挪威、新加坡、西班牙、瑞典、联合王国、欧洲)

对于欧洲，申请人因此请求，如Rule 28(3)EPC中所规定的，保藏的生物材料样品在授予专利权的出版之前或从申请日起20年(如果本申请被驳回或撤回或视为撤回)仅仅通过将样品发放至请求样品的人指定的专家的途径获得(Rule28(4)EPC)。

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

1当Rule6.4(d)适用时，该日期是指获得国际保藏单位地位的日期

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSM ACC2605的PCT/RO/134表格的标识

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

¹当Rule6.4(d)适用时，该日期是指获得国际保藏单位地位的日期

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSMACC2806的PCT/RO/134表格的标识

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSM ACC2807的PCT/RO/134表格的标识

对于欧洲，申请人因此请求，如Rule 28(3)EPC中所规定的，保藏的生物材料样品在授予专利权的出版之前或从申请日起20年(如果本申请被驳回或撤回或视为撤回)仅仅通过将样品发放至请求样品的人指定的专家的途径获得(Rule28(4)EPC))。

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSMACC2856的PCT/RO/134表格的标识

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号还未获得的GT-2X的PCT/RO/134表格的标识

关于保藏的微生物的说明

(PCT实施细则第13条之二)

PCT/RO/134表

根据登记号DSM ACC2858的PCT/RO/134表格的标识

国际表格

葛莱高托普有限公司最初保藏的受理，

Robert-Rossle-str.10 由本页下面所示的国际保藏单位根据

13125柏林 Rule 7.1款发给

DSMZ-BP/9表格(单页)12/2001

Claims

1.生产蛋白分子组合物的方法，其包含

(a)在永生化人血细胞宿主细胞中引入至少一种核酸，其编码所述蛋白的至少一部分；和

(b)在允许生产所述蛋白分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和

(c)分离所述蛋白分子组合物。

2.根据权利要求1的生产蛋白分子组合物、优选抗体分子组合物的方法，其包含下述步骤：

(a)在永生化人血细胞宿主细胞中引入至少一种核酸，其编码蛋白或其至少一部分；其中选择生产具有至少一种下述糖基化特征的蛋白组合物的所述宿主细胞：

(i)它不含有可检测的NeuGc；和/或

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中的相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加的半乳糖基化程度；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中的相同量的蛋白分子相比，它具有高至少5％的量的G2结构，该G2结构是在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上；和/或

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少5％的量的G0结构；和/或

(v)它不含有可检测的末端Galα1-3Gal；和/或

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含少至少5％的量的岩藻糖；和/或

(vii)它包含至少一个含有二等分GlcNAc的糖结构；和/或

(viii)当在其中表达时，具有与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的唾液酸化模式相比改变的唾液酸化模式；

(c)分离所述蛋白分子组合物，其中所述蛋白分子具有(i)至(viii)的至少一种糖基化特征。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述唾液酸化模式的特征在于至少一种下述特征：

-它包含α2-6连接的NeuNAc；和/或

-它具有增加的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有高至少15％量的NeuNAC，和/或

-它具有降低的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上，具有低至少15％量的NeuNAc，和/或

-当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖单元上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含多至少20％的带电荷的N-糖苷连接的糖链，

-当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖单元上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含少至少20％的带电荷的N-糖苷连接的糖链。

4.根据权利要求1-3中至少一项的方法，其中选择所述宿主细胞以生产糖蛋白，其包含总糖单元或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链的至少10％糖结构，且缺少岩藻糖。

5.根据权利要求1-4中至少一项的方法，其中选择所述宿主细胞以生产糖蛋白，其包含总糖单元或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链的至少2％糖结构，其含有二等分GlcNAc。

6.根据权利要求1-5中至少一项的方法，其中选择所述宿主细胞以生产糖蛋白，其包含

-在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的超过35％G2结构；和/或

-在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的小于22％G0结构。

7.根据权利要求1-6中至少一项的方法，其中生产的所述蛋白分子组合物具有至少一种下述特征：

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有增加的活性和/或尤其增加的产量；

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它尤其具有提高的同质性；

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有提高的同质性，这是提高的糖基化同质性；

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有增加的活性；

-在所述蛋白分子是抗体分子的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有增加的Fc-介导的细胞毒性，这比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍；和/或

-在所述蛋白分子是抗体分子的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有增加的抗原介导的或Fc-介导的结合，这比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的结合高至少15％、优选20％、25％、30％、35％、40％、45％和优选50％。

8.权利要求1-7中至少一项的方法，其中所述宿主细胞在无血清条件下生长和产蛋白分子组合物。

9.根据权利要求1-8中至少一项的方法，其中选择所述宿主细胞来生产蛋白组合物，后者包含具有下述特征糖基化组合的蛋白分子：

(a)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时与相同蛋白分子的蛋白组合物相比，或与唾液酸化缺陷型细胞系例如NM-F9和NM-D4相比，它包含增加量的唾液酸；

(b)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的蛋白组合物相比，它包含减少量的唾液酸；

(c)

-它不含有可检测的NeuGc

-它不含有可检测的Galα1-3Gal

-它包含在权利要求2中定义的半乳糖基化模式

-它具有在权利要求2中定义的岩藻糖含量

-它包含bisecGlcNAc

-它包含2-6NeuNAc。

10.权利要求1-9中至少一项的方法，其中使用选自下述组1-4的宿主细胞：

(a)组1，其包含具有高唾液酸化活性的宿主细胞，例如K562或源自它们的细胞系；

(b)组2，其包含因为遗传缺陷或表达抑制系统而具有低或无唾液酸化活性的宿主细胞，包括NM-F9[DSM ACC2606]，NM-D4[DSM ACC2605]和GT-2X；

(c)组3，其包含具有比K562更高唾液酸化程度的宿主细胞，例如NM-H9和NM-H9D8或源自它们的细胞系；

(d)组4，其包含具有低或甚至无岩藻糖基化活性的宿主细胞，例如NM-H9D8-E6和NM H9D8-E6Q12或源自它们的细胞系。

11.根据权利要求1-10中至少一项的方法，其中所述宿主细胞是人骨髓白血病起源，优选地选自：K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、GT-2X[DSM ACC_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSM ACC 2806]、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12或源自它们的细胞或细胞系。

12.根据权利要求1-11中至少一项的方法，其中在宿主细胞中引入编码抗叶酸剂抗性的DHFR-变体的核酸。

13.根据权利要求12的方法，其中除了包含编码要表达的所述蛋白的至少一部分的核酸的载体以外，通过单独的载体，引入编码所述抗叶酸剂抗性的DHFR变体的核酸，或其中使用载体，其至少包含编码要表达的所述蛋白的至少一部分的核酸和编码抗叶酸剂抗性的DHFR变体的核酸。

14.根据权利要求12或13的方法，其中用所述抗叶酸剂培养所述宿主细胞。

15.根据权利要求12-14中至少一项的方法，其中通过逐步增加培养物中的抗叶酸剂浓度，扩增编码要表达的所述蛋白分子的至少一部分的所述核酸序列。

16.根据权利要求12-15中至少一项的方法，其中满足至少一种下述特征

(a)所述抗叶酸剂是甲氨蝶呤

(b)编码所述抗叶酸剂抗性的DHFR变体的核酸会编码序列IDNo.1-9、优选ID.No1的多肽。

17.根据权利要求1-16中至少一项的方法，其中所述蛋白是抗体。

18.根据权利要求1-17中至少一项的生产抗体分子组合物的方法，其包含：

(a)在人骨髓白血病起源的宿主细胞中引入至少一种编码抗体分子或其至少一部分的核酸、和包含编码序列#1至序列#9的至少一种多肽的至少一种核酸序列的至少一种核酸，和

(b)通过用甲氨蝶呤培养所述宿主细胞，扩增编码所述抗体分子或其至少一部分的核酸序列；和

(c)在允许生产所述抗体分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞，和

(d)分离所述抗体分子组合物。

19.根据权利要求1-18中至少一项的生产具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的抗体分子组合物的方法，其包含：

(a)在人骨髓白血病起源的宿主细胞中引入编码抗体分子或其至少一部分的至少一种核酸；和

(b)在允许生产所述抗体分子组合物的条件下，培养所述宿主细胞；和

(c)分离具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的所述抗体分子组合物。

20.根据权利要求1-19中至少一项的生产具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的抗体分子组合物的方法，其包含：

(d)分离具有增加的活性和/或增加的产量和/或提高的同质性的所述抗体分子组合物。

21.选择用于生产具有至少一种下述糖基化特征的蛋白组合物的宿主细胞的方法：

(i)它不含有可检测的NeuGc；和/或

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加的与GlcNAc相连的半乳糖的半乳糖基化程度；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有高至少5％的量的G2结构；和/或

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少5％的量的G0结构；和/或

(v)它不含有可检测的末端Galα1-3Gal；和/或

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少5％的量的岩藻糖；和/或

(vii)它包含至少一个含有二等分GlcNAc的糖结构；和/或

其包含下述步骤

(a)在至少2种提供不同糖基化模式的不同宿主细胞中引入至少一种编码蛋白或其至少一部分的核酸；其中至少一种所述宿主细胞是永生化人血细胞，和

(b)培养所述至少2种不同的宿主细胞，其中每种不同宿主细胞生成的蛋白组合物的糖基化模式不同于另一种宿主细胞生成的糖基化模式；

(c)从至少2种不同的宿主细胞分离具有不同糖基化模式的所述表达的蛋白组合物；和

(d)选择所述生产蛋白组合物的宿主细胞，所述蛋白组合物具有在(i)至(viii)中定义的至少一种糖基化特征。

22.根据权利要求21的方法，其中所述蛋白组合物具有至少一种下述特征：

-在它是抗体分子组合物的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍的增加的Fc-介导的细胞毒性；和/或

-在它是抗体分子组合物的情况下，当在细胞系CHOdhfr-[ATCCNo.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的结合高至少50％的增加的抗原介导的或Fc-介导的结合；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有比来自相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的产量高至少10％的增加的所述蛋白分子组合物的平均或最大产量。

23. 权利要求21或22的方法，其中所述人骨髓白血病起源的至少2种不同的宿主细胞中的至少一种是K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、GT-2X[DSM ACC_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _]、NM-H9、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8[DSM ACC 2806]、NM-H9D8-E6、NM-H9D8-E6Q12或源自它们的细胞或细胞系。

24.权利要求21或22的方法，其中所述至少2种不同的宿主细胞选自下述组1至4：

(b)组2，其包含因为遗传缺陷而具有低或无唾液酸化的宿主细胞，例如NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]和GT-2X或源自它们的细胞系；

(d)组4，其包含具有低或甚至无岩藻糖基化活性的宿主细胞，例如NM-H9D8-E6或NM-H9D8-E6Q12或源自它们的细胞系。

25.根据权利要求21-24中至少一项的方法，其中选择至少一种宿主细胞，其生产具有权利要求2-9中定义的糖基化模式的蛋白组合物、优选抗体组合物。

26.通过根据权利要求1-20中的至少一项的生产方法可得到的蛋白或蛋白分子组合物。

27.根据权利要求26的蛋白或蛋白分子组合物，其中所述组合物具有至少一种下述特征：

(i)它不含有可检测的NeuGc；和/或

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加的半乳糖的半乳糖基化程度；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有增加至少5％的量的G2结构；和/或

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有降低至少5％的量的G0结构；和/或

(v)它不含有可检测的末端Galα1-3Gal；和/或

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物中蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含降低至少5％的量的岩藻糖；和/或

(vii)它包含至少一个含有二等分GlcNAc的糖结构；和/或

(viii)当在其中表达时，它具有与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的唾液酸化模式相比改变的唾液酸化模式。

28.根据权利要求27的蛋白或蛋白分子组合物，其中所述蛋白分子组合物具有至少一种下述特征：

-它包含α2-6连接的NeuNAc，和/或

-它具有增加的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有高至少15％的量的NeuNAc；和/或

-它具有降低的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖结构上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上具有低至少15％的量的NeuNAc；和/或

-当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖单元上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含多至少20％的带电荷的N-糖苷连接的糖链，和/或

-当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物中相同量的蛋白分子相比，它在总糖单元上或在所述蛋白组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含少至少20％的带电荷的N-糖苷连接的糖链，和/或

-它在总糖单元上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含至少10％糖结构，且缺少岩藻糖；和/或

-它在总糖单元上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的特定糖基化位点处的至少一个特定糖链上包含至少2％糖结构，其含有二等分GlcNAc；和/或

-它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含超过35％的G2结构；和/或

-它在总糖结构上或在所述蛋白分子组合物的蛋白分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上包含小于22％的G0结构；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有增加的活性和/或增加的产量；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，与相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物相比，它具有提高的同质性；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有增加的活性，这比来自相同蛋白分子的至少一种蛋白分子组合物的活性高至少10％；和/或

-当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，它具有提高的同质性，这是提高的糖基化同质性，其中所述抗体分子组合物具有比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的唾液酸化程度更低的唾液酸化程度；和/或

在所述蛋白分子是抗体分子的情况下，它具有增加的Fc-介导的细胞毒性，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，这比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍；和/或

29.根据权利要求26-28中的至少一项的蛋白或蛋白分子组合物，其中所述组合物包含至少一种结合MUC1表位的抗体分子，其包含胞外串联重复区域的氨基酸序列DTR。

30.根据权利要求29的蛋白或蛋白分子组合物，其中所述抗体结合TA-MUC1表位，其包含氨基酸序列DTR，其中所述T被糖基化。

31.根据权利要求30的抗体或抗体分子组合物，其中所述抗体以比未糖基化的表位更高的亲和力结合糖基化的表位。

32.根据权利要求30或31的抗体或抗体分子组合物，其中所述抗体选自：

-抗体PankoMab或其变体，它们竞争性地结合与PankoMab相同的TA-MUC1表位；

-抗体Panko1或其变体，它们竞争性地结合与Panko1相同的TA-MUC1表位；

-抗体Panko2或其变体，它们竞争性地结合与Panko2相同的TA-MUC1表位；

33.根据权利要求26至32中的一项、尤其权利要求32的抗体或抗体分子组合物，其中所述抗体具有至少一种下述糖基化特征：

(a)它具有增加的唾液酸化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的N-乙酰基神经氨酸的量高至少15％；

(b)它具有更高的半乳糖基化程度，当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的G2结构的量高至少5％；

(c)它包含bisecGlcNAc。

34.根据权利要求26至33中的一项、尤其权利要求33的抗体或抗体分子组合物，其中所述糖基化模式导致下述活性模式：

(a)比在CHO细胞中表达的相同抗体的活性高超过15％的CDC活性；

(b)与不具有或具有低程度的可检测的唾液酸化的抗体相比延长了因子2的血清半衰期；

(c)它具有增加的Fc-介导的细胞毒性，当在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达时，比来自相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物的Fc-介导的细胞毒性高至少2倍。

35.根据权利要求29-34中的至少一项的抗体或抗体分子组合物，其中所述抗体选自：

(a)PankoMab抗体或其变体，其具有

(i)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少2倍或至少4倍的增加的ADCC活性；和/或

(ii)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少2倍的增加的CDC活性；和/或

(iii)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少20％、优选30％或40％的更高的抗原结合活性；和/或

(iv)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的G2结构的量高至少50％；和/或

(v)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的二等分GlcNAc结构的量高至少20％，

其中通过在宿主细胞NM-F9中生产，与当在其中表达时从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的PankoMab分子组合物相比，以更高的产量得到所述PankoMab分子组合物；

(b)PankoMab抗体或其变体，其具有

(i)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少3倍的增加的ADCC活性；和/或

(ii)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少20％、优选30％或40％的增加的CDC活性；和/或

(iii)可检测的2-6NeuNAc；和/或

(iv)当在其中表达时，与从NM-F分离的相同抗体分子的抗体分子组合物相比延长的血清半衰期；和/或

(v)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的G2结构的量高至少20％；和/或

(vi)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的二等分GlcNAc结构的量高至少20％；

其中通过在宿主细胞NM-H9D8中生产，与当在其中表达时从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的PankoMab分子组合物相比，以更高的产量得到所述PankoMab分子组合物；

(c)Panko2抗体或其变体，其具有

(i)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少4倍的增加的ADCC活性；和/或

(ii)可检测的2-6NeuNAc；和/或

(iii)与来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性相比高至少30％、优选40％或50％的更高的抗原结合活性；和/或

其中通过在宿主细胞NM-H9D8中生产，得到所述Panko2分子组合物；

(d)Panko2抗体或其变体，其具有

(ii)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少30％、优选40％或50％的更高的抗原结合活性；和/或

其中通过在宿主细胞GT-2x中生产，得到所述Panko2分子组合物；

(e)Panko1抗体或其变体，其具有

(i)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少8倍的增加的ADCC活性；和/或

(ii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的G2结构的量高至少50％；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的未岩藻糖基化的结构的量高至少70％；

其中通过在宿主细胞NM-H9D8-E6中生产，得到所述Panko1分子组合物；

(f)Panko1抗体或其变体，其具有

(i)比来自在细胞系CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]中表达的相同抗体分子的抗体分子组合物的活性高至少50％的增加的ADCC活性；和/或

(iii)当在其中表达时，与从CHOdhfr-[ATCC No.CRL-9096]分离的相同抗体分子的至少一种抗体分子组合物中相同量的抗体分子相比，在总糖结构上或在所述抗体分子组合物的抗体分子的一个特定糖基化位点处的糖结构上的未岩藻糖基化的结构的量高至少50％；

其中通过在宿主细胞NM-H9D8中生产，得到所述Panko1分子组合物。

36.根据权利要求26-34中的至少一项的抗体，它是抗体西妥昔单抗或其变体，结合与西妥昔单抗相同的表位。

37.根据权利要求26-30中的至少一项的蛋白，其中所述蛋白是FSH。

38.根据权利要求37的蛋白，其中所述FSH包含可检测的2-6连接的NeuNAc。

39.用于生产根据权利要求26-38中的至少一项的蛋白、尤其抗体组合物的永生化人血细胞，它优选是人骨髓白血病起源的宿主细胞，其包含在适当表达载体中的至少一种编码蛋白分子或其至少一部分的核酸。

40.根据权利要求39的宿主细胞，其包含编码蛋白分子或其至少一部分的至少一种核酸，和含有编码序列#1至序列#9的至少一种多肽的至少一种核酸序列的至少一种核酸。

41.根据权利要求39或36的宿主细胞，其中所述宿主细胞是K562、NM-F9[DSM ACC2606]、NM-D4[DSM ACC2605]、NM-H9，H9、NM-H10、NM-E-2F9、NM-C-2F5、NM-H9D8或NM-H9D8-E6或从任一种所述宿主细胞衍生的细胞或细胞系，其包含编码蛋白分子或其至少一部分的至少一种核酸，和含有编码序列#1至序列#9的至少一种多肽的至少一种核酸序列的至少一种核酸。

42.根据权利要求39-41中的至少一项的宿主细胞，其包含权利要求41或42的至少一种核酸。

43.根据权利要求39-42中的任一项的宿主细胞，其中所述编码的抗体分子是在权利要求31至36中定义的抗体。

44.根据权利要求39-43中的任一项的宿主细胞，其中所述编码的抗体分子是嵌合的或人源化的抗体，尤其PankoMab、Panko1、Panko2或西妥昔单抗或其变体，它们结合相同的表位。

45.根据权利要求39-44中的任一项的宿主细胞，其在无血清条件下生长和生产抗体分子组合物。

46.一种核酸，其包含

(a)编码蛋白分子或其至少一部分的序列，和

(b)编码序列#1至序列#9的序列的至少一个序列。

47.一种核酸，其包含

(a)编码蛋白分子或其至少一部分的序列，和

(b)编码序列#1的至少一个序列。