CN101585736B - 一种农用复合微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农用复合微生物菌剂，其是由大豆根瘤菌、圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌各自的发酵菌液按照15-20％重量百分比的比例分别吸附到吸附剂上制成大豆根瘤菌菌剂、圆褐固氮菌菌剂、巨大芽孢杆菌菌剂和胶质芽孢杆菌菌剂，然后复配而成；本发明采用四种菌种的复合，兼顾了植物对氮磷钾养分的需求，通过田间实验充分证明，对于多种农作物均有较明显的增产提质的作用；其制备方法，分别利用微生物在发酵过程中通气量，温度和接种量的控制来加速其生长，使四种复合菌种大豆根瘤菌，圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌发酵周期都能够缩短而达到同时间发酵，同时间终止。
Description
技术领域
本发明涉及一种农用肥料，特别是涉及一种农用复合微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
氮、磷、钾是植物生长所必需的三大元素。土壤中的磷和钾都以有机或无机磷和钾化合物形态存在，植物不能直接吸收利用，通过具有解磷作用的巨大芽孢杆菌和解钾作用的胶质芽孢杆菌，能分别将植物难以吸收的磷和钾转化为植物可以直接利用的磷和钾。空气中的分子氮，植物无法吸收，通过根瘤菌共生固氮和圆褐固氮菌的自生固氮作用，将分子氮转化成为氨，供植物直接吸收利用。同时，圆褐固氮菌生命活动的代谢产物是能够刺激植物生长的生长素，不仅促进植物的生长，而且增强了植物的抗病抗逆能力。如何将四种菌有效的复合在一起，是研究热点。
目前复合菌剂的菌种搭配一般以其中的两种或三种进行搭配，由于这四种菌分别发酵的周期相差巨大，生产上很难将四种菌同时发酵完成，因此难以同时吸附在吸附剂上，再按比例混合。问题在于每先做好的单一菌剂，先用周转袋装袋，等其他三种陆续生产出来后，再按比例进行混合。这样先生产的单一菌剂由于存放于周转袋中，容易染杂菌，并且容易发干，影响最终产品质量。另外，每生产出一种菌就要包装一次，然后再拆包装，混合，再包装，多了几道工艺，生产成本增加，生产周期增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种农用复合微生物菌剂及其制备方法。
一种农用复合微生物菌剂，其是由大豆根瘤菌、圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌各自的发酵菌液按照15-20％重量百分比的比例分别吸附到吸附剂上制成大豆根瘤菌菌剂、圆褐固氮菌菌剂、巨大芽孢杆菌菌剂和胶质芽孢杆菌菌剂，然后按以下重量百分比复配而成：
大豆根瘤菌菌剂：40-70％；
圆褐固氮菌菌剂：10-20％；
巨大芽孢杆菌菌剂：5-10％；
胶质芽孢杆菌菌剂：10-30％；
其中所述发酵菌液中含菌数不低于1.0×109个/mL。
本发明的农用复合微生物菌剂，其中所述吸附剂为褐煤、蛭石、草炭、麸皮、秸秆或动物粪便等有机物料中的一种或几种。
本发明的农用复合微生物菌剂，当用在番茄上时，所述复配比例优选为：大豆根瘤菌50％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌20％。
本发明的农用复合微生物菌剂，当用在脐橙上时，所述复配比例优选为：大豆根瘤菌40％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌30％。
本发明的农用复合微生物菌剂，当用在大豆上时，所述复配比例为：大豆根瘤菌60％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌10％。
本发明的农用复合微生物菌剂的制备方法，其中所述四种菌种经菌种复壮后接种种子培养液培养至对数生长期后，分别接种发酵培养液中发酵得发酵菌液，再吸附至吸附剂上得各自的菌剂后按所述比例复配。
其中所述种子培养液与发酵培养液相同。
其中所述四种菌种的发酵菌液的发酵条件分别优选为：大豆根瘤菌接种量1％-3％，无菌风量控制在60-80m3/小时；圆褐固氮菌接种量3％-5％，无菌风量控制在45-60m3/小时；巨大芽孢杆菌接种量0.2％-1％，无菌风量控制在90-110m3/小时；胶质芽孢杆菌接种量0.5％-1％，无菌风量控制在80-100m3/小时；发酵温度均在30-40℃之间；发酵时间为18-24小时；其中所述接种量为种子液与发酵液之间的比例。
发酵条件更优选为：大豆根瘤菌接种量1.5％，无菌风量75m3/小时；圆褐固氮菌接种量3.5％，无菌风量50m3/小时；巨大芽孢杆菌接种量1％，无菌风量105m3/小时；胶质芽孢杆菌接种量0.9％，无菌风量100m3/小时；发酵时间为22小时。
本发明的农用复合微生物菌剂可用于多种农作物根部施肥。
本发明的农用复合微生物菌剂，四种菌种的复合，兼顾了植物对氮磷钾养分的需求，通过田间实验充分证明，对于多种农作物均有较明显的增产提质的作用；同时通过土壤跟踪实验证明，其对于作物周边的土壤也有改良土壤环境的作用；同时其制备方法，分别利用微生物在发酵过程中通气量，温度和接种量的控制来加速其生长，使四种复合菌种大豆根瘤菌，圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌发酵周期都能够缩短而达到同时间发酵，同时间终止。即缩短了发酵时间，又使各菌种生产能够同步，降低了杂菌数，提升了产品质量，并且降低了生产成本。提高了产品的实用性。本发明将四种菌的发酵周期都控制在24小时之内，使它们发酵终结时间能够非常接近，便于同时吸附和混合制成复合菌剂产品。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：本发明的大豆根瘤菌、圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的发酵工艺条件研究
1、大豆根瘤菌(ACCC15401或ACCC15400或ACCC15403)发酵菌液的制备：发酵培养液灭菌121℃，30分钟，降温至32-33℃接种根瘤菌种子液，接种量为1％-3％。发酵过程中，温度控制32-34℃，无菌风量控制在60-80m3/小时。发酵终结时间：18-24小时。发酵培养液配方为：K2HPO4 0.25-0.8g，NaCl 0.1-0.5g，MgSO4 0.1-0.4g，甘露醇5-20g，酵母粉0.4-1.5g，CaCO3 1-5g，水1000mL，pH 6.8-7。种子培养液的配制和灭菌过程同发酵培养液。
2、圆褐固氮菌(ACCC10098)发酵菌液的制备：发酵液灭菌121℃，30分钟，降温至32-33℃接种圆褐固氮菌种子液，接种量为3％-5％。发酵过程中，温度控制30-33℃，无菌风量控制在45-60m3/小时。发酵终结时间：18-24小时。培养液配方为：K2HPO4 0.20-1.0g，NaCl0.1-0.5g，MgSO4 0.2-0.6g，甘露醇5-20g，酵母粉0.4-2.0g，CaCO30.1-0.5g，CaSO4 0.002-0.005g，(NH4)2SO4 0.1-2.0g，水1000mL，pH6.8-7。种子培养液的配制和灭菌过程同发酵培养液。
3、巨大芽孢杆菌(ACCC10011)发酵菌液的制备：发酵液灭菌121℃，30分钟，降温至35-36℃接种巨大芽孢杆菌种子液，接种量为0.2％-1％。发酵过程中，温度控制35-38℃，无菌风量控制在90-110m3/小时。发酵终结时间：18-24小时。培养液配方为：玉米粉2-12g，酵母粉0.1-5g，豆饼粉0.4-8g，NaCl0.1-0.5g，MgSO4 0.2-0.8g，K2HPO4 1.0-5g，CaCO3 0.5-3g，水1000mL，pH 7.0-7.2。种子培养液的配制和灭菌过程同发酵培养液。
4、胶质芽孢杆菌(ACCC01429)发酵菌液的制备：发酵液灭菌121℃，30分钟，降温至35-36℃接种胶质芽孢杆菌种子液，接种量为0.5％-1％。发酵过程中，温度控制35-37℃，无菌风量控制在80-100m3/小时。发酵终结时间：18-24小时。培养液配方为：玉米粉2-12g，淀粉1-5g，豆饼粉0.4-8g，NaCl0.1-0.5g，MgSO4 0.2-0.8g，K2HPO41.0-5g，(NH4)2SO4 0.3-0.8g，CaCO3 0.5-3g，水1000mL，pH 7.0-7.2。种子培养液的配制和灭菌过程同发酵培养液。
注：上述接种量为种子液与发酵液之间的比例。
5、发酵工艺研究(发酵过程见上所述)：
(1)大豆根瘤菌，圆褐固氮菌，巨大芽孢杆菌，胶质芽孢杆菌接种量分别为1％，3％，0.2％，0.5％情况下，变化无菌风量，测得菌数，分别见表1-5：
表1
表2
表3
表4
表5
根据以上实验，得出结论如下：在大豆根瘤菌，圆褐固氮菌，巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌接种量分别为1％，3％，0.2％，0.5％情况下，无菌风量分别为75m3/小时，50m3/小时，105m3/小时和100m3/小时的条件下，前三株菌的发酵最佳终结时间为22小时，后一株菌的发酵最佳终结时间为24小时(此条件下平板计数法活菌数最多)。由此得到了最佳无菌风量大豆根瘤菌为75m3/小时，圆褐固氮菌为50m3/小时，巨大芽孢杆菌为105m3/小时，胶质芽孢杆菌为100m3/小时。(2)大豆根瘤菌，圆褐固氮菌，巨大芽孢杆菌，胶质芽孢杆菌无菌风量分别为75m3/小时，50m3/小时，105m3/小时和100m3/小时的情况下，变化接种量，测得菌数，结果见表6-10：
表6
表7
表8
表9
表10
根据以上实验，得出结论如下：在大豆根瘤菌，圆褐固氮菌，巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌无菌风量分别为75m3/小时，50m3/小时，105m3/小时和100m3/小时的情况下，接种量分别为1.5％，3.5％，1％，1％时，前三株菌的发酵最佳终结时间为22小时，后一株菌的发酵最佳终结时间为20小时(此条件下平板计数法活菌数最多)。由此得到了最佳接种量大豆根瘤菌为1.5％，圆褐固氮菌为3.5％，巨大芽孢杆菌为1％，胶质芽孢杆菌为1％。
由以上实验可以得出发酵菌液的最佳发酵条件控制为：大豆根瘤菌接种量1.5％，无菌风量75m3/小时，圆褐固氮菌接种量3.5％，无菌风量50m3/小时，巨大芽孢杆菌接种量1％，无菌风量105m3/小时，胶质芽孢杆菌接种量1％，无菌风量100m3/小时。此条件下，用平板计数法测得每毫升含活菌数最高，且大豆根瘤菌，圆褐固氮菌，巨大芽孢杆菌的发酵周期为22小时，胶质芽孢杆菌的发酵时间为20小时。为了使四种菌能够同时发酵完成，那么胶质芽孢杆菌接种量可以调整为0.9％，在最佳无菌风量100m3/小时的条件下，经过22小时的发酵，其菌数可以达到6.9亿个/毫升，等同于在接种量为1％时20小时发酵周期时的菌数。这种情况，保证了产品质量的最佳。本发明的检测方法使用农用微生物菌剂国家标准GB20287-2006。
实施例2：本发明的大豆根瘤菌菌剂、圆褐固氮菌菌剂、巨大芽孢杆菌菌剂和胶质芽孢杆菌菌剂配比实例：
菌剂的配比可以在以下范围内变动：大豆根瘤菌菌剂比例为40-70％(重量百分比)，圆褐固氮菌菌剂比例为10-20％(重量百分比)，巨大芽孢杆菌比例为5-10％(重量百分比)，胶质芽孢杆菌比例为15-30％(重量百分比)。
配比方法是：将按照实施例1中得到的最佳发酵条件发酵好的菌液分别按照15-20％(重量百分比)左右的比例吸附到吸附剂上(比例视吸附剂的含水率而定)，吸附剂可以使用褐煤、蛭石、草炭、麸皮、秸秆或动物粪便等有机物料中的一种或几种。吸附了发酵菌液的吸附剂制成的产品就是菌剂。此时，将菌剂按照大豆根瘤菌菌剂比例为40-70％，圆褐固氮菌菌剂比例为10-20％，巨大芽孢杆菌比例为5-10％，胶质芽孢杆菌比例为15-30％进行混合，制出复合微生物菌剂。
以下选取了四种菌剂的7种配比比例(见表11)，分别在番茄，脐橙，大豆上作了大田试验，得出数据，分别见下表。
表11
a.番茄上的试验：
本试验9个处理，3次重复，共27个小区，小区面积为4m×6m＝24m2，随机区组排列。实验地区：北京，上海。处理内容如下：
处理1：常规施肥(常规对照)
处理2：常规施肥，近根打孔灌灭菌褐煤1公斤/亩(基质对照)
处理3：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第一组配比比例)
处理4：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第二组配比比例)
处理5：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第三组配比比例)
处理6：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第四组配比比例)
处理7：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第五组配比比例)
处理8：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第六组配比比例)
处理9：常规施肥，近根打孔灌复合微生物菌剂1公斤/亩(第七组配比比例)
检测指标：
植株高度：第一次收获时从每小区选定10株长势一致且具有代表性的番茄，从地面量之番茄顶端的高度，计算其平均值。
叶绿素：第一次收获时从每小区选定10株长势一致且具有代表性的番茄，每株番茄选中上部叶5片，用SPAD计测定番茄叶绿素含量，计算其平均值。
产量构成：收获时从每小区选定10株长势一致且具有代表性的番茄，计算各次收获的单株穗数，单株果数和单果重量。
产量：收获时每小区测定实产，各次产量累加为最后产量。
品质：总酸用滴定法，硝酸盐用比色法，固形物用糖度计法，Vc用滴定法。
表12
相比较对照1常规施肥和对照2灭菌褐煤，7种配比比例的复合菌剂都有较明显的增产提质的作用，其中在番茄上试验，第三组配比即大豆根瘤菌50％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌20％的配比比例最适合，该比例下，番茄产量最高，品质最好。
b.脐橙试验
本试验9个处理，3次重复，共27个小区，每个处理选择5株树为观察树，随机区组排列。实验地区：江西，四川。处理内容如下：
处理1：常规施肥(常规对照)
处理2：常规施肥，近根开沟施灭菌褐煤400g/株(基质对照)
处理3：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第一组配比比例)
处理4：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第二组配比比例)
处理5：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第三组配比比例)
处理6：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第四组配比比例)
处理7：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第五组配比比例)
处理8：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第六组配比比例)
处理9：常规施肥，近根开沟施复合微生物菌剂400g/株(第七组配比比例)
表13
相比较对照1常规施肥和对照2灭菌褐煤，7种配比比例的复合菌剂都有较明显的增产提质的作用，其中在脐橙上试验，第一组配比即大豆根瘤菌40％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌30％的配比比例最适合，该比例下，脐橙产量最高，品质最好。
c.大豆试验
本试验9个处理，3次重复，共27个小区，小区面积为0.5亩，随机区组排列。实验地区：山西，辽宁。处理内容如下：
处理1：常规施肥(常规对照)
处理2：常规施肥，拌种施灭菌褐煤2kg/亩(基质对照)
处理3：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第一组配比比例)
处理4：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第二组配比比例)
处理5：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第三组配比比例)
处理6：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第四组配比比例)
处理7：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第五组配比比例)
处理8：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第六组配比比例)
处理9：常规施肥，拌种施复合微生物菌剂2kg/亩(第七组配比比例)
表14
相比较对照1常规施肥和对照2灭菌褐煤，7种配比比例的复合菌剂都有较明显的增产提质的作用，其中在大豆上试验，第五组配比即大豆根瘤菌60％圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌10％的配比比例最适合，该比例下，大豆产量最高，品质最好。
实施例3：本发明提供的复合微生物菌剂对土壤养分的改造试验
广顺程鹏果园位于北京，园内土壤质量比较差，特别是有机质的含量很低。从2003年开始使用本发明提供的复合微生物菌剂(实施例2中大豆根瘤菌50％，圆褐固氮菌20％，巨大芽孢杆菌10％，胶质芽孢杆菌20％的配比比例)，随底肥施用或用作追肥，开沟施用在作物根部土壤，同年开始对该果园进行采土取样，对土壤有机质，全氮，碱解氮，速效磷和速效钾的指标进行分析，结果汇总如下：
表15：土壤成份检测结果
注：增加是指各年的检测结果分别与2003年检测结果相比。
从表中可以得出，2003年，0-20CM土层土壤有机质含量1.07％说明土壤太贫瘠，到2006年提高到1.58％，即提高了0.51个百分点，相对提高了47.7％，变化相当显著。数据显示，20-50CM土层有机质变化也非常显著。
而全氮含量的变化为：笫一年0-20CM土层土壤全氮含量0.062％，且逐年提高。至第四年，全氮含量提高到0.107％，同比增加了0.045个百分点，相对增加了72.6％，变化明显。20-50CM土层全氯含量也呈逐年上升趋势。
速效磷含量的变化为：初期检测，0-20CM土层速效磷含量为47.2PPM，至2006年含量增加了193.2个PPM，达到240.4PPM。虽然中间略有下降，但总体呈上升趋势，变化显著。20-50CM土层速效磷含量也表现上升趋势。
速效钾含量的变化为：2003年，0-20CM土层速效钾含量为168PPM，后两年略有上升，2006年达到379个PPM，增加了211个PPM，增幅达到125.6％。20-50CM土层检测数据反映同样趋势。
结论：通过4年的土壤跟踪检测，广顺程鹏果园土壤养分各指标都有不同程度的提高，均较为显著，证明本发明微生物菌剂对土壤改良有积极的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种农用复合微生物菌剂，其特征在于，其是由大豆根瘤菌、圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌各自的发酵菌液按照15-20％重量百分比的比例分别吸附到吸附剂上制成大豆根瘤菌菌剂、圆褐固氮菌菌剂、巨大芽孢杆菌菌剂和胶质芽孢杆菌菌剂，然后按以下重量百分比复配而成：
大豆根瘤菌菌剂：40-70％；
圆褐固氮菌菌剂：10-20％；
巨大芽孢杆菌菌剂：5-10％；
胶质芽孢杆菌菌剂：10-30％；
其中所述发酵菌液中含菌数不低于1.0×109个/mL。
2.如权利要求1所述的农用复合微生物菌剂，其特征在于，所述吸附剂为褐煤、蛭石、草炭、麸皮、秸秆或动物粪便中的一种或几种。
3.权利要求1或2所述的农用复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述四种菌种经菌种复壮后接种种子培养液培养至对数生长期后，分别接种发酵培养液中发酵得发酵菌液，再吸附至吸附剂上得各自的菌剂后按所述比例复配。
4.权利要求3中所述的制备方法，其特征在于：所述种子培养液与发酵培养液相同。
5.权利要求3或4中所述的制备方法，其特征在于：所述四种菌种的发酵菌液的发酵条件分别为：大豆根瘤菌接种量1％-3％，无菌风量控制在60-80m3/小时；圆褐固氮菌接种量3％-5％，无菌风量控制在45-60m3/小时；巨大芽孢杆菌接种量0.2％-1％，无菌风量控制在90-110m3/小时；胶质芽孢杆菌接种量0.5％-1％，无菌风量控制在80-100m3/小时；发酵温度均在30-40℃之间；发酵时间为18-24小时；其中所述接种量为种子液与发酵液之间的比例。
6.权利要求5中所述的制备方法，其特征在于：大豆根瘤菌接种量1.5％，无菌风量75m3/小时；圆褐固氮菌接种量3.5％，无菌风量50m3/小时；巨大芽孢杆菌接种量1％，无菌风量105m3/小时；胶质芽孢杆菌接种量0.9％，无菌风量100m3/小时；发酵时间为22小时。
7.权利要求1或2所述的农用复合微生物菌剂在农作物根部施肥中的应用。
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