CN101578967B - 一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其包括以下步骤：待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，将无节幼虫置于有饵料的培养介质中在黑暗环境中恒温培养；恒温培养过程中对无节幼虫进行间歇性光照；金星幼虫出现后即将其冷藏储存。本发明所提供述的方法可克服金星幼虫孵化过程中死亡率高、收获率小且不稳定、附着变态过程迅速而不能进行储存积累等缺点，大幅度提高金星幼虫的收获率，有效延长金星幼虫浮游阶段的时间，促进其附着的同步性，为筛选海洋污损生物防污剂和环境毒理学研究提供所需实验材料，应用前景广泛。

Description

一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法。

背景技术

海洋污损生物(Marine fouling organisms)是海洋环境中栖息或附着在船舶和各种水下人工设施上，对人类经济活动产生不利影响，给投资者带来负效益的动物、植物和微生物的总称。污损生物在船舶上的附着会降低舰船航速，缩小管道内径，改变金属腐蚀过程，甚至引发航标移位；在养殖设施上的附着会占据某些水产养殖对象的有效附着面，妨碍网箱内外水体交换，影响养殖对象的生长发育；而且某些种类(如藤壶)的附着能力很强，一旦附着则难以清除。因此，海洋污损生物的防除工作一直是国内外研究的重点，而该方面的研究工作需要有大量的污损生物幼虫作为测试对象。

网纹藤壶Balanus reticulatus Utinomi作为世界性热带和亚热带广布种，也是我国华南沿海污损生物的优势种，同时具有很强的附着能力，因此，是海洋污损生物防除研究的理想实验材料。藤壶的生活史可分为两个阶段：首先为营浮游生活阶段：从无节幼虫脱出卵膜到金星幼虫时断时续地探索和选择适宜附着物体期间；其后为营固着生活阶段：从金星幼虫选好附着基，在其表面附着、变态发育为藤壶幼体直至成体的阶段。从污损的角度来说，藤壶的危害始于其幼虫附着变态之后。基于藤壶的生物学特性及其附着机制，金星幼虫是开展海洋污损生物防除研究的理想实验材料，而且也可应用于生物附着机理和海洋环境保护等领域的研究工作。

自2008年以来，有机锡防污涂料已在全球范围禁用，研究开发新型环保防污涂料更为迫切，而相关防污剂筛选和防除测试工作的前提就是解决实验材料——金星幼虫的来源问题。因此，网纹藤壶金星幼虫的培养具有重大的现实意义和良好的应用前景。

但是，目前在网纹藤壶金星幼虫的培养方面仅停留在小规模培养阶段，虽然有研究已成功地培养出网纹藤壶金星幼虫，但其培养仅能为藤壶幼虫个体发育研究提供材料，培养数量不大。对于人工大量培养网纹藤壶金星幼虫的方法和技术，迄今国内外均尚未见有关的研究与报道。

此外，由于金星幼虫短时间内就会附着变态发育成为藤壶幼体，因此，如何在小水体中获得大量藤壶金星幼虫并将其妥善储存，有效延长其浮游阶段的时间，提高其附着的同步性以满足测试工作需要，也是确保研制开发新型环保海洋防污技术的关键。

现有技术公开过关于纹藤壶的培养方法，但(1)该种类生物与网纹藤壶不同，其主要是北方海区污损生物优势种，而网纹藤壶是热带亚热带暖水种、为华南沿岸海区代表性污损生物优势种；(2)培养纹藤壶过程中每24小时需更换新鲜海水一次，增加了额外工作量；(3)纹藤壶培养的饵料为青岛大扁藻(Platymonas helgolandica Kylin var.tsingtaoensis Tseng et T.J.Chang var.nov.)；(4)培养是在无光的环境条件下进行，容易导致作为饵料的藻类沉底，妨碍幼虫摄食；(5)该方法未探讨金星幼虫储存备用的方法，获得的金星幼虫需及时用于研究测试，否则，金星幼虫很快出现附着变态；(6)20世纪70～80年代开展幼虫培养与防除测试研究时均未进行生物统计分析，通常只设2个平行重复样；而目前广泛采用的生物统计分析方法要求各组(包括空白组、对照组、实验处理组)均需设置3～5个平行重复样，每个平行样中的幼虫数量为30个左右，从而导致测试工作所需幼虫数量比过去大幅增加，一个批次培养所获得的幼虫数可能满足不了测试实验所需数量。因此已有技术没有解决网纹藤壶培养和储存的技术方案，而且网纹藤壶与纹藤壶是不同的两个物种，培养纹藤壶幼虫的方法也不适合于网纹藤壶幼虫的培养。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过人工生物培养技术，能在小水体中短时间内获得大量健康活跃的网纹藤壶金星幼虫的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法，包括以下步骤：

(1)待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，将无节幼虫置于有饵料的培养介质中在黑暗环境中恒温培养；

(2)恒温培养过程中对无节幼虫进行间歇性光照；

(3)金星幼虫出现后即将其冷藏储存。

所述恒温培养的温度为29～31℃。

所述恒温培养幼虫时幼虫的培养密度为1～2个/ml。

所述恒温培养是在培养箱中进行。

所述间歇性光照的最佳方案是利用早晨或傍晚的自然光，光照时长为0.5～1小时，具体光照时间的长短取决于作为饵料的扁藻浮起状况。

所述培养介质为天然海水，但为更好地实现为本发明，海水需经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。

所述冷藏的温度为2～10℃。

所述饵料为亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis(Wille)Hazen)，扁藻的投放量是2.5～3.0×10⁵个扁藻细胞/ml。

本发明所述培养网纹藤壶金星幼虫的方法的培养水体为1000ml左右，是一种在小水体中培养网纹藤壶金星幼虫的方法。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明为本技术领域提供了一种完全可行的在小水体中大量培养网纹藤壶金星幼虫的方法，填充了这一技术领域中的空白，而且本发明方法网纹藤壶金星幼虫培养过程的死亡率低、收获率高、保存期长、附着同步性强，在克服网纹藤壶金星幼虫培养过程中死亡率高、收获率小、金星幼虫浮游阶段时间短、不可储存备用的缺点同时，大幅度提高金星幼虫的收获率，延长其浮游时间，促进幼虫附着的同步性，为筛选海洋污损生物防污剂和环境毒理学研究提供所需实验材料，满足新型防污技术研究和环保工作发展中有关幼虫附着测试和毒理试验的需要。

本发明在小水体环境中，短时间内培育出大批量的供实验测试所需的网纹藤壶金星幼虫，解决了防除测试实验中需大量具有附着能力的藤壶金星幼虫的难题，确保了测试样本数量得以符合生物统计的要求，为开展各种研究测试工作提供充足的实验对象，在防污剂筛选、涂料测试及环境毒理学研究等方面具有广阔的应用前景。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。本发明的实施例由于实验设备的性能所限，恒温是在29～31℃波动，室温是在25～28℃波动，但均未超出上述范围。

实施例1

培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。

采集网纹藤壶成熟个体，采样时挑选较大的个体，且外表完好无损。

解剖成体藤壶，选取成熟受精卵块放入装有消毒海水的500ml烧杯中孵化(本实施例选用的500ml的烧杯是指采集藤壶卵块和孵化无节幼虫时采用的烧杯，因为烧杯太大不好操作，而烧杯太小水体也少，不利于将未孵化的卵块和孵化出的无节幼虫分开，下同)，再将采集的无节幼虫移入1000ml的烧杯中按以下步骤进行培养：

(1)待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，以1000ml海水为培养介质，亚心形扁藻为饵料(投放量控制在2.5～3.0×10⁵个细胞/ml之内)，置于烧杯中再放入培养箱在黑暗环境中于29～31℃的恒温条件下培养；海水中幼虫密度约1～2个/ml；

(2)每天早晨和傍晚取出盛有藤壶幼虫的烧杯接受自然光照0.5小时；

(3)金星幼虫大量(目测观察)出现后，采集发育良好健康活泼的金星幼虫个体，开展2～10℃环境中冷藏储存试验。

将采集的幼虫分为4组，A组为对照组，直接放置于29～31℃恒温培养箱中培养；B组在2℃条件下存放48小时后，置于29～31℃恒温培养箱中培养；C组在4℃条件下存放48小时后，放置于29～31℃恒温培养箱中培养；而D组在10℃条件下存放48小时后，放置于29～31℃恒温培养箱中培养；对照组和各温度处理实验组均设3个以上平行样以便进行统计分析。

实验结果显示，在培养4天后，对照组金星幼虫的平均附着率为60.1％，B组为84.2％，C组为81.3％，D组为80.5％。可见，温度处理组的幼虫附着率显著高于对照组(P＜0.05)，表明金星幼虫在低温环境(2～10℃)中保存2天，不仅没对其附着能力产生不利影响，而且幼虫附着的同步性有所提高。

实施例2

培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。

采集网纹藤壶成熟个体，采样时挑选较大的个体，且外表完好无损。

解剖成体藤壶，选取成熟受精卵块放入装有消毒海水的500ml烧杯中孵化，再将采集的无节幼虫按以下步骤进行培养：

(1)待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，以海水为培养介质(1000ml)，亚心形扁藻为饵料(2.5～3.0×10⁵个细胞/ml)，于室温(25～28℃)黑暗环境中培养；海水中幼虫密度为1～2个/ml；

(2)每天早晨和傍晚将盛有藤壶幼虫的烧杯接受自然光照1小时；

本实施例中每天定时取样观察幼虫发育状况并添加适量饵料；

(3)金星幼虫开始出现后，采集发育良好健康活泼的幼虫个体迅速置于10℃以下环境中冷藏储存，并统计金星幼虫的收获率。。

实验结果表明，在室温(25～28℃波动)的黑暗环境中培养网纹藤壶幼虫，其无节幼虫发育的同步性很差(培养过程中取样镜检时发现第IV、V、VI期的无节幼虫同时存在)，且金星幼虫的收获率低于10％。

实施例3

培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。

采集网纹藤壶成熟个体，采样时挑选较大的个体，且外表完好无损。

解剖成体藤壶，选取成熟受精卵块放入装有消毒海水的500ml烧杯中孵化，再将采集的无节幼虫按以下步骤进行分组培养：

(1)分为四组进行实施，前期均待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，以1000ml海水为培养介质，亚心形扁藻为饵料，将无节幼虫放入培养箱中在黑暗环境中恒温29～31℃培养；海水中幼虫密度为2个/ml；

四个实验组的差别在于，亚心形扁藻的投饵量按浓度梯度分别为1.0×10⁵个细胞/ml、2.5×10⁵个细胞/ml、3.0×10⁵个细胞/ml和5.0×10⁵个细胞/ml，进行对照实验；其他实验方法均相同；

(2)每天早晨和傍晚将盛有藤壶幼虫的烧杯接受自然光照1小时；期间，培养幼虫4天后更换1次海水并添加适量饵料继续培养；

(3)金星幼虫出现后，采集发育良好健康活泼的幼虫个体，并统计金星幼虫的收获率。

实验结果表明，扁藻量为1.0×10⁵个细胞/ml时，幼虫一般发育至无节幼虫第IV-V期的阶段就出现大量死亡，可能与饵料不足、无节幼虫没有吃饱有关；投饵量为2.5～3.0×10⁵个细胞/ml时，幼虫发育快而且整齐，金星幼虫的收获率高于90％；投饵量增至5.0×10⁵个细胞/ml时，金星幼虫的收获率有所下降，可能与藻类密度过高、影响了水质有关。

实施例4

培养介质为天然海水，海水经过滤、煮沸消毒、冷却至室温后，放置于经高温消毒的器皿中备用。

采集网纹藤壶成熟个体，采样时挑选较大的个体，且外表完好无损。

解剖成体藤壶，选取成熟受精卵块放入装有消毒海水的500ml烧杯中孵化，再将采集的无节幼虫按以下步骤进行培养：

(1)待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，以海水为培养介质(1000ml)，亚心形扁藻为饵料，投饵量为2.5～3.0×10⁵个细胞/ml，将无节幼虫放入培养箱中在黑暗环境中恒温29～31℃培养；海水中幼虫密度为1～2个/ml；

(2)每天早晨和傍晚将盛有藤壶幼虫的烧杯接受自然光照0.5小时；

(3)金星幼虫大量出现后，采集发育良好健康活泼的幼虫个体用于下述冷藏实验：

将采集的幼虫分为5组，其中A组为对照组，直接放置于29～31℃恒温培养箱中；B组在4℃条件下存放48小时后，放置于29～31℃恒温培养箱中；C组在4℃条件下存放96小时后，放置于29～31℃恒温培养箱中；而D组在4℃条件下存放144小时后，放置于29～31℃恒温培养箱中；E组在4℃条件下存放20天后，放置于29～31℃恒温培养箱中进行附着测试；对照组和各冷藏实验组均设3个以上平行样以便进行统计分析。

实验结果显示，在恒温培养箱中培养4天后，对照组平均附着率为60.1％，B组为81.3％，C组为90.6％，D组为85.5％。经检验，各冷藏处理组幼虫附着率均高于对照组(P＜0.05)，表明幼虫的附着率和同步性均有所提高。然而，如果将冷藏储存时间延长至20天之后，金星幼虫不再具备附着变态能力，而且出现大量死亡。因此，采用本发明的培养方法，金星幼虫在低温环境中保存10天以内，不会对其附着能力产生不利影响。

Claims (8)

1.一种大批量培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)待网纹藤壶的卵孵化为无节幼虫后，将无节幼虫置于有饵料的培养介质中在黑暗环境中恒温培养；

(2)恒温培养过程中对无节幼虫进行间歇性光照；

(3)金星幼虫出现后即将其冷藏储存；冷藏的温度为2～4℃。

2.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述恒温培养的温度为29～31℃。

3.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述恒温培养幼虫时幼虫的培养密度为1～2个/ml。

4.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述恒温培养是在培养箱中进行。

5.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于步骤(2)中所述间歇性光照的是利用早晨和傍晚的自然光进行光照，光照时长为0.5～1小时。

6.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述培养介质为海水。

7.如权利要求6所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述海水经过过滤、煮沸消毒后冷却至室温。

8.如权利要求1所述的培养网纹藤壶金星幼虫的方法，其特征在于所述饵料为亚心形扁藻，投放量为2.5～3.0×10⁵个细胞/ml。