CN101568551A - 重组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法 - Google Patents

重组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检验基于β折叠的蛋白结构的一部分或完整表面的可变性，特别集中于酶。所述改变是通过将一种蛋白的一部分或完整表面取代/移植到可叠合多肽主链的同源蛋白表面上，通过使用β折叠的结构特征仅改变参与底物/配体结合和催化作用的表面区域进行的。所述移植涉及将选择的构成一种酶/蛋白中待改变的表面区域的不连续残基组替换为位于另一种酶/蛋白中类似位置处的不连续残基组，这是以促进通过组合来自这两种酶/蛋白的残基形成的新蛋白的折叠和功能的方式进行的。本发明还涉及利用该表面改造方法来选择性组合来自不同生命领域的酶/蛋白特征，所述特征一般不通过天然进化组合，诸如构建这样的新蛋白，所述新蛋白保留在其上移植了嗜中温同系物的活性表面的嗜热性酶的大部分热稳定支架，以构建具有最佳功能pH和温度的中温活性功能特征的热稳定蛋白。

Description

重组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法
发明领域
本发明提供包括嗜热性蛋白的结构稳定性特征和嗜中温蛋白的活性特征的重组中温活性热稳定蛋白(meso-active thermo-stable protein)及其设计和生物合成方法，其中包括嗜热性蛋白的底物-结合和催化活性表面的主要不连续氨基酸组被结构-同源的嗜中温蛋白中的结构等价位置处存在的不同的不连续氨基酸组所替换。
更具体地，本发明描述通过基于理性的残基替换由一组残基改变，或“理论上移植”，其表面的一个部分(或多个部分)而谨慎改变蛋白分子功能行为的一般适用方法，所述一组残基包括不同的、独立演化的、结构同源的蛋白质中的一个功能等价表面(或多个表面)，所述蛋白在结构稳定性、和物理活性方面具有明显不同的特征，但是具有相同的化学特征。变化的蛋白中的许多不同的不连续放置的残基被同源蛋白等价位置处使用的残基合理替换意欲引起将所述变化的蛋白折叠为三维结构，其充满相同蛋白的未改变形式的原始结构稳定性特征，和另一种(同源)蛋白的活性特征(例如，最佳活性的温度)。这促进产生组合来源于不同生命形式和不同生命领域的酶的理想特征的酶。
现有技术和发明背景
蛋白质序列-结构关系：常识：蛋白质是通过肽键连接在一起的氨基酸的天然聚合物，其在合成时折叠成具有某些生物活性的三维结构。蛋白质的三维结构受到其氨基酸序列的控制(Anfinsen，1973.科学(Science)181，223)。氨基酸序列包括指示由蛋白链形成三维结构所需的全部相关信息。在进化过程中通过天然引入突变产生的或通过遗传工程技术引起的蛋白质序列的改变导致蛋白质结构的改变。所述改变可以是细微的或深切的。如果所述改变是细微的，则它们通常仅涉及蛋白质特定区域显微结构的微小变化，表现为变化的残基附近的局部残基群(所述蛋白中包埋的，或位于其表面上的)的形状改变，但对该蛋白质总体形状或功能，或其肽主链穿过其三维结构所采用的轨道不具有任何深切或明显的影响。然而，当所述改变是深切的时候，它们改变蛋白质的整体形状以及主链穿过蛋白结构所采用的轨道。有时，由突变产生的深切变化甚至可以引起所述链失去稳定折叠为特定三维结构的能力(导致聚集和沉淀)。不能总使突变对蛋白结构的影响与其序列中发生的变化相联系或针对其进行校准。尽管现在所述非常有限改变的作用可以通过计算机建模，但是实验研究序列改变的作用在所有情形中(无论这些改变是细微的或是深切的)成为基本的，因为还不能对确定这些改变的作用所涉及的所有参数、以及物理力进行建模。现今充分已知的是深切和细微的序列改变均可以以挑战可预期性的方式导致结构深切或细微的改变。
因此，有时可以看到来自两种在进化上不相关的生物体的两种蛋白质具有在它们的总形状和折叠结构上几乎相同的多肽主链(尽管不是氨基酸残基侧链)，即使这两种蛋白质具有无相似性的完全不同的氨基酸序列。然而，这作为超越这样的规则的例外，所述规则是，通常相似尺寸的蛋白质仅倾向于采用基本相似的主链结构，如果它们具有稍微相似的氨基酸序列(包括所有残基的至少20％的一致性)。然而，所述蛋白质的外部形状特征非常不同，且这是由于所述蛋白质特有的特异性相互作用残基(侧链)组以由其特异性氨基酸序列决定的方式对各种蛋白质的主链进行特异性“修饰”。因此，主链结构的保守性与广泛的功能保守性相关；功能性的精确热力学和动力学参数几乎完全受到由蛋白质表面上存在的侧链所决定的蛋白质外部形状特征的影响。
为了总结以上讨论，氨基酸序列和蛋白质结构之间的精确关系是非常微妙的；尚不理解或领会这种关系的所有方面，且尚不可能在不进行必要实验或不参考特定结构情形的条件下预期在序列中进行的特定变化对蛋白质结构的影响。在这点上，和在与通过序列改变再改造任何蛋白质表面的特定关系中，折叠和稳定性的考虑因素起作用，因为改造完整或部分的蛋白质表面影响其结构-形成能力，及其结构稳定性。通常，在改造蛋白质的所有尝试中，无论关于它们的表面还是它们的内部，可以采用两种不同的方法，这些是：(i)基于结构-功能分析的理性改造方法，和谨慎引入特定的突变，和(ii)更依赖于随机过程诸如基因改组，或筛选表现出随机产生的变体群的噬菌体的非理性的(基于组合学的和基于定向进化的)方法，随后基于结合特征进行选择。在蛋白质工程领域中，理性方法是最初采用的方法。然而，因为做出的改变的作用的不可预期性，证明它不够令人满意。随后，最近可用的重组DNA技术使得基于组合学的(组合的)方法也可行。所述理性方法的不够令人满意的结果最初导致转换为组合方法。然而，逐渐地，研究可以通过完全随机方法(对于n个残基的链有20n种变化)令人信服地产生的序列变化的甚至非常小的级分的不可行性导致采用试图组合这两种方法的最佳部分的杂交方法。这些杂交方法包括理性选择待进行改变的蛋白质中的残基或结构位点，和非-理性(基于组合学研究)研究在所述位点处进行突变的影响。以下，我们简要评述先前的工作者如何采用理性、非-理性或杂交方法，从而帮助随后对这些和我们在本发明中采用的方法进行区分。
纯理性蛋白质改造的实例：Rutter和同事在胰蛋白酶的活性位点的两个位置引入位点-特异性突变(在对其活性位点进行结构分析后)，从而降低催化速度，但增强酶针对其天然底物的底物特异性(Craik等，1985.科学(Science)228，291-297)。许多其他小组随后基于蛋白质结构的理性分析引入有限的突变，从而产生具有改变的速度和/或亲和性特征的变体。Estell和同事在关于酶活性位点附近的静电学方面，改造了另一种蛋白酶，即枯草杆菌蛋白酶，从而改变由于它们静电学特征而不同的底物结合的优选性(Wells等，1987.美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84，1219-1223)。Perham和同事在谷胱甘肽还原酶中进行了理性的突变，以在将其辅酶特异性由NADP+改变为NAD+的同时保持其底物特异性不变(Scrutton等，1990.自然(Nature)343，38-43)。在九十年代中进行了所述工作的若干实例，在所有这些中在活性位点附近引入有限的理性-选择的突变，以在活性位点附近改变关于蛋白质-配体相互作用方面的酶特征。随后，进行了下述更大胆的改造尝试。Benkovic和同事成功地利用细胞核转运因子2的结构同源蛋白支架设计了scytalone dehyratase-样酶，从而证明所述理性改造方法在通过重新设计支架蛋白的主要部分开发新实体中的功效(Nixon等，1999.国家科学院学报(Proct Natl Acad Sci.)96，3568-3571)。类似地，Hellinga和同事分析了核糖-结合蛋白的结构，针对预期可能赋予该蛋白丙糖磷酸异构酶(TIM)活性的18-22位点-定向的突变合理地选择了位点，并证明这是实验的情形(Dwyer等，2004.科学(Science)304，1967-1971)。随后，组合的方法也获得了成功。
纯非-理性(组合)蛋白质改造的实例：定向的进化由将随机分布的突变低频率引入到目的基因中，随后选择具有理想性质的突变的(变体)蛋白质组成(Roberto等，2005.现代生物技术观点(Current Opinion inbiotechnology).16，378-384)。证明了定向进化是修饰蛋白质的有力工具，并且现在已经成为广泛使用的方法。然而，其主要用于利用错误-倾向的PCR技术将突变随机引入蛋白质序列来寻找温度-敏感的以及诸如此类的突变体，和用于发展新型结合试剂(通过噬菌体-展示组合方法，其包括通过将简并寡核苷酸结合到编码DNA中随机化蛋白质的部分)。存在非常少量的用于改变酶活性的纯非-理性方法的实例，这大概是因为用于随机引入突变的机制在不进行一些位点的理性选择的条件下，通常不能被控制和限制在蛋白质表面特定的区域内，这是因为组合空间的完全研究是不可能的(存在太多可以产生的变体)。利用人雌激素受体α配体结合结构域，Zhao和同事使用随机诱变和体外定向进化，从而发展新型皮质酮活性(Chen等，2005.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)348，1273-1282)。
纯粹的随机改造方法应用的另一个著名实例(然而，基于随机化位点的半-理性选择)是Bryan和同事的实例，他们利用定向共同进化，来改变无钙的枯草杆菌蛋白酶的稳定性和催化活性(Strausberg等，2005.生物化学(Biochemistry)44，3272-3279)。定向进化深切改变热稳定性而非活性的应用的一个实例是Rao和同事的实例，他们使用该方法开发高度稳定的脂肪酶(Acharya等，2004.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)341，1271-1281)。基本上，现今的趋势是混合所述理性和非-理性的方法，一些这样的实例引用如下。
杂交(理性-组合的)蛋白质改造实例：如通过由Kim和同事在乙二醛酶II的αβ/βα金属水解酶支架上发展新的催化活性(β-内酰胺酶活性)所例证地，一些小组使用了杂交方法，其组合理性和组合的要素以获得成功的结果(Park等，2006.科学(Science).311，535-538)。该方法成功的第二个实例是Peimbert和Segovia的实例，他们在D-Ala D-Ala转肽酶折叠上发展了β内酰胺酶活性(Peimbert和Segovia，2003.蛋白工程(ProteinEngg.)16，27-35)。另外一个实例是该方法改变NHR人雌激素受体特异性，相对于天然配体，即17β-雌二醇，所述受体更支持合成的配体，即4，4’-二羟基偶苯酰(Chockalingam等，2005.美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)102，5691-5696)。
通过盐桥或二硫化物修饰进行蛋白质结构稳定性改造的实例：另外，尽管尚未详细研究这个方面，但是可以注意到也已经尝试了包括理性方法的蛋白质改造，以通过引入如特异性静电相互作用或其他另外的键诸如二硫键获得特定蛋白质的结构稳定性。所述尝试基于这样的知识，即表面盐桥(Anderson等，1990.生物化学(Biochemistry)29，2403-2408)以及二硫键(Creighton，1986.酶学方法(Methods.Enzymol.)131，83-106)为蛋白质提供额外的稳定性。然而，所述理性尝试没有获得什么成功，正如通过Perham和同事的工作所例证地(Scrutton等，1998.FEBS通信(FEBS Letters)241，46-50)，他们通过设计将二硫键引入到谷胱甘肽还原酶中，以试图提高其稳定性，并且生成形成预期的二硫键但不显示额外的结构稳定性的活性酶。
我们能够发现的试图以某种方式组合一种蛋白质的结构稳定性和另一种(相关的)蛋白质活性的温度方案的蛋白质构建体的仅有的先前实例包括反复试验(trial-and-error)方法，其中重组了由源自两种不同的同源蛋白质的连续的残基序列段组成的结构域，以产生嵌合蛋白。我们已经能够发现四个制备所述嵌合蛋白的实例，两个涉及β葡萄糖苷酶，来自Hayashi和同事的工作(Singh和Hayashi，1995.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270，21928-21933；；Goyal等，2001.分子催化作用B：酶杂志(J.Mol.Catalysis.B：Enzymatic)16，43-51)，一个涉及柠檬酸合酶，来自Danson和同事的工作(Arnott等，2000.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)304，657-668)，和一个涉及抗生物素蛋白(Hytonen等，2007.美国专利7,268,216)。在第一个实例中，制备来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和gilvus纤维弧菌(Cellvibrio gilvus)的同源-β葡萄糖苷酶(～37％的序列同一性；40％的序列相似性)的嵌合体(Singh等，1995.同前引用)。在第二个实例中，制备来自根癌农杆菌和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的同源-β葡萄糖苷酶的嵌合体(Goyal等，2001.同前引用)。在第三个实例中，制备来自嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的同源柠檬酸合酶(Arnott等，2000.同前引用)。在所有三个实例中，目的是为了获得具有提高的酶稳定性和改变的最佳功能温度和pH的酶性质的嵌合体。在第四个实例中，它是在专利文献中找到的(Hytonen等，2007.同前引用)，鸡抗生物素蛋白的热稳定性是通过其称为β4的结构域被不同抗生物素蛋白-相关(AVR)蛋白的完整β4结构域替换得到提高的。
本发明的公开内容、本发明的新颖性、和‘嵌合体’方法与本发明提议的方法之间的区别：
在本发明中，我们已经研究了序列变化对蛋白质表面的微观-结构和宏观-结构的影响(来自蛋白质的进化比较)，其具体涉及使用所述变化，通过设计(而非通过非-理性的组合方法)产生组合一种蛋白质的结构特征和源自不同生物体的另一种(同源)蛋白质的功能特征的新型蛋白。因此，在本发明中，我们的重点是对蛋白质表面的重新改造，其具体涉及改造限定蛋白质酶活性和/或其他功能(例如，蛋白质-蛋白质相互作用)的物理参数。
发明内容
我们叠合两种基于β-折叠的β薄卷饼型(jelly-roll)折叠蛋白RMCel12A(SEQ ID NO：1)和TR Cel12A(SEQ ID NO：2)的结构，它们是纤维素-降解酶，称为纤维素酶。我们证实这两种酶的多肽主链原子可与1.1埃的均方根偏差重叠。我们然后在这两种酶中构建约60个类似残基的对应组，其包括它们的活性表面。在此，活性表面定义为这两种酶中的扭曲的/弯曲的、结构-同源的β折叠的完整的溶剂-暴露表面，其包含底物(纤维素)-结合沟。认为SEQ ID NO：1是主体酶(host enzyme)，且保留其大部分氨基酸序列，我们然后在位于折叠的酶结构活性表面上的位置处将突变引入该序列中，从而使所有所述残基被另一种(客体)酶结构中的结构-类似位置处使用的残基替换，所述另一种(客体)酶结构具有由SEQ IDNO：2表示的氨基酸序列。该替换的目的是为了将组成其活性表面的60个主要不连续残基的完整组(完全来自主体酶的多肽链)替换为组成客体酶的活性表面的结构-等价残基。该替换导致形成由SEQ ID NO：3表示的宿主酶突变形式。这实现在主体酶突变形式的折叠结构上对客体酶的活性表面的模仿，以使SEQ ID NO：3折叠，从而表现出RM Cel12A的结构稳定性特征和TR Cel12A的活性特征。由于RM Cel12A是嗜热性纤维素酶，且TR Cel12A是嗜中温纤维素酶，我们将RM Cel12A的该种突变形式(引入TR Cel12A的活性表面)称为中温活性热稳定纤维素酶(meso-activethermo-stable cellulase)，即MT Cel12A。利用X-射线晶体学、圆二色谱学、质谱学、凝胶过滤色谱法和凝胶电泳、和纤维素酶活性测定法，在结构上和功能上表征MT Cel12A。证明了MT Cel12A的确是一种中温活性热稳定酶，其组合TR Cel12A的活性表面和RM Cel12A的大部分结构稳定性特征。
本发明中提出的方法的新颖性：
总之，在现有技术和背景中，上述改造方法的所有成功应用涉及试图使用蛋白质改造(利用理性或组合的方法)来改变：(a)蛋白/酶活性位点关于对结合底物或其他配体(例如，辅酶)的优选性的化学特异性，或(b)结合底物或配体的热力学和动力学参数。相反，在本发明中，我们提出针对酶/蛋白质功能的物理特征(即，最佳结合的温度，或活性)，而非与例如优选结合特定化学结构的底物或配体相关的功能的化学特征，而改变蛋白质/酶表面。我们提出使用理性改造方法而非组合的或杂交的方法，但是其是足够系统的，以至于具有适用于所有这样的蛋白质的高度可能性，所述蛋白质的功能部分(即其活性表面、或活性结构域、或亚-结构域)主要为特定类型的二级结构，即β-折叠结构。在不干扰所述折叠的条件下将突变引入β-折叠(在所述折叠完整的朝向溶剂的一侧)比将突变引入位于蛋白质表面上的β-螺旋中更容易进行，因为在β-折叠中交替的残基以相反的方向背离朝向，且“紧邻的”的残基彼此不相互作用或彼此相互干扰。在另一方面，在β-螺旋中，“紧邻的”残基处于螺旋的同一侧或同一面，彼此非常大地互相影响，由于该原因，在不在直接相邻的残基中生成伴随(补偿)突变条件下进行的甚至单个突变可以极大地扰乱结构-形成和稳定性。我们的情形是突变作用的不可预知性对螺旋结构比对折叠结构更适用得多。我们提出利用关于所有-β结构的结构/功能关系的详细理解，在理性设计的β折叠表面上产生突变，从而探究理性方法可以进行到什么程度。可以注意到，不存在关于这种性质的实例，并且因此没有在此引用任何内容。
‘嵌合体’方法和本发明之间的区别
如已经阐述地，我们的目的之一是构建具有嗜热性(热稳定的)类似物的结构稳定性特征和嗜中温类似物作用于相同底物的功能特征的新型蛋白质/酶。而且，如已经阐述地(在现有技术和背景中)，先前在该方向(即具有相似的总体目标)的唯一类型的尝试涉及交换包括连续残基序列段的完整结构域，从而产生嵌合的蛋白。在嵌合蛋白中，不存在在任何单独的二级结构或超二级结构元件(诸如β折叠)水平上重建蛋白表面，而涉及来自两种执行相似功能的多-结构域蛋白的完全自主-折叠的结构域的混合。在蛋白质中，通常，公知结构域之间的相互作用水平总是远低于(就涉及的残基-残基接触的数目而言)结构域中结构元件之间的相互作用水平、或单一二级或超二级结构元件中的残基之间的相互作用水平。实际上，从结构观点来看，两种自主折叠的结构域通常甚至不直接相互作用，而结构域中二级和超二级结构元件中的残基参与广泛且亲密的相互作用。因此，将来自不同蛋白质的结构域组合到同一多肽链中并设法保持这两种结构域中的功能一般是简单且微不足道的工作，因为关于结构域-结构域相互作用的关注少得多。
所述的连续序列段的简单(嵌合体-型)组合不能成功地进行重建单-结构域蛋白质，因为在所述嵌合体中，来自两种蛋白质的序列将位于表面上和内部中。不能迫使来自在两种不同蛋白质中预进化的二级结构元件的残基在任何蛋白质内部的两种结构的交界面处彼此接触和结合，因为交界面的形成需要高度的形状互补性和化学相容性。简单的嵌合体不能避免在它们内部的结构-结构交界面处的形状互补性和化学不相容性的这种冲突。大概作为这样的结果，不存在构建包括单结构域蛋白的任何嵌合体的已知成功实例，在所述单结构域蛋白中，连续的氨基酸序列段被来自另一种蛋白质的等价序列段所替代。
我们的发明通过仅改造表面残基和仅在基于β折叠的结构内进行改造，避免了上述问题，并成功地组合了两种单结构域蛋白的特征。我们的方法成功的原因如下：(i)彼此邻近的表面残基仅需要在蛋白质表面的一个限定的区域内与溶剂且彼此间相互作用，其中所有残基来自于同一蛋白质，并且因此具有参与相互作用的预-进化方案，从而构建所述表面。与在嵌合体中不同，这些残基不必须与另一组来自具有包埋的内部位置的不同蛋白质的残基接合，由此消除形状互补性和化学不相容性的问题。(ii)我们使用结构元件(二级或超二级结构元件)的完整表面，诸如例如，β折叠的完整的溶剂-暴露表面，而不是任何结构元件的一部分表面。这消除了在结构元件表面内的形状互补性和化学相容性问题，并将该问题仅限制到所述表面的边缘，在所述边缘处其与不同结构元件表面的另一部分接触，在此处，在任何情形中，由于溶剂暴露，存在更高程度的灵活性和适应性。
因此，总之，现有技术中引用的嵌合体方法在以下方面与本发明提出的方法不同：
-他们对相似酶的选择基于已知序列的酶之间的序列相似性。相反，我们的选择基于已知结构的酶之间的结构(主链)的叠合性。
-他们对提高稳定性、最佳温度和最佳pH的尝试基于这样的假设，即这些特征确定地处于由总序列中的连续序列段限定的各个结构域中，没有提供支持该假设的证明，即所述特征确实是由单独的结构域-样结构限定的。相反，我们的方法不将特性归咎于连续的残基序列段。而是，我们认为最佳pH和温度特征是单独构成活性表面的溶剂-暴露残基(通过链折叠三维集合在一起的明确的不连续残基组)的相互作用和灵活性的函数。我们认为结构稳定性在很大程度上是构成蛋白质的疏水性中心的隐蔽残基的函数。因此，我们的新型蛋白质的构建涉及一起位于结构(而非位于序列！)中的不连续残基的突变。我们基于结构原则和在文献中首次说明的理解，制造这样的突变，即通过同源嗜中温酶的活性表面仅移植热稳定酶的活性表面。
-作为上述方法中基本区别的结果，Hayashi和同事(Singh和Hayashi，1995.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270，21928-21933；Goyal等，2001.分子催化作用B：酶杂志(J.Mol.Catalysis.B：Enzymatic)16，43-51)以及Danson和同事(Arnott等，2000.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)304，657-668)设法仅构建具有这样的稳定性和功能特征的嵌合体，所述嵌合体是制备所述嵌合体所来源的两种酶的序列的中间产物，或以完全不可预期的方式与两种亲本序列完全不同。相反，我们的方法提出理性和可预期地混合一种亲本的功能特征(即精确的最佳pH和温度)和另一种亲本的稳定性特征，从而衍生在很大程度上保持这些特征的蛋白。
-在所述嵌合体中，不基于在蛋白质的内部或蛋白质的表面上的残基位置选择来自祖先酶的残基。这使得该方法仅对简单混合来自多-结构域蛋白质的编码结构域的序列有效。相反，我们的方法集中于基于结构选择溶剂-暴露的残基。
发明目的
本发明的目的是提供包括嗜热性蛋白的结构稳定性特征和嗜中温蛋白的活性特征的重组中温活性热稳定蛋白及其合成方法，其中主要不连续的氨基酸组被结构-同源蛋白的结构等价部分中存在的不同的不连续氨基酸组代替。
-而且，本发明提供用于系统改变任何主要由β结构构成的蛋白质的功能表现的方法学。
-本发明的另一个目的是将一种蛋白质的完整表面或所述表面的一部分取代/移植到具有高度叠合性的主链的同源蛋白上。
-另一个目的是将来自嗜中温蛋白的活性表面移植到嗜热性蛋白上，从而生成重组的热稳定蛋白。
-另一个目的是生成表现出嗜热性蛋白的稳定性特征和嗜中温蛋白的活性特征的重组热稳定蛋白，由此提供用于组合经天然进化一般不组合的结构和功能属性的方法学。
发明概述
本发明涉及基于β折叠的蛋白质结构，并特别集中于检验蛋白质表面可变性的酶。这是通过将一种蛋白的完整表面取代/移植到重叠主链轨迹的同源蛋白表面上(即，完整表面移植)或仅改变参与催化和/或底物/配体结合的表面区域(即，活性表面移植)而进行的。本发明还涉及选择性混合和匹配不连续的和/或连续的残基，从而完成移植包括β链和/或来自β折叠结构的中间环的表面。本发明还涉及进行表面改造，其涉及将嗜热性功能特征的蛋白转化为嗜中温功能特征的蛋白，同时保持嗜热性蛋白的结构特征。
因此，本发明提供包括嗜热性蛋白结构稳定性特征和嗜中温蛋白活性特征的重组的中温活性热稳定蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述重组中温活性热稳定蛋白包括具有单结构结构域的蛋白，其中主要不连续的氨基酸组被在结构-同源蛋白的结构等价部分处存在的不同的不连续氨基酸组代替。
在本发明的一个实施方案中，将“客体”或“供体”祖蛋白的一部分或整体理论上移植到“主体”或“受体”祖蛋白的结构核心上。
然而，在本发明的另一个实施方案中，所述客体和主体祖蛋白具有同源结构和相同的功能。
然而，在本发明的另一个实施方案中，所述客体祖蛋白是嗜中温蛋白，和所述主体祖蛋白是嗜热性蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述同源客体和主体祖蛋白的功能-活性表面区域由基于β折叠的二级结构组成。
在本发明的一个实施方案中，使用的嗜热性主体祖蛋白和嗜中温客体先祖分别具有由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列，并且重组的中温活性热稳定蛋白包括由SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，所述重组中温活性热稳定蛋白具有下列特征：
1.分子质量：20-30千道尔顿；
2.残基数目：约200-300个；
3.等电点：在4-8范围内；
4.最佳活性pH：在4-8范围内；
5.解链温度(Tm)：80-95℃，和
6.最佳活性温度(TOA)：在30-60℃范围内。
在本发明的另一个实施方案中，所述蛋白或其先祖是属于水解酶组的单-结构域β折叠蛋白的结构类的酶，并选自由纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶组成的组，优选地，是纤维素酶。
在本发明的另一个实施方案中，所述重组中温活性热稳定蛋白还可以起生物催化剂的作用。
在本发明的另一个实施方案中，用于设计重组中温活性热稳定蛋白的方法包括主体祖蛋白的结构稳定性特征和不同的且结构同源的客体祖蛋白的活性特征。
在本发明的一个实施方案中，所述结构-同源的主体和客体祖蛋白包括这样的结构，在所述结构中由位于基于β折叠的二级结构上的残基提供底物-结合和催化功能。
在本发明的一个实施方案中，用于涉及重组中温活性热稳定蛋白的方法包括下列步骤：
a.叠合所述客体和主体祖蛋白的结构，并在多肽主链水平上，优选地，在包括所述底物-结合和催化功能的结构区域中，评估它们结构的叠合性程度，
b.通过使用步骤(a)的信息，生成所述主体和客体祖蛋白的蛋白序列以及编码DNA序列的基于结构类似的序列对比，
c.鉴定在主体祖蛋白序列中构成基于β折叠的‘活性表面’的特定氨基酸残基，并且使用获自步骤(b)的对比序列以在所述客体祖蛋白中鉴定相应类似的不连续残基和残基组，
d.确定在来自所述主体和客体祖蛋白构成所述两种蛋白的活性表面的两个相应氨基酸残基组中相同的特定残基，并且消除所述相同的残基，从而获得在所述两种蛋白中的结构-等价位置处存在的一组相应的不同残基，
e.在基于β折叠的‘活性表面’中的位置处突变所述主体祖蛋白，所述位置与所述客体祖蛋白的相应残基不同，
f.将在所述主体祖蛋白中存在的残基替换为所述客体祖蛋白中存在的残基，导致构成新型中温活性热稳定蛋白，
g.通过已知的重组DNA方法生物合成该新型中温活性热稳定蛋白，随后通过已知方法分离和纯化，和
h.通过活性测量证实在该理想的中温活性热稳定蛋白中的主体祖蛋白的结构稳定特征和客体祖蛋白的物理和化学活性特征。
在本发明的一个实施方案中，构成产物中温活性热稳定蛋白的结构核心的氨基酸残基源自所述两种祖蛋白中的一种，而构成该产物蛋白的一部分或完整表面的残基源自另一种祖蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述两种祖蛋白是结构同源的，它们的主链原子的坐标以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)叠合。
在本发明的一个实施方案中，使用的主体和客体祖蛋白中的最佳功能和结构解链温度相差5℃以内。
然而，在本发明的另一个实施方案中，所述两种祖蛋白的结构-同源‘活性表面’区域主要由基于β折叠的二级结构组成。
然而，在本发明的另一个实施方案中，使用的客体先祖是SEQ ID NO：1的嗜热性蛋白RM Cel12A，且使用的主体先祖是SEQ ID NO：2的嗜中温蛋白TR Cel12A。
在本发明的一个实施方案中，构成产物蛋白的结构核心的氨基酸残基源自RM Cel12A，而构成产物蛋白一部分表面的残基源自TR Cel12A。
在本发明的一个实施方案中，RM Cel12A和TR Cel12A蛋白是结构同源的，它们的主链原子的坐标以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)叠合。
在本发明的一个实施方案中，RM Gel12A和TR Cel12A蛋白中的最佳功能和结构解链温度相差5℃以内。
在本发明的一个实施方案中，RM Cel12A和TR Cel12A的结构-同源性‘活性表面’区域主要由基于β折叠的二级结构组成。
在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO：3的产物MT Cel12A是通过将主体先祖活性表面包括的残基替换为客体先祖活性表面包括的结构-相似残基，而衍生自主体先祖的。
在本发明的另一个实施方案中，获得的新型中温活性热稳定(MTCel2A)产物具有嗜中温客体先祖TR Cel12A的最佳活性温度和同源嗜热性主体先祖RM Cel12A的结构稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，所述中温活性热稳定蛋白(MT Cel2A)具有下列特征：
1.分子质量：20-30千道尔顿；
2.残基数目：约200-300个；
3.等电点：在4-8范围内；
4.最佳活性pH：在4-8范围内；
5.解链温度(Tm)：80-95℃，和
6.最佳活性温度(TOA)：在30-60℃范围内。
然而，在本发明的另一个实施方案中，所述方法在不改变所述酶活性的化学特征或所述底物的化学限定的条件下，有效调整酶的物理功能特征。
然而，在本发明的另一个实施方案中，所述方法有效用于重组来自两种非常不同的生命领域的酶结构稳定性与蛋白质稳定性和活性特征。
在本发明的一个实施方案中，所述中温活性热稳定蛋白有效用于纺织工业的应用中，诸如牛仔布(denim fabrics)的石洗(stone-washing)。
附图和表格简述
图1：RM Cel12A(红色)，和TR Cel12A(蓝色)之间的结构相似性和相异性。
图A显示以
Figure A20078004816200191
的RMSD叠合的多肽主链。注意夹心的上和下折叠，以及由顶部折叠形成的凹沟构成纤维素-结合‘活性表面’。图B和C，分别地，显示TR Cel12A和RM Cel12A表面的顶视图，强调19-21
Figure A20078004816200192
长的纤维素-结合沟。注意这两个沟的显微结构特征的相异性。
图2：RM(红色)、TR(蓝色)、和建模的MT(红-蓝)Cel12的基于-结构的序列对比和表面描绘。
图A.绿色框突出由SEQ ID NO：1表示的RM Cel12A(1HOB)和由SEQID NO：2表示的TR Cel12A(1OA2)中的‘活性表面’残基，其为保守的(三行)或不保守的(两行)。在最上一行的单个残基表示在预测的和获得的序列之间的差异，在文献中报告的关于1HOB的所述残基显示在我们通过对我们的克隆(SEQ ID NO：1)测序获得所述残基的上方。在中间一行中提到的序列是MT Cel12A(SEQ ID NO：3)的序列。注意来自β链的交替‘活性表面’残基簇。图B.RM(红)、TR(蓝)、和建模的MT(红-蓝)Cel12A的表面的侧视图。对MT Cel12A模型进行彩色-编码，从而指示来自RM和TR先祖的残基的不同来源。
图3：RM Cel12A和MT Cel12A在pH 8.0和pH 5.0时的四级和二级结构。
在缺乏(黑线)和存在(红线)100mM NaCl条件下的洗脱液Superdex-75层析图，将关于MT Cel12A的显示在图A(pH 8.0)和图B(pH5.0)中，并且将关于RM Cel12A的显示在图C(pH 8.0)和图D(pH 5.0)中。注意在缺乏盐的条件下在1.23ml处(单体)的MT和RM Cel12A的洗脱，和后来在存在盐和低pH的条件下的体积。在存在100mM NaCl条件下在pH 8.0(黑线)和pH 5.0(红线)下的酶的远-UV CD光谱显示在图E(MTCel12A)和图F(RM Cel12A)中。在缺乏盐的条件下获得相同的光谱(未显示)。
图4：RM Cel12A和MT Cel12A在pH 8.0和pH 5.0时的热稳定性。
218nm处的平均残基椭圆率的温度-依赖性变化显示在图A(RMCel12A，pH 5.0)、图B(MT Cel12A，pH 5.0)、图C(RM Cel12A，pH 8.0)和图D(MT Cel12A，pH 8.0)中。注意在所有情况下，结构改变仅发生在85℃以上，且MT Cel12A在pH 8.0和pH 5.0时的RM Cel12A-样热稳定性。
图5：MT Cel12A和RM Cel12A的温度-和pH-依赖性活性。
图A：作为温度的函数，在pH5.0测量的MT Cel12A(空心三角形)和RM Cel12A(实心方块)的活性变化。图B：作为pH的函数，在50℃测量的MT Cel12A(空心三角形)和RM Cel12A(实心方块)的活性变化。平均值和标准误差条各基于5次实验。注意MT Cel12A具有与TRCel12A接近的最佳温度和pH(本图)，即使它具有与RM Cel12A相当的结构稳定性(图4)。
图6：在不同温度和pH值处比较RM Cel12A和MT Cel12A活性。
纵坐标表示关于DNSA反应的还原糖在550nm处的光学密度。为了允许更好的视觉比较，关于RM Cel12A数据的刻度(0-8)与关于MTCel12A的那些(0-1.5)不同地显示。
图7：比较MT Cel12A(3B7M)测定的结构和RM Cel12A(1HOB)与TRCel12A(1OA2)的已知结构。
图A：叠合MT Cel12A(蓝)、RM Cel12A(红)和TR Cel12A(绿)的主链。图B：由氨基酸极性彩色-编码的RM Cel12A(左上)、TR Cel12A(右上)和MT Cel12A(中下)的活性表面沟的视图。图C：针对它们的主链(如细带表示地)叠合的MT Cel12A(绿)和TR Cel12A(蓝)的活性表面侧链。
图D：与图C中显示的相同的活性表面侧链，不存在主链(为了清楚)。
图E：MT Cel12A(绿)、RM Cel12A(红)和TR Cel12A(蓝)侧视图的所有-原子表面表示法，显示MT Cel12A与两种亲本酶的的相似性。
图8：参与β折叠形成的链中的残基的交替几何排列，和由来自折叠中相邻链的侧链形成表面。
利用软件PYMOL生成来自RM Cel12A的三条链的图示。图A：作为β折叠一部分的链中的交替残基以相反方向背离朝向该折叠的平面。图B：来自β折叠中的相邻链的、以相同方向背离朝向该折叠的侧链彼此相邻。
图C：图B中显示的侧链的这些原子彼此相互作用。图D：图C中显示的侧链的原子充分相互作用，以至于足以形成表面。
图9：RM Cel12A和TR Cel12A之间结构同源性和构成这两种酶的活性表面的β折叠的视觉描述。
图A：主链的重叠。尽管在RM Cel12A和TR Cel12A之间仅存在～28％的序列同一性，但是其结构高度同源，并可以以
Figure A20078004816200211
的RMSD叠合。由两种弯曲的β折叠组成的蛋白质夹入到β薄卷饼型折叠中，纤维素-结合沟位于上方折叠的凹陷表面中。RM Cel12A主链显示为黄色。其活性表面显示为青色。TR Cel12A主链显示为红色。图B：RM Cel12A的活性表面。显示在所述两种蛋白的叠合主链上的是RM Cel12A的活性表面，其由来自构成纤维素-结合沟的上方β折叠的残基组成。RM Cel12主链显示为红色，且TR Cel12A为蓝色。图C：TR Cel12A的活性表面。显示在所述两种蛋白的叠合主链上的是TR Cel12A，其由来自构成纤维素-结合沟的上方β折叠的残基组成。RM Cel12主链显示为红色，且TR Cel12A为蓝色。该嗜中温活性表面和嗜热性同系物的活性表面的视觉比较显示本工作中试图进行的表面-改造的深度的理论“切除”视图。
图10：TR Cel12A的“温度对比活性”、“pH对比活性”和“温度对比结构含量”特征。
图A和B：如Karlsson，J.，Siika-aho，M.，Tenkanen，M.& Tjerneld，F.(2002).生物技术杂志(J.Biotechnol.)99，63-78报告地，TR Cel12A活性随温度和pH的变化。图C：如Sandgren，M.，Gualfetti，P.J.，Shaw，A.，Gross，L.S.，Saidajeno，M.，Day，A.G.，Jones，T.A.& Mitchinson，C.(2003).蛋白质科学(Protein Science)12，848-860报告地，TR Cel12A CD信号(结构含量)随温度的变化。本附图中显示的图来自于以上引用的论文。
图11：RM Cel12A和MT Cel12A的DNA和蛋白质序列。
最上一行——M Cel12A蛋白序列。第二行——RM Cel 12A DNA序列。第三行——MT Cel12A DNA序列。第四行——MT Cel12A蛋白序列。注意：仅显示残基编号。未显示碱基编号。显示的残基编号是来自原始参考文献中真实序列的那些，忽视缺口。在标记物后，RM序列以Met(残基1)起始，其未显示。
图12：合成编码RM Cel112A(通过来自基因组DNA的PCR)和MTCel12A(通过利用诱变引物的SOE-PCR)的基因的示意图。编号是分配的引物编号(见表4)。星号标记表示引物是诱变的。诱变的引物结合DNA碱基变化，所述变化设计为(i)改变RM残基为结构类似的TR残基，(ii)包括与RM中无类似性的来自TR的环，(iii)通过破坏备选(不理想的)引物-模板缔合的可能性进行沉默突变，从而最优化PCR的可行性，和(iv)进行沉默突变，从而破坏二级结构，认为所述二级结构可能在基因表达过程中在mRNA水平影响翻译效率。注意：利用引物1N和12，从海洋红嗜热盐菌(R.marinus)基因组DNA中扩增关于RM Cel 12A的基因。利用诱变引物1-11和不包括突变的引物12，通过剪接编码RM Cel12A的基因的合适的突变部分构建关于MT Cel12A的基因。
图13：显示来自PCR和SOE-PCR反应的扩增的凝胶。凝胶显示a)通过PCR从来自海洋红嗜热盐菌的基因组DNA(反应号1)生成编码RMCel12A的基因，和b)编码MT Cel12A的基因的合成中涉及的步骤，其涉及来自编码RM Cel12A的基因的区域的诱变PCR扩增和通过剪接重叠延伸(splicing-by-overlap-extension，SOE)PCR(反应号2-11)装配所述区域。
图14：DNA测序电泳图验证编码MT Cel12A的基因的正确构建。
图15：显示MT Cel12A(图A&B)和RM Cel12A(图C&D)的非-变性纯化的凝胶。
图A：泳道1-沉淀。泳道2-溶胞产物(在10mM咪唑中)。泳道3-流出液。泳道4-洗涤液(在20mM咪唑中)。泳道5-分子量标记(从上到下：分别为116，66，45，35，25，18.4，14.4kDa)。泳道6-9-洗脱在1M咪唑中的MT Cel12A级分。图B：泳道10-15-洗脱在1M咪唑中的MTCel12A级分。泳道16-分子量标记(从上到下：分别为116，66，45，35，25，18.4kDa)。图C：泳道1-沉淀。泳道2-溶胞产物(在10mM咪唑中)。泳道3-流出液。泳道4-洗涤液(在20mM咪唑中)。泳道5-分子量标记(从上到下：分别为116，66，45，35，25，18.4，14.4kDa)。泳道6-9-洗脱在1M咪唑中的MT Cel12A级分。图D：泳道10-15-洗脱在1M咪唑中的MT Cel12A馏分。泳道16-分子量标记(从上到下：分别为116，66，45，35，25，18.4kDa)。
图16：RM Cel12A和MT Cel12A的MS特征。
利用IgG校准、以具有＞100ppm的精确性的线性模式在ABI VoyagerDE-STR MALDI-TOF质谱仪上收集数据。RM Cel12A的预测质量是26215.93Da。MTC Cel12A的预测质量是25037.01Da。注意1：观察到的质量在对这些质量预测的误差范围内。注意2：对于m值m＝1，z＝2 & m＝1，z＝1 & m＝2，z＝1 & m＝3观察到m/z峰。
图17：凝胶过滤校准和以不同浓度运行MTC Cel12A。该附图显示MT Cel12A样品的堆叠的凝胶过滤洗脱层析图，每份样品为50μl体积，所述样品是在将蛋白质浓度稀释为插入数据中显示的数值后上样的。四种样品的吸光度值范围明显不同，并且因此在标准化后显示它们堆叠，从而促进观察洗脱体积的变化，如果存在变化的话。利用50mM Tris pH 8.0平衡样品和SMART Superdex-75柱。观察到的结果是MT Cel12A的稀释不引起凝胶过滤洗脱体积(已知与分子流体力学体积有关)的任何变化。在稀释时，任何缔合、或解离的缺乏，以及在以上校准图中插入其洗脱体积(1.23ml)，表明MT Cel12A是～25kDa的稳定单体。
表1：通过LSQMAN叠合程序生成的相似残基对(具有RMSD数据)。该表仅显示存在结构叠合的残基对。以上未显示未叠合的环。
表2：活性表面移植的详细信息。该表显示为RM Cel12A和TR Cel12A各自的活性表面沟贡献侧链的所有结构-类似的残基对。构成β链的残基显示为绿色突出标记的格中。在经过移植保守的残基显示为黄色。其他残基来自于连接链的环，其侧链朝向溶剂。重要的注意：上表仅列出上方折叠和指向溶剂的表面环上存在的残基，而没有列出在上方折叠上向下指向下方折叠的残基。
表3：基因片段合成和装配的序列(PCR和SOE-PCR条件)。
表4：用于基因合成的引物序列。
表5：序列信息差异表。
表6：蛋白质的结构-生物化学和物理-化学性质。对中温活性热稳定酶(MT Cel12A)测量的性质与由文献已知的嗜中温(TR Cel12A)和嗜热性(RM Cel12A)先祖的性质一起显示在比较表格中。
发明详述
本发明提供包括嗜热性蛋白结构稳定性特征和嗜中温蛋白活性特征的重组中温活性热稳定蛋白及其合成方法，其中包括嗜热性蛋白表面的底物-结合和催化-活性区域的主要不连续的氨基酸组被结构-同源的嗜中温蛋白中的结构等价位置处存在的不同的不连续氨基酸组代替。
我们的发明提出重建酶“活性表面”。认为酶“活性表面”在酶反应的任何阶段，可以包括所有包括与催化作用直接有关的活性位点的残基以及与结合底物或接触底物原子有关的残基。值得注意的是，即使在与底物-类似物结合的酶的结构在原子水平详细已知的情形中，例如通过X-射线晶体学技术已知，人们却从来不能确信哪些其他残基(除在晶体结构中实际看到与底物接触的那些外)也在酶处理过程中与底物接触，因为许多酶被认为在它们结合和催化循环过程中改变构象。因此，假定仍然不存在确定知晓任何酶完整活性表面的全部范围的方法，实际上，我们应该将“活性表面”定义为酶中参与底物-结合或催化作用的特定的二级结构(或超二级结构)元件的与溶剂接触的全部残基组。因此，例如，如果底物-结合和催化残基处于基于β折叠的结构的溶剂-暴露面，则我们应该将指定所述特定β折叠的完整的溶剂-暴露面为“活性表面”。
本发明提出并且示范用于酶活性表面的“表面重建”或“表面重新改造”的理性方法。所述重建涉及对两种具有广泛叠合的主链(“广泛叠合的”定义为具有0.5-2.5埃均方根偏差的主链原子叠合性)的结构-同源酶的残基使用的比较。所述比较一旦完成，随后用另一种酶的完整活性表面对一种酶中包括一个完整活性表面的所有残基进行基于残基-对-残基(residue-by-residue)突变的替换，——我们称为“表面移植”的方法，因为其导致活性表面从一种酶有效移植到另一种酶。如果以这样的方式选择在它们的结构稳定性和功能性最佳条件方面不同的两种酶，则所述“移植”作用导致基于折叠构建新型酶生物催化剂，所述酶生物催化剂结合“主体”酶的结构稳定性特征和“客体”酶的活性特征，所述主体和客体是进行结构同源性比较的两种酶。因此，所述主体和客体酶有效地成为新型酶生物催化剂的祖先酶，因为客体酶促成新型酶结构的活性表面，且主体酶促成所有其他残基和主要部分。
公知所述活性表面的形成是形成酶的总体三维结构的结果，即其依赖于酶的折叠。由于活性位点构成活性表面的子集，所以断定所述活性表面也是由于折叠形成的。然而，重要的是理解通过折叠仅形成几乎-正确的三维结构不暗示任意酶的活性位点或“活性表面”的正确形成和功能执行。这是因为可以在结构上充分干扰所述活性位点引起终止执行功能，而不以任何可辨别的方式干扰酶的总体结构，正如Tsou和同事关于通常在整体解折叠前可以观察到失活作用的许多酶的解折叠和折叠行为所示范地，这提示所述活性位点在构象上比其余的分子更灵活(Tsou，1993.科学(Science)262，380-381；Tsou，1995.Biochim.Biophys.Acta 1253，151-162；Yang和Tsou，1995.生物化学杂志(Biochem J.)305，379-384)。因而断定这对活性表面也是正确的，即活性表面的形成和功能执行也可以表现出脱离展示所述表面的酶的折叠的一些自主性。本发明提出并示范用于验证和利用所述活性表面脱离酶的总体三维结构的支持支架的自主性的理性方法，这是通过显示可以怎样在酶中通过由多(主要)不连续残基替换实现的“移植”容易地模拟活性表面而进行的。
本发明示范利用具有β薄卷饼型折叠结构的酶进行活性表面移植的可行性；然而，本发明提出本发明中开发和公开的特殊的理性方法可以用于利用任何两种结构-同源酶进行所述活性表面移植，所述酶使用基于β折叠的活性表面，所述基于β折叠的活性表面使用以0.5-2.5埃的RMSD叠合的主链原子。
重建β折叠结构的溶剂-暴露面
在基于β折叠的蛋白，诸如β薄卷饼型折叠酶中，所述活性表面由β-折叠形成。我们的发明的一个延伸是如果考虑到这样的事实，即β-链上交替的残基以相反方向背离朝向，则可能突变酶的完整的基于β折叠的表面。那些从折叠内指向溶剂的残基通常形成所述活性表面，而指向内部的那些与另一个折叠的残基疏水性相互作用，这两组残基之间不存在相互作用。因此，我们的情况是从β折叠中去除朝向溶剂的残基组并用来自结构-相似(同源)酶的等价的朝向溶剂的残基组替换它们是可行的，即换言之，将一种酶的完整活性表面“理论上移植”到另一种酶上，如我们在此提出的在β薄卷饼型折叠酶中，或实际上在任何基于β折叠的表面中，所述表面提供分别处理隐蔽残基的机会，所述隐蔽残基主要参与由在蛋白表面上暴露和参与其功能的那些确定酶的总折叠和结构稳定性。
移植可行性的结构分析
我们的移植方法仅适用于基于β折叠的蛋白结构。由于β折叠中处在延伸构象中的肽键的反式构型，链中任意残基的侧链以与其在每一侧的两个紧邻残基完全相反的方向朝向背离折叠的方向。折叠中的交替残基组因此以相反方向背离朝向，并对其侧链发展完全独立的包装流程，这两面彼此之间具有非常小的任意相互影响范围。在优选的平面折叠中，同一面上的残基有时可以太过远离，以至于不能有效相互作用形成表面；因此，在多-折叠结构中，残基通过堆叠在一起的折叠获得刚性构象，这容许朝向的侧链组之间的相互作用。然而，由长链构成的β折叠很少是完全平面的，大多数天然是弯曲的。尽管所述弯曲的折叠也可以堆叠(如，例如发生在Cel12A酶的顶部和底部折叠之间)，但是一组堆叠的折叠中的顶部折叠的凹入、溶剂-暴露面上的残基潜在地可以相互作用，从而形成自主包装流程(图1A-1C)和与所述堆叠中其他折叠有效隔离的表面。这造成选择性重建顶部折叠的凹面的可能性(图1A，2B)。我们继续对形成RM Cel12A活性表面的顶部折叠进行重建，如下文详述。
RM Cel12A和TR Cel12A共享约28％的氨基酸序列同一性。两种结构的详细检验容许鉴定在两种蛋白质中的类似残基位置。关于每种蛋白质中的每对类似残基，我们鉴定具有参与构成或毗邻纤维素-结合沟的链的主链原子的那些，并然后分别将这些指定为具有这样的侧链，所述侧链是：(a)向上朝向所述沟，(b)向下(离开所述沟的方向)朝向下方的β折叠，或(c)落入分隔链的环区域内。然后，从所述列表中除去朝下的残基，它们是不具有参与沟形成的侧链的环结构中存在的残基。剩下的残基，以及在每种蛋白中在其他蛋白质中没有负体的某些沟-组成残基显示在表2中，其还总结了关于哪些残基位置是保守的，和哪些位置构成结构-类似的非-相同残基对的详细信息。在表2中，可以观察到来自交替残基位置的数组侧链存在于单独的“框”中，其中这些源自相同的β链，尽管构成所述表面的残基是由整个蛋白质序列获得的(图2A)。
总之，可以观察到由RM Cel12A中的总共66个残基，和由TR Cel12A中的57个位于结构-类似位置处的残基形成所述沟本身和毗邻所述沟的上升区域。仅29个参与形成TR Cel12A活性表面的残基由RM Cel12A中的结构-类似负体的不-相同的组表示。此外，RM Cel12A中的两个环，即分别地，12个残基(Cys66-Leu77)和4个残基(Ser115-Gly118)，在TR Cel12A中被各自3个残基的非-结构-同源环[(Ile67-Gln69)和(His107-Thr110)]替换。而且，TR Cel12A中与RM Cel12A中的Asp160和Trp161对应的类似位置之间存在残基插入(Ala153)。因此(见表2)，RM Cel12A和TR Cel12A活性表面之间的区别由来自TR Cel12A的总共36个残基[29(类似的)+3(来自一个环)+3(来自另一个环)+1(来自插入)]限定。
因此，我们改造的目的是在这36个位置处用TR Cel12A残基替换RMCel12A残基。这两种酶的序列，以及结合这36个残基变化的重新设计的海洋红嗜热盐菌酶的序列显示在图2A中，所述重新设计的海洋红嗜热盐菌酶命名为“中温活性热稳定”Cel12A，或MT Cel12A。编码MT Cel12A的基因的合成是通过多突变-引入的聚合酶链反应(PCR)步骤，以及随后通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)程序由逐步剪接连接所获得的扩增子而完成的。克隆引入6xHis N-末端亲和标记物的基因构建体，过表达并且纯化，以及类似地克隆、过表达和纯化未修饰的RM Cel12A作为对照，其蛋白质量是通过MALDI-TOF质谱法证实的。
合成MT Cel12A
合成编码MT Cel12A的基因是通过多突变-引入的聚合酶链反应(PCR)程序，以及随后通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)程序由逐步剪接装配所获得的扩增子而实现的[见图12(SOE PCR流程)、表3(SOE装配详细信息)、表4(使用的引物的详细信息)、图13(PCR结果)、图14(DNA序列电泳图)、和表5中的序列的一组差异]。克隆、过表达和纯化引入6xHis亲和标记物的基因构建体，以及类似地克隆、过表达和纯化未修饰的海洋红嗜热盐菌Cel12A(RM Cel12A)作为对照分子(图15)。这两种蛋白的质量是通过MALDI-TOF质谱法证实的(图16)。
MT Cel12A如RM Cel12A一样地折叠
通过在非-变性条件下的相同程序纯化的MT Cel12A(图3A)和RMCel12A(图3C)在pH 8.0的凝胶过滤色谱法过程中表现出相同的洗脱体积，这提示单体状态。在存在盐(100mM NaCl)，和pH 5.0下，MT Cel12A在洗脱中显示出相同的延迟(图3A，3B)，这说明与柱基质相互作用的疏水性残基簇可能的暴露；在存在盐，和pH5.0下，对于RM Cel12A也观察到所述延迟的洗脱(图3C，3D)。以四种不同样品浓度、三个十进制量级范围内层析的MT Cel12A，以完全相同的洗脱体积洗脱，这进一步证实其为单体，并在浓度升高时不经历缔合。
MT Cel12A(图3E)和RM Cel12A(图3F)的远-UV圆二色谱彼此类似，并是典型的βI型(β折叠)二级结构，其在216nm处具有相似信号强度的特有负波段最大值。在从酸性转移到碱性pH时，酶均不经历任何结构改变(图3E、3F)。RM Cel12A光谱在～225-235nm区域内显示出另外的负波段，该负波段在MT Cel12A光谱中较不明显，这提示可能存在一些微小的结构差别。
MT Cel12A从RM Cel12A继承其Tm
通过监测作为25-98℃温度升高函数的平均残基椭圆率(MRE)的减小，评估MT Cel12A和RM Cel12A的热稳定性。MT Cel12A表现出～93℃的Tm，其显示结构在pH 5.0完全解链(图4B)，和在pH 8.0不完全解链(图4D)，由此证明其具有与RM Cel12A相似的结构(热)稳定性水平，所述RM Cel12A表现出96℃的Tm，其显示结构在pH 8.0近似-完全解链(图4C)，和在pH 5.0不完全解链(图4A)。MT Cel12A的极端热稳定性明显归功于其使其大多数残基，即其完整的疏水性核心和其大部分表面，来源于热稳定的RM Cel12A。两种酶在两种不同pH值下加热时完全解折叠的事实可能可以阐释如下。对于RM Cel12A在pH 5.0可获得的高度稳定性，MT Cel12A在该pH下不能获得，因为MT Cel12A具有在pH5.0时发展为其最高活性(且大概，因此，最高构象灵活的)状态的活性表面；该活性表面在pH 5.0时的热不稳定性可能起始继续完成的解链过程。相同的论据可能适用于RM Cel12A，其具有在pH7.0时发展为最佳活性的活性表面，在pH 8.0或pH 6.0具有相似的活性，但在pH 5.0具有低得多的活性。因此，每种酶似乎更易于在其拥有的活性表面的最佳活性pH(或接近该pH)下热解链。
MT Cel12A从TR Cel12A继承其Toa
如作为恒定pH5.0下温度的函数(图5A)；作为恒定温度50℃下pH的函数(图5B)；并且针对不同pH和温度的组合(图6)测量的由RMCel12A和MT Cel12A对底物羧基-甲基纤维素(CMC)所显示的活性，共同表示许多令人感兴趣的领悟。
第一，(a)与由RM Cel12A显示的90℃的Toa相比，MT Cel12A具有显著降低的55℃的Toa，其接近于已知的由TR Cel12A显示的50℃的Toa(图5A)。这证明TR Cel12A的活性表面即使在移植到RM Cel12A的结构支架上后，仍以其原始性质起作用(在MT Cel12A中)，其没有由具有高出42℃的Tm(即96℃代替54℃；见表6)的支架的适用性引起Toa上移。
第二，(b)尽管由MT Cel12A显示的55℃的Toa，其活性对照温度曲线图(图5A)比关于TR Cel12A已知的相应曲线图(图10)显著更宽。即使在已知由于其结构在54℃解链TR Cel12A不显示活性的高温下，仍存在显著的活性保留(例如，在70℃保留最大活性的70％，和在90℃保留7-8％的活性)。因此，明显地，对在MT Cel12A中起作用的输入的TRCel12A活性表面赋予另外的稳定性，即使该活性表面的Toa在很大程度上保持不变。
第三，(c)MT Cel12A具有比RM Cel12A的低1.0单位的最佳活性pH，即pH 6.0代替7.0(图5B)，这进一步确定在MT Cel12A中起作用的TR Cel12A的自主性并为解释它们移植能力的原理提供支持。
最后，(d)在pH 5.0和50℃，MT Cel12A显示出RM Cel12A活性的1/5，(图6)。该值在其它温度和pH值时更低，这可能是由于移植的活性表面在其新结构背景中的‘脆性’，这可以进一步通过诱变改进。尽管如此，在pH 5.0和50℃时，MT Cel12A几乎是RM Cel12A活性的1/5的事实提示从定性和定量的观点来看，结构成分的折叠和装配在新酶中几乎完全地发生。这些结果还证明，与引入的改变的深度相比，改变的支架的任何显微结构(对活性的)影响是非常小的。
MT Cel12A继承TR Cel12A活性表面和RM Cel12A支架以及(剩余的)表面
我们通过X-射线晶体学确定了MT Cel12A的结构。该结构保存在蛋白质数据库(PDB)中，其具有标识码(PDB ID)3B7M。该蛋白质结晶为四聚体。该四聚体的几何排列是这样的，即各个亚基与另外两个亚基相互作用。然而，在溶剂中使用的pH和离子强度条件下，作为已经提到地，所述分子是单体，在储存时也观察到二聚体群(数据未显示)，这表明结晶条件可以有利于这种二聚体形式的二聚体的沉积。单体结构的详细视图显示在图7的图A中，其显示与RM Cel12A(红)和TR Cel12A(绿)的已知多肽主链结构叠合的确定的MT Cel12A(蓝)主链结构的带状结构草图。该图揭示MT Cel12A的大多数主链结构与RM Cel12A和TR Cel12A的相似。在图7的图B中，以残基极性编码显示所有三种蛋白质的沟的表面视图，从而证明MT Cel12A的沟与TR Cel12A的沟共享特征。在图7的图C中，观察到构成与MT Cel12A(绿)和TR Cel12A(蓝)叠合的活性表面的大多数侧链，图D以稍微放大的形式显示相同的侧链，且没有带状结构(为了清楚)。直接证明MT Cel12A的活性表面与TR Cel12A的类似，其移植的残基在这两种情形中采用相同的几何排列。在图7的图E中，MTCel12A(绿)、RM Cel12A(红)和TR Cel12A(蓝)的表面的侧视图均从相同的角度显示。可以看出，在很大程度上，MT Cel12A的表面与RM Cel12A共享特征，因为其大部分残基和其全部表面(不包括活性表面沟)源自RM Cel12A。总之，结构的详细信息证明尽管引入36个不连续突变，MTCel12A采用与RM Cel12A非常类似的折叠结构，其具有与TR Cel12A非常类似的表面(除了环区域中的一些微小偏差外)。这为本发明中已经提出的实验观察提供进一步的支持，所述实验观察显示MT Cel12A具有RMCel12A的结构稳定性和TR Cel12A的物理活性特征。
推论讨论
MT Cel12A是混合嗜中温亲本的功能性特征和嗜热性亲本的结构特征的新型酶，所述混合通过从所述嗜中温获得不连续残基组(构成负责底物结合的弯曲β折叠的溶剂-暴露面)并使用其代替所述嗜热性中的结构-类似残基组实现的。当然，提供稳定的结构支架的确在高温下将移植的活性表面的功能性明显地增强到显著的程度，尽管TR Cel12A的原始Toa延续到MT Cel12A中。尝试的“活性表面移植”的成功证明酶中Toa和Tm的关联不是必须的，并且显示如何利用蛋白质工程来分开并独立分类酶中的热稳定性和功能性。采用易于结晶和结构确定的所述彻底重新-改造的酶的显著折叠和功能不仅证明酶活性表面在其较宽的总体三维结构背景中操作的自主性，还为新型理性方法提供“概念-的-证据”示范，所述新型理性方法能够在较宽的酶范围内用于缩短生物体中酶功能性和稳定性的天然共同进化，其目的是产生具有自然界通常不产生的特征的分子。
本发明涉及所有β蛋白的功能行为的改变，其通过下列步骤进行：
1)鉴定具有不同物理功能特征(例如，酶功能的最佳温度)和相同化学功能特征(即，作用在相同底物上)的两种蛋白质，称为A和B。
2)确定所需改造转化的性质，并且还确定A和B中哪种蛋白质被认为是“客体”或供体结构，和哪种是“主体”或接纳体结构[例如，所述主体蛋白应该是需要保持其结构稳定性的蛋白，例如，嗜热性蛋白，且所述客体蛋白应该是需要将其功能行为经过涉及特定残基改变(如以下步骤3-6中给出地确定)的表面移植引入到所述主体中的蛋白，例如，嗜中温蛋白]。
3)叠合A和B的多肽主链。
4)鉴定位于A和B中类似表面位置处的残基对。
5)鉴定位于A和B中与底物结合有关的类似位置处的残基对子集。
6)确定将要产生的残基变化的表(包括从链和环区域中的连续或不连续的取代、插入和缺失)。
7)构建靶多肽氨基酸序列，其是利用合适的诱变引物和来自主体基因的野生型模板区域，通过重叠序列延伸(SOE)聚合酶链反应(PCR)引起的剪接合成的(引入未改变和改变的残基)，从而生成突变的蛋白。
8)DNA测序以验证正确的基因合成。
9)利用亲和标记物(例如，用于固定金属亲合层析的6xHis标记物)克隆、过表达和纯化突变的和其他形式的酶。
10)针对生物化学和生物物理特征纯化酶。
11)利用标准测定法绘制活性对比温度曲线图。
12)利用标准测定法绘制活性对比pH曲线图。
13)远-UV CD光谱法确定二级结构。
14)通过在远-UV范围内监测圆二色(CD)信号获得热解链曲线图。
15)质谱法确定完整酶的分子量。
16)凝胶过滤色谱法确定所述蛋白质的四级结构状态(即是单体还是多聚体)。
17)X-射线结晶学确定所述酶的三维结构，并验证是否发生了预期的结构变化。
下列实施例通过例证本发明的方式给出，并且因此不应该将其解释为对本发明范围的限制。
实施例：
实施例1：设计中温活性热稳定(MT)Cel12A
我们利用软件LSQMAN检查了RM Cel12A和TR Cel12A之间的结构同源性，从而计算主链的叠合。我们使用相同的软件量化主链叠合性水平(图1，图A)，并确定所述主链能够以
Figure A20078004816200331
的RMSD叠合，尽管这两种蛋白的表面特征是显著不同的(图1，图B)。叠合的主链可以用于确定处于这两种酶中的类似位置处的残基号(表1)。使用该信息产生这两种酶基于结构-类似的蛋白质(图2)和DNA(图11)序列对比。然后进行视觉检验RM Cel12A酶的结构，从而鉴定构成纤维素-结合沟和所述沟周围相关区域的残基。确定这些位于构成所述蛋白的弯曲顶部β折叠的β链和中间环中。形成弯曲的β折叠的链区域由分别属于RM Cel12A链的位置8-29，53-77，100-140，159-167，200-210的残基序列段限定。对于上述RMCel12A序列段中的每个残基，我们确定侧链是向上指向生物素-结合沟中，还是沿着沟的侧面(即，具有与纤维素底物相互作用的可能性)，还是位于沿着沟排列的壁外侧(不具有与底物相互作用的可能性)。这组成构成RM Cel12A活性表面的残基子集，其显示在表2的第一栏中。我们然后检查了TR Cel12A序列/结构中相应的类似残基，从而确定是否对于RMCel12A中每个残基，TR Cel12A中的类似残基也参与形成纤维素-结合表面。我们发现对于位于链中的所有残基和对于位于环中的大部分残基，每对结构-类似残基的两个组成部分均具有完全相同的结构排列，即二者均向上指向纤维素-结合表面(活性表面)或向下指向下方的β折叠，或指向侧面。因此，鉴定为构成RM Cel12A活性表面的残基子集在TR Cel12A中具有类似物，这显示在表2的第二栏中。然而，可以注意到，类似残基对不在所有残基位置存在。在某些区域中，环可能不叠合。因此，残基取代和插入的最终定义还包括非-类似的残基环，如表2所示。可以注意到，在两种酶中，一些残基是保守的。在表面移植过程中不需要对这些进行突变。关于RM Cel12A、MT Cel12A、和TR Cel12A蛋白质序列的基于结构的多序列对比显示在图2，图A中。
表1
Figure A20078004816200351
表2
  海洋红嗜热盐菌链中的原始残基   里氏木霉(T.reesei)链中的相应(类似)残基   结构起源   采取的作用
  Arg8   Gln6   环   突变的
  Trp9   Trp7   链   保守的
  Ala11   Thr9   链   突变的
  Asp13   Thr11   链   突变的
  Arg20   Thr16   链   突变的
  Ile22   Ser18   链   突变的
  Asn24   Asn20   链   保守的
  Trp26   Trp22   链   保守的
  Asn54   Asn55   环   保守的
  Asp55(报告序列中的Asn 55)   Asn56   环   突变的
  Val56   Val57   环   保守的
  Tyr59   Tyr60   链   保守的
  Ala61   Asn62   链   突变的
  Tyr63   Gln64   链   突变的
  Gly65   Ala66   链   突变的
  Cvs66-Leu77即，Cys66，His67，Trp68，Gly69，Ala70，Cys71，Thr72，Ser73，Asn74，Ser75，Gly76，Leu77   Ile67-Gln69即，Ile67，Pro68，Gln69   环，在RM和TR序列之间不具有结构一致性   突变的
  Arg100   Arg93   链   保守的
  Asn102   Asn95   链   保守的
  Ala104   Ala97   链   保守的
  Asp106   Asp99   链   保守的
  Trp108   Phe101   链   突变的
  Ser110   Ala103   链   突变的
  Pro111   Ala104   环   突变的
  Gly112(报告序列中的Val112)   Asn105   环   突变的
  Thr113   Pro106   环   突变的
  Asn114   Asn107   环   保守的
  Ser115-Glv121即，Ser115，Ser116，Asn117，Gly118，Tyr119，Ser120，Gly121(报告序列中的Gly116)   His108-Asp113即，His108，Val109，Thr110，Tyr111，Ser112，Gly113   环，但在RM和TR序列之间不具有结构一致性   Tyr111，Ser112和Gly113保守的；His108，Vsl109，和Thr110突变的
  Gly122   Asp114   链   突变的
  Glu124   Glu116   链   保守的
  Met126   Met118   链   保守的
  Trp128   Trp120   链   保守的
  Trp131   Lys123   环   突变的
  Gly134   Asp126   环   突变的
  Gly138   Ile130   环   突变的
  Ser140   Ser132   环   保守的
  Trp159   Asn151   环   突变的
  Asp160   Gly152   环   突变的
  ---   Ala153   环   插入的
  Trp161   Met154   链   突变的
  Tyr163   Val156   链   突变的
  Ala165   Ser158   链   突变的
  Arg167   Val160   链   突变的
  His200   Leu193   环   突变的
  Ala201   Ser194   链   突变的
  Glu203   Gln196   链   突变的
  Gly205   Gly198   链   保守的
  Glu207   Glu200   链   保守的
  Trp209   Phe202   链   突变的
  Glu210   Thr203   环   突变的
实施例2：MT Cel12A结构的建模
通过用TR Cel12A中结构-类似残基的坐标在计算机芯片上代替RMCel12A残基的坐标首先生成MT Cel12A的坐标文件来生成移植的蛋白(MT Cel12A)的模型。利用AMBER 8.0通过能量最小化去除原子撞击和键角异常(DRMS 0.01；使用急剧下降和共轭梯度方法)。该模型以全-原子表面表示，以及RM Cel12A和TR Cel12A的类似表示显示在图2B中。
实施例3：基因合成、克隆和DNA测序
我们构建两种编码天然-存在RM Cel12A酶重组形式和重组非-天然-存在中温活性热稳定酶MT Cel12A的基因。用于基因合成的方案，用于PCR和剪接-重叠序列延伸(SOE)PCR的引物和条件，以及合成的基因的全序列和编码的氨基酸序列的详细信息分别在图11、表3和4和图12、和图13中给出。可以注意到基因合成引入(i)Bam HI限制位点(其5’末端侧连12个碱基对的突出端，以促进消化)，该位点在编码RM Cel12A和MT Cel12A的基因中均紧接在编码起始N-端残基(苏氨酸)的密码子之前，(ii)终止密码子，其在编码最后的C-端残基(谷氨酰胺)之后，和(iii)Hind III限制位点(其3’末端侧连12个碱基对的突出端，以促进消化)，其紧接在终止密码子之后。消化Bam HI和Hind III限制位点，从而容许将基因插入和连接进入pQE-30(Qiagen)载体。除选择标记(氨苄青霉素抗性)外，所述载体提供可诱导的启动子、转录起始位点、翻译起始位点、和N-端亲合标记物(N-MRGSHHHHHGS-C)。载体中用于编码所述标记物最后两个残基，即G和S的碱基一起构成Bam HI位点，这容许插入合成的基因。所述载体还在Hind III位点后提供终止密码子，但是我们优选使用在Hind III位点前、紧随C-端谷氨酰胺之后的终止密码子，如已经提及地。将连接的载体转化进入携带基因型hsdR17 recA1 lacF’[proAB+lacIqlacZΔ15 Tn10(tetr)]的感受态大肠杆菌(E.coli)XL-1 blue细胞中。在含有四环素和氨苄青霉素的LB平板上进行克隆的选择。使用应用生物系统DNA测序仪(3130XL测序仪)进行克隆的自动化DNA测序。利用ABI MiniPrep试剂盒，从XL-1 blue细胞中纯化质粒。使用具有序列5’-CGGATAACAATTTCACACAG-3’的载体-特异性正向引物，或具有序列5’-GTTCTGAGGTCATTACTGG-3’的载体-特异性反向引物进行热-(循环)-测序反应，所述正向引物用于通读编码所述蛋白N-末端的基因区域，所述反向引物用于通读编码所述蛋白C-末端的区域。反应使用ABI现成反应混合物(大染料终止子v3.1循环测序RR-100(Big Dye Terminator v3.1cycle sequencing RR-100))，所述混合物在96℃变性(5分钟)，随后进行30个循环的96℃变性(1分钟)，50℃退火(1分钟)，和60℃延伸(2分钟)。在上样到分析器上之前，通过标准程序结合使用EDTA和乙醇的洗涤进行反应-后的清理，。显示编码MT Cel12A的基因的序列的电泳图提供在图14中。
表3
  反应号   正向引物   反向引物   模板DNA   退化温度/时间   延伸温度/时间   产物(bp)   酶   Mg2+浓度(mM)
  1   引物1N   引物12   RM基因组   60℃；2分钟   75℃；3分钟   714   TripleMaster   2.5
  2   引物1   引物2   反应1的产物   55℃；2分钟   75℃；3分钟   219   TripleMaster   2.5
  3   引物3   引物4   反应1的产物   55℃；2分钟   75℃；3分钟   174   DeepVent   4.0
  4   引物5   引物6   反应1的产物   60℃；2分钟   75℃；3分钟   114   TripleMaster   2.5
  5   引物7   引物8   反应1的产物   60℃；2分钟   75℃；3分钟   117   TripleMaster   2.5
  6   引物9   引物10   反应1的产物   60℃；2分钟   75℃；3分钟   156   TripleMaster   2.5
  7   引物11   引物12   反应1的产物   60℃；2分钟   75℃；3分钟   99   TripleMaster   2.5
  8   引物1   引物4   反应2和3的产物   55℃；2分钟   75°；3分钟   360   TripleMaster   2.5
  9   引物5   引物8   反应4和5的产物   55℃；2分钟   75℃；3分钟   207   TripleMaster   2.5
  10   引物9   引物12   反应6和7的产物   60℃；2分钟   75℃；3分钟   234   TripleMaster   2.5
  11   引物1   引物12   反应8、9和10的产物   60℃；2分钟   75°；3分钟   681   DeepVent   2.0
表4
  引物号   引物序列
  引物1N   5’-ACTTATACTATAGGATCCACTGTCGAGCTGTGTTGTAGATGGGACGCGCGC-3’
引物1   5’-ACTTATACTATCGGATCCACGGTCGAGCTGTGCGGACAGTGGGACACGAGAACGGTGGCTGGGGGGCGCTACACGGTGAGCAACAACGTATGGGGC-3’
  引物2   5’-CTGCGGGATGGCAAACTGGATGTTCGGATAGGCGGCCACGTT-3’
引物3   5’-GCCTATCCGAACATCCAGTTTGCCATCCGCAGCCGCGCCGTGTGCAAGAACTGTCCGACGTG-3’
引物4   5’-CAGCTCGGCGTCTCCAGAATACGTCACGTGGTTTGGGTTGGCGGCGAAGAAGATGTCGTAGGCGGC-3’
引物5   5’-CGCTGGAATGCCGCCTACGACATCTTCTTCGCCGCCAACCCAAACCACGTGACGTATTCTGGAGACGCCGAGCTG-3’
引物6   5’-GATAGGCATCACATCGCCGTTTTTGTTCAGCC-3’
  引物7   5’-AAAAACGGCGATGTGATGCCTATCGGCAGCCGCGTGGCCACCG-3’
  引物8   5’-CCTCACGTAGCTGATCACATTCATCGCACCATTGTCAGCATACCAGACTTCCC-3’
引物9   5’-TGGTATGCTGACAATGGTGCGATGAATGTGATCAGCTACGTGAGGACGACGCCC-3’
引物10   5’-GCCCGTTTGCACCGACAGCAGATACCACTCCGG-3’
  引物11   5’-CTGCTGTCGGTGCAAACGGGCTTTGAACTCTTTACTGGTGGTGCCGGTCTGCGAAG CGCC-3’
引物12   5’-ACTTATACTATCAAGCTTCTACTGCACAGTTACGGAAAAATCGGC-3’
表5：
  RM Cel12A中的残基(PubMed和PDB中报告的)   RMCel12A中的残基(我们发现的)   MTCel12A的残基(我们使用的)   TRCel12A中的残基(报告的)   位置   注释
  Asp49(D)   Glu   Glu   Gln49   不是活性表面的一部分   因为Asp和Glu均带负电荷，我们决定保留在我们克隆的基因中发现的Glu
  Asn55(N)   Asp   Asn   Asn56   活性表面的一部分   由于该残基是活性表面的一部分，且TR Cel12A中的类似残基是Asn，所以我们确定在MTCel12A中应该是Asn
  Val112(V)   Gly   Asn   Asn105   -Do-   -Do
  Gly116(G)   Ser   His   His108   -Do-   -Do
  Ser176(S)   Thr   Thr   Ser169   不是活性表面的一部分   在Wicher等，应用微生物学和生物技术(Appl.Microb.Biotechnol.)55，578-584(2001)中，报告了RM Cel12A原始序列的作者将Ser176修正为Thr176。由于我们在该位置发现为Thr，所以我们保留它。不将其改变为Ser，因为它不在活性表面中。
实施例4：蛋白质表达和纯化
小规模纯化：将设置在摇动烧瓶中2升总体积中的XL-1 blue细胞的二级培养物在37℃生长直到至O.D600～0.6，并用0.4mM IPTG进行诱导。为了生成RM Cel12A，诱导后4小时收获细胞，而对于MT Cel12A，我们发现在12小时后收获对获得高产率更好。裂解收获的细胞，并在非-变性条件下对其进行标准的基于Ni-NTA的亲合纯化(Qiagen)，区别是利用1M咪唑进行洗脱。随后将咪唑透析掉，以获得纯的折叠蛋白。MT Cel12A的非-变性纯化PAGE模式图显示在图15A和15B中，RM Cel12A的非-变性纯化PAGE模式图显示在图15C和15D中。
大规模纯化：对诱导后12小时从培养物中收获的细菌细胞使用基于超声波-或基于dynamill的裂解作用，并重悬在50mM NaH2PO4，300mMNaCl，pH 8.0中。基于离心去除细胞碎片，然后通过向上清液中加入硫酸铵达到80％的饱和水平，以及随后基于离心收集沉淀的蛋白。将沉淀的蛋白溶解在pH 5.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中，并进行透析以去除痕量的硫酸铵。在65℃加热重新溶解在柠檬酸盐缓冲液中的蛋白质15-30分钟，从而加热-变性和加热-沉淀裂解物中除存在的酶，即RM Cel12A或MTCel12A(依赖于纯化这些蛋白的哪一种)之外的所有细菌细胞质蛋白。随后进行离心，去除热-沉淀的蛋白，将纯RM Cel12A或MT Cel12A保留在上清液中，其可作为考马斯-染色的SDS-PAGE中单一条带辨别。
实施例5：质谱法
在Voyager DE-STR MALDI-TO质谱仪上对纯化的RM Cel12A和MTCel12A进行质谱鉴定。获得的质量值充分落入确定这些质量范围的质量精确性中预期的误差范围内。图16的图例中提供了进一步的详细信息。
实施例6：远-UV CD光谱法
为了波长扫描和温度(结构解链)扫描，使用0.1-0.3mg/ml范围内的蛋白质浓度，使用径长为0.1或0.2cm的杯子，和250-195nm范围内的扫描原始椭圆率(θ)值，以6-9升/分钟的N2气流速，在Jasco J-810分光偏振计上，进行CD光谱测量。对于在固定波长(218nm)处的pH-依赖性温度扫描，考虑到218nm处25℃的θ值对应于完全折叠的状态，且为零的θ值对应于完全未折叠状态，将原始观察到的椭圆率值转换为部分解折叠值。对于标准波长扫描，利用公式[θ]＝{θobs×100×平均残基重量}/{浓度(mg/ml)×径长(cm)}，将原始θ转换为平均残基椭圆率值。CD结果提供在图3和4中。
实施例7：凝胶过滤色谱法
使用与SMART色谱工作站(法玛西亚(Pharmacia))连接的、预校准和适当预平衡的微-分析Superdex-75凝胶过滤柱(床体积2.4ml)，在存在不同浓度的盐，和使用不同蛋白浓度条件下，检查处于pH 5.0或pH 8.0缓冲液中正常条件下的RM Cel12A和MT Cel12A的流体力学体积和洗脱行为。校准数据显示在图17图A中，且显示MT Cel12A缺乏任何解离的对照(进一步支持单体状态)显示在图17图B中。
实施例8：内切葡聚糖酶活性测定
通过标准的基于DNS-终止的方法(Miller等，1960.分析生物化学(Anal.Biochem.)2，127-132)测定MT Cel12A和RM Cel12A的酶活性。对于在多种温度(具有固定的pH)，或在多种pH值(具有固定的温度)下进行总酶活性测量，使用以下详述的条件。温度扫描(图5A)-为了在各种温度下温育，我们使用处在pH 5.0的柠檬酸盐缓冲液中的最终MTCel12A浓度0.1mg/ml和NaCl浓度100mM(终浓度35mM)。对每次实验，用水使反应体积达到1ml，并向其中加入1ml 1.8％的CMC(羧甲基纤维素)，并温育该溶液1小时。对每种温度进行总共5次这样的实验。关于RM Cel12A，我们使用处在pH 5.0的柠檬酸盐缓冲液中的最终酶浓度0.04mg/ml和NaCl浓度100mM(终浓度35mM)。类似地使反应体积达到1ml，并向其中加入1ml 1.8％CMC，并温育该溶液20分钟。对每种温度进行总共5次这样的实验。在下列温度下温育各容纳2ml的不同管：10，20，30，40，50，60，70，80，和90℃。还在100℃对RM Cel12A进行测量。温育后，将3ml DNS(二硝基水杨酸)试剂加入到每个管中，并将所述管煮沸15分钟，从而通过DNS与由纤维素酶对CMC底物的作用释放的还原糖反应而产生颜色。也在没有酶的条件下温育对照反应。通过550nm的吸光度测量评估颜色的形成，并减去关于对照的值(～0.03)。还使用葡萄糖进行标准校准图，以评估还原糖——但没有报告这些，因为受监测的相关参数具有相对活性。认为获得的最高活性是100％，且将剩余的活性转换为观察到的最大活性的百分比数值。pH扫描(图5B)-为了在各种pH下温育，我们使用处在适当缓冲液中的最终MT Cel12A浓度0.1mg/ml和NaCl浓度100mM(最终浓度35mM)。使反应体积达到1ml，并向其中加入1ml 1.8％CMC，并在50℃温育该溶液1小时。对每种pH进行总共5次这样的实验。关于RM Cel12A，我们使用处在适当缓冲液中的最终酶浓度0.01mg/ml和NaCl浓度100mM(终浓度35mM)，使其达到1ml，并向其中加入1ml1.8％CMC，并在50℃培养该溶液20分钟。对每种pH进行总共5次这样的实验。不同的管容纳2ml处于下列pH值范围内的各种以上混合物：3，4，5，6，7，8，9，和10。对于3.0-6.0范围内的pH，使用柠檬酸盐缓冲液。对于pH 7.0-9.0，使用tris缓冲液。对于pH 10.0，使用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液。严格按照关于以上的温度扫描，进行利用DNS的颜色形成反应。认为获得的最高活性是100％，且将剩余的活性转换为观察到的最大活性的百分比数值。在相同条件下比较RM Cel12A和MT Cel12A的活性(图6)-为了比较，在以下绝对相同的条件下对RM Cel12A和MT Cel12A进行活性测定：在45mM柠檬酸盐缓冲液(用于在pH 5.0比较)或45mM tris缓冲液(用于在pH 8.0比较)中，在存在100mM NaCl的条件下，使用相同最终浓度(0.1mg/ml)的两种酶，使其达到1ml，并加入到1.0ml 1.8％CMC中，以形成总体积2ml。在两种不同温度，即50℃和90℃，在这两种pH下，使用这两种酶一式三份地进行温育1小时。严格按照关于以上的温度和pH扫描，进行利用DNS的颜色形成反应。
实施例9：蛋白质参数
RM Cel12A。长度：236个残基(包括具有序列N-MRGSHHHHHHGS-C的12个残基长的N-端亲合标记物)。分子量：26215.93Da。消光系数(280nm)：280nm处的92940.1 O.D等价于0.28mg/ml。等电点(pI)：5.53。MT Cel12A。长度：227个残基(包括具有序列N-MRGSHHHHHHGS-C的12个残基长的N-端亲合标记物)。分子量：25037.01Da。消光系数(280nm)：280nm处的56,000.1 O.D等价于0.45mg/ml。等电点(pI)：5.39。
表6
Figure A20078004816200431
*排除在RM Cel12A和MT Cel12A上存在的N-MRGSHHHHHHGS-C标记物的长度。
#包括在RM Cel12A和MT Cel12A上存在的N-MRGSHHHHHHGS-C标记物的质量。
+我们的RM Cel12A克隆在所述标记物后仅具有224个残基，因为我们去除了N-端的甲硫氨酸。
@关于TR Cel12A和RM Cel12A的详细信息来自公开的文献，或我们的数据。TR Cel12A的详细信息来自Sandgren等，2003.蛋白质科学(ProteinScience)12，848-860；Simmons，1977，第二届国际真菌大会(Second Intl.Mycol.Congress)，坦帕，美国佛罗里达，第618页；Karlsson等，2002.生物技术杂志(J.Biotechnol.)99，63-78。RM Cel12A的详细信息来自Crennel等.2002.分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)320，883-897；Bjornsdottir等，2006.嗜极端生物(Extremophiles)10，1-16；Hallorsdottir等，1998.应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)49，277-284。
实施例10：结构鉴定
利用悬滴蒸汽扩散法，在下列条件下，使用约10mg/ml的起始蛋白浓度使蛋白结晶：0.2M NaH2PO4.H2O，20％PEG 3350，pH 4.5。晶体在20℃，2-3天后，生长为尺寸0.5×0.4×0.8mm。利用旋转式阳极X-射线发生器(Rigaku UltraX，日本)和图像板检测器(MAR研究(MARresearch)，德国)收集数据。晶体衍射到
Figure A20078004816200441
分辨率。利用程序的HKL组简化和测量数据(Denzo和Scalepack)。利用RM Cel12A作为模型，和如在CCP4中执行的MOLREP程序，通过分子替换法确定结构。利用CNS和CCP4进行细化。通过利用Coot程序计算傅里叶和差别傅里叶图谱，在绘图工作站上检查所述模型。利用PROCHECK和WHATCHECK程序验证所述模型，从而检查任何误差。将模型和结构因子存放在蛋白质数据库中(PDB ID No.3B7M)。
优点
·本发明阐明的设计原理促进将基于β折叠结构的任何活性表面从任何蛋白质/酶“移植”结构-同源的蛋白质/酶中，所述移植不管序列同一性水平，但以严格依赖于供体(客体)和接纳体(主体)酶主链、特别是在移植涉及的两种酶类似区域内的叠合能力水平的方式进行。
·酶活性表面的成功移植，如通过本发明所述示范地，揭示酶活性表面是能够主要不依赖其主体酶的支持结构支架的结构和稳定性起作用的酶显微结构和功能的自主单位，这是因为在所有支持活性表面功能的条件下保持所述主体结构；同样地，该发现(和相关方法)容许研究者重组来自两种非常不同的生命领域的酶结构稳定性和蛋白质活性特征，如本发明中所示。
·本发明示范调整酶物理功能特征，诸如例如其最佳活性温度的严格理性方法的第一个用途。
·本发明证明酶活性位点功能特征的差别显著归功于与底物分子结合的表面的特征(结构/稳定性/灵活性/化学)的不同，而非仅归功于直接参与催化作用的残基。
·尽管，本发明示范了使用β折叠结构的原理，但是通过仔细的结构分析可以将该概念和方法外推至移植还包括螺旋和其他结构的表面。
·尽管，本发明示范包括对小分子底物结合和催化作用的活性表面的移植，但是可将该概念和方法外推至不包括任何催化化学活性的蛋白-蛋白和蛋白-小分子相互作用。
·尽管，本发明示范仅移植酶表面的一部分，但是，可以将该概念和方法外推至酶之间、或非-酶蛋白质之间的完整-表面移植，从而以自然界中一般不采用的方式，组合一种酶的核心的结构稳定性特征和另一种同源酶的表面特征和功能性。
序列表
<110>科学与工业研究委员会
<120>重组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法
<130>0215NF2006
<160>SEQ ID NO：1
<170>Patentln version 3.4
<210>SEQ ID NO：1
<211>224
<212>PRT
<213>海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)
<400>SEQ ID NO：1
Thr Val Glu Leu Cys Gly Arg Trp Asp Ala Arg Asp Val Ala
 2           5                   10                   15
Gly Gly Arg Tyr Arg Val Ile Asn Asn Val Trp Gly Ala Glu Thr
                 20                   25                 30
Ala Gln Cys Ile Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asn Phe Thr Ile
                 35                  40                  45
Thr Arg Ala Glu His Asp Asn Gly Asn Asp Val Ala Ala Tyr Pro
                 50                  55                  60
Ala Ile Tyr Phe Gly Cys His Trp Gly Ala Cys Thr Asn Ser Ser
                 65                  70                  75
Gly Leu Pro Arg Arg Val Gln Glu Leu Ser Asp Val Arg Thr Ser
                 80                   85                 90
Trp Thr Leu Thr Pro Ile Thr Thr Gly Arg Trp Asn Ala Ala Tyr
                 95                  100                 105
Asp Ile Trp Phe Ser Pro Gly Thr Asn Ser Ser Asn Gly Tyr Ser
                 110                 115                 120
Gly Gly Ala Glu Leu Met Ile Trp Leu Asn Trp Asn Gly Gly Val
                125                  130                 135
Met Pro Gly Gly Ser Arg Val Ala Thr Val Val Leu Ala Gly Ala
                140                 145                  150
Thr Trp Glu Val Trp Tyr Ala Asp Trp Asp Trp Asn Tyr Ile Ala
                155                 160                  165
Tyr Arg Arg Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Glu Leu Asp Leu
                170                  175                 180
Lys Ala Phe Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Gly Tyr Ile Arg Pro
                185                  190                 195
Glu Trp Tyr Leu His Ala Val Glu Thr Gly Phe Glu Leu Trp Glu
                200                  205                 210
Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Ser Val Thr Val Gln
                215                  220                 225
<110>科学与工业研究委员会
<120>组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法
<130>0215NF2006
<160>SEQ ID NO：2
<170>Patentln version 3.4
<210>SEQ ID NO：2
<211>218
<212>PRT
<213>里氏木霉(Trichoderma reesei)
<400>SEQ ID NO：2
Glu Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr
 1               5                   10                   15
Thr Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe
                 20                  25                   30
Gly Cys Val Thr Val Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His
                 35                  40                   45
Ala Asp Trp Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr
                 50                  55                   60
Gln Asn Ser Gln Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser
                 65                  70                   75
Ile Ser Ser Met Pro Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser
                 80                  85                   90
Asn Ile Arg Ala Asn Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn
                 95                  100                  105
Pro Asn His Val Thr Tyr Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp
                 110                 115                  120
Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly
                 125                 130                  135
Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr
                 140                 145                  150
Asn Gly Ala Mer Gln Val Tyr Ser Phe Val Ala Gln Thr Asn Thr
                 155                 160                  165
Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe Asn Tyr Leu Arg
                 170                 175                  180
Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val Leu Ser Tyr
                 185                 190                  195
Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu Asn Val
                 200                 205                  210
Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn
                 215
<110>科学与工业研究委员会
<120>重组中温活性热稳定蛋白及其设计和生物合成方法
<130>0215NF2006
<160>SEQ ID NO：3
<170>Patentin version 3.4
<210>SEQ ID NO：3
<211>215
<212>PRT
<213>海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)
<400>SEQ ID NO：3
Thr Val Glu Leu Cys Gly Gln Trp Asp Thr Arg Thr Val Ala Gly
 2               5                   10                   15
Gly Arg Tyr Thr Val Ser Asn Asn Val Trp Gly Ala Glu Thr Ala
                 20                  25                   30
Gln Cys Ile Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asn Phe Thr Ile Thr
                 35                  40                   45
Arg Ala Glu His Asp Asn Gly Asn Asn Val Ala Ala Tyr Pro Asn
                 50                  55                   60
Ile Gln Phe Ala Ile Pro Gln Pro Arg Arg Val Gln Glu Leu Ser
                 65                  70                   75
Asp Val Arg Thr Ser Trp Thr Leu Thr Pro Ile Thr Thr Gly Arg
                 80                  85                   90
Trp Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Phe Phe Ala Ala Asn Pro Asn His
                 95                 100                  105
Val Thr Tyr Ser Gly Asp Ala Glu Leu Met Ile Trp Leu Asn Lys
                110                 115                  120
Asn Gly Asp Val Met Pro Ile Gly Ser Arg Val Ala Thr Val Glu
                125                 130                  135
Leu Ala Gly Ala Thr Trp Glu Val Trp Tyr Ala Asp Asn Gly Ala
                140                 145                  150
Met Asn Val Ile Ser Tyr Val Arg Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val
                155                 160                  165
Thr Glu Leu Asp Leu Lys Ala Phe Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg
                170                 175                  180
Gly Tyr Ile Arg Pro Glu Trp Tyr Leu Leu Ser Val Gln Thr Gly
                185                 190                  195
Phe Glu Leu Phe Thr Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe
                200                 205                  210
Ser Val Thr Val Gln
                215

Claims (30)

1.重组中温活性热稳定蛋白，其包括嗜热性蛋白的结构稳定性特征和嗜中温蛋白的活性特征。
2.按照权利要求1的重组中温活性热稳定蛋白，包括具有单结构域的蛋白质，其中主要不连续的氨基酸组被结构-同源蛋白中结构等价位置处存在的不同的不连续氨基酸组替换。
3.按照权利要求1和2的重组中温活性热稳定蛋白，其中“客体”或“供体”祖蛋白的一部分或完整表面有效地移植到“主体”或“接纳体”祖蛋白的结构核心上。
4.按照权利要求1-3的重组中温活性热稳定蛋白，其中所述客体和主体祖蛋白具有同源的结构和相同的功能。
5.按照权利要求1-4的重组中温活性热稳定蛋白，其中所述客体祖蛋白是嗜中温蛋白，且所述主体祖蛋白是嗜热性蛋白。
6.按照权利要求1-5的重组中温活性热稳定蛋白，其中所述同源的客体和主体祖蛋白的功能-活性表面区域由基于β折叠的二级结构组成。
7.按照权利要求1-6的重组中温活性热稳定蛋白，其中使用的嗜热性主体祖蛋白和嗜中温客体先祖具有分别由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列。
8.按照权利要求1-7的重组中温活性热稳定蛋白，其包括由SEQ IDNO：3表示的氨基酸序列，其具有由SEQ ID NO：1表示的主体蛋白的结构稳定性特征(热-稳定性)和由SEQ ID NO：2表示的客体蛋白的活性特征(中温-活性)。
9.按照权利要求1-8的重组中温活性热稳定蛋白，其具有下列特征：
i.分子质量：   20-30千道尔顿；
ii.残基数目：  约200-300个；
iii.等电点：   在4-8范围内；
iv.最佳活性pH：在4-8范围内；
v.由解链温度(Tm)定义的热稳定性：80-95℃，和
vi.由最佳活性温度(TOA)定义的中温-活性：在30-60℃范围内。
10.按照权利要求1-9的重组中温活性热稳定蛋白，其中所述蛋白及其先祖是属于水解酶组的单-结构域β折叠蛋白结构类的酶，并且选自由纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶组成的组，优选地为纤维素酶。
11.按照权利要求1的重组中温活性热稳定蛋白，其还可以起生物催化剂的作用。
12.用于设计包括主体祖蛋白的结构稳定性特征和不同的且结构同源的客体祖蛋白的活性特征的重组中温活性热稳定蛋白的方法。
13.按照权利要求12的用于设计重组中温活性热稳定蛋白的方法，其中所述结构-同源的主体和客体祖蛋白包括这样的结构，在所述结构中，由位于基于β折叠的二级结构中的残基提供底物-结合和催化功能。
14.用于设计重组中温活性热稳定蛋白的方法，所述方法包括下列步骤：
a.叠合所述客体和主体祖蛋白的结构，并在多肽主链水平上，优选地，在包括底物-结合和催化功能的结构区域中，评估它们结构的叠合性程度，
b.通过使用步骤(a)的信息，生成所述主体和客体祖蛋白的蛋白序列以及编码DNA序列的基于结构类似的序列对比，
c.鉴定在主体祖蛋白序列中构成基于β折叠的‘活性表面’的特定氨基酸残基，并且使用获自步骤(b)的对比序列以在所述客体祖蛋白中鉴定相应类似的不连续残基和残基组，
d.确定在来自所述主体和客体祖蛋白构成所述两种蛋白的活性表面的两个相应氨基酸残基组中相同的特定残基，并且消除所述相同的残基，从而获得在所述两种蛋白中的结构-等价位置处存在的一组相应的不同残基，
e.将所述主体祖蛋白的‘活性表面’中与所述客体祖蛋白中相应的残基不相同的残基替换为后者蛋白中的残基，由此构成新型中温活性热稳定蛋白，
f.通过已知的重组DNA方法，生物合成所述新型中温活性热稳定蛋白，随后通过已知方法分离和纯化蛋白，和
g.通过活性测量，证实在理想的中温活性热稳定蛋白中的所述主体祖蛋白的结构稳定性特征和所述客体祖蛋白的物理和化学活性特征。
15.按照权利要求12-14的方法，其中构成所述产物中温活性热稳定蛋白的结构核心的氨基酸残基源自所述两种祖蛋白中的一种，而构成所述产物蛋白的一部分或完整表面的残基源自另一种祖蛋白。
16.按照权利要求12-15的方法，其中所述两种祖蛋白是结构同源的，它们的主链原子的坐标以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)叠合。
17.按照权利要求12-16的方法，其中所述主体和客体祖蛋白二者中的最佳功能温度和结构解链温度相差5℃以内。
18.按照权利要求12-17的方法，其中所述两种祖蛋白的结构-同源‘活性表面’区域主要由基于β折叠的二级结构组成。
19.按照权利要求12-18的方法，其中使用的客体先祖是SEQ ID NO：1的嗜热性蛋白RM Cel12A。
20.按照权利要求12-19的方法，其中使用的主体先祖是SEQ ID NO：2的嗜中温蛋白TR Cel12A。
21.按照权利要求12-20的方法，其中构成所述产物蛋白的结构核心的氨基酸序列源自RM Cel12A，而构成所述产物蛋白一部分表面的残基源自TR Cel12A。
22.按照权利要求12-21的方法，其中所述RM Cel12A和TR Cel12A蛋白是结构同源的，它们的主链原子的坐标以0.5-2.5埃的均方根偏差(RMSD)叠合。
23.按照权利要求12-22的方法，其中RM Cel12A和TR Cel12A二者中的最佳功能温度和结构解链温度相差5℃以内。
24.按照权利要求12-23的方法，其中RM Cel12A和TR Cel12A的结构-同源‘活性表面’区域主要由基于β折叠的二级结构组成。
25.按照权利要求12-24的方法，其中所述SEQ ID NO：3的产物MTCel12A是通过将所述主体先祖活性表面包括的残基替换为所述客体先祖活性表面包括的结构-相似的残基，而来源于所述主体先祖。
26.按照权利要求12-25的方法，其中获得的新型中温活性热稳定(MTCel2A)产物具有所述嗜中温客体先祖TR Cel12A的最佳活性温度和所述同源嗜热性主体先祖RM Cel12A的结构稳定性。
27.按照权利要求12-26的方法，其中所述中温活性热稳定蛋白(MTCel2A)具有下列特征：
i.分子质量：   20-30千道尔顿；
ii.残基数目：  约200-300个；
iii.等电点：   在4-8范围内；
iv.最佳活性pH：在4-8范围内；
v.由解链温度(Tm)定义的热稳定性：80-95℃，和
vi.由最佳活性温度(TOA)定义的中温-活性：在30-60℃范围内。
28.按照权利要求12-18的方法，其有效用于在不改变所述酶活性的化学特征或底物的化学限定的条件下调整酶的物理功能特征。
29.按照权利要求12-19的方法，其有效用于重组来自两种非常不同的生命领域的酶结构稳定性与蛋白稳定性和活性特征。
30.按照权利要求12-19的方法，其中所述中温活性热稳定蛋白有效用于纺织工业的应用中，诸如牛仔布的石洗。
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