CN101558346B - 用于染色生物样品的包括发光二极管的照明源 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种显微镜照明系统(10)，包括：光源(16)，具有至少四个LED光源(16R，16B，16G，16Y)，每个LED光源都发射可见光谱的不同部分内的光。该至少四个LED光源中的每一个光源均是可独立控制的。从至少四个LED源发射的所合成的光基本上接近来自白炽光源的光。在一个实施例中，该系统包括至少一个红色LED(16R)、至少一个绿色LED(16G)、至少一个蓝色LED(16B)、及至少一个黄色LED(16Y)。其他颜色的组合也是可行的。该照明可以被定位为将诸如载玻片(14)的样品固定器放置在光源的光路内。该系统还可以包括用于放大生物样品的图像的光学放大系统(22)。

Description

用于染色生物样品的包括发光二极管的照明源

技术领域

本发明的领域大体涉及细胞学和组织学的领域。更具体地，本发明的领域涉及利用一个或多个发光二极管(LED)对染色生物样品进行照明的装置和方法。

背景技术

大多数的显微镜都是利用传统白炽灯来对染色生物样品进行照明。白炽灯产生作为可见光谱(从约400nm到约700nm)中所有颜色的组合的白光。不幸的是，白炽灯产生相当大的热量，具有低的能量效率，并且通常必须频繁更换。

发光二极管(LED)是典型地产生单一颜色、仅覆盖可见光谱中的一个窄频带的已知光源。例如，产生中心在450nm、525nm、及625nm上的窄频带光的LED呈现给人眼的分别是蓝色、绿色、及红色。人类利用眼睛中的专门细胞来显现颜色。具体地，人眼包含三种颜色感受细胞。这些细胞包括所谓的S-视锥、M-视锥、及L-视锥，它们分别感测可见光中的短波长、中波长、及长波长。三类视锥细胞全部对波长的宽频带敏感，但具有不同的峰灵敏度。例如，S-视锥在420nm(蓝色)附近最敏感，而M-视锥在532nm附近(绿色)最敏感，以及L-视锥在564nm(红色)附近最敏感。

眼睛本质上综合了光谱函数，产生三种信号。一种信号是光强度。另一种信号将蓝光与黄光区分开。最后，第三种信号将黄光分离为红光和绿光。这种光谱综合对这些颜色一起求平均。在人眼看来，来自黄色LED(590nm)的光与来自绿色LED和红色LED的组合光是一样的，这是因为在这两种情况下红色和绿色是平衡的并且多于蓝色。

将不同强度的红光、绿光、及蓝光组合在一起将产生几乎任一颜色的外观。例如，根据操作者的偏好，使用单独显色的红色LED、绿色LED、及蓝色LED的显微镜照明系统可以被调谐到任意照明颜色。

在典型的显微镜成像应用中，需要白光(诸如从传统的白炽灯泡发出的光)给生物样品照明。病理学家及观察疾病状态生物样品的其他受训人员对分析利用宽带的白炽光源所照明的样品较熟悉。已经尝试使用LED来模拟从传统白炽光源发出的白光。例如，已经生产出了产生接近白光的有色光混合的单个LED。例如，在前述提到的设计中，从氮化镓二极管半导体中发出蓝光(在460nm附近)。由位于聚合物封装套(polymerjacket)内部的磷光体涂层发出约550nm至650nm附近的范围中的次级光。这些波长的组合产生了具有相对较高的色温的“白”光。上述的该类型LED的问题在于，它们不善于产生相对较长波长的光(例如，红光)。

在另一设计中，将来自红色LED、绿色LED、及蓝色LED的光组合起来以产生看上去是白色的照明，但不包含全部的可见光谱。具体地，黄色带(565nm至590nm附近)中的照明强度非常低。如果利用白炽灯来给一些染色细胞样品照明，则光谱的黄色部分中的该间隙使这些染色细胞样品看上去是不同的颜色。这是有问题的，因为对于病理学者或其他受训人员来说，与传统白炽白光相比，在基于LED的白光下面该染色生物样品看上去不一样。然而，典型地，病理学者是在使用宽带白炽光源的显微镜上接受训练的。不同的视觉外观会导致对载玻片结果的混淆和误释。

发明内容

在本发明的一个实施例中，一种显微镜照明系统包括：光源，具有至少四个LED光源，每个LED光源都发出可见光谱的不同部分内的光。该至少四个LED光源中的每个都是可独立控制的。其中，所得到的从该至少四个LED源发出的光基本接近于来自白炽光源的光。该至少四个LED源可以是任意颜色的，当将它们进行组合时，就非常接近模拟了从白炽或宽带光源发出的光。例如，该至少四个LED可以包括红色LED、蓝色LED、绿色LED、及黄色LED。照明系统可以包括每种颜色的单一LED，或者可替换地，照明系统可以包括每种颜色的多个LED。在又一实施例中，照明系统可以包括单一的红色、绿色、及蓝色LED以及多个黄色LED。其他颜色组合也是可行的。例如，这四种LED颜色可以包括紫色、蓝绿色、黄绿色、和橙色。

在本发明的一个实施例中，照明系统包括一个或多个驱动电路，驱动电路可操作地连接到四种颜色的LED。例如，第一电路可以用于驱动RGB颜色，而第二电路可以用于驱动黄色LED。作为又一替换方式，每种颜色(红色、绿色、蓝色、及黄色)可以由单独的电路控制。在另一实施例中，可以独立控制各有色LED的亮度。这四种有色LED可以是单独的或者它们可以集成到单一的或多个模块中。例如，RGB LED可以位于一个模块中，而各黄色LED位于一个单独的模块中。

在本发明的又一实施例中，显微镜照明系统包括具有至少一个红色LED、至少一个绿色LED、至少一个蓝色LED、及至少一个黄色LED的光源。该显微镜照明系统包括放置在光源的光路内的固定器。样品固定器被配置为将生物样品固定在光学照明路径内。显微镜照明系统包括用于获得生物样品的一个或多个放大图像的光学系统。例如，照相机可以用于获取生物样品的放大图像。可替换地，可以采样传统的显微镜光学器件(例如，物镜等)。

在本发明的又一实施例中，给生物样品照明的方法包括：提供具有至少四个LED的照明源，其中，一个LED是红色的，一个是绿色的，一个是蓝色的，另一个是黄色的。当相比于传统的RGB LED单元时，黄色LED填充可见光谱的黄色部分中的间隙。生物样品(其可以包括组织部分、细胞、或多个细胞)被设置在照明源的光路上。典型地利用该至少四个LED对用生物染色剂染色的生物样品进行照明。各种有色LED的亮度可以被调整以改变图像的外观。例如，可以调整一个或多个黄色LED的亮度以改变感觉到的色调。

附图说明

现在将通过使用附图利用其他的说明和细节来阐述并描述本发明的实施例，在附图中：

图1示意性示出了根据本发明一个实施例的基于LED的照明系统。

图2示意性示出了根据本发明另一个实施例的基于LED的照明系统。

图3示出了四个有色LED各自被单独的驱动电路所驱动的实施例。

图4示出了基于LED的光源，该光源具有被多个黄色LED围绕的一个红色LED、一个绿色LED、一个蓝色LED。

图5示出了另一个基于LED的光源，其中，第一模块包含红色LED、绿色LED、及蓝色LED。第二模块被设置为包括至少一个黄色LED。这两个模块相对于分束器设置，使得黄光与红光、绿光、蓝光组合在一起以形成用于给样品照明的白光。

图6示出了基于四色(红色、绿色、蓝色、及黄色)LED的照明系统的作为波长函数的光强度的曲线图。

图7示出了用于基于四色(红色、绿色、蓝色、及黄色)LED的照明系统的作为波长函数的光强度的曲线图。还示出了染色剂曙红Y的吸收光谱。

具体实施方式

图1示意性示出了显微镜照明系统10。广义上讲，显微镜照明系统10包括具有至少四个单独的LED的照明源或光源12。这些LED包括至少一个红色LED、至少一个绿色LED、至少一个蓝色LED、以及至少一个黄色LED。以上涉及的这些颜色指的是从各个LED发出的光的颜色。例如，红色LED一般发射约625nm至约660nm范围内的光。绿色LED一般发射约480nm至约575nm范围内的光。蓝色LED一般发射约450nm至约500nm范围内的光。黄色LED一般发射约575nm至约625nm范围内的光。当然，这些范围意味着涵盖由各个LED发射的大部分光，并且可以预计到会出现一些超出所述范围的发射光。

如以下更详细的阐述，如果只有红色LED、绿色LED、及蓝色LED用作照明源，则添加黄色LED会填充来自显微镜照明系统10的发射光谱中的间隙。在这点上，添加黄色LED使得在基于LED的显微镜照明系统下观察的生物样品的外观更加类似于在传统白炽系统下观察的同一样品。在这点上，病理学者和其他受训专业人员能够更好地显现该生物样品的特定结构和多个方面。例如，当使用特定染色剂(诸如曙红Y和橙色G染色剂)时，对于用户来说，相比于利用传统宽带白炽光源进行照明的同一对象，只利用来自LED的RGB(红色、蓝色、绿色)光所照明的细胞和细胞结构在视觉上看上去是不同的。

返回参照图1，显微镜照明系统10的一个目的在于，提供一种利用多个不同颜色的LED 16对显微镜载玻片14上的生物(例如，细胞学)样品12进行成像的“白”光源。该照明源包括至少一个红色LED 16R、至少一个绿色LED 16G、至少一个蓝色LED 16B、以及至少一个黄色LED 16Y。每个LED 16均可以是高亮度的LED，从而明亮的白光能够对生物样品12进行照明以进行显现。多个LED可以通过组合单个离散的LED来形成、或通过定制基于多管芯LED的模块来形成。例如，可以利用库存部件将单独的LED进行装配以形成照明组件。可替换地，可以使用其中多个单独的LED管芯安装在一个公共衬底18上(如图1和2所示)的基于LED的模块。

LED 16产生热量，并且随着LED温度的增加，输出波长移动。所产生的热量取决于驱动LED的电流和施加该电流的持续时间。为了增加来自该装置的光输出而不产生足以导致波长移动的热量，在一些实施例中，使可以利用脉冲电路20驱动的LED 16与成像系统10的照相机22同步以在照相机积分时段期间向照相机22传送短而强的光脉冲。在该实施例中，照相机22放大并拍摄生物样品12的图像用于随后观察和/或分析。当然，例如，如果显微镜照明系统10被人类操作者所使用时，LED 16不必与照相机22同步。在该实施例中，照相机22可以被传统的放大光学器件(例如，物镜等)替代。在该应用中，LED 16将被持续供电——不需要同步。

再次参照图1，在利用照相机22的实施例中，通过(例如，利用方波发生器26)提供触发照相机/帧抓取器24和LED脉冲驱动器20两者的外部触发信号，使LED脉冲与照相机帧积分同步。照相机22并不瞬时响应于该触发信号。为了补偿该延迟，脉冲驱动电路20具有用于使这些系统同步的可编程延迟。当然，根据照相机类型和实际的实现方式，其他同步方式也是可行的。

照明系统10可以包括处理器29(诸如个人计算机)，处理器可以用于对经由照相机22拍摄的图像的存储和获取进行控制。处理器29可以使成像序列的各种函数协同工作，并且还保留或传送生物样品12的数字图像。

LED 16固有地产生空间上不均匀的光输出，而一些光学应用合理地需要样品的均匀照明。对于不均匀是个问题的情况，可以使用利用LED 16来产生空间均匀照明的两类系统，即，克勒(Koehler)和光纤系统。这两种系统中的任一种系统中所使用的LED 16均可以是邻近封装的多个LED 16，或多个LED 16管芯可以集成在单一衬底18上以产生更加密集的布置。

克勒照明(见图1和图2)是一种标准技术，用于从传统的显微镜照明器中所使用的白炽灯的空间上非均匀的灯丝产生显微镜载玻片14的均匀照明。如通过测试所确定的，当采用LED 16时，该技术在实现均匀性时同样有效。在基于LED的照明系统10的一个实施例中，各LED 16紧密封装在一起并被放置在传统克勒照明器28中的灯丝的一般位置处。

在实现均匀性的另一实施例中，见图2，利用透镜或其他光学设备将多个LED 16耦合到一个大纤芯(约500μm至600μm)光纤30中。第6,665,060号美国专利(其通过引证结合于此，如同在此全文阐述)公开了一种可以与LED 16一起使用的透镜。光纤30的长度被选择为使得多个LED 16的空间非均匀性被混合在一起并获得来自光纤30的相对均匀的空间输出。实际上，光纤30的输出在空间轮廓上近似为高斯图。光纤30可必须与显微镜载玻片14有一定距离，从而只使用该输出中的中央相对平坦的部分。作为对单独的LED 16的一种替换方式，多个LED管芯(诸如图1和图2所示)可以被放置在单一衬底18上。单独的透镜可以被放置在每个管芯上方，从而来自每个管芯的辐射都被收集到窄视锥中。在特定实施例中，克勒照明器28、30可以全部省略。

如上所述，图1和图2中的黄色LED 16Y填充了利用RGB LED16R、16G、16B的发射光的发射光谱中的间隙。通过存在至少一个黄色LED 16Y来填充光谱的黄色区域中的照明强度(约565nm至约590nm)。尽管图1和2示出了单一的黄色LED 16Y，但是在一些实施例中，可以使用多个黄色LED 16Y。例如，在一个配置中，多个黄色LED 16Y环绕或围绕包含RGB LED 16R、16G、16B或多个LED管芯的内部部分(例如，见图4)。

在本发明的一个实施例中，如图3所示，多个LED 16R、16G、16B、及16Y被多个单独的驱动电路所驱动。也就是说，至少一个红色LED 16R被第一驱动电路40R所驱动，至少一个绿色LED 16G被单独的第二驱动电路40G所驱动，至少一个蓝色LED 16B被单独的第三驱动电路40B所驱动，以及至少一个黄色LED 16Y被单独的第四驱动电路40Y所驱动。图3示出了该实施例，在该实施例中，单独的驱动电路40R、40G、40B、40Y与各个LED 16R、16G、16B、及16Y相关联。

驱动电路40R、40G、40B、40Y典型地包括用于将电流施加到LED 16R、16G、16B、及16Y的电流源。当电流正向偏置地通过LED p-n结时，从二极管发射光。驱动电路40R、40G、40B、40Y能够彼此独立地调整每个LED 16R、16G、16B、及16Y的亮度。例如，可以独立于红色LED 16R、绿色LED 16G、及蓝色LED 16B来调整黄色LED 16Y的亮度。利用脉宽调制来调整亮度等级。例如，为了实现10％的亮度等级，使电流在10％的时间处于“接通”状态而90％的时间处于“断开”状态中进行脉动。脉宽调制是一种用于控制LED亮度等级的已知方法。可以利用一个或多个微处理器来实现驱动电路40R、40G、40B、40Y。

图4和图5示出了照明系统10的基于LED的光源50的两种示例性配置。在图4中，一系列黄色LED 16Y围绕着具有红色LED16R、绿色LED 16G、及蓝色LED 16B的LED模块42。黄色LED16Y关于LED模块42以对称的方式来布置。图5示出了基于LED的光源50的另一种配置，其中，包含红色LED 16R、绿色LED 16G、及蓝色LED 16B的模块42向分束器BS中发射辐射光。包含黄色LED 16Y的单独模块42被大体定位为垂直于RGB模块42的光路，从而从黄色LED 16Y发出的黄光与透射过分束器的红光、绿光、及蓝光组合或合并。当然，图4和图5的基于LED的光源50是示例性的，并且可以预想到处于本发明之内的用于将红色LED 16R、绿色LED 16G、蓝色LED 16B、及黄色LED 16Y组合起来的其他配置。

黄色LED 16Y的存在填充了可见光谱(约565nm至约590nm)的该区域中的间隙。图6示出了利用红色LED 16R、绿色LED 16G、蓝色LED 16B、及黄色LED 16Y的照明系统10的光谱。添加该第四种颜色(即，黄色)使得染色生物样品(例如，细胞)看上去更接近于用宽带白炽光源给这些样品照明所感觉到的颜色。例如，本发明特别涉及使用生物染色剂(诸如曙红Y(C20H6Br4Na2O5；CASNo.17372-87-1)，苏木紫及曙红(H&E)方法中普通明矾苏木紫复染色剂)的染色生物样品。曙红Y吸收窄带的光，吸收峰为约525nm。该吸收峰几乎精确地与绿色LED 16G的峰值发射波长相对应。图7示出了曙红Y叠加在照明光谱(四种颜色的LED 16R、16G、16B、及16Y(图6))上的吸收光谱。要注意，利用曙红Y来对样品进行染色，大部分绿光被阻挡，而蓝色波长、黄色波长、及红色波长被透射。

如果用白炽源对用曙红Y染色的生物样品进行照明，则大部分绿光被阻挡，而其余的光谱被人眼感觉为淡粉色。然而，如果只利用红色LED 16R、16G、16B来对用曙红Y染色的生物样品进行照明，则缺少黄色波长会导致所感觉到的生物样品颜色上的显著移动。如同利用白炽源一样，大部分的绿光被阻挡，而其余的红色和蓝色混合光被人眼感觉为高度饱和色调的红紫色。随后，用曙红Y染色的厚的细胞群看上去非常暗非常饱和以至于难以识别细胞核。因此，病理学者或细胞学技士会看到与他或她预计在传统白炽照明下看到的图像非常不同的图像。

在用橙红G染色剂(1-苯偶氮基-2-萘酚-6，8-二磺酸二钠盐；C16H10N2Na2O7S2，CAS No.1936-15-8)染色的生物样品中会出现类似的颜色感觉。如果只具有红色LED、蓝色LED、及绿色LED的基于LED的照明系统被用于对所观察的生物样品进行照明，则难以将橙色G染色剂和曙红Y区分开。然而，这是有问题的，因为橙红G染色剂是角质化癌症的指示剂。因此，在只依赖于RGB颜色的照明系统中，存在误诊的可能性。

由于细胞染色提供了诊断信息，因此，不可避免地，用LED照明的生物结构(例如，细胞和细胞器官)看上去要与那些用显微镜中所典型使用的白炽光源照明的生物结构一样。如果只使用RGBLED给细胞照明，则有可能样品由于不同的外观而会被病理学者或细胞学技士误诊。

然而，如果添加了黄色LED 16Y并将LED 16R、16G、16B的相对强度调整为看上去光还是白色的，就解决了该问题。因此，用曙红Y染色的样品会被感觉或显现为具有所预计的略带桃红的色调而不是暗的红紫色着色。如同利用白炽光源一样，来自LED 16G的大部分的绿光被阻挡，而其余的红光、蓝光、及黄光混合光被人眼感觉为淡粉色。通过将黄光的亮度改变为与白炽照明的外观相匹配可以调整所感觉到的色调。例如，参照图3，通过脉宽调制，LED驱动电路40Y可被用于改变黄色LED 16Y的亮度。

通过构建LED模块42可以实现改进的白光照明，其中除了一个或多个传统的红色LED 16R、绿色LED 16G、及蓝色LED 16B之外该LED模块还结合了一个或多个黄色LED 16Y。可替换地，可以组合多个LED模块42以模拟宽带白炽光源。尽管本文描述的发明是利用四种颜色LED(红色、绿色、蓝色、及黄色)描述的，但是通过对足以覆盖可见光谱的LED颜色进行任意组合可以获得类似结果。例如，组合紫色、蓝绿色、黄绿色、和橙色LED将提供由红色LED、绿色LED、蓝色LED、及黄色LED所产生的光谱一样全的光谱。在本文所描述类型的照明系统10中包含附加颜色的LED将能够提供模拟从白炽辐射发射的光谱的更加完整、更全的光谱。

Claims (8)

1.一种显微镜照明系统(10)，包括：

光源，所述光源包括：至少一个红色LED(16R)，被配置为发射约625nm至约660nm范围内的光；至少一个绿色LED(16G)，被配置为发射约480nm至约575nm范围内的光；至少一个蓝色LED(16B)，被配置为发射约450nm至约500nm范围内的光；以及以对称方式围绕所述至少一个红色LED(16R)、所述至少一个绿色LED(16G)和所述至少一个蓝色LED(16B)的多个黄色LED(16Y)，所述多个黄色LED(16Y)被配置为发射约575nm至约625nm范围内的光；

样品固定器，放置在所述光源的光路内，所述样品固定器被配置为固定包含生物样品(12)的显微镜载玻片(14)；

照相机(22)，被配置为放大所述生物样品(12)的图像；

LED脉冲驱动电路(20)，被配置为驱动所述至少一个红色LED(16R)、所述至少一个绿色LED(16G)、所述至少一个蓝色LED(16B)和所述多个黄色LED(16Y)；以及

方波发生器(26)，被配置为以同步脉冲的方式触发所述LED脉冲驱动电路(20)和所述照相机(22)。

2.根据权利要求1所述的显微镜照明系统(10)，其中，所述至少一个红色LED(16R)、所述至少一个绿色LED(16G)、所述至少一个蓝色LED(16B)以及所述多个黄色LED(16Y)安装在一个公共衬底上。

3.根据权利要求1所述的显微镜照明系统(10)，还包括：用单独的驱动电路(40_R、40_G、40_B、40_Y)代替所述LED脉冲驱动电路，所述至少一个红色LED(16R)、所述至少一个绿色LED(16G)、所述至少一个蓝色LED(16B)和所述多个黄色LED(16Y)连接至所述单独的驱动电路，用于调整每种颜色的各自的亮度。

4.根据权利要求1或3所述的显微镜照明系统(10)，其中，所述至少一个红色LED(16R)、所述至少一个绿色LED(16G)和所述至少一个蓝色LED(16B)被包含在第一模块中，而所述多个黄色LED(16Y)被包含在第二模块中。

5.根据权利要求1或3所述的显微镜照明系统(10)，其中，所述光源包括一个红色LED(16R)、一个绿色LED(16G)、一个蓝色LED(16B)和多个黄色LED(16Y)。

6.根据权利要求1或3所述的显微镜照明系统(10)，还包括克勒照明器(28)，所述克勒照明器介于所述样品(12)和所述光源之间。

7.根据权利要求1或3所述的显微镜照明系统(10)，还包括光纤(30)，所述光纤光连接至所述光源的输出且介于所述样品(12)和所述光源之间。

8.根据权利要求1或3所述的显微镜照明系统(10)，还包括处理器(29)，所述处理器被配置为获取并存储来自所述照相机(22)的图像。

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