CN101555450A - 一种实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，包括穿刺微针本体的末端通过过渡接头与变幅杆固定；一超声换能器由一段中心开有螺孔的金属圆柱，一段加工出螺钉的金属圆柱，2压电陶瓷圆环与3片电极相间排列，加装在金属圆柱之间，通过螺钉连接成一体；第一金属圆柱的另一端面设一凸台，橡胶导管一端套在凸台上，该橡胶导管的另一端与压力调节部件连接；功率正弦信号发生器与所述的电极片电连接；超声换能器一端相连的变幅杆。本发明的超声装置，适于操作植物细胞或卵细胞类具有坚固细胞壁或具有弹性细胞膜，能避免细胞膜和细胞骨架的大幅度变形对细胞本体造成的伤害，提高穿刺成功率，实现向胞内注射外源物质或吸引胞内或组织内部组分。

Description

一种实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置

技术领域

本发明涉及一种医用器械，特别是涉及一种用于细胞或小组织穿刺，并实现向胞内注射外源物质或吸引胞内或组织内部组分的装置。

技术背景

单细胞层次的分子或药物筛选，在分子生物学和药物开发等研究领域具有重要的意义。在该研究领域中，研究者经常需要将外源物质(染色剂，大分子，基因等)准确的引入目标细胞中或从细胞中提取待测的细胞质，而其中主要面临的困难就是来自于细胞壁(仅植物细胞具有)和细胞膜的阻挡。细胞壁和膜的存在，与细胞的物质交换、细胞识别、分泌、排泄、免疫等功能密切相关。其不仅提供了对于细胞本体的结构性保护，更重要的是具备选择透过性，而选择性恰是生命活动的体现，因为只有活细胞才具备该种特性。除水以外，单细胞膜只允许被选择的离子和小分子通过，这一特性很重要，对于以单细胞为目标的研究者而言，大分子物质除特殊情况下可通过胞吞和胞吐的作用进出细胞以外，一般情况下均不能自由通过细胞膜，必须通过其它手段进行人为的干预。

目前国际上用于外源物质注入细胞的方法包括：电穿孔法，脂质体载体法，病毒载体导入法，基因枪，超声渗透法，显微注射法，基于MEMS器件的注射，基于纳米管的注射。其中，前五种方法属于批量操作，适用于针对一定浓度的细胞群一次性导入。其缺点是需要外界载体或瞬间大能量的介入，容易对细胞本体造成污染或伤害，转染量不易控制，已转染和未转染细胞无法分离，因此不适合稀有或珍贵的细胞样本，也不适合针对体积较大的卵细胞进行的转基因实验。显微注射是当前单细胞注射操作中应用最普遍的方法，实验者依靠固定于显微镜上的微操作器，在镜下采用手动或电动的方式控制玻璃中空微针寻找并刺入目标细胞，然后将微针中灌注的物质注入细胞内。其优点是技术成熟，操作可视化，能够针对单细胞进行主动操作。缺点是使用这种静态力穿刺细胞时引起较大的变形将对细胞造成一定的伤害，穿刺的成功率低，对实验者的操作技能要求高，需要对细胞进行预处理，例如提前去除植物细胞的细胞壁。基于MEMS器件的注射方法和基于纳米管的注射法都属于显微注射范畴内，是采用新材料、新结构的一种创新性尝试，器件制备复杂，作用原理仍然为静力穿刺，无法减少细胞由于受挤压变形而遭受的损伤。

目前用于细胞和小组织内物质提取的方法主要包括：高速组织捣碎法，机械研磨法，反复冻融法，化学处理法和超声处理法等。它们的原理是通过机械、物理、化学等手段破坏细胞壁或细胞膜，继而将细胞内质或核酸释放到溶液中以待进一步检测。但无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少。现在尚缺乏一种可实现细胞胞内或小组织内部物质吸引的技术。

随着现代科学技术的不断深入发展和交叉融合，本发明结合微纳米技术、微制造技术、微流体技术、功率超声技术和细胞生物学等，为实现针对单细胞和小组织内部的注射和吸引提供了一种新的方法和手段。本发明的特点是改变通常显微注射中采用的静态力穿刺原理，在中空微针穿刺细胞膜的同时，在针尖上施加瞬间的超声频率振动，在局部极大加速度的影响下，产生一个瞬间的冲击力，以提高微针的穿刺效率并减少由于挤压变形对细胞造成的伤害。

发明内容

本发明的目的在于：克服通常显微注射中采用的静态力穿刺，无法减少细胞由于受挤压变形而遭受损伤的缺陷；从而提供一种在中空微针穿刺细胞膜的装置。此装置能将超声频率振动传递至针尖，引起局部极大的加速度，从而产生一个瞬间的冲击力，以提高微针的穿刺效率，并减少由于挤压变形对细胞造成的伤害，实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引。

本发明的目的是这样实现的：

本发明提供的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，包括穿刺微针本体1、过渡接头2和变幅杆3；其特征在于，还包括超声换能器4、橡胶导管5、压力调节部件6和正弦信号发生器8；所述的穿刺微针本体1为一根中空管，该穿刺微针本体1的末端通过所述的过渡接头2与所述的变幅杆3固定；所述的超声换能器4由第一金属圆柱401和第二金属圆柱402，2个或4个压电陶瓷圆环和3片电极13组成，所述的第一金属圆柱401一端中心开有螺孔，另一端面上设置一凸台14；所述的第二金属圆柱402一端加工出螺钉15，另一端与所述的变幅杆3的另一端固定；所述的压电陶瓷圆环与所述的3片电极相间排列，并加装在金属圆柱401和402之间的螺钉15上，通过螺钉15连接第一金属圆柱与第二金属圆柱，并对压电陶瓷圆环施加预应力；所述的橡胶导管5一端套在所述的凸台14上，该橡胶导管5的另一端与所述的压力调节部件6连接；所述的功率正弦信号发生器8与所述的电极片13电连接；所述的超声换能器4一端相连的变幅杆3，实现能量传递和放大，即完成一个微型超声吸引器，参考图1和2。

在上述技术方案中，所述的压力调节部件6为双向泵。

在上述技术方案中，所述的压力调节部件6为一由注射器9和螺旋测微仪12组成；包括第一支架10、第二支架10’、联轴器11、注射器9和螺旋测微仪12；其中所述的联轴器11连接注射器9的推杆和螺旋测微仪12的顶杆；所述的第一支架10与第二支架10’同轴安装在一块平台上，分别支撑所述的注射器9和螺旋测微仪12，如图3所示。

在上述技术方案中，所述的穿刺微针本体1的针尖(刺入端)，考虑其生物兼容性和强度，可采用微针拉制器拉制的内径为1～50μm玻璃针尖，或通过冷拔，金属卷饶、激光焊接、精磨等工艺制成内孔径为50～500μm的金属针尖。

在上述技术方案中，所述的压电陶瓷圆环7和压电陶瓷圆环7’为PZT-8(锆钛酸铅)，该压电陶瓷圆环7和7’的外径15mm×内径8mm×厚度2mm。使用压电陶瓷圆环7的特点是发热小，工作稳定，在实际工作中，压电陶瓷的两端被加载正弦变化的交流电压，幅值在1～100V之间，压电陶瓷将产生纵向振动。由于压电陶瓷变形率小，在低电压下为了达到较大的振幅，必须令穿刺针尖工作于超声谐振状态下，并使用变幅杆3完成超声能量传递和振幅放大。

在上述技术方案中，所述的3片电极13为青铜材料的制成的，其厚度0.05～0.3mm。

在上述技术方案中，所述的变幅杆3采用阶梯形和圆锥形设计，尺寸大小由四端网络法或有限元仿真设计法确定。

在上述技术方案中，其穿刺微针本体1与过渡接头2固定的方式可采用激光焊接，氩弧焊，粘接或钎焊，保证机械连接并可完成超声波的传递。

在上述技术方案中，所述的压电陶瓷7和7’与3片所述的电极13相间粘结在一起，再套在所述的螺钉15上。

在上述技术方案中，本发明的对单细胞或小组织内部实现注射和吸引的超声装置，工作频率为20kHz～50kHz，尖端振幅设计为1～20μm，总加速度设计超过50000g，符合软组织受加速度破坏的阈值。超声换能器4、变幅杆3、过渡接头2和穿刺微针本体1的总长度根据工作频率和设计差异，可在1cm～50cm以内。

本发明提供的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，及其相应的方法，适合对直径10μm～10mm的细胞和直径在5cm以内的小组织进行操作，可广泛用于基因工程，药物筛选，细胞生物学和微创生化检测等领域。

本发明的优点在于：

本发明提供的对单细胞或小组织内部实现注射和吸引的超声装置，适合单细胞胞内物质吸引或注射的中空微针尖，用于细胞或小组织穿刺操作，即在针刺瞬间于针尖处施加一个超声振动，克服传统显微操作中所用静力穿刺造成细胞变性大，对于坚固细胞壁或富有弹性的细胞膜穿刺成功率低等缺点，在微针穿刺单细胞或小组织质膜的同时，超声振动产生微米级别的振幅，引起针尖局部的加速度，从而提供瞬间的(0.1～0.2秒)力，因此相比于通常的人工微操作穿刺，可以避免细胞膜和细胞骨架的大幅度变形对细胞本体造成的伤害，提高细胞穿刺的成功率和细胞的成活率。尤其适用于植物细胞或卵细胞这类具有坚固细胞壁或富有弹性细胞膜的操作对象。

本发明提供的对单细胞或小组织内部实现注射和吸引的超声装置，使用压电陶瓷圆环7的特点是发热小，工作稳定，在实际工作中，压电陶瓷的两端被加载正弦变化的交流电压，幅值在1～100V之间，压电陶瓷将产生纵向振动。由于压电陶瓷变形率小，在低电压下为了达到较大的振幅，必须令穿刺针尖工作于超声谐振状态下，并使用变幅杆3完成超声能量传递和振幅放大。

附图说明

图1本发明的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置组成示意图

图2本发明的超声换能器4的剖面图

图3本发明的压力调节部件结构示意图

图面说明：

1中空穿刺微针；   2过渡接头；   3变幅杆；

4超声换能器；      5橡胶导管；          6压力调节部件；

7第一压电陶瓷圆环  7’第二压电陶瓷圆环；8功率正弦信号发生器；

9注射器；          10第一支架；         10’第二支架；

11联轴器；         12螺旋测微仪；       13电极；

14凸台；           15螺钉；             401第一金属圆柱；

402第二金属圆柱

具体实施方式

下面结合实施例及附图详细对本发明进行说明：

实施例1

参考图3，首先制作一个用于本发明的压力调节部件6。该压力调节部件6由第一支架10、第二支架10’、联轴器11、注射器9和螺旋测微仪12组成；第一支架10与第二支架10’采用可以调节高度的金属支架，例如试管支架、光具座等，第一支架10与第二支架10’同轴安装在一块金属平台(或者防震平台)上，它们分别支撑所述的注射器9和螺旋测微仪12(注射器9安装在第一支架10上，螺旋测微仪12安装在第二支架10’上)。一根橡胶导管5的一端口与注射器9的前端连接，通过一个联轴器11(市场上购买的)连接注射器9的推杆和螺旋测微仪12的顶杆，使之固定在一起。

本实施例中的调节部件6也可以采用双向泵，橡胶导管5装在双向泵的管路接头上。

参考图1和图2，采用图3制作的压力调节部件6，制作一个本发明的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置。

穿刺微针本体1为一根内径500μm的钛合金中空管，长度40mm，通过激光焊接工艺连接至过渡接头2，由于被焊接对象内外径存在间隙，因此，激光焊接时必须添加焊料。另外变幅杆3与带有微针的过渡接头2通过螺纹相连。

过渡接头2的材料为钛合金，前端内径为1mm。

超声换能器4采用夹心式设计；其中第一压电陶瓷圆环7和第二压电陶瓷圆环7’选用的材料为PZT-8，外径15mm，内径8mm，厚度2mm，共2片。电极13采用青铜材料，厚度0.2mm，共3片。超声换能器4中的第一金属圆柱401和第二金属圆柱402，由不锈钢圆柱制成，在第一金属圆柱401的一端车出内螺纹，在第二金属圆柱402的一端加工出螺钉15，其中螺钉15的螺杆上可以留一段不车出螺纹，也可以全部车出螺纹；第二金属圆柱402通过螺钉15与第一金属圆柱401的内螺纹螺合固定在一起；第一压电陶瓷圆环7和第二压电陶瓷圆环7’，与3片电极13相间粘接在一起，并且套在第一金属圆柱401和第二金属圆柱402之间的螺钉15上，在拧紧第一金属圆柱401和第二金属圆柱402时，通过螺钉15连接成一体，并对第一压电陶瓷圆环7和第二压电陶瓷圆环7’施加预应力，即完成超声换能器4的制作。第一金属圆柱402的前端通过过渡接头2与变幅杆相连，该变幅杆装置3可实现能量传递和放大。

所述的超声换能器4另一端设置一凸台14，通过一根所述的橡胶导管5与所述的压力调节部件6连接；所述的电极13分别引线与功率正弦信号发生器8相连；变幅杆装置3与带有微针的过渡接头2通过螺纹相连后，即完成一个微型超声吸引器，参考图1和图2。

实施例2

参考图1和图2，在实施例1的基础上，穿刺微针本体1的材料改用不锈钢，其内径50μm，长度20mm。过渡接头2的材料为钛合金，内径为0.8mm，两者通过钎焊工艺连接，使用银粉和助焊剂的混合物作为焊料。超声换能器4中第一压电陶瓷圆环7和第二压电陶瓷圆环7’选用材料为PZT-8，外径10mm，内径5mm，厚度2mm，共4片。电极13采用青铜材料，厚度0.2mm，共3片。压力调节部件6可选用标准的手动注射器(市场上可购买的)来代替。

实施例3

参考图1和图2，在实施例1的基础上，穿刺微针本体1的材料改用玻璃，使用拉制器制成尖端内径2μm，长度40mm。过渡接头2，其材料为钛合金，内径为0.5mm，两者通过环氧树脂胶粘接，高温4小时凝胶后可使用。超声换能器4中第一压电陶瓷圆环7和第二压电陶瓷圆环7’的材料为PZT-8，外径6mm，内径3mm，厚度1mm，共2片；电极13采用青铜材料，厚度0.1mm，共3片。由于本实施例面向的目标是单个小细胞，注射和吸引压力需要微调，因此压力调节部件6选用以注射器为主体的微推进器。本发明中使用的压力调节装置结构如图3所示，一个5mL容量的注射器9和一个螺旋测微仪12分别被固定在支架10和10’上，注射器9的针头部分与橡胶导管5相连，用于为微型超声吸引器提供正负压力，螺旋测微仪12的前端与注射器9的推进器部分，通过一个市场上购买的联轴器11相连，当转动螺旋测微仪12的手柄时，注射器内的活塞可以按照微米精度前进或后退，改变导管5中的压力。

Claims (9)

1.一种实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，包括穿刺微针本体(1)、过渡接头(2)和变幅杆(3)；其特征在于，还包括超声换能器(4)、橡胶导管(5)、压力调节部件(6)和正弦信号发生器(8)；所述的穿刺微针本体(1)为一根中空管，该穿刺微针本体(1)的末端通过所述的过渡接头(2)与所述的变幅杆(3)固定；所述的超声换能器(4)由第一金属圆柱(401)和第二金属圆柱(402)，2个或4个压电陶瓷圆环和3片电极(13)组成；所述的第一金属圆柱(401)一端中心开有螺孔，另一端面上设置一凸台(14)；所述的第二金属圆柱(402)一端加工出螺钉(15)，另一端与所述的变幅杆(3)的另一端固定；所述的压电陶瓷圆环与所述的3片电极相间排列，并加装在金属圆柱(401)和(402)之间的螺钉(15)上，通过螺钉(15)连接第一金属圆柱与第二金属圆柱，并对压电陶瓷圆环施加预应力；所述的橡胶导管(5)一端套在所述的凸台(14)上，该橡胶导管(5)的另一端与所述的压力调节部件(6)连接；所述的功率正弦信号发生器(8)与所述的电极片(13)电连接；所述的超声换能器(4)一端相连的变幅杆(3)，实现能量传递和放大。

2.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的压力调节部件(6)为双向泵，橡胶导管(5)装在双向泵(6)的管路接头上。

3.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的压力调节部件(6)为一由注射器(9)和螺旋测微仪(12)组成；包括第一支架(10)、第二支架(10’)、联轴器(11)、注射器(9)和螺旋测微仪(12)；其中所述的联轴器(11)连接注射器(9)的推杆和螺旋测微仪(12)的顶杆；所述的第一支架(10)与第二支架(10’)同轴安装在一块平台上，分别支撑所述的注射器(9)和螺旋测微仪(12)。

4.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的穿刺微针本体(1)的针尖采用微针拉制器拉制的内径为1～50μm玻璃针尖，或制成内孔径为50～500μm的金属针尖。

5.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的压电陶瓷圆环为PZT-8材料制作，该压电陶瓷的两端被加载正弦变化的交流电压，幅值在1～100V之间，压电陶瓷将产生纵向振动。

6.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的电极(13)为青铜材料的制成的，其厚度0.05～0.3mm。

7.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的变幅杆(3)采用阶梯形和圆锥形设计，尺寸大小由四端网络法或有限元仿真设计法确定。

8.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的穿刺微针本体(1)与过渡接头(2)固定的方式可采用激光焊接，氩弧焊，粘接或钎焊。

9.按权利要求1所述的实现对单细胞或小组织内部的注射和吸引的超声装置，所述的压电陶瓷圆环与3片所述的电极相间粘结在一起，再套在所述的螺钉(15)上。

Images