CN101543210A

CN101543210A - 批量冻存动物细胞的装置及方法

Info

Publication number: CN101543210A
Application number: CN200910061909A
Authority: CN
Inventors: 高其双; 温文生; 陶弼菲; 向敏; 漆世华; 尹建文; 汪云; 舒银辉
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: Wuhan Chopper Biology Co., Ltd.
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2009-09-30

Abstract

本发明涉及批量冻存细胞的装置及方法，本发明的装置由细胞冻存袋、细胞冻存盒、细胞架组成，细胞冻存袋置于细胞架上，细胞架置于细胞冻存盒内。批量冻存细胞的方法：将细胞悬液装入细胞冻存袋中置于细胞架上，再将细胞架放入细胞冻存盒内，将细胞冻存盒投入液氮罐或－70℃以下冷冻设备冷冻24小时，将细胞冻存袋取出投入液氮中或－70℃以下冷冻设备长期冻存，当需解冻细胞时，拉出细胞冻存袋放入38℃－39℃的温水中解冻，当凝固物都融化为液体后，移入无菌操作台，按无菌操作程序操作将细胞冻存袋中的细胞悬液分装入离心管中离心，弃上清液，按常规解冻细胞来操作。本发明的细胞冻存袋冻存细胞体积达50－200ml，整套装置直接投入液氮中或放入－70℃以下冷冻设备。

Description

批量冻存动物细胞的装置及方法

技术领域

本发明属于生物技术与生物制品领域，具体涉及一种在一个冻存单位中可大批量一步法冻存细胞的装置及方法。

背景技术

超低温冻存是动物细胞培养与应用过程中必须经历的技术环节，广泛应用于生物技术研究及生物制品生产行业。目前，人们对动物细胞及其培养物的超低温冻存主要采取如下方法：将细胞用专用试剂(如胰蛋白酶、EDTA等)消化分散，离心收集，再用专用的冷冻保护液稀释到一定密度，或直接用专用的冷冻保护液将消化好的细胞分散，分装入专用冻存管中，采取规定的程序将冻存管逐级移入不同低温梯度的环境中(或使用程序冷冻仪)，最终使冻存管所处环境的温度至少达到-70℃以下，通常冻存管最终会投入液氮中长期保存。这种冷冻保存技术有两个明显的缺陷：1、对于需要大批量培养细胞的生物制品企业来说，每1个冻存单位(1支冻存管)容积只有1-5ml，所能冻存的细胞的量极其有限，每一支冻存管的细胞解冻后往往只够1个50-100ml的克氏瓶正常培养所需细胞量，而几乎所有的大型生物制品企业都用1万ml以上的转瓶培养细胞，有些甚至用生物反应器培养细胞，其单次接种1个培养单位所需细胞的量可能相当于几十到几百个100ml克氏瓶培养的细胞量，因此，从一支冻存管的细胞扩繁至接种1个转瓶所需细胞量，通常至少需要15天的时间，至于扩繁到接种1个生物反应器所需细胞量，则需要时间更长，这么长的等待时间对企业来说是极大的浪费；另外，当企业遭遇到大面积污染，或者偶然间获得了某个新产品生产权，而要想在瞬间将工厂的产能发挥到极致，靠冻存管的细胞扩繁是无法达到目的的。因此改进现有的细胞冻存工具，大幅度增加单个冻存单位的细胞冻存量，将能使生物制品企业提高效益、节约资源、减少损失、抢抓机遇。2、细胞的冻存过程往往需要较复杂的程序，需要在不同温度下各放置一段时间，这对操作人员极不方便，往往造成在某一中间温度下放置时间过长而使一批冻存细胞报废。因此，尽量使细胞一步进入超低温环境中保存，将会极大的方便操作人员的工作。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术存在的问题及缺点，提供批量冻存细胞的装置及方法，本发明其单个冻存单位也就是细胞冻存袋冻存细胞体积可以达到50-200ml，是冻存管的30-150倍；整套装置在冻存细胞时可直接投入液氮中或放入-70℃以下的冷冻设备中，无需放置于不同温度下或使用程序冷冻仪降温。

批量冻存细胞的装置，由细胞冻存袋、细胞冻存盒、细胞架组成，细胞冻存袋放置在细胞架上，细胞架放置在细胞冻存盒内，其特征在于：所述的细胞冻存袋为方形PVC材质的塑料袋，细胞冻存袋有四种规格：5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm，容纳细胞悬液的量分别为50ml、100ml、150ml、200ml，每个细胞冻存袋的一边都连接有一内径为0.5cm、长10-50cm的细管，为细胞悬液进出冻存袋的通道，与该细管同一压边上留有一孔径为0.5cm的系绳孔，有一细绳从该孔中穿出，拴系细胞冻存袋，细胞冻存袋由专业厂家生产，生产后做过无菌处理和密封包装；所述的细胞冻存盒为立方形聚碳酸酯材质的塑料盒，盒壁厚度为2-3mm，其六个面中的五个面为无缝连接，剩下朝上的面是冻存盒的开口，开口上装有盒盖，其四边下侧边沿垫有密封条，盒盖的一边与盒体的一边用活页连接，其对边装有卡扣，其作用是当盒盖关上时保证整个冻存盒密封，以防液氮或冷冻器具中的冷空气直接进入冷冻盒内，盒盖上有一个吊耳，吊耳上系有系绳，用以将细胞冻存盒吊于液氮罐或其他冷冻容器中；所述的细胞架为立方形钢架，由不锈钢钢丝焊接而成，钢架垂直面的四边由四根直径为4-6mm的不锈钢丝构成主柱，钢架水平面是直径为2-3mm的不锈钢丝焊接而成的多层方形架，每个方形架的四个顶点分别与四根主柱焊接构成整体，每个方形架的上表面都铺盖一层0.25mm的不锈钢薄板，是放置细胞冻存袋的地方；各层方形架间的距离为3-5cm。细胞冻存盒的横截面大小规格7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm、13cm*13cm，与之配套的细胞架横截面规格分别为5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm，分别适用于放置50ml、100ml、150ml、200ml的细胞冻存袋，细胞冻存盒的长度可以从6cm到60cm取值，与之配套的细胞架的方形架层数可以从1到19层间取值，在实际应用中具体选用何种规格应根据当时需要冻存的细胞量以及冻存容器的结构而定，总的原则是细胞冻存盒整体方便进出冻存容器，每个冻存袋所装细胞量能满足解冻后接种一个培养单元(通常是一个转瓶)所需细胞的量。

批量冻存细胞的方法，按以下步骤进行：(1)、将转瓶中大批量培养的细胞用胰蛋白酶消化后，用培养基吹打分散细胞或直接用冷冻保护液吹打分散细胞，将分散后的细胞液分装入离心管中离心，弃上清液；(2)、用冷冻保护液重悬细胞，并调整细胞密度至1*10⁶-1*10⁷个/ml；(3)、将细胞袋上的细管剪开，将细胞悬液从开口分装入细胞冻存袋中，封住细管口，从细胞冻存袋的系绳孔上系上吊绳，绳的另一端系上标签卡，卡上记录细胞的有关资料；(4)、然后将所有装细胞悬液的细胞冻存袋放在细胞架的方形架上，每个方形架上只能放置一个细胞冻存袋，打开细胞冻存盒的盒盖，把装有细胞冻存袋的细胞架从细胞冻存盒的开口放入细胞冻存盒内，盖上盒盖，扣紧卡扣，在细胞冻存盒的系绳的末端系上标签卡，卡记录冻存细胞的有关资料；(5)、将整个细胞冻存盒直接投入液氮罐或-70℃以下冷冻设备中冷冻，24小时后，将细胞冻存袋从细胞冻存盒中取出装入另外的容器后(或直接)投入液氮中或-70℃以下的冷冻设备中长期冻存，并将细胞冻存袋的吊绳的另一端拉出液氮罐(或其他冷冻设备)口外；(6)、当需要解冻细胞时，通过吊绳上的标签找到所需细胞，并拉出细胞冻存袋后，立即放入38℃-39℃的温水中，温水必须能浸没细胞冻存袋，摆动细胞冻存袋以加快解冻速度，并随时注意水温的变化，当水温下降到36℃以下时应补加热水使水温上升到38℃-39℃，当细胞冻存袋中所有凝固物都融化为液体后，把细胞冻存袋移入无菌操作台，按无菌操作程序对整个细胞袋消毒，剪开细胞冻存袋的细管，将细胞冻存袋中的细胞悬液分装入离心管中，离心，弃上清液，以后的操作与常规解冻细胞后的操作一致。

本发明的设计原理：细胞的冷冻过程需要逐步降温，为此人们采取将细胞悬浮于冷冻保护液之后，放置在不同温度下分段降温，或者用程序冷冻仪按程序降温。本发明将细胞悬浮于冷冻保护液后，直接放入密封的冷冻盒中，由于装细胞的容器不直接与超低温环境接触，冷冻盒中存留的空气起到了缓冲降温的作用，使其按一定的程序自动降温，保证了细胞的存活。

本发明的有益效果：1、本发明的装置，其单个冻存单位也就是细胞冻存袋冻存细胞悬液的体积可以达到50-200ml，是冻存管的30-150倍；2、整套装置在冻存细胞时可直接投入液氮中或放入-70℃以下的冷冻设备中，无需放置于不同温度下或使用程序冷冻仪降温。

附图说明

图1为本发明的装置结构示意图。

图2为本发明的细胞冻存袋结构示意图。

图3为本发明的细胞架结构示意图。

图4为本发明的细胞冻存盒结构示意图。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的描述。

如图1、图2、图3、图4所示，本发明的装置由细胞冻存袋1、细胞冻存盒2、细胞架9组成，细胞冻存袋1放置在细胞架9上，细胞架9放置在细胞冻存盒2内，所述的细胞冻存袋为方形PVC材质的塑料袋，细胞冻存袋有四种规格：5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm，容纳细胞悬液的量分别为50ml、100ml、150ml、200ml，每个细胞冻存袋的一边都连接有一内径为0.5cm、长30cm的细管13，为细胞悬液进出冻存袋的通道，与该细管同一压边上留有一孔径为0.5cm的系绳孔14，以便使用中将细胞冻存袋投入液氮中时，系上细胞袋吊绳15，细胞冻存袋由专业无菌医用器材生产厂家生产，生产后做过无菌处理和密封包装；所述的细胞冻存盒2为立方形聚碳酸酯材质的塑料盒，盒壁厚度为3mm，其六个面中的五个面为无缝连接，剩下朝上的面是冻存盒的开口，开口上装有盒盖3，其四边下侧边沿垫有密封条4，盒盖3的一边与盒体的一边用活页5连接，其对边装有卡扣6，其作用是当盒盖关上时保证整个冻存盒密封，以防液氮或冷冻器具中的冷空气直接进入冷冻盒内，盒盖3上有一个吊耳7，吊耳7上系上系绳8，用以将细胞冻存盒吊于液氮罐或其他冷冻容器中；所述的细胞架9为立方形钢架，由不锈钢钢丝焊接而成，钢架垂直面的四边由四根直径为4mm的不锈钢丝构成主柱10，钢架水平面是直径为2mm的不锈钢丝焊接而成的多层方形架11，每个方形架11的四个顶点分别与四根主柱10焊接构成整体，每个方形架11的上表面都铺盖一层0.25mm的不锈钢薄板12，是放置细胞冻存袋1的地方；各层方形架11间的距离为约3cm。细胞冻存盒2的横截面大小规格7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm、13cm*13cm，与之配套的细胞架横截面规格分别为5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm，分别适用于放置50ml、100ml、150ml、200ml的细胞冻存袋，细胞冻存盒的长度可以从6cm到60cm取值，与之配套的细胞架的方形架层数可以从1到19层间取值，在实际应用中具体选用何种规格应根据当时需要冻存的细胞量以及冻存容器的结构而定，总的原则是细胞冻存盒整体方便进出冻存容器，每个冻存袋所装细胞量能满足解冻后接种一个培养单元(通常是一个转瓶)所需细胞的量。

批量冻存细胞的方法，按以下步骤进行：(1)、将转瓶中大批量培养的细胞用胰蛋白酶消化后，用培养基吹打分散细胞或直接用冷冻保护液吹打分散细胞，将分散后的细胞液分装入离心管中离心，弃上清液；(2)、用冷冻保护液重悬细胞，并调整细胞密度至1*10⁶-1*10⁷个/ml；(3)、将细胞袋上的细管剪开，将细胞悬液从开口分装入细胞冻存袋中，封住细管口，从细胞冻存袋的系绳孔上系上吊绳，绳的另一端系上标签卡，卡上记录细胞的有关资料；(4)、然后将所有装细胞的细胞冻存袋放在细胞架的方形架上，每个方形架上只能放置一个细胞冻存袋，打开细胞冻存盒的盒盖，把装有细胞冻存袋的细胞架从细胞冻存盒的开口放入细胞冻存盒内，盖上盒盖，扣紧卡扣，在细胞冻存盒的系绳的末端系上标签卡，卡记录冻存细胞的有关资料；(5)、将整个细胞冻存盒直接投入液氮罐或-70℃以下冷冻设备中冷冻，24小时后，将细胞冻存袋从细胞冻存盒中取出装入另外的容器后或直接投入液氮中或-70℃以下冷冻设备中长期冻存，并将细胞冻存袋的吊绳的另一端拉出液氮罐(或-70℃以下冷冻设备)口外；(6)、当需要解冻细胞时，通过吊绳上的标签找到所需细胞，并拉出细胞冻存袋后立即放入38℃-39℃的温水中，温水必须能浸没细胞冻存袋，摆动细胞冻存袋以加快解冻速度，并随时注意水温的变化，当水温下降到36℃以下时应补加热水使水温上升到38℃-39℃，当细胞冻存袋中所有凝固物都融化为液体后，把细胞冻存袋移入无菌操作台，按无菌操作程序对整个细胞袋消毒，剪开细胞冻存袋的细管，将细胞冻存袋中的细胞悬液分装入离心管中，离心，弃上清液，以后的操作与常规解冻细胞后的操作一致。

Claims

1、批量冻存细胞的装置，由细胞冻存袋、细胞冻存盒、细胞架组成，细胞冻存袋放置在细胞架上，细胞架放置在细胞冻存盒内，其特征在于：所述的细胞冻存袋为方形PVC材质的塑料袋，每个细胞冻存袋的一边都连接有一内径为0.5cm、长10-50cm的细管，与该细管同一压边上留有一孔径为0.5cm的系绳孔，并系上细胞袋吊绳；所述的细胞冻存盒为立方形聚碳酸酯材质的塑料盒，盒壁厚度为2-3mm，其六个面中的五个面为无缝连接，剩下朝上的面是冻存盒的开口，开口上装有盒盖，其四边下侧边沿垫有密封条，盒盖的一边与盒体的一边用活页连接，其对边装有卡扣，盒盖上有一个吊耳，用以系上吊绳；所述的细胞架为立方形钢架，钢架垂直面的四边由四根直径为4-6mm的不锈钢丝构成主柱，钢架水平面是直径为2-3mm的不锈钢丝焊接而成的多层方形架，每个方形架的四个顶点分别与四根主柱焊接构成整体，每个方形架的上表面都铺盖一层0.25mm的不锈钢薄板；各层方形架间的距离为3-5cm。

2、根据权利要求1所述的批量冻存细胞的装置，其特征在于：所述细胞冻存袋的规格有5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm或11cm*11cm，对应的细胞架横截面规格分别为5cm*5cm、7cm*7cm、9cm*9cm或11cm*11cm，对应的细胞冻存盒的横截面大小规格7cm*7cm、9cm*9cm、11cm*11cm、或13cm*13cm。

3、根据权利要求1所述的批量冻存细胞的装置，其特征在于：细胞架的方形架层数为1-19，对应的细胞冻存盒的长度在6cm-60cm。

4、批量冻存细胞的方法，按以下步骤进行：(1)、将转瓶中大批量培养的细胞用胰蛋白酶消化后，用培养基吹打分散细胞或直接用冷冻保护液吹打分散细胞，将分散后的细胞液分装入离心管中离心，弃上清液；(2)、用冷冻保护液重悬细胞，并调整细胞密度至1*10⁶-1*10⁷个/ml；(3)、将细胞袋上的细管剪开，将细胞悬液从开口分装入细胞冻存袋中，封住细管口，从细胞冻存袋的系绳孔上系上吊绳，绳的另一端系上标签卡，卡上记录细胞的有关资料；(4)、然后将所有装细胞的细胞冻存袋放在细胞架的方形架上，每个方形架上只能放置一个细胞冻存袋，打开细胞冻存盒的盒盖，把装有细胞冻存袋的细胞架从细胞冻存盒的开口放入细胞冻存盒内，盖上盒盖，扣紧卡扣，在细胞冻存盒的吊绳的末端系上标签卡，卡记录冻存细胞的有关资料；(5)、将整个细胞冻存盒直接投入液氮罐或-70℃以下冷冻设备中冷冻，24小时后，将细胞冻存袋从细胞冻存盒中取出装入另外的容器后(或直接)投入液氮中或-70℃以下冷冻设备中长期冻存，并将细胞冻存袋的吊绳的另一端拉出冷冻器口外；(6)、当需要解冻细胞时，通过吊绳上的标签找到所需细胞，拉出细胞冻存袋后，立即放入38℃-39℃的温水中，温水必须能浸没细胞冻存袋，摆动细胞冻存袋以加快解冻速度，并随时注意水温的变化，当水温下降到36℃以下时应补加热水使水温上升到38℃-39℃，当细胞冻存袋中所有凝固物都融化为液体后，把细胞冻存袋移入无菌操作台，按无菌操作程序对整个细胞袋消毒，剪开细胞冻存袋的细管，将细胞冻存袋中的细胞悬液分装入离心管中离心，弃上清液，以后的操作与常规解冻细胞后的操作一致。