CN101463340A - 消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，属于生物医学技术领域。两步降温是指首先在冷氮气中降温然后再转移至液氮。通过两步降温技术，可以适度地减小样品的降温速率，则可以减弱样品内的热应力，进而有望消除低温断裂；同时仍能保证样品的玻璃化。在执行两步降温时，应遵循以下操作：在降温的第一步，将样品置于氮气中－196～－135℃的温度范围内，在－80～4℃温度范围的降温速率应为10～30℃/min，以保证冻存样品在降温过程中实现玻璃化；当温度降到－196～－100℃范围内，即可将冻存对象浸入液氮，降温速率应为0～165℃/min，以避免溶液主体部分的断裂。实现两步降温的设备简单，主要包括杜瓦瓶或类似设备以及温度测量装置。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的方法。
背景技术
玻璃化法是生物体超低温保存的方法之一，这种方法由于能够避免冰晶对细胞或组织的机械损伤，近年来越来越受到重视。然而，玻璃化法也有着一定的劣势，除了高浓度的冷冻保护剂带来的毒性损伤和渗透损伤外，由于某些原因引起的热应力以及当热应力达到某种程度而导致的低温断裂现象，对成功实现细胞和组织的低温保存构成了极大的障碍。热应力及低温断裂对细胞和组织的损伤体现在以下几方面。首先，热应力和断裂会直接损伤细胞。有文献报道，热应力导致的弹性变形和塑性变形会对细胞膜和组织造成严重的机械损伤(Rubinsky B et al，Cryobiology，1980，17：66-73)。另外，还会通过促使反玻璃化的发生或加重，进而引起细胞损伤。对同样的复温过程，在降温过程出现了低温断裂的溶液比没有低温断裂的溶液更容易反玻璃化(Steif PS et al，CellPreserv Technol，2005，3(3)：184-200)。对大型的组织或器官来说，组织内会产生宏观的、或者微观的相对位移，严重的断裂会使组织变成碎片，使得组织失去原有的功能。
玻璃化法保存中，引起热应力的因素主要有以下两个方面。一是组织和玻璃化溶液的盛载容器[2]。一般地说，组织和玻璃化溶液的盛载容器所用材料的热膨胀系数小于玻璃化溶液的热膨胀系数，因此，在温度变化时，容器和玻璃化态固体的热应变不同，因而会产生机械应力。除了容器的影响，较高的温度变化速率也是热应力和断裂的产生的重要因素。对于常用的将冻存管直接投入液氮的方式，会由于降温速率过快使得冻存体系内温度梯度较大，进而导致样品内体积变化不均匀，产生热应力。热应力超过组织承受的极限就会引发断裂现象。在其他条件相同的情况下，温度变化的速率越快，样品内的热应力越大，样品就越容易断裂(Landa V，Folia Biol，1982，28：350-358；Lehn-Jensen H et al，Theriogenology，1983，19：263-277；Rall WF et al，Theriogenology，1989，31：683-692)。
目前，关于如何消除组织玻璃化法保存中的低温断裂的报道很少。Song等采用以下方法，即-100℃以上的温度范围采用较快速率，而在-100℃以下的温度范围采用较慢速率，以避免玻璃体断裂(Song YC et al，Nature Biotech，2000，18：296-299)。具体地，首先以43±2℃/min快速降温至-100℃，以避免降温过程产生冰晶，然后以3±0.2℃/min慢速降温到-135℃以避免断裂，之后转移到-135℃的低温冰箱里储存；在复苏时，首先以30±2℃/min慢速复温至-100℃以避免断裂，然后以225±15℃/min快速复温直至融化以避免反玻璃化和重结晶。还有学者建议，可在玻璃化转变温度和低温断裂温度之间保存组织。然而，以上方法只能在高于液氮温度下储存组织，而不能继续降温至液氮温度同时避免断裂。而在高于液氮温度下储存组织，就存在使用何种廉价的介质和设备以实现长期储存的问题。
发明内容
本发明的目的是提供消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，解决传统的冷冻方法即一步法导致的低温断裂问题；还可以解决现有的断裂消除方法中只能在高于液氮温度下储存组织，而不能继续降温至液氮温度同时避免断裂的问题。
本发明的技术方案包括以下步骤：
步骤1，组织准备：获取组织后，将其浸没于玻璃化溶液中，使保护剂充分渗透到组织内。然后，将组织放进冻存管底部，加入玻璃化溶液完全浸没组织，在组织上方保持3～100mm的液层高度，在冻存管顶部保持1～100mm的空气腔。
步骤2，装置准备：向液氮容器内内倾倒液氮，盖上保温盖，稳定5～20min。确定氮气场中温度介于-196～-135℃所对应的位置，即第一步降温中样品允许放置的位置，以确定支撑板的厚度范围。然后放入支撑板，稳定5～20min。支撑板可以采用能飘浮在液氮上的材料，也可以采用支架。
步骤3，降温操作：第一步：将盛有玻璃化溶液和生物组织的冻存管通过保温盖上的小孔竖直地放在支撑板上，同时监测样品的温度变化。第二步：待样品的温度降至-196～-100℃范围内，将支撑板翻转，使样品浸入液氮。将支撑板翻转的方法，可以采用手动，也可以通过自动控制程序和设备来实现。
本发明的效果和优点是：通过两步降温方法，可以减小样品的降温速率进而削弱样品内的热应力集聚现象，避免组织断裂，从而实现生物组织在液氮温度下的高效的玻璃化法保存；解决了传统的冷冻方法即一步法导致的低温断裂问题；还解决了现有的断裂消除方法中只能在高于液氮温度下储存组织，而不能继续降温至液氮温度同时避免断裂的问题。两步降温技术简单、设备易操作，适合大规模推广使用。
附图说明
图1是两步降温方法的流程图。
图2是两步降温装置的结构示意图。
图中：1 保温盖；2 杜瓦瓶；3 牵引绳；4 支撑板；5 热电偶；6 冻存管；7 玻璃化溶液；8 液氮；9 数据采集器；10 电脑。
图3是玻璃化溶液的断裂现象图。
图中：A 冷冻前；B 一步降温法；C 两步降温法。
图4是两步降温过程中样品的温度随时间变化曲线。
图中：A 样品的气相距离为17.5mm、27.5mm、37.5mm和47.5mm；
B 样品的气相距离为57.5mm。
图5是两步降温过程的不同温度位置对应的降温速率曲线。
图中：一步冷冻的降温速率曲线作为两步降温速率结果的对照。
图6是角膜的断裂情况图。
图中：A 新鲜角膜；B 一步降温；C 两步降温；bar：100μm。
图7是两步降温冷冻及复苏后的角膜的断面图。
图中：A、C和E新鲜角膜作为对照；B、D和F实验组；A和B全厚度的角膜，40倍；C和D角膜上皮侧，200倍；E和F角膜内皮侧，200倍；bar：100μm。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1：
本实施例为考察纯玻璃化溶液在两步降温和水浴复苏过程的断裂情况。
两步降温的流程和装置分别如图1和图2所示。图2中，杜瓦瓶的高200mm，内径105mm。冻存管的规格为2ml。玻璃化溶液的体积为1ml。
向杜瓦瓶内倾倒高度为40mm左右的液氮，对于此高度的液氮气相中-196～-135℃温度范围对应的样品位置(又称为气相距离，即样品的中心与液氮的距离。下同。)为0～47.5mm，而冻存管内玻璃化溶液的中心与管底的距离为7.5mm，因此支撑板的厚度应为0～40mm。本实验中使用的支撑板厚度为10mm。放入支撑板，盖上保温盖，稳定10min。然后，将盛有玻璃化溶液的冻存管通过保温盖上的小孔竖直地放在支撑板上。监测样品的温度，待温度降至-100℃以下，使支撑板翻转，冻存管浸入液氮。5min后，将冻存管快速取出，立即观察其断裂情况。然后迅速转移至37℃水浴，观察样品在复苏过程的断裂情况。同时也对样品实施一步法降温和复苏，观察其断裂情况用作对照。
所使用的玻璃化溶液为CPTES-乙二醇-葡萄糖-硫酸软骨素。其中，乙二醇、葡萄糖和硫酸软骨素的质量百分比浓度分别为52％、8％和3％。CPTES由实验室自行配制，乙二醇和葡萄糖系国产分析纯药品，硫酸软骨素购自Sigma。
实验结果如图3所示。一步降温过程中，溶液的主体发生严重的断裂；在两步降温的冷冻过程中没有发生断裂，断裂发生在复苏过程的初始阶段，且仅在溶液表面0～3mm范围内。
此实施例说明，使用两步降温方法，仅仅在玻璃化溶液的表面有断裂发生，而溶液的主体部分没有断裂。
实施例2：
本实施例为两步降温操作参数的确定。
为了确定两步降温过程的操作参数，首先考察了液氮深度为40mm及气相距离值分别为17.5mm、27.5mm、37.5mm、47.5mm和57.5mm的断裂现象，方法同实施例1；然后测量以上情况下玻璃化溶液的温度变化，进行数据处理获得降温速率的变化情况；将实验现象结果和降温速率测量结果联合，最终可确定消除溶液的主体断裂所允许的操作参数的范围。
本实验中，所用溶液的体积为1.0ml，因此溶液深度为15mm。因此，当支撑板厚度为10mm时，冻存体系的气相距离为17.5mm。依此类推可获得其他的支撑板厚度20mm、30mm、40mm和50mm对应的冻存体系的气相距离分别为27.5mm、37.5mm、47.5mm和57.5mm。
温度测量的步骤如下：向杜瓦瓶内倾倒深度为40mm的液氮，放入支撑板，盖上保温盖，稳定10min。将热电偶插入冻存管内溶液的中央，在冻存管外部用胶带固定热电偶。打开软件，开始监测并采集温度。把冻存管通过保温盖上的小孔竖直放到支撑板上；待电脑屏幕上显示的温度趋于稳定后，通过牵引绳将支撑板翻转，使冻存管浸入液氮中；待温度再次趋于稳定后，停止监测温度。
对两步降温中的每一步的数据分别进行多项式拟合，并对拟合出的表达式求导，可以得到不同的时间对应的降温速率，进而得到不同操作温度对应的降温速率。一步降温即把冻存管直接投入液氮过程的降温速率也由同样的方法获得。
实验结果如下：
(1)实验观察的结果
尽管断裂的发生具有随机性，但是对应于本实验所考察的几个冻存体系的气相距离值17.5mm、27.5mm、37.5mm、47.5mm和57.5mm，冻存体系在经历两步降温和水浴复苏的过程中，均只在复苏过程的初始阶段有断裂发生，并且断裂仅仅位于溶液的表面0～3mm范围内，而发生在体系表面的断裂不会危及到浸没在溶液内部的生物组织。
关于两步降温过程能否实现玻璃化，我们首先采用了肉眼观察的方法来进行判断。我们发现，气相距离为17.5mm、27.5mm、37.5mm和47.5mm时，溶液在降温过程均能够实现玻璃化；而对于气相距离为57.5mm这种情况，溶液在降温过程中会出现肉眼可见的白色颗粒，这说明溶液没有实现完全的玻璃化。另外，还应用以下方法作为玻璃化的判据，即如果实际的降温速率大于或等于玻璃化溶液的玻璃化冷冻临界降温速率，那么则能实现玻璃化。应用100倍低温显微镜获得体积为200μl的玻璃化溶液的临界降温速率为10℃/min。而在本实施例中，对于冻存体系的气相距离值17.5mm、27.5mm、37.5mm和47.5mm，在降温到-80～4℃温度范围内，其降温速率处于10～30℃/min内；对于气相距离值为57.5mm的情况，其降温速率处于0～10℃/min内(由图5可知)。而在-80℃之后，由于溶液的粘度已经很大，不会再形成冰晶。根据以上两种方法，可以断定，气相距离为17.5mm、27.5mm、37.5mm和47.5mm时，均能够实现完全的玻璃化。
(2)冻存样品的温度变化
液氮深度为40mm时，对应于冻存体系的几个气相距离值17.5mm、27.5mm、37.5mm、47.5mm和57.5mm，两步降温过程中玻璃化溶液的温度随时间的变化如图4所示。可以看出，在降温的第一阶段，对于冻存体系的气相距离为17.5mm、27.5mm、37.5mm和47.5mm，体系的温度需20min达到稳定；对于冻存体系的气相距离为57.5mm，则需要更长的时间。在第二阶段，体系的温度达到-196℃需1min。
降温过程中不同温度对应的降温速率如图5所示。可以看出，两步法的降温速率比一步法要低。也就是说，与一步降温比较，两步降温步骤能削弱样品中的热应力，使得断裂的避免成为可能。
对于玻璃化法保存的降温过程，应力的产生主要是在深低温度区域[93]。从图5可以看出，对于两步降温的深低温度区域，总体上可以认为冻存体系的气相距离越小，降温速率越低，因而体系内的应力越小，越有利于避免断裂的发生。因此，在液氮深度为40mm时，冻存体系的气相距离0～47.5mm的情况下，均可以消除溶液的主体断裂。综合玻璃化判断的结果，可知在液氮深度为4cm时和冻存体系的气相距离0～47.5mm的情况下，既能够保证溶液实现玻璃化又可以消除溶液的主体断裂。
从图4中可以查出，气相距离47.5mm时，降温达到平衡时的温度为-135℃，即气相距离47.5mm的位置对应的氮气温度为-135℃，因此气相距离为0～47.5mm对应的氮气温度范围为-196～-135℃。另外，由于气相距离为57.5mm这种情况能避免溶液主体的断裂，而其对应的氮气温度为-100℃，因此，降温过程中，可以当温度降到-100℃时即开始第二步操作，对应的第二步降温的起始降温速率为165℃/min。综上，两步降温应遵循以下操作参数：在降温的第一步，将冻存对象置于氮气中-196～-135℃的温度范围内，在-80～4℃温度范围的降温速率应大于10～30℃/min；当其温度降到-196～-100℃温度范围，即可将冻存对象浸入液氮，降温速率的范围为0～165℃/min。
实施例3：
本实施例为考察三种组织在两步降温和水浴复苏后的断裂情况。
以角膜环钻在牛角膜中央钻取Φ8mm的组织块；从猪的肋骨软骨上切取5mm×5mm×8mm的组织块；切取牛的动脉血管，尺寸为5mm×8mm×2mm，其中2mm为血管壁的厚度。将三种组织分别浸泡于玻璃化溶液中，使保护剂的渗透达到平衡。
对组织的断裂现象分别行宏观和微观观察。微观观察，即为在倒置光学显微镜200倍下观察角膜上是否有断裂。与此同时，也对组织进行传统的一步降温及复温处理，并观察断裂情况；未经保护剂平衡和冷冻的组织作为对照。
另外，如果在组织的截面上不能找到裂纹，也可以说明组织没有断裂。对三种组织行福尔马林固定、石蜡包埋、超薄切片和HE染色，然后在光学显微镜下观察。其中，角膜的切片方向为其厚度方向，血管的切片方向为其厚度方向且平行于血流方向，软骨切片则分别取自其表面和断面。未经保护剂平衡和冷冻的组织作为对照组。
结果显示：对于经一步降温和两步降温及复苏后的三种组织，宏观上均没有发现任何断裂。角膜的显微镜的观察结果如图6所示，一步降温及复苏后的角膜上存在着明显的微观裂纹，而在经历两步降温和复苏后的组织上找不到任何裂纹。角膜断面的照片如图7所示。可以看出，经历两步法冷冻的角膜，在复苏后，其断面上没有任何裂纹。另外，在血管和软骨的断面上也找不到任何裂纹。
尽管本发明是以玻璃化溶液CPTES-乙二醇-葡萄糖-硫酸软骨素保存的角膜、血管和软骨组织的断裂的消除为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描述，其他种类的组织和玻璃化溶液、相似的冷冻装置、其他形状的冷冻容器以及实施案例的其他变形，对于木领域技术人员都是可以预料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。
Claims (6)
1、消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，即首先将样品置于冷氮气相中降温然后转移到液氮长期保存；其特征在于：
(1)在降温的第一步，样品所处氮气的温度范围为-196～-135℃；
(2)当样品温度降到-196～-100℃范围内，开始执行第二步，即将样品浸入液氮；
(3)在降温的第一步的-80～4℃温度范围内，样品的降温速率为10～30℃/min；
(4)第二步的降温速率为0～165℃/min。
2、根据权利1所述的消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征还在于在液氮温度即-196℃储存样品。
3、根据权利1所述的消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征还在于玻璃化溶液应完全浸没组织，且在组织上方留有3～100mm的液层高度，在冻存管顶部留有1～100mm高度的空气腔。
4、一种消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征在于：
步骤1，组织准备：获取组织后，将其浸没于玻璃化溶液中，使保护剂充分渗透到组织内；然后，将组织放进冻存管底部，加入玻璃化溶液完全浸没组织，在组织上方保持3～100mm的液层高度，在冻存管顶部保持1～100mm的空气腔；
步骤2，装置准备：向液氮容器内内倾倒液氮，盖上保温盖，稳定5～20min；确定氮气场中温度介于-196～-135℃所对应的位置，即第一步降温中样品允许放置的位置；然后放入支撑板，稳定5～20min；
步骤3，降温操作：
第一步：将盛有玻璃化溶液和生物组织的冻存管通过保温盖上的小孔竖直地放在支撑板上，同时监测样品的温度变化；
第二步：待样品的温度降至-196～-100℃范围内，将支撑板翻转，使样品浸入液氮。
5、根据权利要求1所述的消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征还在于：在步骤2装置准备时，支撑板采用能飘浮在液氮上的材料或采用支架。
6、根据权利要求1所述的消除生物组织玻璃化法保存低温断裂的两步降温方法，其特征还在于：在步骤3降温操作时，将支撑板翻转的方法，采用手动或通过自动控制程序和设备实现。
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