CN101541800A - 用于治疗癌症的作为plk抑制剂的蝶啶衍生物 - Google Patents

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CN101541800A CNA2007800399378A CN200780039937A CN101541800A CN 101541800 A CN101541800 A CN 101541800A CN A2007800399378 A CNA2007800399378 A CN A2007800399378A CN 200780039937 A CN200780039937 A CN 200780039937A CN 101541800 A CN101541800 A CN 101541800A
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D·F·C·莫法特
S·R·佩特尔
S·J·戴维斯
K·W·J·贝克
O·J·菲利普斯
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Abstract

式(I)的化合物是Polo样激酶(PLK)的抑制剂，可用于治疗细胞增殖疾病：其中，R1和R2是氢，或任选取代的(C1－C6)烷基、(C2－C6)烯基、(C2－C6)炔基或(C3－C6)环烷基；R3和R3′独立地选自氢、－CN、羟基、卤素、任选取代的(C1－C6)烷基、(C2－C6)烯基、(C2－C6)炔基或(C3－C6)环烷基、－NR5R6或C1－C4烷氧基，其中R5和R6独立地是氢或任选取代的(C1－C6)烷基；环A是最多具有12个环原子的任选取代的单环或双环碳环或杂环或环系统；T是式R－L1－Y1－的基团，其中R是α氨基酸或α氨基酸酯基序，由连接基团R－L1－Y1－连接至环A，如权利要求所述。

Description

用于治疗癌症的作为PLK抑制剂的蝶啶衍生物
技术领域
本发明涉及一系列氨基酸酯，含有其的组合物，其制备方法及其作为Polo样激酶“PLK”抑制剂的药物用途。Polo样激酶(PLK)是控制增殖细胞进入有丝分裂和调节成功胞质分裂所必需的有丝分裂各方面的关键酶。在四种已知的人PLK中，PLK1表征最完善，在许多肿瘤类型中过度表达，其异常升高常常构成疾病结局差的预后指标。化合物在细胞增殖性疾病如癌症的治疗中是有用的。本发明包括二氢蝶啶衍生物类化合物。
背景技术
PLK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶，其功能和序列类似于果蝇(Drosophila melanogaster)的原型polo激酶而得名，在有丝分裂过程中发挥多种功能(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2001，2，21-32.)。在酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和稷酒酵母(S.pombe))中存在单一的PLK，而迄今为止在哺乳动物中已鉴别出四种不同的PLK。人PLK1(Cell Growth Differ.，1994，5，249-257)、PLK2(血清可诱导的激酶，SNK，Mol.Cell.Biol.，1992，12，4164-4169)、PLK3(增殖相关激酶，PRK J.Biol.Chem.1997，272，28646-28651)和PLK4(Oncol.Rep.，1997，4，505-510)结构上同源，包括两个保守区域，N-末端催化激酶区域，以及由所谓polo盒(polo box)构成的C-末端区域。虽然PLK1、PLK2和PLK3在所有组织中都有表达，PLK4似乎具有独特的生理学作用，成人中PLK4 mRNA的分布限于某些组织如睾丸和胸腺。
PLK1是一类表征最完善的PLK，似乎具有无脊椎动物中存在的单一PLK的绝大多数的已知功能(Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2004，5，429-441)。PLK1蛋白水平以细胞周期依赖性的方式波动，其激酶活性在真核细胞分裂周期的G2期和有丝分裂期之间的过渡时期(G2/M)达到峰值。完成有丝分裂后，PLK1水平因为泛素依赖性蛋白酶解作用而降低。已报道PLK1通过激活细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1/细胞周期蛋白B复合物，即进入有丝分裂的总开关(促有丝分裂因子，MPF Nature，1990，344，503-508)，而参与有丝分裂的启动。
PLK1使双特异性磷酸酶CDC25C磷酸化因而活化，CDC25C又能通过在CDK1pThr14和pTyr15位点脱磷酸化来缓解有丝分裂前MYT1-和WEE1-介导的CDK1/细胞周期蛋白B活性的抑制(Cell，1991，67，197-211)。进入有丝分裂过程后，PLK1和PLK3使CDC25C磷酸化导致其易位入核。除了通过CDK1活化控制进入有丝分裂外，PLK1还具有调节有丝分裂进程的额外作用。其参与两极纺锤体的形成，包括中心体成熟和微管组织中心的调节，在有丝分裂的后续步骤中参与姐妹染色单体的分离及最终的胞质分裂(Dev.Cell，2003，5，127-138)。
发明概述
本发明化合物涉及WO2004076454中公开的化合物。它们是PLK1及其同种型(isoform)的抑制剂。因此，该化合物可用于药物，例如用于治疗多种增殖疾病状态，包括癌症。该化合物的特征在于分子内存在可通过胞内羧酸酯酶水解的氨基酸基序或氨基酸酯基序。具有亲脂性氨基酸酯基序的本发明化合物横跨细胞膜，可以被胞内羧酸酯酶水解成酸。由于极性水解产物不易通过细胞膜，因而在细胞内蓄积。因此，化合物的PLK1活性在细胞内延长且增强。
发明详述
根据本发明，提供了式(I)的化合物，或其盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物：
Figure A20078003993700091
式中，
R1是氢，或任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基；
R2是氢，或任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基；
R3和R3′独立地选自：氢、-CN、羟基、卤素、任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基、-NR5R6或C1-C4烷氧基，其中R5和R6独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
环A是最多具有12个环原子的任选取代的单环或双环碳环或杂环或环系统；
T是式R-L1-Y1-的基团，其中
Y1是键、-O-、-S-、-NR6-、-(C＝O)-、-S(O2)-、-(C＝O)NR6-、-NR6(C＝O)-、-S(O2)NR6-、-NR6S(O2)-或-NR6(C＝O)NR9-，其中R6和R9独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
L1是式-(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-的二价基团，其中
m，n和p独立地是0或1，
Q是(i)具有5-13个环原子的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，或(ii)p为0的情况下，是式-Q1-X2-的二价基团，其中X2是-O-、-S-或NRA-，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基，Q1是具有5-13个环原子的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，
Alk1和Alk2独立地代表任选取代的二价C3-C7环烷基、或任选取代的直链或支链的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基基团，它们可任选地含有醚(-O-)，硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)连接键或以这些基团为末端，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基；
R是式(X)或(Y)的基团
Figure A20078003993700101
其中
R7是羧酸基团(-COOH)，或可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解形成羧酸基团的酯基；
R8是氢；或任选取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基、芳基或杂芳基或-(C＝O)R6、-(C＝O)OR6或-(C＝O)NR6，其中R6是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；和
D是5或6环原子的单环杂环，其中R7连接在与所示环氮原子相邻的环碳原子上，环D任选地与5或6个环原子的第二碳环或杂环稠合，此时与波浪线相交的键可形成所述第二环的环原子。
在本发明的化合物中，如果R1不是氢，则与R1取代基相连的碳原子是不对称的。该不对称中心的立体化学优选是R。
在另一广泛的方面，本发明提供了上述式(I)的化合物、或其N-氧化物、盐、水合物或溶剂合物在制备用于抑制PLK1活性的组合物中的应用。
本发明涉及的化合物可用于抑制PLK1的离体或体内活性。
在本发明的一方面，本发明的化合物可用于制备用于治疗细胞增殖疾病如实体瘤以及血液肿瘤如白血病和淋巴瘤的组合物。
在另一方面，本发明提供了用于治疗上述疾病类型的方法，该方法包括给予患有这些疾病的对象有效量的上述式(I)的化合物。
术语
文中，术语“(Ca-Cb)烷基”，其中a和b是整数，表示含有a-b个碳原子的直链和支链烷基。因此，例如当a是1而b是6时，该术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。
文中，术语“二价(Ca-Cb)亚烷基”，其中a和b是整数，表示含有a-b个碳原子和两个不饱和化学价的饱和烃链。
文中，术语“(Ca-Cb)烯基”，其中a和b是整数，表示含有a-b个碳原子并具有至少一个合适的E或Z立体化学的双键的直链和支链烯基部分。该术语包括，例如，乙烯基、烯丙基、1-和2-丁烯基和2-甲基-2-丙烯基。
文中，术语“二价(Ca-Cb)亚烯基”表示含有a-b个碳原子、至少一个双键和两个不饱和化学价的烃链。
文中，术语“Ca-Cb炔基”，其中a和b是整数，表示含有2-6个碳原子且还含有一个三键的直链和支链烃基。该术语将包括，例如，乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基和5-己炔基。
文中，术语“二价(Ca-Cb)亚炔基”，其中a和b是整数，表示含有2-6个碳原子和至少一个三键的二价烃链。
文中，术语“碳环”指含有最多达16个环原子且所有环原子均为碳原子的单环、二环或三环基团，并包括芳基和环烷基。
文中，术语“环烷基”指含有3-8个碳原子的单环的饱和碳环基团，该术语包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
文中，非限制性术语“芳基”指单环、二环或三环的碳环芳香基团，并包括含有两个通过共价键直接相连的单环碳环芳香环的基团。这种基团的例子有苯基、联苯基和萘基。
文中，非限制性术语“杂芳基”指含有一个或多个选自S、N或O的杂原子的单环、二环或三环芳香基团，并包括含有通过共价键直接相连的两个此类单环或者一个此类单环和一个单环芳基环的基团。这种基团的例子有噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噻唑基、苯并异噻唑基、吡唑基、噁唑基、苯并噁唑基、异噁唑基、苯并异噁唑基、异噻唑基、三唑基、苯并三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基和吲唑基。
文中，非限制性术语“杂环基”或“杂环”包括上面定义的“杂芳基”，其非芳香含义包括含有一个或多个选自S、N或O的杂原子的单环、二环或三环非芳香基团，并包括由含有一个或多个这种杂原子的单环非芳香基团共价连接到另一个此类基团或连接到单环碳环基团构成的基团。这种基团的例子有吡咯基、呋喃基、噻吩基、哌啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、嘧啶基、吗啉基、哌嗪基、吲哚基、吗啉基、苯并呋喃基、吡喃基、异噁唑基、苯并咪唑基、亚甲二氧基苯基、亚乙二氧基苯基、马来酰亚胺基(maleimido)和琥珀酰亚胺基。
“二价亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡嗪基、亚哌啶基、亚哌嗪基、亚吡咯烷基(pyrrolidenylene)、亚吡咯基、环亚丙基(cyclopropylene)、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基或3-氮杂-双环[3.1.0]亚己基基团”是具有两个不饱和价键的苯、吡啶、嘧啶、吡嗪、哌啶、哌嗪、吡咯烷(pyrrolidene)、吡咯、环丙基、环丁基、环戊基、环己基或3-氮杂-双环[3.1.0]己基环，包括1，3-亚苯基、1，4-亚苯基和如下：
Figure A20078003993700121
除非在文中出现时另外说明，如用于本文中任何基团，术语“取代的”意味着被最多4个相容的取代基取代，每个单独可以是例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、苯基、卤代(包括氟、溴和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、-COOH、-COORA、-CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、-SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、-NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、-NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB、或-NRACONRARB，其中RA和RB独立地是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、苯基或具有5或6个环原子的单环杂芳基，或者RA和RB连接到相同氮原子时形成环状氨基(例如吗啉代，哌啶基，哌嗪基或四氢吡咯基)。“任选的取代基”可以是上述取代基之一。
文中，术语“盐”包括碱加成盐、酸加成盐和季盐(quaternary salt)。酸性的本发明的化合物可与碱、有机碱形成盐，包括药学上可接受的盐，所述碱例如碱金属的氢氧化物如氢氧化钠和氢氧化钾；碱土金属的氢氧化物如氢氧化钙、氢氧化钡和氢氧化镁；所述有机碱例如N-甲基-D-葡糖胺、胆碱三(羟甲基)氨基-甲烷、L-精氨酸、L-赖氨酸、N-乙基哌啶、二苄基胺等。那些碱性的化合物(I)可与无机酸和有机酸形成盐，包括药学上可接受的盐，所述无机酸例如氢卤酸如盐酸或氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等，所述有机酸例如乙酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、水杨酸、柠檬酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸、苯磺酸、谷氨酸、乳酸和扁桃酸等。
由于存在不对称碳原子，含有一个或多个实际的或潜在的手性中心的本发明的化合物可作为许多在各手性中心上具有R或S立体化学的非对映异构体存在。本发明包括所有这些非对映异构体和它们的混合物。
关于上述取代基R7，术语“酯”或“酯化的羧基”表示基团RxO(C＝O)-，其中Rx是从理论上说衍生自醇RxOH的酯的特征性基团。
取代基R 1 -R 3 ’
R1是氢，(C1-C6)烷基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、(C2-C6)烯基如烯丙基、(C2-C6)炔基如-CH2C≡CH、或(C3-C6)环烷基如环丙基、环戊基或环己基。在本发明化合物的一个亚类中，R1是乙基。
R2是氢、(C1-C6)烷基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、(C2-C6)烯基如烯丙基、(C2-C6)炔基如-CH2C≡CH或(C3-C6)环烷基如环丙基、环戊基或环己基、或C6-14芳基如苯基或萘基。在本发明化合物的一个亚类中，R2是环戊基。
R3和R3′独立地选自：氢、-CN、羟基、卤素、(C1-C6)烷基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、(C2-C6)烯基如烯丙基、(C2-C6)炔基如-CH2C≡CH或(C3-C6)环烷基如环丙基、环戊基或环己基、-NR5R6和C1-C4烷氧基，其中R5和R6独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基如甲基或乙基。在本发明化合物的一个亚类中，R3是甲氧基、氟或氯，R’3是氢、氟或氯。
环A
环A是最多12个环原子的单环或双环碳环或杂环或环系统。这些环的例子是哌啶、哌嗪、吡啶、嘧啶、吡唑啉、三唑啉(triazoline)、呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑和噻二唑环。目前优选环A是苯基、吡啶基和嘧啶基。
环A可被任何上述任选的取代基取代，例如氯、溴或氟、三氟甲基、甲氧基和三氟甲氧基。
取代基T
该取代基包含式(X)或(Y)的α氨基酸或α氨基酸酯部分，通过连接基与环A相连。
本发明的酯化合物可由胞内酯酶转化为羧酸。酯和羧酸本身均具有PLK抑制活性。因此，本发明化合物不仅包括酯，也包括相应的羧酸水解产物。
取代基T上的酯基团R7必须是在本发明化合物中可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解成羧酸基的基团。能够将本发明化合物的酯基水解成相应的酸的胞内羧酸酯酶包括三种已知的人酶同种型hCE-1、hCE-2和hCE-3。虽然这些酶被认为是主要的酶，但其他的酶如联苯基水解酶(BPH)也具有水解偶联物的作用。通常，如果羧酸酯酶能将游离氨基酸酯水解成母体酸，当共价偶联到调节剂时也将水解酯基序。因此，本文所述的破细胞测定法(broken cell assay)提供了一种直接、快速且简便的首次筛选具有所需水解曲线的酯的方法。当将用这种方法选出的酯基序通过所选择的偶联化学偶联到分子的其余部分时可采用相同的羧酸酯酶测定法再次测定，以证实它仍旧是该背景下的羧酸酯酶底物。
为被细胞内羧酸酯酶水解，特定的酯基R7的例子包括式-(C＝O)OR10的基团，其中，R10是R11R12R13C-，其中：
(i)R11是氢或任选取代的(C1-C3)烷基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-或(C2-C3)烯基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-，其中a和b独立地是0或1，Z1是-O-、-S-或-NR14-，其中R14是氢或(C1-C3)烷基；和R12和R13独立地是氢或(C1-C3)烷基-；
(ii)R11是氢或任选取代的R15R16N-(C1-C3)烷基-，其中R15是氢或(C1-C3)烷基，R16是氢或(C1-C3)烷基；或R15和R16与它们连接的氮原子一起形成任选取代的具有5-或6-个环原子的单环杂环或具有8-10个环原子的双环杂环系统，R12和R13独立地是氢或(C1-C3)烷基-；或
(iii)R11和R12与它们所结合的碳原子一起形成任选取代的具有3-7个环原子的单环碳环或具有8-10个环原子的双环碳环系统，R13是氢。
在这些类别中，R10可以是例如甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基、环己基、烯丙基、苯基、苄基、2-、3-或4-吡啶基甲基、N-甲基哌啶-4-基、四氢呋喃-3-基、甲氧基乙基、茚满基、降冰片基(norbonyl)、二甲基氨基乙基或吗啉代乙基。目前优选R10是环戊基或叔丁基。
环D
当R是式(Y)的基团时，R的例子包括：
Figure A20078003993700151
其中R7定义同上。
基团R 8
当式(I)中R是式(X)的基团时，本发明化合物中存在基团R8。
R8可以是例如任选取代的(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂芳基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、环丙基、环戊基、环己基、苯基或吡啶基。R8也可以是例如氢或-(C＝O)R16，其中R16是任选取代的(C1-C6)烷基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基或仲丁基、(C3-C6)环烷基如环丙基、环戊基、环己基、苯基、吡啶基、噻吩基、苯基(C1-C6烷基)-、噻吩基(C1-C6烷基)-或吡啶基(C1-C6烷基)-如苄基、4-甲氧基苯基甲基羰基、噻吩基甲基或吡啶基甲基。
R8也可以是例如-(C＝O)OR17或-(C＝O)NHR17，其中R17是氢或任选取代的(C1-C6)烷基如甲基、乙基或正丙基或异丙基。
目前优选R8是氢。
对于要全身给予的本发明的化合物，优选被酯酶断裂的速率慢的酯，因为这种酯不易于被系统前代谢。因此它们完整到达其靶组织的能力增强了，且所述酯可在靶组织的细胞内被转化成酸产物。然而，对于局部给药而言，此时酯被直接施加于靶组织或通过例如吸入直接到达靶组织，通常需要这种酯被酯酶快速断裂，以使全身暴露和随后不希望的副作用最小。如果连接R基团的碳原子是未被取代的，即R连接到亚甲基(-CH2)-，则与碳原子是被取代的，或是环系统如苯基或环己环的一部分相比，这种酯趋于更快断裂。
基团-L 1 -Y 1 -
该基团(或键)源自将取代基T中的氨基酸酯基序R连接于抑制剂的环A的具体化学方案。显然，实现这种偶联的化学方案可大相径庭，因而可能存在变量Y1和L1的各种组合。然而，当抑制剂结合酶活性位点时，氨基酸酯基序通常沿远离酶的方向延伸，从而避免对抑制剂结合方式的干扰或使干扰最小化。因此，构成氨基酸酯基序与分子其余部分之间的连接化学的变量的精确组合常常与化合物整体的主要结合方式无关。
考虑前面的一些观察结果，依次分析组成-L1-Y1-基团的变量：
Y1可以是例如、-NR3-、-S-、-O-、-C(＝O)NR3-、-NR3C(＝O)-或-C(＝O)O-，其中R3是氢或任选取代的C1-C6烷基如-CH2CH2OH；
在基团L1中，Alk1和Alk2基团的例子包括(如果存在)：-CH2-、-CH2CH2--CH2CH2CH2-、-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH-、CH2CH＝CHCH2-、-C≡C-、-C≡CCH2-、-CH2C≡C-和CH2C≡CCH2。Alk1和Alk2的其他例子包括：任意取向的-CH2W-、-CH2CH2W-、-CH2CH2WCH2-、-CH2CH2WCH(CH3)-、-CH2WCH2CH2-、-CH2WCH2CH2WCH2-和-WCH2CH2-，其中W是-O-、-S-、-NH-、-N(CH3)-或-CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-。Alk1和Alk2的其他例子包括：二价环丙基、环戊基和环己基基团。
Alk1和Alk2如果存在，也可以是支链烷基如-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、或任意取向的-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-。
在L1中，当n为0时，该基团是烃链(被例如羟基任选地取代)，可能具有醚、硫醚或氨基连接键。目前优选L1中无任选的取代基。如果m和p都为0，L1是具有5-13个环原子的二价单环或双环碳环或杂环基团(任选地被取代)。当n为1且m和p中至少一个为1时，L1是包括一条或多条烃链、具有5-13个环原子的单环或双环碳环或杂环(任选地被取代)的二价基团。如果存在，Q可以是例如二价亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡嗪基、亚哌啶基、亚哌嗪基、亚吡咯烷基、亚吡咯基、环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基或3-氮杂-双环[3.1.0]亚己基基团，目前优选1，4-亚苯基、1，4-亚哌啶基或1，4-哌嗪基。
基团-L1-Y1-的具体例子包括实施例中所述化合物中存在的那些。
本发明化合物的具体亚类包括式(IA)的化合物
Figure A20078003993700181
式中，R3是甲氧基、氟或氯，其余变量定义同上。
如上所述，本发明考虑的化合物是PLK1激酶活性的抑制剂，因而可用于治疗细胞增殖性疾病如癌症。
应理解，用于任何特定患者的具体剂量水平将取决于各种因素，其中包括采用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给药次数、给药途径、排泄率、药物组合以及接受治疗的特定疾病的严重性。最佳剂量水平和给药频率将由临床试验确定。
本发明涉及的化合物可被制成通过任何与其药代动力学特性一致的任何途径给予。可口服给予的组合物的形式可以是片剂，胶囊，粉末，颗粒，锭剂，液体或凝胶制品如口服、局部或无菌肠胃外溶液或悬浮液。供口服给药的片剂或胶囊可采用单位剂型，并可含有常规赋形剂，如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填料，例如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉，或可接受的润湿剂如月桂基硫酸钠。可按照常规制药实践中熟知的方法将片剂包衣。口服液体制剂的形式可以是，例如，水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可呈现为在使用前用水或其它合适载体重建的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，如悬浮剂，例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶、氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、去水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(可包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，需要的话还可含有常规的调味剂或着色剂。
当局部施用于皮肤时，可将药物制成霜剂、洗剂或软膏剂。可用于药物的霜剂或软膏剂配方是本领域熟知的常规配方，例如标准药物教科书如《英国药典》(British Pharmacopoeia)中描述的配方。
为通过吸入局部施用，可将药物制成通过气雾剂递送，例如通过压力驱动的喷射雾化器或超声雾化器，或者优选通过推进剂驱动的计量式气雾剂或者不采用推进剂给予微粉化粉末，例如吸入剂胶囊或其它“干粉”递送系统。这种吸入配方中可含有赋形剂，例如推进剂(例如，在计量式气雾剂中为Frigen)、表面活性物质、乳化剂、稳定剂、防腐剂、调味剂和填料(例如，在干粉吸入器中为乳糖)。为了吸入，大量装置都是适用的，这些装置能产生最佳粒度的气溶胶并采用适合患者的吸入技术给予。除了采用适配器(间隔物(spacer)、扩展器)和梨形容器(例如
Figure A20078003993700191
)以及发射吹入喷雾的自动装置(
Figure A20078003993700192
)，为给予经过计量的气溶胶，尤其是采用干粉吸入器时，许多技术方案是适用的(例如，
Figure A20078003993700193
或者例如欧洲专利申请EP 0 505 321中描述的吸入器)。
为局部施用于眼睛，可用合适的水性或非水性无菌载体将药物制成溶液或悬浮液。也可含有添加剂，例如，缓冲剂，如偏亚硫酸氢钠或依地酸二钠；防腐剂，包括杀菌剂和杀真菌剂如醋酸苯汞或硝酸苯汞、苯扎氯铵或氯己定；以及增稠剂，如羟丙甲纤维素。
也可采用无菌介质肠胃外给予活性成分。根据所用载体和浓度，药物可悬浮于或溶于载体中。有利地，辅助试剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可溶于载体。
本发明化合物可与许多已知的药学活性物质联合使用。例如，本发明化合物可与细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、bcl-2拮抗剂，mTor抑制剂和单克隆抗体(例如靶向生长因子受体的单克隆抗体)联合使用。优选的细胞毒剂包括例如，紫杉烷，铂，抗代谢物如5-氟尿嘧啶，拓扑异构酶抑制剂等。包含式(I)氨基酸衍生物、其互变异构体或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物的本发明药物通常还包含细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂和/或单克隆抗体。
而且，本发明提供了包含以下成分的药物组合物：
(a)化合物(I)、或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物；
(b)细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、bcl-2拮抗剂、mTor抑制剂和/或单克隆抗体；和
(c)药学上可接受的载体或稀释剂。
还提供了一种在人或动物体的治疗中分开、同时或相继使用的产品，其包含：
(a)化合物(I)、或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物；和
(b)细胞毒剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、bcl-2拮抗剂、mTor抑制剂和/或单克隆抗体。
合成
有多种合成策略可用来合成本发明所涉及的化合物(I)，但它们都依赖于已知的化学方法并为合成有机化学家所知晓。因此可按照标准文献中描述的并为精通本领域的技术人员所熟知的方法合成式(I)中的化合物。典型的文献来源有“高级有机化学(Advanced organic chemistry)”，第四版(Wiley)，JMarch，“综合有机转化(Comprehensive Organic Transformation)”，第二版(Wiley)，R.C.Larock，“杂环化学手册(Handbook of Heterocyclic Chemistry)”，第二版(Pergamon)，A.R.Katritzky)，例如在“Synthesis”、“Acc.Chem.Res.”、“Chem.Rev”中的综述文章，或者通过标准在线文献检索找到的第一文献来源或来自诸如“Chemical Abstracts”或“Beilstein”等第二文献来源。
本发明的化合物可通过许多方法制备而得，其中一些方法在随后的实施例中进行更具体的阐述。在下文所述的反应中，有必要对活性官能团进行保护，例如羟基、氨基和羧基(它们应在终产物中得到)，以避免它们参与不必要的反应[例如参见“有机合成中的保护基团(Protecting Groups in OrganicSynthesis)”，第三版(Wiley)，T.W.，Greene]。可将常规的保护基团和标准方法联合使用。在一些情况下，去保护可以是合成通式(I)化合物的最后步骤，下文所述的本发明的方法应理解能延伸到这种去除保护基团上。
缩写
AcOH＝乙酸
Boc或boc＝叔丁氧基羰基
BOC2O＝二碳酸二-叔丁酯
Cbz＝苄氧基羰基
DBU＝1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯
DCE＝二氯乙烷
DCM＝二氯甲烷
DIPEA＝二异丙基乙胺
DMAP＝二甲基氨基吡啶
DMF＝二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EtOAc＝乙酸乙酯
EtOH＝乙醇
Et2O＝乙醚
Et3N＝三乙胺
H2SO4＝硫酸
HCl＝盐酸
HOBt＝N-羟基苯并三唑
K2CO3＝碳酸钾
LiOH＝氢氧化锂
MeOH＝甲醇
MgSO4＝硫酸镁
Na2CO3＝碳酸钠
NaH＝氢化钠
NaHCO3＝碳酸氢钠
NaI＝碘化钠
NaOH＝氢氧化钠
NBS＝N-溴代琥珀酰亚胺
NBu4Br＝溴化四丁基铵
NMM＝N-甲基吗啉
Pd(dppf)Cl2＝二氯-(1，2-双(二苯基膦基)乙烷)-钯(II)
Pd/C＝碳载钯
PPh3＝三苯基膦
PyBrOP＝溴代-三-吡咯烷磷鎓六氟磷酸盐(pyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate)
STAB＝三乙酸基硼氢化钠
TBTU＝O-苯并三唑基-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
aq＝水性
g＝克
LCMS＝高效液相色谱/质谱
mg＝毫克
min＝分钟
mL＝毫升
μL＝微升
mol＝摩尔
mmol＝毫摩尔
NMR＝核磁共振
RT或rt室温
sat＝饱和的
市售反应试剂和溶剂(HPLC级)无需进一步纯化即可使用。采用Buchi旋转蒸发仪去除溶剂。用Biotage IntiatorTM Eight微波合成器进行微波辐射。选用来自氟化学公司(Fluorochem)的粒径为40-63μm(230-400目)的硅胶，以快速层析柱法纯化化合物。在Gilson系统上，采用色谱柱为反相AxiaTM制备型Luna C18柱(12μm，100×21.2毫米)，色谱条件为：梯度0-100％B(A为水/0.05％TFA，B为乙腈/0.05％TFA)，经10分钟，流速为25毫升/分钟，UV检测波长为254nm，由制备型HPLC纯化化合物。
以Bruker 300MHz AV核磁共振仪记录1H NMR谱，溶剂为氘代溶剂。化学位移(δ)为百万分之一。在Kieselgel 60 F254(Merck)板上进行薄层层析(TLC)分析，并在UV光下观察。
采用反相Luna C18柱(3微米，50×4.6毫米)，梯度为5-95％B(A为水/0.1％甲酸，B为乙腈/0.1％甲酸)，经2.25分钟，流速为2.25毫升/分钟，在Agilent HP1100系统上进行分析级HPLC/MS。采用G1315B DAD检测器，记录220和254nm处的UV谱。在LC/MSD SL G1956B检测器上，获得m/z150-800范围内的质谱。数据进行积分处理，用ChemStation和ChemStationData Browser软件记录。
中间体
下面示出了用于制备本文所述实施例的中间体(图1)：
Figure A20078003993700241
图1
Figure A20078003993700251
图1(续)
中间体1：
(7R)-2-氯-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮
Figure A20078003993700252
采用WO2004076454所述的方法制备标题中间体。
中间体2A-2F
一般方法
方案1
中间体2A：
(7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-羟基苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮
Figure A20078003993700262
根据一般方法(方案1)，由中间体1制备标题中间体。
向(7R)-2-氯-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮[中间体1](200毫克，0.68毫摩尔)在EtOH(2毫升)、水(8毫升)和浓盐酸(0.2毫升)的溶液中加入4-氨基苯酚(148毫克，1.36毫摩尔)。将该反应混合物回流18小时并减压浓缩。残留物在饱和NaHCO3(20毫升)和MeOH/DCM混合物(1∶3，20毫升)之间分配。分离水层，用MeOH/DCM(1∶3，20毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到褐色固体。用Et2O研磨，得到灰色固体状标题中间体(125毫克，产率50％)。ESMS：m/z 368[M+H]+。1HNMR(DMSO-d6，300MHz)8.90(1H，s)，8.64(1H，s)，7.74(1H，s)，7.43(2H，d，J＝8.9Hz)，6.64(2H，d，J＝8.9Hz)，4.39-4.29(1H，m)，4.16(1H，dd，J＝3.6，7.8Hz)，3.22(3H，s)，1.99-1.54(10H，m)，0.77(3H，t，J＝7.4Hz)。
根据类似于上述方法的方法，制备下表所示的中间体。
Figure A20078003993700271
  中间体   R1  R2   名称   ESMS
2B -OMe -OH   (7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-羟基2-甲氧基苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮   m/z 398[M+H]+
2C -OMe -CO2H   4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸   m/z 426[M+H]+
2D -Me -CO2H   4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲基苯甲酸   m/z 410[M+H]+
2E -F -CO2H   4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-氟苯甲酸   m/z 414[M+H]+
2F -H -I   (7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-碘-苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮   m/z 478[M+H]+
中间体3A：
(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
根据下述方法(方案2)制备标题中间体。
Figure A20078003993700281
方案2
步骤1-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸
0℃，向L-高丝氨酸(1.00克，8.40毫摩尔)在乙腈(10毫升)的悬浮液中加入DBU(1.32毫升，8.80毫摩尔)。然后在5分钟的时间内分批加入叔丁基-二甲基甲硅烷基氯化物(1.33克，8.80毫摩尔)，使该反应混合物升高至RT并搅拌16小时。将白色固体过滤，用乙腈洗涤，得到产物(1.80克，产率92％)。ESMS：m/z 234[M+H]+。
步骤2-N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸
0℃，向O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸(1.80克，7.70毫摩尔)在DCM(100毫升)的悬浮液中，加入Et3N(2.15毫升，15.4毫摩尔)和BOC2O(1.77克，8.10毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌16小时。减压除去DCM，残留物重新溶解在EtOAc(20毫升)和盐水(10毫升)中。将EtOAc层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到粗产物，该粗产物可直接使用而无需进一步纯化(2.53克，产率99％)。ESMS：m/z 356[M+H]+。
步骤3-N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸环戊酯
0℃，向N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸(2.53克，7.6毫摩尔)在DCM(50毫升)的溶液中，加入环戊醇(1.39毫升，15.3毫摩尔)、EDC(1.61克，8.40毫摩尔)和DMAP(93毫克，0.76毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌16小时，然后进行减压浓缩。将粗品残留物溶解在EtOAc(100毫升)中，用1M HCl(30毫升)、1M Na2CO3(30毫升)和盐水(20毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(25％EtOAc/庚烷)，得到产物(2.24克，产率73％)。ESMS：m/z 402[M+H]+。
步骤4-N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸环戊酯
将N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸环戊酯(1.57克，3.90毫摩尔)在乙酸∶THF∶水(3∶1∶1，100毫升)中的溶液在30℃搅拌16小时。加入EtOAc(200毫升)，用1M Na2CO3(10毫升)、1M HCl(10毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将EtOAc层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到澄清油状产物，该产物静置后固化(1.00克，产率95％)。ESMS：m/z 310[M+Na]+。
步骤5-(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
向NBS(1.86克，10.4毫摩尔)在DCM(16毫升)的悬液中加入三苯膦(2.56克，9.70毫摩尔)的DCM(7毫升)溶液。加入后将该溶液搅拌5分钟。加入吡啶(0.34毫升，4.20毫摩尔)，再加入N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸环戊酯(1.00克，3.5毫摩尔)的DCM(9毫升)溶液。将该溶液在室温下搅拌18小时，减压浓缩，残留溶剂与甲苯(3×16毫升)共沸。将残留物用Et2O(10毫升)和EtOAc∶庚烷(1∶9，2×10毫升)研磨。将合并的有机溶液浓缩到二氧化硅上并用柱色谱纯化(10％-25％EtOAc/庚烷)，得到标题中间体(1.02克，产率84％)。ESMS：m/z351[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)5.30-5.05(2H，m)，4.45-4.30(1H，m)，3.45(2H，t，J＝7.3Hz)，2.50-2.30(1H，m)，2.25-2.10(1H，m)，1.95-1.60(8H，br m)和1.47(9H，s)。
中间体3B：
(2S)-2-{[苄氧基)羰基]氨基}-4-溴代丁酸叔丁酯
Figure A20078003993700301
根据下述方法(方案3)制备标题中间体。
Figure A20078003993700302
方案3
步骤1-(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸
0℃，向(3S)-3-氨基-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(900毫克，4.75毫摩尔)和氢氧化钠(280毫克，7.13毫摩尔)在25％水/二噁烷(50毫升)的溶液中，加入用二噁烷(10毫升)配制的氯甲酸苄酯(2克，4.13毫摩尔)。将该混合物在0℃搅拌1小时然后在室温下搅拌过夜。加水(10毫升)，将该混合物用EtOAc(2x20毫升)萃取。有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(2x10毫升)反萃取。将合并的水层用1M HCl酸化至pH 1，用EtOAc(3x10毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(35％EtOAc/庚烷)，得到无色油状产物(0.76克，产率50％)。ESMS：m/z 346[M+23]+。
步骤2-N-[(苄氧基)羰基]-L-高丝氨酸叔丁酯
-20℃，向(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(600毫克，1.87毫摩尔)在无水THF(20毫升)的溶液中缓慢加入Et3N(32μL，2.24毫摩尔)和氯甲酸乙酯(21μL，2.24毫摩尔)。将该混合物在-20℃搅拌2小时。滤出形成的固体，用THF(2x10毫升)洗涤。0℃，10分钟的时间内将滤液逐滴加入硼氢化钠(0.2克，5.61毫摩尔)溶液中，然后升高至室温。将混合物再搅拌4小时。减压蒸发溶剂，残留物用水(10毫升)稀释，用1M HCl酸化至pH 5，用EtOAc(2x20毫升)萃取。将合并的有机相用10％NaOH水溶液(10毫升)、水(10毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到澄清油状产物(0.3克，产率51％)。ESMS：m/z 332[M+23]+。
步骤3-(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-溴代丁酸叔丁酯
向NBS(520毫克，2.91毫摩尔)在DCM(10毫升)的溶液中缓慢加入三苯膦(0.71克，2.72毫摩尔)的DCM(10毫升)溶液。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后逐滴加入吡啶(94μL，1.16毫摩尔)和N-[(苄氧基)羰基]-L-溴代高丝氨酸叔丁酯(0.30克，0.97毫摩尔)的DCM(20毫升)溶液。将该混合物在室温下再搅拌18小时。减压蒸发溶剂，残留物与甲苯(2x15毫升)共沸，用Et2O(2x25毫升)和10％EtOAc的庚烷溶液研磨。合并研磨所得滤液并减压浓缩。粗产物经柱色谱(15％EtOAc/庚烷)纯化，得到澄清油状标题中间体(0.16克，产率44％)。ESMS：m/z 395[M+23]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)，ppm 7.39-7.30(5H，m)，5.40(1H，d，J＝6.8Hz)，5.12(2H，s)，4.38(1H，q，J＝7.7Hz)，3.47-3.38(2H，m)，5.49-2.33(1H，m)，2.28-2.13(1H，m)和1.48(9H，s)。
中间体3C：
5-溴-N-(叔丁氧基羰基)-L-正缬氨酸环戊酯
Figure A20078003993700321
根据下述方法(方案4)制备标题中间体。
Figure A20078003993700322
方案4
步骤1-1-环戊基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸-5-苄基酯
0℃，向(2S)-5-(苄氧基)-2[((叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸(15克，44.5毫摩尔)在DCM(220毫升)的溶液中，加入环戊醇(4.8毫升，53.3毫摩尔)、EDC(9.4克，48.9毫摩尔)和DMAP(543毫克，4.4毫摩尔)。将该反应混合物升高至室温，继续搅拌12小时。将该反应混合物用DCM(200毫升)稀释，用1M HCl(50毫升)、1M Na2CO3(30毫升)和盐水(50毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(25％EtOAc/庚烷)，得到白色固体的产物(12.4克，产率69％)。ESMS：m/z 406[M+H]+。
步骤2-1-环戊基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸
将1-环戊基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸-5-苄基酯(12.4克，30.5毫摩尔)溶解在EtOAc(200毫升)中并用氮气吹扫，然后加入碳负载的Pd(OH)2催化剂(1.3克，20％w/w)。然后用氢气吹扫反应烧瓶持续5分钟的时间后，在氢气球下保持5分钟。经硅藻土滤器(
Figure A20078003993700331
)过滤除去催化剂，用EtOAc(50毫升)彻底洗涤。减压去除溶剂，得到澄清油状产物(7.73克，产率85％)。ESMS：m/z316[M+H]+。
步骤3-N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-L-正缬酸环戊酯
-20℃，向搅拌的1-环戊基N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸(6.73克，21.4毫摩尔)在THF(150毫升)的溶液中加入NMM(3.05毫升，27.8毫摩尔)和氯甲酸乙酯(2.45毫升，25.6毫摩尔)。将该反应混合物在-20℃搅拌2小时。过滤去除固体，0℃在20分钟的时间内逐滴加入到硼氢化钠(2.43克，64.1毫摩尔)在THF(20毫升)和水(5毫升)中的溶液中。将该反应混合物升高至室温，继续静置4小时。将混合物用1M HCl酸化至pH 5，减压去除THF。水性溶液用EtOAc(3x100毫升)萃取，干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(0-5％MeOH/DCM)，得到澄清油状产物(5.0克，产率78％)。ESMS：m/z 302[M+H]+。
步骤4-5-溴-N-(叔丁氧基羰基)-L-正缬氨酸环戊酯
向NBS(3.54克，19.9毫摩尔)在DCM(30毫升)的悬浮液中加入三苯膦(4.87克，18.8毫摩尔)的DCM(15毫升)溶液。将该溶液继续搅拌5分钟后加入吡啶(644μL，7.96毫摩尔)和N-(叔丁氧基羰基)-5-羟基-L-正缬氨酸环戊酯(2.0克，6.64毫摩尔)的DCM(20毫升)溶液。将该溶液搅拌18小时，减压浓缩，残留溶剂与甲苯(3x30毫升)共沸。残留物用Et2O(30毫升)和10％EtOAc/庚烷(2x30毫升)研磨。将合并的Et2O和EtOAc/庚烷溶液浓缩到二氧化硅上并用柱色谱纯化(10％-25％EtOAc/庚烷)，得到澄清油状标题中间体(1.34克，产率55％)。ESMS：m/z 365[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)，5.25(1H，m)，5.05(1H，bd)，3.45(2H，m)，2.00-1.55(12H，bm)和1.45(9H，s)。
中间体3D：
N-[(苄氧基)羰基]-5-溴-L-正缬氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700341
以(4S)-4-氨基-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸为原料，根据中间体3B所述方法[方案3]，制备标题中间体。ESMS：m/z 409[M+Na]+。
中间体4A：
(2R)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
Figure A20078003993700342
以D-高丝氨酸为原料，根据中间体3A所述方法[方案2]，制备标题中间体。ESMS：m/z 351[M+H]+。
中间体4B：
5-溴-N-(叔丁氧基羰基)-D-正缬氨酸环戊酯
Figure A20078003993700343
以(2R)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸为原料，根据中间体3C所述方法[方案4]，制备标题中间体。ESMS：m/z 365[M+H]+。
中间体5
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸(1R，2S，5R)-2-异丙基-5- 里基环己酯
Figure A20078003993700351
根据下述方法(方案5)制备标题中间体。
Figure A20078003993700352
方案5
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸-(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己酯
0℃，向N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸[方案2步骤2](6.22克，19毫摩尔)在DCM(120毫升)的悬浮液中，加入(-)-薄荷醇(5.85克，37.0毫摩尔)、DMAP(228毫克，1.87毫摩尔)和EDC(3.93克，20.3毫摩尔)。将该溶液升高至室温，继续搅拌18小时。将反应混合物减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(20％EtOAc/庚烷)，得到澄清油状产物(4.86克，产率55％)。ESMS：m/z 394[M+Na]+。
步骤2-N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸-(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己酯
将N-(叔丁氧基羰基)-O-[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-L-高丝氨酸-(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己酯(4.86克，14.0毫摩尔)在THF/水/乙酸(60毫升∶60毫升∶180毫升)中的悬浮液在30℃加热20小时。将反应液用EtOAc(60毫升)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(20毫升)、1M HCl(30毫升)和盐水(30毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到产物(3.45克，产率69％)。ESMS：m/z 380[M+Na]+。
步骤3-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸-(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己酯
0℃，向N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸-(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己酯(500毫克，1.40毫摩尔)在DCM(20毫升)的悬浮液中，加入戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane)(595毫克，1.54毫摩尔)。将反应液升高至室温，搅拌3小时。向溶液中加入1∶1Na2SO3/NaHCO3饱和溶液(30毫升)，将混合物搅拌15分钟。分离有机层，水层用DCM(2x10毫升)萃取。将合并的有机层用1∶1Na2SO3/NaHCO3溶液(15毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到无色油状标题中间体(480克，产率97％)。ESMS：m/z 378[M+Na]+。1HNMR(CDCl3)δ：7.90(1H，m)，5.30(1H，d J＝4.7Hz)，4.70-4.57(2H，m)，4.45(1H，br.s)，2.92(2H，t，J＝5.7Hz)，1.91-1.68(6H，m)，1.58(9H，s)，1.05-0.85(4H，m)和0.66(6H，d，J＝7.0Hz)。
中间体6A
4-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸环戊酯
Figure A20078003993700361
根据下述方法(方案6)制备标题中间体。
Figure A20078003993700371
方案6
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸环戊酯
0℃，向N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙氨酸(1.00克，3.23毫摩尔)在DMF(10毫升)的溶液中，加入环戊醇(0.585毫升，6.44毫摩尔)、DMAP(39毫克，0.32毫摩尔)和EDC(0.655克，3.39毫摩尔)。将反应混合物升高至室温，继续搅拌16小时。使混合物在水(200毫升)和EtOAc(200毫升)之间进行分批。有机层用水(3x50毫升)萃取，干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(33％庚烷/EtOAc)，得到淡黄色油状产物(1.12克，产率95％)。ESMS：m/z365[M+H]+。
步骤2-4-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸环戊酯
向N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸环戊酯(480毫克，1.32毫摩尔)在EtOAc(10毫升)的溶液中加入10％Pd/C(48毫克，10％w/w)。对烧瓶抽真空并置于氢气气氛下2小时。对反应液抽真空，使混合物通过硅藻土(
Figure A20078003993700372
)过滤，用过量EtOAc(20毫升)洗涤。减压浓缩滤出液，得到粉色油状标题中间体(432毫克，产率98％)。ESMS：m/z 335[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：6.62(2H，d，J＝8.4Hz)，5.15-5.25(1H，m，CH)，4.95(1H，d，J＝4.2Hz)，4.40-4.55(1H，m)，6.94(2H，d，J＝8.1Hz)，3.62(2H，br s)，2.97(2H，d，J＝5.7Hz)，1.50-1.96(9H，m)和1.44(9H，s)。
中间体6B
4-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700381
根据下述方法(方案7)制备标题中间体。
Figure A20078003993700382
方案7
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸叔丁酯
0℃，向N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙氨酸(500毫克，1.61毫摩尔)在66％DCM/环己烷(30毫升)的溶液中，加入三氟化硼乙醚合物(10μL)，然后立即在10分钟的时间内逐滴加入用环己烷(10毫升)配制的三氯亚氨逐乙酸叔丁酯(tert-butyl trichloroacetimidate)(704毫克，3.22毫摩尔)。将该混合物升高至室温，搅拌30分钟后，用NaHCO3粉末(80毫克)淬灭。粗品混合物通过硅藻土
Figure A20078003993700383
过滤，滤液经减压浓缩得到残留物。用柱色谱纯化残留物(20％EtOAc/庚烷)，得到黄色固体产物(320毫克，产率54％)。ESMS：m/z 389[M+Na]+。
步骤2-4-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸叔丁酯
将步骤1的产物(0.53克，1.40毫摩尔)溶解在MeOH(29毫升)中形成0.05M的溶液。使该溶液通过H-CubeTM连续氢化器(TN公司(ThalesNanotechnology)，HC-2，SS)。反应采用30mm CatCartTM(10％Pd/C)在完全H2模式下进行。维持1毫升/分钟的流速，温度25℃，H2压力1巴。产物被洗脱到2M NaOH(20毫升)中，减压去除MeOH。水性溶液用EtOAc(2x20毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到黄色油状标题中间体。(0.15克，产率31％)。ESMS：m/z 359[M+Na]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ：6.97(2H，d，J＝8.5Hz)，6.68(2H，d，J＝8.3Hz)，4.15(1H，t，J＝5.9Hz)，2.85(2H，dd，J＝19.0，7.2Hz)和1.42(18H，s)。
中间体7A
(2S)-4-氨基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
Figure A20078003993700391
根据下述方法(方案8)制备标题中间体。
Figure A20078003993700392
方案8
步骤1-(2S)-4-叠氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
向(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体3A](1.00克，2.90毫摩尔)在DMF(30毫升)的溶液中加入叠氮化钠(0.93克，14.3毫摩尔)。将该反应混合物在40℃搅拌32小时并减压浓缩。使残留物在Et2O(100毫升)和饱和Na2CO3溶液(100毫升)之间进行分配。分离有机层，用饱和Na2CO3溶液(100毫升)和盐水(100毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到黄色油状产物(1.05克)。该产物无需进一步纯化即可使用。ESMS：m/z 335[M+Na]+。
步骤2-(2S)-4-氨基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯
向粗品(2S)-4-叠氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯(1.05克，2.90毫摩尔)在乙醇(50毫升)的溶液中加入乙酸(0.16毫升，2.90毫摩尔)。将该反应混合物用氮气吹洗(flush)3次。加入Pd/C(50毫克，10％w/w)。将该混合物用氮气吹洗3次，最后在氢气气氛下，在室温下搅拌2小时。反应混合物通过短的硅藻土滤垫过滤，减压浓缩滤出液。残留物在EtOAc(50毫升)和饱和Na2CO3溶液(50毫升)之间进行分配。分离有机层，用盐水(50毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到黄色的油。用柱色谱纯化(2％氨：5％MeOH的DCM溶液)得到无色油状标题中间体(638毫克，2个步骤的产率78％)。ESMS：m/z 287[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.55(1H，br d)，5.21(1H，m)，4.35(1H，m)，2.81(2H，m)，1.89(2H，m)，1.81-1.55(8H，m)和1.45(9H，s)。
中间体7B
N 2 -(叔丁氧基羰基)赖氨酸环戊酯
Figure A20078003993700401
根据下述方法(方案9)制备标题中间体。
方案9
步骤1-N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)赖氨酸环戊酯
0℃，向N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)赖氨酸(1.00克，2.63毫摩尔)在无水DCM(20毫升)的溶液中，加入DMAP(32毫克，0.26毫摩尔)、环戊醇(0.48毫升，5.23毫摩尔)和EDC(552毫克，2.89毫摩尔)。将反应液升高至室温，继续搅拌16小时。混合物用DCM(50毫升)稀释，用盐水(50毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到无需进一步纯化即可使用的油状粗产物(1.18克，产率100％)。ESMS：m/z 471[M+Na]+。
步骤2-N2-(叔丁氧基羰基)赖氨酸环戊酯
氮气气氛下，向N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)赖氨酸环戊酯(1.18克，2.63毫摩尔)在乙醇(5毫升)的溶液中小心加入碳载氢氧化钯(235毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并置于氢气气氛下。再重复该过程2次，将反应液在氢气气氛下搅拌2小时。使反应混合物通过硅藻土(
Figure A20078003993700411
)过滤，浓缩得到标题中间体(250毫克)。ESMS：m/z 315[M+H]+。1H NMR(300MHz，DMSO)δ：6.70-6.77(1H，m)，5.13-5.15(1H，m)，4.08-4.09(1H，m)，2.88-2.90(2H，m)，1.82(2H，m)，1.57-1.66(10H，m)和1.03-1.37(11H，m)。
中间体8
(2S，4S)-4-氨基吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
根据下述方法(方案10)制备标题中间体。
Figure A20078003993700413
方案10
步骤1-(2S，4R)-4-(苄氧基)吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
0℃，向(4R)-4-(苄氧基)-1-(叔丁氧基羰基)-L-脯氨酸(5.06克，15.7毫摩尔)在DCM(50毫升)的溶液中加入环戊醇(2.9毫升，31.4毫摩尔)、DMAP(192毫克，1.60毫摩尔)和EDC(3.32克，17.3毫摩尔)。使反应混合物升高至室温，继续搅拌18小时。将混合物用饱和Na2CO3(30毫升)、1M HCl(30毫升)和盐水(30毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到淡黄色的油。用柱色谱纯化(15％EtOAc/庚烷)得到无色油状产物(5.21克，产率85％)。ESMS：m/z412[M+Na]+和801[2M+Na]+。
步骤2-(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
向(2S，4R)-4-(苄氧基)吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯(5.21克，13.4毫摩尔)在EtOH∶环己烷(5∶1，120毫升)的溶液中小心加入碳载氢氧化钯(521毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并用氮气吹洗3次，回流21小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，减压浓缩滤液，得到淡黄色的油。用柱色谱纯化(50％EtOAc/庚烷)得到淡粉色油状产物(3.77克，产率100％)。ESMS：m/z 621[2M+Na]+。
步骤3-(2S，4S)-4-(215-三氮-1-烯-2-炔-1-基(215-triaz-1-en-2-yn-1-y1))吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
0℃，向(2S，4R)-4-羟基-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯(3.07克，10.3毫摩尔)在DCM(100毫升)的溶液中，加入Et3N(2.90毫升，20.5毫摩尔)、DMAP(125毫克，1.02毫摩尔)和甲磺酰氯(0.87毫升，11.3毫摩尔)。将该反应混合物升高至室温，搅拌1小时。混合物用水(50毫升)和盐水(50毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。残留物溶解在DMF(100毫升)中，加入叠氮化钠(100毫克，15.5毫摩尔)。将反应混合物在60℃搅拌3天，冷却至室温，在水(200毫升)和EtOAc(200毫升)之间进行分配。分离有机层，用盐水(200毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到淡黄色的油。用柱色谱纯化(30％EtOAc/庚烷)，得到无色油状标题化合物(3.26克，产率98％)。ESMS：m/z 671[2M+Na]+。
步骤4-(2S，4S)-4-氨基吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
向(2S，4S)-4-(215-三氮-1-烯-2-炔-1-基)吡咯烷-1，2-二羧酸 1-叔丁基2-环戊基酯(3.26克，10.0毫摩尔)在EtOH∶THF(5∶1，120毫升)的溶液中加入碳载氢氧化钯(326毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并置于氢气气氛下。将该过程再重复2次，将反应液在氢气气氛下搅拌16小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，减压浓缩滤出液，得到淡黄色的油。用柱色谱纯化(5-10％MeOH/DCM)，得到稠厚的无色油状标题中间体(1.34克，产率45％)。ESMS：m/z 299[M+H]+和597[2M+Na]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.19(1H，m)，4.31-4.18(1H，m)，3.75-3.63(1H，m)，3.57-3.50(2H，m)，3.31-3.22(1H，m)，2.52-2.43(1H，m)和1.91-1.38(15H，m)。
中间体9
3-[1-(2-氨基乙基)哌啶-4-基]-N-(叔丁氧基羰基)丙氨酸环戊酯
Figure A20078003993700441
根据下述方法(方案11)制备标题中间体。
Figure A20078003993700442
方案11
步骤1-4-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-(环戊氧基)-3-氧代丙基}哌啶-1-羧基苄酯
0℃，向3-{1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基}-N-(叔丁氧基羰基)丙氨酸(250毫克，0.62毫摩尔)在DCM(5毫升)的溶液中，加入环戊醇(0.11毫升，1.23毫摩尔)、DMAP(9.6毫克，0.06毫摩尔)和EDC(180毫克，0.68毫摩尔)。使反应液升高至室温，继续搅拌16小时。反应混合物用水(30毫升)和EtOAc(30毫升)稀释。水层用EtOAc(2x30毫升)重新萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到无需进一步纯化即可使用的粗产物(340毫克，＞100％产率)。ESMS：m/z 475[M+H]+。
步骤2-N-(叔丁氧基羰基)-3-哌啶-4-基丙氨酸环戊酯
氮气气氛下，向N-(叔丁氧基羰基)-3-哌啶-4-基丙氨酸(340毫克，0.72毫摩尔)在乙醇(5毫升)的溶液中小心加入碳载氢氧化钯(68毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并置于氢气气氛下。该过程再重复2次，在氢气气氛下将反应液搅拌3小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，减压浓缩得到产物(250毫克，＞100％产率)。ESMS：m/z 341[M+H]+。
步骤2a-(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯
-78℃，向(2-羟乙基)氨基甲酸苄基酯(210毫克，1.08毫摩尔)在DCM(3毫升)的溶液中，加入戴斯-马丁氧化剂(504毫克，1.19毫摩尔)。使反应液升高至室温，继续搅拌2小时。加入1∶1Na2SO3/NaHCO3(20毫升)的饱和溶液淬灭反应，然后用DCM(3x30毫升)萃取。将合并的有机相干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到无需进一步纯化即可使用的所需产物(150毫克，70％产率)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ：9.59(1H，s)，7.28-7.30(5H，m)，5.06(2H，s)和4.08(2H，d，J＝5.0Hz)。
步骤3-3-[1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基]-N-(叔丁氧基羰基)丙氨酸环戊酯
向N-(叔丁氧基羰基)-3-哌啶-4-基丙氨酸环戊酯(250毫克，0.74毫摩尔)在DCE(5毫升)的溶液中加入(2-氧代乙基)氨基甲酸苄基酯(131毫克，0.67毫摩尔)。将反应液搅拌30分钟后，加入STAB(424毫克，2.01毫摩尔)。将反应液继续搅拌16小时，然后加入饱和NaHCO3溶液(10毫升)淬灭。用DCM(3x30毫升)萃取混合物，将有机层合并，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到产物(240毫克，69％产率)。ESMS：m/z 518[M+H]+。
步骤4-3-[1-(2-氨基乙基)哌啶-4-基]-N-(叔丁氧基羰基)丙氨酸环戊酯
氮气气氛下，向3-[1-(2-{[(苄氧基)羰基]氨基}乙基)哌啶-4-基]-N-(叔丁氧基羰基)丙氨酸环戊酯(240毫克，0.46毫摩尔)在乙醇(5毫升)的溶液中小心加入碳载氢氧化钯(48毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并置于氢气气氛下。将该过程再重复2次，将反应液在氢气下搅拌3小时。再加入一份碳载氢氧化钯(48毫克，20％w/w)，将反应液继续搅拌16小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，减压浓缩，得到标题中间体(250毫克)。ESMS：m/z 384[M+H]+。
中间体10
O-[4-(氨基甲基)苯基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸环戊酯
根据下述方法(方案12)制备标题中间体。
Figure A20078003993700462
方案12
步骤1-(4-羟基苄基)氨基甲酸苄基酯
向4-(氨基甲基)苯酚(300毫克，2.44毫摩尔)在10％THF/H2O(10毫升)的悬浮液中加入NaHCO3(266毫克，3.17毫摩尔)。使该混合物冷却至0℃，缓慢加入氯甲酸苄酯(344μL，2.44毫摩尔)。将反应液在室温下搅拌1.5小时。反应混合物在水(40毫升)和EtOAc(40毫升)之间进行分配。分离有机层，水层用EtOAc(20毫升)重新萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。残留物用庚烷研磨，得到白色固体产物(610毫克，产率97％)。ESMS：m/z 258[M+H]+。
步骤2-(S)-4-[4-(苄氧基羰基氨基-甲基)-苯氧基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丁酸环戊酯
向(4-羟基苄基)氨基甲酸苄基酯(150毫克，0.58毫摩尔)在DMF(5毫升)的溶液中加入碳酸钾(107毫克，0.77毫摩尔)和(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体3A](219毫克，0.64毫摩尔)。将反应液在60℃加热20小时。将反应混合物减压浓缩，然后在水(30毫升)和EtOAc(30毫升)之间进行分配。水层用EtOAc(20毫升)萃取，合并的有机层进行干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(10-50％EtOAc/庚烷)，得到产物(250毫克，产率74％)。ESMS：m/z 527[M+H]+。
步骤3-O-[4-(氨基甲基)苯基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸环戊酯
向(S)-4-[4-(苄氧基羰基氨基-甲基)-苯氧基]-2-叔丁氧基羰基氨基-丁酸环戊酯(250毫克，0.47毫摩尔)在乙醇(8毫升)的溶液中加入Pd/C(50毫克，20％w/w)的EtOH(2毫升)浆液。将反应液抽真空并置于氢气气氛下2小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，用乙醇(15毫升)洗涤。减压浓缩滤出液，得到标题中间体(110毫克，59％产率)。ESMS：m/z 393[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.21(2H，d，8.1Hz)，6.84(2H，d，J＝8.4Hz)，5.38(1H，m)，5.22(1H，m)，4.42(1H，d，J＝6.3Hz)，4.03(2H，t，6Hz)，3.80(2H，s)，3.72(1H，m)，2.29-1.51(9H，m)1.45(9H，s)，1.28-1.20(2H，m)。
中间体11
O-[4-(氨基甲基)苯基]-N-[(苄氧基)羰基]-L-高丝氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700481
根据下述方法(方案13)制备标题中间体。
Figure A20078003993700482
方案13
步骤1-(4-羟基苄基)氨基甲酸叔丁酯
向4-(氨基甲基)苯酚(200毫克，1.62毫摩尔)在MeOH(2.5毫升)的溶液中加入碳酸氢钠(476毫克，5.68毫摩尔)和BOC2O(390毫克，1.79毫摩尔)。将该溶液在室温下搅拌72小时。反应混合物在水(20毫升)和EtOAc(20毫升)之间进行分配。分离有机层，水层用EtOAc(10毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，减压浓缩，得到黄色油状产物(360毫克)。ESMS：m/z 224[M+H]+。
步骤2-N-[(苄氧基)羰基]-O-(4-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯
采用中间体3B，根据方案12步骤2的方法制备。
ESMS：m/z 515[M+H]+。
步骤3-O-[4-(氨基甲基)苯基]-N-[(苄氧基)羰基]-L-高丝氨酸叔丁酯
将N-[(苄氧基)羰基]-O-(4-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯(200毫克，0.39毫摩尔)溶解在4M HCl/二噁烷(1.5毫升)中，0℃搅拌20分钟。将反应混合物通过硅藻土过滤，用乙醇(15毫升)洗涤。残留物用EtOAc(15毫升)稀释，用1M NaOH溶液将pH调节至12。水层用EtOAc(3x10毫升)萃取，将合并的有机相干燥(MgSO4)，减压浓缩，得到无色油状标题中间体(152毫克，产率95％)。ESMS：m/z 224[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.36(5H，s)，7.19(2H，d，J＝8.5Hz)，6.83(2H，d，J＝8.3Hz)，5.12(2H，s)，4.45(1H，br.s.)，4.25(2H，d，J＝5.3Hz)，4.04(2H，t，J＝6.0Hz)，2.11-2.46(2H，m)和1.48(9H，s)。
中间体12A
哌嗪-1，2-二羧酸1苄基2-环戊基酯
Figure A20078003993700491
根据下述方法(方案14)制备标题中间体。
方案14
步骤1-哌嗪-1，2，4-三羧基1-苄基4-叔丁基2-环戊基酯
0℃，向1-[(苄氧基)羰基]-4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-2-羧酸(1.00克，2.85毫摩尔)在DCM(20毫升)的溶液中加入环戊醇(520μL，5.70毫摩尔)、EDC(602毫克，3.14毫摩尔)和DMAP(35毫克，0.29毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌48小时后，减压去除溶剂。将粗品残留物溶解在EtOAc(30毫升)中，用1M HCl(15毫升)、1M Na2CO3(15毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，减压去除溶剂，得到产物(1.23克，95％产率)。ESMS：m/z 433[M+H]+。
步骤2-哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-环戊基酯
将哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-环戊基酯(200毫克，0.39毫摩尔)溶解在4MHCl/二噁烷(3毫升)中，0℃搅拌1小时。将反应混合物减压浓缩，得到无色油状标题中间体(145毫克)。ESMS：m/z 333[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.20-7.28(5H，m)，5.16-5.17(1H，m)，5.01-5.09(2H，m)，4.49-4.60(1H，m)，3.82(1H，t J＝14.8Hz)，3.43(1H，t J＝12.9Hz)，2.26-3.12(4H，m)和1.51-1.76(8H，m)。
中间体12B
4-(2-氨基乙基)哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-环戊基酯
根据下述方法(方案15)制备标题中间体。
Figure A20078003993700512
方案15
步骤1-4-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}哌嗪-1，2-二羧酸1-叔丁基2-环戊基酯
向哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-环戊基酯[中间体12A](165毫克，0.50毫摩尔)DCE(8毫升)的溶液中加入(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(72毫克，0.45毫摩尔)。室温下搅拌10分钟后，加入AcOH(35μL)和STAB(287毫克，1.35毫摩尔)。搅拌1小时后，将混合物用饱和NaHCO3(2毫升)淬灭，用DCM(10毫升)稀释。有机层用1M HCl(10毫升)、1M Na2CO3(10毫升)和盐水(10毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压蒸发，分离得到粗产物(240毫克)。ESMS：m/z 476[M+H]+。
步骤2-4-(2-氨基乙基)哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-环戊基酯.
根据[方案14步骤2]的方法。
ESMS：m/z 376[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.17-7.31(5H，m)，4.98-5.20(3H，m)，4.44-4.91(2H，m)，3.83(1H，t，J＝14.8Hz)，3.04-3.52(4H，m)，1.91-2.46(4H，m)和1.44-1.85(8H，m)。
中间体12C
4-(2-氨基乙基)哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-叔丁基酯
Figure A20078003993700521
根据下述方法(方案16)制备标题中间体。
Figure A20078003993700522
方案16
步骤1-哌嗪-1，2，4-三羧酸1-苄基2，4-二-叔丁基酯
0℃，向1-[(苄氧基)羰基]-4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-2-羧酸(500毫克，1.37毫摩尔)在DCM(10毫升)和环己烷(10毫升)的溶液中加入三氟化硼三乙基醚合物(boron trifluoride triethyl etherate)，然后立即在15分钟的时间内缓慢加入用环己烷(10毫升)配制的三氯亚氨逐乙酸叔丁酯(600毫克，2.74毫摩尔)。将该反应液升高至室温，搅拌30分钟。加入碳酸氢钠(80毫克)，继续搅拌10分钟后，通过硅藻土过滤。用DCM彻底洗涤硅藻土，减压蒸发滤液中的溶剂。用柱色谱纯化残留物(10％EtOAc/庚烷)，得到白色固体(0.240克，产率42％)。ESMS：m/z 443[M+H]+。
步骤2-哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-叔丁基酯
将哌嗪-1，2，4-三羧酸1-苄基2，4-二-叔丁基酯(240毫克，0.57毫摩尔)溶解在4M HCl/二噁烷(1.5毫升)中，室温下搅拌1小时。将该混合物稀释到EtOAc(10毫升)中，用2M NaOH洗涤。然后将有机层干燥(MgSO4)，减压蒸发，得到粗产物(240毫克)。ESMS：m/z 321[M+H]+。
步骤3-4-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-叔丁基酯
根据[方案15步骤1]的方法。
ESMS：m/z 464[M+]+。
步骤4-4-(2-氨基乙基)哌嗪-1，2-二羧酸1-苄基2-叔丁基酯
根据[方案13步骤3]的方法
ESMS：m/z 364[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.17-7.31(5H，m)，4.98-5.20(3H，m)，4.44-4.91(2H，m)，3.83(1H，t，J＝14.8Hz)，3.04-3.52(4H，m)，1.91-2.46(4H，m)和1.35(9H，s)。
中间体13
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]戊-4烯酸-环戊酯
Figure A20078003993700531
根据下述方法(方案17)制备标题中间体。
Figure A20078003993700541
方案17
步骤1-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]戊-4烯酸
0℃，向(2S)-2-氨基戊-4烯酸(1.00克，8.70毫摩尔)在1M NaOH(20毫升)和二噁烷(10毫升)的溶液中加入BOC2O(2.28克，10.5毫摩尔)。将该反应混合物升高至室温，继续搅拌18小时。检查pH，需要时调节至碱性。将反应混合物减压浓缩，水相用Et2O(2x10毫升)洗涤以去除过量的BOC2O。用2MH2SO4将水相酸化至pH2，用EtOAc(4x20毫升)萃取，同时每次用氯化钠饱和水相。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到产物(2.2克，100％产率)。ESMS m/z：238[M+Na]+。
步骤2-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]戊-4烯酸环戊酯
向(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-戊-4烯酸(2.20克，10.2毫摩尔)在DCM(50毫升)的溶液中加入DMAP(125毫克，1.02毫摩尔)、环戊醇(1.1毫升，12.2毫摩尔)和EDC(2.15克，11.2毫摩尔)。将反应液搅拌65小时并减压浓缩。用柱色谱纯化(5％EtOAc/庚烷)，得到澄清油状标题中间体(1.75克，产率60％)。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ：5.61-5.79(1H，m)，5.21(1H，dd，J＝8.3，3.4Hz)，5.15(1H，dd，J＝2.9，1.2Hz)，5.10(1H，d，J＝1.3Hz)，4.25-4.38(1H，m)，2.49(1H，dd，J＝12.8，6.4Hz)，1.53-1.92(8H，m)和1.44(9H，s)。
实施例1
4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-L- 苯基丙氨酸环戊酯
Figure A20078003993700551
根据下述方法(方案18)制备标题化合物。
方案18
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-L-苯基丙氨酸环戊酯
向(7R)-2-氯-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮[中间体1](100毫克，0.34毫摩尔)在2-乙氧基乙醇(2毫升)的溶液中加入4-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-L-苯基丙氨酸环戊酯[中间体6A](170毫克，0.51毫摩尔)。将该反应混合物在150℃加热4小时，冷却并减压浓缩，得到褐色残留物。用柱色谱纯化残留物(5％甲醇/1％NH4OH的EtOAc溶液)，得到黄色固体产物(89毫克，产率43％)。ESMS：m/z 607[M+H]+。
步骤2-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-L-苯基丙氨酸环戊酯
向(S)-2-叔丁氧基羰基氨基-3-[4-((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-L-苯基丙氨酸环戊酯(32毫克，0.05毫摩尔)在DCM(3毫升)的溶液中加入4M HCl/二噁烷(3毫升)。将该反应混合物在室温下搅拌4小时，减压浓缩得到褐色残留物。用饱和NaHCO3溶液(3毫升)将残留物的pH调节至9，然后用EtOAc(3x10毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到白色固体的标题化合物(9毫克，产率34％)。ESMS：m/z 507[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：7.43(2H，d，J＝7.7Hz)，7.04-7.33(3H，m)，5.06-5.24(1H，m)，4.02-4.18(1H，m)，4.20-4.44(2H，m)，3.14(2H，m)，2.83-11.04(1H，s)，1.32-2.14(18H，m)和0.80(3H，t，J＝7.4Hz)。
实施例2
(2S，4E)-2--氨基-5-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)戊-4烯酸环戊酯
Figure A20078003993700561
根据下述方法(方案19)制备标题化合物：
Figure A20078003993700562
方案19
步骤1-(7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-碘苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮
向(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]戊-4烯酸环戊酯[中间体13](175毫克，0.62毫摩尔)在DMF(3毫升)的溶液中加入(7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-碘-苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮[中间体2F](197毫克，0.41毫摩尔)、Pd(dppf)Cl2(34毫克，0.04毫摩尔)、Et3N(0.13毫升，0.90毫摩尔)和NBu4Br(133毫克，0.40毫摩尔)。将该反应混合物在微波中120℃加热1小时，并减压浓缩。使粗品残留物吸收到二氧化硅上并用柱色谱纯化(40％EtOAc/庚烷)，得到产物(72毫克，产率30％)。ESMS m/z：633[M+H]+。
步骤2-(2S，4E)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)戊-4烯酸环戊酯
向(7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-碘苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(36毫克，0.06毫摩尔)在DCM(2毫升)的溶液中加入4M HCl/二噁烷(20μl，0.08毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌2小时，然后减压浓缩。将残留物重新溶解在DCM(10毫升)中，用1M NaHCO3(10毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压蒸发。反相色谱纯化后得到黄色油状标题化合物(3毫克，产率10％)。ESMS m/z：533[M+H]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ：7.55-7.62(1H，m)，7.39-7.51(4H，m)，6.61(1H，d，J＝15.6Hz)，6.17(1H，ddd，J＝15.4，7.6，7.3Hz)，5.26-5.34(1H，m)，4.39(1H，dd，J＝6.3，3.3Hz)，4.32(1H，t，J＝8.8Hz)，4.17(1H，t，J＝6.2Hz)，3.25(3H，s)，2.83(2H，t，J＝6.7Hz)，1.79-2.06(9H，m)，1.54-1.78(9H，m)和0.86(3H，t，J＝7.4Hz)
实施例3
O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基} 苯基)-L-高丝氨酸环戊酯
Figure A20078003993700571
根据下述方法(方案20)制备标题化合物。
Figure A20078003993700581
方案20
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)-L-高丝氨酸环戊酯
Figure A20078003993700582
向(7R)-8-环戊基-7-乙基-2-[(4-羟基苯基)氨基]-5-甲基-7，8-二氢蝶啶-6(5H)-酮_[中间体2A](120毫克，0.33毫摩尔)在DMF(2毫升)的溶液中加入(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体3A](114毫克，0.33毫摩尔)和K-2CO3(90毫克，0.65毫摩尔)。将该反应混合物在40℃搅拌40小时后，用EtOAc(25毫升)稀释反应混合物。将混合物用水(2x25毫升)和盐水(25毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到褐色的油。用柱色谱纯化(100％EtOAc)得到淡褐色固体产物(177毫克，产率85％)。ESMS：m/z 637[M+H]+。
步骤2-O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)-L-高丝氨酸环戊酯
Figure A20078003993700591
将N-(叔丁氧基羰基)-O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)-L-高丝氨酸环戊酯(177毫克，0.28毫摩尔)悬浮在4M HCl/二噁烷(2毫升)溶液中。将该反应混合物在室温搅拌30分钟，减压浓缩得到稠厚的黄色油。用Et2O研磨得到灰白色固体，该固体在DCM(25毫升)和饱和Na2CO3溶液(25毫升)之间进行分配。将有机层分离，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到灰白色固体的标题化合物(90毫克，产率60％)。ESMS：m/z537[M+H]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ：7.55(1H，s)，7.32(2H，d，J＝9.0Hz)，6.76(2H，d，J＝9.0Hz)，5.15-5.09(1H，m)，4.28-4.19(1H，m)，4.11(1H，dd，J＝3.6，7.5Hz)，4.01-3.95(2H，m)，3.55(1H，t，J＝6.5Hz)，3.20(3H，s)，2.11-1.51(20H，m)和0.75(3H，t，J＝7.5Hz)。
采用合适的中间体，根据类似于上述方法(方案20)的方法制备下表所列出的化合物。
  实施例   采用的中间体   名称   ESMS
4 2B和3A   O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯基)-L-高丝氨酸环戊酯 m/z 567[M+H]+
实施例5
(2S)-2-氨基-4-[(4-{[7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶- 2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]丁酸环戊酯
Figure A20078003993700601
根据下述一般方法(方案21)制备标题化合物。
Figure A20078003993700602
方案21
步骤1-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]丁酸环戊酯
Figure A20078003993700603
向4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢-蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸[中间体2C](200毫克，0.47毫摩尔)在DCM(5毫升)的溶液中加入O-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(166毫克，0.52毫摩尔)和DIPEA(0.16毫升，0.94毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌30分钟后，加入(2S)-4-氨基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体7A](269毫克，0.84毫摩尔)。将该反应混合物在室温下继续搅拌18小时后，用DCM(20毫升)稀释，用水(2x20毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到黄色的油。用柱色谱纯化(100％EtOAc)得到黄色固体产物(228毫克，产率70％)。ESMS：m/z 694[M+H]+。
步骤2-(2S)-2-氨基-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]丁酸环戊酯
将(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]丁酸环戊酯(228毫克，0.33毫摩尔)溶解在DCM(20毫升)中，加入4M HCl/二噁烷(10毫升)。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并减压浓缩。残留物溶解在EtOAc(50毫升)中，用饱和Na2CO3溶液(25毫升)、盐水(25毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到白色固体的标题化合物(180毫克，产率92％)。ESMS：m/z594[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.55(1H，d，J＝8.4Hz)，7.70(2H，br s)，7.62(1H，s)，7.48(1H，d，J＝1.5Hz)，7.32(1H，dd，J＝2.0，8.6Hz)，5.23-5.19(1H，m)，4.55-4.49(1H，m)，4.24(1H，dd，J＝3.6，7.8Hz)，3.99(3H，s)，3.92-3.80(1H，m)，3.59-3.47(2H，m)，3.35(3H，s)，2.14-1.60(22H，m)和0.90(3H，t，J＝7.4Hz)。
采用合适的中间体，根据类似于上述方法(方案21)的方法制备下表所列出的化合物。
实施例  步骤1采用的中间体 名称 ESMS
6 2C和8   (4S)-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-脯氨酸环戊酯   m/z 606[M+H]+
7 2C和6A   4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯基丙氨酸环戊酯   m/z 656[M+H]+
8 2C和7B   N6-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)赖氨酸环戊酯 m/z 622[M+H]+
9 2C和10   O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸环戊酯 m/z 700[M+H]+
10 2C和9   3-(1-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌啶-4-基)丙氨酸环戊酯 m/z 691[M+H]+
＊11 2C和6B   4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯基丙氨酸叔丁酯   m/z 644[M+H]+
＊为了实现选择性Boc脱保护[方案21步骤2]，将混合物在0℃搅拌30分钟而不是室温下搅拌2小时。
实施例12
O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2- 基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700631
根据下述一般方法(方案22)制备标题化合物。
Figure A20078003993700632
方案22
步骤1-N-[(苄氧基)羰基]-O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700633
采用中间体2C和11，根据[方案21步骤1]的方法。
步骤2-O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700634
氮气气氛下，向N-[(苄氧基)羰基]-O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯(132毫克，0.16毫摩尔)在EtOH(5毫升)的溶液中加入Pd/C(30毫克，20％w/w)。将该反应混合物抽真空并置于氢气气氛下。再重复该过程2次，氢气气氛下将反应液搅拌1小时。使反应混合物通过硅藻土过滤，滤液减压浓缩并用柱色谱纯化(10％MeOH/DCM)，得到白色固体状标题化合物(42毫克，38％产率)。ESMS：m/z 688[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.52(1H，d，J＝8.5Hz)，7.56-7.70(2H，m)，7.48(1H，d，J＝1.3Hz)，7.27-7.32(2H，m)，6.88(2H，d，J＝8.5Hz)，6.53(1H，t，J＝5.5Hz)，4.44-4.62(3H，m)，4.21(1H，dd，J＝7.7，3.6Hz)，3.95(3H，s)，3.59(1H，dd，J＝7.6，5.0Hz)，3.31(3H，s)，2.08-2.28(4H，m)，1.66-2.01(10H，m)，1.47(9H，m)和0.87(3H，t，J＝7.5Hz)。
采用合适的中间体，根据类似于上述方法(方案22)的方法制备下表所列出的化合物。
实施例  步骤1所用的中间体 名称 ESMS
13 2C和12A   4-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)哌嗪-2-羧酸环戊酯 m/z 606[M+H]+
14 2C和12B   4-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌嗪-2-羧酸环戊酯 m/z 325[(M+2)/2]+
15 2C和12C   4-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌嗪-2-羧酸叔丁基酯 m/z 637[M+H]+
实施例16
(2S)-2-氨基-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸环戊酯
Figure A20078003993700651
根据下述一般方法(方案23)制备标题化合物。
Figure A20078003993700661
方案23
步骤1-3-[(4-[{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
Figure A20078003993700662
向4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸[中间体2C](200毫克，0.47毫摩尔)在DCM(10毫升)的溶液中加入TBTU(170毫克，0.52毫摩尔)和DIPEA(163μl，0.94毫摩尔)。将该混合物在室温下搅拌30分钟。加入3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(98μl，0.56毫摩尔)，将该反应混合物在室温下继续搅拌2小时。将混合物用DCM(10毫升)稀释，用水(2x20毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(0-1％MeOH的DCM溶液)得到黄色固体状产物(220毫克，产率78％)。ESMS：m/z 594[M+H]+。
步骤2-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基-N-吡咯烷-3-基苯甲酰胺
Figure A20078003993700671
将3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(22毫克，0.36毫摩尔)溶解在4M HCl/二噁烷(6毫升)中，室温下搅拌1小时。减压浓缩反应液，得到白色固体状产物(120毫克，产率68％)。ESMS：m/z 494[M+H]+。
步骤3-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸环戊酯
Figure A20078003993700672
向搅拌的4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基-N-吡咯烷-3-基苯甲酰胺(120毫克，0.25毫摩尔)在DMF(5毫升)的溶液中加入K2CO3(140毫克，1.0毫摩尔)、NaI(75μl，0.5毫摩尔)和(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸(S)-环戊基酯[中间体3A](130毫克，0.37毫摩尔)。将该反应混合物在80℃搅拌过夜，然后用EtOAc(10毫升)稀释。将混合物用水(2x10毫升)和盐水(10毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化残留物(0-2％MeOH/DCM)得到淡黄色固体产物(140毫克，71％产率)。ESMS：m/z 522[M+H]+。
步骤4-(2S)-2-氨基-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸环戊酯
Figure A20078003993700681
将(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸环戊酯(140毫克，0.18毫摩尔)溶解在4M HCl/二噁烷(5毫升)中并在室温下搅拌2小时。将反应液减压浓缩。残留物用Et2O研磨，过滤，减压干燥，得到白色固体状标题化合物(60毫克，产率50％)。ESMS：m/z 663[M+H]+。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：8.56(1H，d，J＝8.5Hz)，7.69(1H，s)，7.61(1H，s)，7.51(1H，d，J＝1.7Hz)，7.44(1H，d，J＝8.7Hz)，6.66-6.72(1H，m)，5.09-5.16(1H，m)，4.47-4.69(2H，m)，4.23(1H，dd，J＝7.9，3.8Hz)，3.99(3H，s)，3.48(1H，t，J＝6.2Hz)，3.34(3H，s)，2.95-3.05(1H，m)，2.83(1H，d，J＝10.0Hz)，2.46-2.71(3H，m)，2.11-2.45(3H，m)，1.47-2.05(22H，m)，0.89(3H，t，J＝7.5Hz)。
采用合适的中间体，根据类似于上述方法(方案23)的方法制备下表所列出的化合物。
实施例  步骤3中所用的中间体 名称 ESMS
17 4A   (2R)-2-氨基-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸环戊酯 m/z 663[M+H]+
实施例18
(2S)-2-氨基-4-{6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己-3-基} 丁酸环戊酯
Figure A20078003993700691
根据下述方法(方案24)制备标题化合物：
Figure A20078003993700692
方案24
步骤1-6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-3-羧酸叔丁酯
向搅拌的4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸[中间体2C](200毫克，0.47毫摩尔)在DCM(10毫升)的溶液中加入DIPEA(0.16毫升，0.94毫摩尔)和TBTU(167毫克，0.52毫摩尔)。将反应液在室温下搅拌30分钟后，加入6-氨基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-3-羧酸叔丁酯[WO2006123121](111毫克，0.56毫摩尔)。将反应液继续搅拌30分钟后，混合物用DCM(15毫升)进行稀释，用水(2x5毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。所得固体用Et2O研磨后得到白色固体状产物(230毫克，81％产率)。ESMS：m/z 606[M+H]+。
步骤2-N-3-氮杂二环[3.1.0]己-6-基-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰胺
将6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-3-羧酸叔丁酯(230毫克，0.38毫摩尔)悬浮在4M HCl/二噁烷(5毫升)中，并将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时，减压浓缩。残留物用Et2O研磨，然后在DCM(5毫升)和饱和Na2CO3溶液(5毫升)之间进行分配。将有机层用饱和Na2CO3溶液洗涤，干燥(MgSO4)，减压浓缩，得到白色固体状产物(152毫克，产率80％)。ESMS：m/z506[M+H]+。
步骤3-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己-3-基}丁酸环戊酯
向搅拌的N-3-氮杂二环[3.1.0]己-6-基-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰胺(152毫克，0.30毫摩尔)在DMF(3毫升)的溶液中加入(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体3A](157毫克，0.45毫摩尔)、K2CO3(166毫克，1.20毫摩尔)和NaI(90毫克，0.60毫摩尔)。将该混合物在80℃加热24小时。减压浓缩反应混合物，所得残留物溶解在EtOAc(10毫升)中，用盐水(10毫升)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到褐色固体状标题产物(228毫克，产率98％)。ESMS：m/z 775[M+H]+。
步骤4-(2S)-2-氨基-4-{6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己-3-基}丁酸环戊酯
将(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己-3-基}丁酸环戊基酯(228毫克，0.29毫摩尔)悬浮在4M HCl/二噁烷(5毫升)中，将该反应混合物在室温下搅拌1.5小时，减压浓缩。残留物用制备型HPLC进行纯化，然后冻干浓缩产物60小时。将所得固体溶解在DCM(5毫升)和Na2CO3(5毫升)中，搅拌20分钟。分离有机层，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到澄清油状标题化合物(23毫克，产率12％)。ESMS：m/z 675[M+H]+。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ：8.47(1H，d，J＝8.5Hz)，7.43-7.65(3H，m)，7.25(1H，d，J＝6.6Hz)，5.23(2H，s)，5.16(1H，t，J＝5.9Hz)，4.34-4.49(1H，m)，4.15(1H，dd，J＝7.9，3.8Hz)，3.92(2H，s)，3.55(1H，dd，J＝8.4，3.9Hz)，3.22-3.31(4H，m)，3.18(1H，d，J＝9.0Hz)，2.92(1H，br.s)，2.57(2H，t，J＝8.3Hz)，2.34-2.44(2H，m)，1.38-2.15(20H，m)和0.81(3H，t，J＝7.4Hz)。
实施例19
5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢-蝶啶-2- 基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-L-正缬氨酸环戊酯
Figure A20078003993700711
根据下述方法制备标题化合物(方案25)：
Figure A20078003993700721
方案25
步骤1-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-N-(4-碘苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺
向搅拌的4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸[中间体2C](200毫克，0.47毫摩尔)在THF(4毫升)的溶液中加入4-碘代苯胺(154毫克，0.71毫摩尔)、DMAP(6毫克，0.05毫摩尔)、DIPEA(0.25毫升，1.41毫摩尔)和EDC(99毫克，0.52毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜，用水洗涤(10毫升)，干燥(MgSO4)并减压浓缩。用柱色谱纯化(40-50％EtOAc/庚烷)得到产物(81.9毫克，产率28％)。ESMS m/z：627[M+H]+。
步骤2-(2S，4E)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯
向搅拌的4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-N-(4-碘苯基)-3-甲氧基苯甲酰胺(81.9毫克，0.13毫摩尔)在DMF(3毫升)的溶液中加入(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]戊-4烯酸环戊酯[中间体13](56毫克，0.20毫摩尔)、Pd(dppf)Cl2(11毫克，0.01毫摩尔)、Et3N(40μl，0.29毫摩尔)和NBu4Br(42毫克，0.13毫摩尔)。将该反应混合物在微波中120℃加热1小时，减压浓缩。将粗品残留物加载到二氧化硅上，用柱色谱纯化(40％EtOAc/庚烷)得到产物(50毫克，30％产率)。ESMS m/z：NI。
步骤3-N-{[(叔丁氧基羰基)氧]羰基}-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-L-正缬氨酸环戊酯
用MeOH(5毫升)配制的(2S，4E)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯(50毫克，0.06毫摩尔)通过H-CubeTM连续氢化器(TN公司(Thales Nanotechnology)，HC-2，SS)。采用30mmCatCartTM(10％Pd/C)，在完全H2模式下进行反应。维持1毫升/分钟的流速30分钟，温度25℃，H2压力1巴。然后将溶液蒸发至干，得到产物(50毫克，100％产率)。ESMS m/z：784[M+H]+。
步骤4-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-L-正缬氨酸环戊酯
向N-{[(叔丁氧基羰基)氧]羰基}-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-L-正缬氨酸环戊酯(25毫克，0.03毫摩尔)在DCM(1毫升)的溶液中加入4M HCl/二噁烷(30μl，0.12毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，减压蒸发。通过制备型HPLC进行纯化，得到白色固体状标题化合物(3毫克，产率14％)。ESMS m/z：342[(M+2)/2]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ；ppm 8.14(1H，d，J＝8.1Hz)，7.66-7.78(4H，m)，7.26-7.54(3H，m)，5.37(1H，dd，J＝4.0，1.9Hz)，4.53(1H，dd，J＝6.8，3.4Hz)，4.45(1H，t，J＝8.2Hz)，4.09(2H，s)，3.38(3H，s)，2.73-2.95(2H，m)，1.90-2.21(10H，m)，1.62-1.87(12H，m)和0.94(3H，t，J＝7.5Hz)。
实施例20
(2S,4E)-2-氨基-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯
Figure A20078003993700741
根据以下方法(方案26)制备标题化合物：
方案26
步骤1-(2S，4E)-2-氨基-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯
向搅拌的(2S，4E)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯[方案25，步骤2](36毫克，0.06毫摩尔)在DCM(2毫升)的溶液中加入4M HCl/二噁烷(20μL，0.08毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌2小时，减压浓缩并重新溶解在DCM(10毫升)中。有机层用1M NaHCO3(10毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并蒸发至干。通过制备型HPLC纯化，得到黄色油状标题化合物(3毫克，10％产率)。ESMS m/z：342[M/2]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ：7.55-7.62(1H，m)，7.39-7.51(4H，m)，6.61(1H，d，J＝15.6Hz)，6.17(1H，ddd，J＝15.4，7.6，7.3Hz)，5.26-5.34(1H，m)，4.39(1H，dd，J＝6.3，3.3Hz)，4.32(1H，t，J＝8.8Hz)，4.17(1H，t，J＝6.2Hz)，3.25(3H，s)，2.83(2H，t，J＝6.7Hz)，1.79-2.06(9H，m)，1.54-1.78(9H，m)和0.86(3H，t，J＝7.4Hz)。
实施例21
5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢-蝶啶-2- 基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-4-羟基-L-正缬氨酸环戊酯
Figure A20078003993700751
根据以下方法(方案27)制备标题化合物：
Figure A20078003993700752
方案27
步骤1-N-(叔丁氧基羰基)-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-4-羟基-L-正缬氨酸环戊酯
0℃，向搅拌的(2S，4E)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}戊-4烯酸环戊酯[方案25，步骤2](130毫克，0.17毫摩尔)在THF(2毫升)的溶液中加入硼烷-二甲基硫化物复合物(complex)(80ul，0.87毫摩尔)。将该混合物在0℃搅拌5小时后，加入乙醇(0.3毫升)、水(0.27毫升)和过硼酸钠四水合物(133毫克，0.87毫摩尔)。将反应液在0℃继续搅拌3小时，然后在室温下搅拌8小时。将反应混合物浓缩，用EtOAc(3x50毫升)萃取，干燥(MgSO4)，浓缩得到产物(90毫克，75％产率)。ESMS：m/z 800[M+H]+。
步骤2-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢-蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]苯基}-4-羟基-L-正缬氨酸环戊酯
根据[方案26，步骤2]的方法
ESMS：m/z 700[M+H]+。1H NMR(300MHz，MeOD)δ：8.12(1H，d，J＝8.3Hz)，7.74-7.66(5H，m)，7.40(2H，dd J＝1.8，8.6Hz)，5.31(1H，m)，4.49-4.38(3H，m)4.04(3H，s)，3.33(3H，s)，3.10-3.09(2H，m)，2.17-1.62(22H，m)和0.89(3H，t，J＝7.5Hz)。
实施例22
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯
Figure A20078003993700761
根据下述一般方法(方案28)制备标题化合物：
Figure A20078003993700771
方案28
步骤1-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-羧酸叔丁酯
Figure A20078003993700772
向4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酸[中间体2C](500毫克，1.18毫摩尔)在DCM(20毫升)的悬浮液中加入TBTU(415毫克，1.29毫摩尔)和DIPEA(0.41毫升，2.35毫摩尔)。将该反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后加入4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(282毫克，1.41毫摩尔)。将该反应混合物在室温下继续搅拌30分钟后，用DCM(30毫升)稀释。该溶液用水(2x30毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到稠厚的褐色油。用Et2O/庚烷(1∶3)研磨得到浅褐色固体状产物(528毫克，产率74％)。ESMS：m/z 608[M+H]+。
步骤2-4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基-N-哌啶-4-基苯甲酰胺
Figure A20078003993700781
将4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(528毫克，0.87毫摩尔)悬浮在4M HCl/二噁烷(10毫升)溶液中。将该反应混合物在室温下搅拌1小时，减压浓缩。残留物用Et2O研磨，然后在DCM(100毫升)和饱和Na2CO3(50毫升)之间进行分配。分离有机层，用饱和Na2CO3(50毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到稠厚的黄色油状产物，该产物静置后固化(407毫克，产率92％)。ESMS：m/z 508[M+H]+。
步骤3-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯
向4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基-N-哌啶-4-基苯甲酰胺(100毫克，0.20毫摩尔)在DMF(2毫升)的溶液中加入(2S)-4-溴-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸环戊酯[中间体3A](103毫克，0.30毫摩尔)、K2CO3(109毫克，0.79毫摩尔)和NaI(59毫克，0.40毫摩尔)。将该反应混合物在80℃搅拌15小时，用EtOAc(20毫升)稀释，用水(2x20毫升)、盐水(20毫升)洗涤，干燥(MgSO4)。减压浓缩溶剂，得到黄色的油。用柱色谱纯化(5％MeOH/DCM)得到白色固体状产物(86毫克，产率56％)。ESMS：m/z 777[M+H]+。
步骤4(方法A)-(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯
Figure A20078003993700791
将(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯(86毫克，0.11毫摩尔)悬浮在4M HCl/二噁烷(5毫升)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌20分钟，减压浓缩。残留物用Et2O研磨，然后在DCM(25毫升)和饱和Na2CO3(25毫升)之间进行分配。分离有机层，干燥(MgSO4)，减压浓缩，得到白色固体状标题化合物(49毫克，产率65％)。ESMS m/z 677[M+H]+。1H NMR(300MHz，CD3OD)8.49(1H，d，J＝9.0Hz)，7.77(1H，s)，7.50-7.47(2H，m)，5.24-5.19(1H，m)，4.54-4.47(1H，m)，4.28(1H，dd，J＝3.5，7.7Hz)，4.01(3H，s)，3.95-3.87(1H，m)，3.66-3.59(1H，m)，3.32(3H，s)，3.01(2H，s)，2.50(2H，t，J＝7.2Hz)，2.19-2.10(2H，m)，1.99-1.68(23H，m)和0.86(3H，t，J＝7.5Hz)。
实施例23
5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2- 基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸叔丁酯
Figure A20078003993700801
根据上述一般方法和方案(方案28)制备标题化合物。
步骤1-3采用中间体2C(步骤1)和3D(步骤3)，根据方案28。
采用下述方法B进行步骤4的脱保护步骤。
步骤4(方法B)-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸叔丁酯
向步骤3的产物；N-[(苄氧基)羰基]-5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸叔丁酯(290毫克，0.36毫摩尔)在EtOAc(6毫升)的溶液中加入氢氧化钯(60毫克，20％w/w)。对该系统抽真空，并置于氢气气氛下(采用3-通装置(3-way tap apparatus)和充满氢气的气球)，重复该过程2次，将混合物在氢气气氛、室温下搅拌90小时。排出系统中的氢气，在硅藻土上滤出钯残留物。用EtOAc彻底洗涤硅藻土，将合并的滤液减压蒸发。用柱色谱纯化残留物(100％EtOAc以去除杂质，然后是5-10％MeOH/DCM以洗脱产物)得到白色固体状标题化合物(37毫克，产率15％)。ESMS：m/z 679[M+H]+。1HNMR(300MHz，CDCl3)δ：8.53(1H，d，J＝8.5Hz)，7.67(1H，s)，7.58(1H，s)，7.47(1H，d，J＝1.5Hz)，7.34(1H，dd，J＝8.5，1.5Hz)，6.45(1H，d，J＝7.5Hz)，4.50(1H，t，J＝7.7Hz)，4.21(1H，dd，J＝7.8，3.7Hz)，4.00-4.10(1H，m)，3.97(3H，s)，3.31-3.44(1H，m)，3.32(3H，s)，2.95(2H，d，J＝8.9Hz)，2.40(2H，t，J＝6.7Hz)，1.59-2.21(20H，m)，1.45(9H，s)和0.87(3H，t，J＝7.4Hz)。
采用合适的中间体，根据类似于上述方法(方案28)的方法制备下表所列出的化合物。
Figure A20078003993700811
实施例32
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8- 四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸(1R，2S，5R)-2- 异丙基-5-甲基环己基酯
Figure A20078003993700821
根据下述方法(方案29)制备标题化合物：
Figure A20078003993700822
方案29
步骤1-(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基酯
向(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基酯[中间体5](140毫克，0.39毫摩尔)在DCE(15毫升)的溶液中加入4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基-N-哌啶-4-基苯甲酰胺[实施例22，步骤2](108毫克，0.30毫摩尔)。将该溶液搅拌30分钟后，加入三乙酰氧基硼氢化钠(193毫克，0.91毫摩尔)。将该反应液在室温下继续搅拌18小时。加入NaHCO3(10毫升)，将反应液搅拌20分钟。加入DCM(10毫升)，分离有机层。水层用DCM(2x10毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并减压浓缩。快速柱色谱(2％MeOH/DCM)纯化得到澄清油状产物(68毫克，产率24％)。ESMS m/z 847[M+H]+。
步骤2-(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基酯
向(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸(1R，2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基酯(11毫克，0.01毫摩尔)在DCM(1毫升)的溶液中加入4M HCl/二噁烷(1毫升)。将该溶液在室温下搅拌3小时。然后减压浓缩混合物，得到白色固体状标题化合物(6.1毫克，63％产率)。ESMS m/z 747[M+H]+。1HNMR(300MHz，MeOD)δ7.90(1H，d，J＝8.3Hz)，7.68-7.55(3H，m)，4.56-4.47(1H，m)，4.45-4.07(4H，m)，4.01(3H，s)，3.75(2H，m)，3.67(2H，s)，2.77(1H，m)，2.64-1.06(38H，m)和082(3H，d，J＝7.0Hz)。
实施例33
4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}- 3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯丙氨酸
Figure A20078003993700831
根据下述方法(方案30)制备标题化合物：
Figure A20078003993700841
方案30
步骤1-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯丙氨酸
向THF(3毫升)配制的4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯丙氨酸环戊酯[实施例7](45毫克，70μmol)中加入氢氧化锂(8.4毫克，0.35毫摩尔)的水(3毫升)溶液。将该反应混合物在室温下搅拌过夜并减压浓缩。加水(4毫升)，用1MHCl将pH调节至pH＝5-6。用正丁醇(3x10毫升)萃取水相。将合并的有机层用水(5毫升)、盐水(5毫升)洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。经制备型HPLC纯化得到白色固体状标题化合物(37毫克，产率90％)。ESMS m/z：588[M+H]+。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ：10.17(1H，s)，8.48-8.75(1H，m)，8.18-8.34(4H，m)，7.83(1H，s)，7.73(2H，d，J＝8.7Hz)，7.61-7.67(2H，m)，7.23(2H，d，J＝8.5Hz)，4.36(1H，dd，J＝6.8，3.2Hz)，4.14-4.30(2H，m)，3.96(3H，s)，3.23(3H，s)，3.07(2H，d，J＝6.4Hz)，1.43-2.04(10H，m)和0.76(3H，t，J＝7.4Hz)。
根据上述方法(方案30)通过酯水解制备下表所列出的化合物。
  酯实施例编号 酸名称   酸实施例编号 ESMS
1   4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-L-苯丙氨酸 34   m/z 439[M+H]+
2   (2S，4E)-2-氨基-5-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)戊-4烯酸 35 m/z：465[M+H]+
3   O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}苯基)-L-高丝氨酸 36 m/z 469[M+H]+
4   O-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯基)-L-高丝氨酸 37 m/z 499[M+H]+
5   (2S)-2-氨基-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]丁酸(butananoic acid) 38 m/z 526[M+H]+
6   (4S)-4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-脯氨酸 39 m/z 538[M+H]+
8   N6-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)赖氨酸 40 m/z 554[M+H]+
9   O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸 41   m/z 632[M+H]+
13   4-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)哌嗪-2-羧酸 42 m/z 538[M+H]+
14   4-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌嗪-2-羧酸 43 m/z 581[M+H]+
16   (2S)-2-氨基-4-{3-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]吡咯烷-1-基}丁酸 44 m/z 595[M+H]+
18   (2S)-2-氨基-4-{6-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-3-氮杂二环[3.1.0]己-3-基}丁酸 45 m/z 607[M+H]+
24   5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸 46   m/z 623[M+H]+
  酯实施例编号   酸名称   酸实施例编号   ESMS
  27   5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-D-正缬氨酸   47   m/z 623[M+H]+
28   (2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸 48 m/z 593[M+H]+
30   (2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-氟苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸 49 m/z 598[M+H]+
31   (2R)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸 50 m/z 609[M+H]+
7   4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯丙氨酸 51   m/z 588[M+H]+
13   4-(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)哌嗪-2-羧酸 52 m/z 539[M+H]+
22   (2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸 53 m/z 609[M+H]+
生物学活性的测定
PLK1酶试验
在英国佩斯利英吉公司(Invitrogen，Paisley，UK)进行的试验中测定化合物抑制PLK-1激酶活性的能力。Z′-LYTETM生化试验采用基于荧光的偶联酶模式，建立在磷酸化和非磷酸化肽对蛋白酶解的敏感性的差异的基础上。用两个荧光团标记肽底物(一端一个)构成FRET对。在初次反应中，激酶将ATP的γ-磷酸酯转移至合成的FRET-肽中的单个丝氨酸或苏氨酸残基上。在二次反应中，位点特异性蛋白酶识别并切割(cleave)非磷酸化的FRET-肽。FRET-肽的磷酸化抑制了显影试剂的切割。切割破坏供体(即，香豆素)与FRET-肽上受体(即，荧光素)荧光团之间的FRET，而未切割的磷酸化FRET-肽保留FRET。采用放射测定法定量反应进程，该方法计算供体荧光团在400nm激发后供体发射与受体发射的比率(发射比)。
最终10μL激酶反应液包含2.8-25.3纳克PLK1，2μM Ser/Thr 16肽底物和在50mM HEPES pH 7.5中的ATP，0.01％BRIJ-35，10mM MgCl2，1mMEGTA。试验在Km或接近Km的ATP浓度下进行。室温下孵育激酶反应液60分钟后，加入5μL 1∶8显影试剂稀释液。将测试板在室温下继续孵育60分钟，在荧光板读数仪上测定。
由测试化合物在DMSO中的储备液的1/3对数稀释液得到一式两份数据点。由最高浓度10μM进行9个稀释步骤，包括“无化合物”的空白。收集数据并使用IDBS的XLfit软件进行分析。将剂量响应曲线拟合至模型号205(S形剂量响应模型)。由所得曲线，确定并记录50％抑制的浓度。
IC50结果被归入3个范围之一，如下：
范围A：IC50＜100nM，
范围B：IC50从100nM到500nM；
范围C：IC50＞500nM；
NT＝未检测
本文实施例化合物的结果在下述表格中给出。
细胞抑制实验
采用方法A或方法B进行细胞抑制实验。
方法A
将细胞以每孔500个的细胞密度接种到含有50μl适当培养液(如下所述)的96孔组织培养板中(1孔＝30mm2)。24小时后，加入50μl用相同培养液配制的化合物，进行4倍稀释使得最终浓度范围为0.15nM-2500nM(每个浓度n＝6)。然后将培养板置于37℃，5％CO2中培养120小时。根据制造商说明书，用WST-1(一种代谢指示染料，罗氏(Roche)目录号1 644 807)评价细胞增殖。结果以运载体响应百分比表示，IC50值表示抑制运载体响应50％时的化合物浓度。
HCT-116培养液-Dulbeccos MEM(西格玛(Sigma)D6546)加10％加热灭活的胎牛血清(Hyclone SH30071热费氏科技公司(Thermo Fischer Scientific))，含2mM谷胺酰胺(西格玛(Sigma)目录号G-7513)和50U/毫升青霉素和硫酸链霉素(西格玛目录号P-0781)。
方法B
根据细胞类型将细胞以一定的密度接种到含50μl适当培养液的96孔组织培养板中(1孔＝30mm2)[HCT-116是750个细胞/孔，Hut-78和U937是1500个细胞/孔]。
24小时后，加入50μl用相同培养液配制的化合物，进行12倍稀释使得最终浓度从10000nM到0.28pM(每个浓度n＝6)。
然后将培养板置于37℃，5％CO2中培养72小时。
采用氚标记的胸苷掺入试验测定细胞增殖。简言之，将细胞以0.4μCi/孔培养4小时，然后将细胞收集到滤垫上。将它们干燥，上面熔化麦勒闪烁计数片(meltilex scintillation sheet)，然后密封在袋中，在Trilux微β计数器上测定3H发射。
结果以运载体响应百分比表示，IC50值表示抑制运载体响应50％时的化合物浓度。
IC50结果被归入3个范围之一，如下：
范围A：IC50＜100nM，
范围B：IC50从100nM到500nM；
范围C：IC50＞500nM；
NT＝未检测
下表列出了本文实施例化合物获得的结果。
实施例编号   对PLK1的抑制活性  对HCT 116细胞系的抑制活性(方法A)
  1   A   B
  2   A   A
  3   A   B
  4   A   A
  5   A   A
  6   A   A
  7   B   A
  8   A   A
  9   B   A
  10   A   A
  11   A   B
  12   A   A
  13   A   B
  14   A   A
  15   A   A
  16   A   A
  17   A   A
  18   A   A
  19   A   A
  20   A   A
  21   NT   NT
  22   A   A
  23   A   A
  24   A   A
  25   A   A
  26   A   A
  27   A   A
  28   A   A
实施例编号   对PLK1的抑制活性  对HCT 116细胞系的抑制活性(方法A)
  29   A   A
  30   A   A
  31   A   A
  32   A   NT
  33   A   NT
  34   A   NT
35 A NT
  36   A   NT
  37   A   NT
  38   A   NT
  39   A   NT
  40   A   NT
  41   A   NT
  42   A   NT
  43   A   NT
44 A NT
  45   A   NT
  46   A   NT
  47   A   NT
  48   A   NT
  49   A   NT
  50   A   NT
  51   A   NT
  52   A   NT
  53   A   NT
破坏细胞羧酸酯酶试验
通过以下试验，测试任何给定的本发明化合物(其中R7是酯基团)以确定其是否符合被胞内酯酶水解的要求。
制备细胞提取物
将U937或HCT 116肿瘤细胞(～109)在4体积的Dulbeccos PBS(约1升)中洗涤，在4℃以525g离心10分钟。重复该操作2次，将最终的细胞团粒重悬在35毫升冷的均质化缓冲液中(Trizma 10mM，NaCl 130mM，CaCl20.5mM pH 7.0，25℃)。氮气孔穴化制备匀浆(700psi，4℃持续50分钟)。将匀浆置于冰上保存并补充最终浓度如下的抑制剂混合物：
亮肽酶素1μM
抑肽酶0.1μM
E648μM
抑胃酶肽1.5μM
苯丁抑制素162μM
抑糜酶素33μM
在525g离心10分钟澄清细胞匀浆之后，将所得上清液用作酯酶活性原料，-80℃储存备用。
酯裂解测定
采用根据上述方法制备的细胞提取物测定酯水解为相应的羧酸。为此，将细胞提取物(约30μg/总试样体积0.5毫升)在25℃时pH为7.5的Tris-HCl25mM，125mM NaCl缓冲液中，在37℃进行培养。在零时间，加入最终浓度2.5μM的酯(底物)，将样品在37℃培养适当的时间(通常0或80分钟)。加入3×体积的乙腈终止反应。对于零时间的样品，在酯化合物之前加入乙腈。在12000g离心5分钟后，由LCMS(Sciex API 3000，HP1100二元泵，CTCPAL)在室温下分析样品中的酯及相应的羧酸。色谱方法是基于AceCN(75x2.1mm)柱，流动相5-95％乙腈的水溶液/0.1％甲酸。
下表的数据表明，通过各种连接基团偶联至各种胞内酶抑制剂的一些氨基酸酯基序都可被胞内羧酸酯酶水解成相应的酸。
Figure A20078003993700941
下表示出，含可切割的酯酶基序的实施例22的化合物在细胞中的活性比缺乏酯酶基序的化合物，即化合物1(WO04076454中实施例46)高得多，虽然它们具有类似的酶活性。
Figure A20078003993700951

Claims (22)

1.式(I)的化合物或其盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物：
Figure A2007800399370002C1
式中，
R1是氢，或任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基；
R2是氢，或任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基；
R3和R3′独立地选自：氢、-CN、羟基、卤素、任选取代的(C1-C6)烷基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基或(C3-C6)环烷基、-NR5R6或C1-C4烷氧基，其中R5和R6独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
环A是最多具有12个环原子的任选取代的单环或双环碳环或杂环或环系统；
T是式R-L1-Y1-的基团，其中
Y1是键、-O-、-S-、-NR6-、-(C＝O)-、-S(O2)-、-(C＝O)NR6-、-NR6(C＝O)-、-S(O2)NR6-、-NR6S(O2)-或-NR6(C＝O)NR9-，其中R6和R9独立地是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；
L1是式-(Alk1)m(Q)n(Alk2)p-的二价基团，其中
m，n和p独立地是0或1，
Q是(i)具有5-13个环原子的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，或(ii)p为0的情况下，是式-Q1-X2-的二价基团，其中X2是-O-、-S-或NRA-，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基，Q1是具有5-13个环原子的任选取代的二价单环或双环碳环或杂环基团，
Alk1和Alk2独立地代表任选取代的二价C3-C7环烷基、或任选取代的直链或支链的C1-C6亚烷基、C2-C6亚烯基或C2-C6亚炔基基团，它们可任选地含有醚(-O-)，硫醚(-S-)或氨基(-NRA-)连接键或以这些基团为末端，其中RA是氢或任选取代的C1-C3烷基；
R是式(X)或(Y)的基团
其中
R7是羧酸基团(-COOH)，或可被一种或多种胞内羧酸酯酶水解形成羧酸基团的酯基；
R8是氢；或任选取代的C1-C6烷基、C3-C7环烷基、芳基或杂芳基或-(C＝O)R6、-(C＝O)OR6或-(C＝O)NR6，其中R6是氢或任选取代的(C1-C6)烷基；和
D是5或6环原子的单环杂环，其中R7连接在与所示环氮原子相邻的环碳原子上，环D任选地与5或6个环原子的第二碳环或杂环稠合，此时与波浪线相交的键可形成所述第二环的环原子。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R1是乙基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R2是环戊基。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，环A是苯环。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，R3和R3′是氢、甲氧基、三氟甲氧基、-CN、羟基、氯、氟、甲基、三氟甲基、乙基、正丙基和异丙基、烯丙基、-CH2C≡CH、环丙基、环戊基、环己基、-NR5R6，其中R5和R6独立地是氢、甲基或乙基。
6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于，R3是甲氧基、氟或氯，R’3是氢、氟或氯。
7.式(IA)的如权利要求1所述的化合物：
Figure A2007800399370004C1
式中，R3是甲氧基、氟或氯，其余变量如权利要求1中的定义。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，R7具有式-(C＝O)OR10，其中R10是R11R12R13C-，其中：
(i)R11是氢或任选取代的(C1-C3)烷基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-或(C2-C3)烯基-(Z1)a-[(C1-C3)烷基]b-，其中a和b独立地是0或1，Z1是-O-、-S-或-NR14-，其中R14是氢或(C1-C3)烷基；R12和R13独立地是氢或(C1-C3)烷基-；
(ii)R11是氢或任选取代的R15R16N-(C1-C3)烷基-，其中R15是氢或(C1-C3)烷基，R16是氢或(C1-C3)烷基；或R15和R16与它们连接的氮原子一起形成任选取代的具有5-或6-个环原子的单环杂环或具有8-10个环原子的双环杂环系统，R12和R13独立地是氢或(C1-C3)烷基-；或
(iii)R11和R12与它们所结合的碳原子一起形成任选取代的具有3-7个环原子的单环碳环或具有8-10个环原子的双环碳环系统，R13是氢。
9.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，R10是甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基、环己基、烯丙基、苯基、苄基、2-、3-或4-吡啶基甲基、N-甲基哌啶-4-基、四氢呋喃-3-基、甲氧基乙基、茚满基、降冰片基、二甲基氨基乙基、吗啉代乙基。
10.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，R10是环戊基或叔丁基。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，R是式(X)的基团，R8是氢。
12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，基团L1中，Y1是-NHC(＝O)-。
13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，基团L1中，Alk1和Alk2基团如果存在，选自-CH2-、-CH2CH2--CH2CH2CH2-、-CH2CH(OH)CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH＝CH-、-CH2CH＝CHCH2-、-C≡C-、-C≡CCH2-、-CH2C≡C-、CH2C≡CCH2-CH2W-、-CH2CH2W-、-CH2CH2WCH2-、-CH2CH2WCH(CH3)-、-CH2WCH2CH2-、-CH2WCH2CH2WCH2-、-WCH2CH2-、-CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2以及二价环丙基、环戊基和环己基基团；W是-O-、-S-、-NH-或-N(CH3)-。
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，基团L1中，Q如果存在，是二价亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡嗪基、亚哌啶基、亚哌嗪基、亚吡咯烷基、亚吡咯基、环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基或3-氮杂-双环[3.1.0]亚己基基团。
15.如权利要求1-13中任一项所述的化合物，其特征在于，Q如果存在，是二价1，4-亚苯基、1，4-亚哌啶基或1，4-亚哌嗪基。
16.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自下组：
4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯基丙氨酸环戊酯，
O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸环戊酯，
4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]-L-苯基丙氨酸叔丁酯，
O-(4-{[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]甲基}苯基)-L-高丝氨酸叔丁酯，
4-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌嗪-2-羧酸环戊酯，
4-{2-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]乙基}哌嗪-2-羧酸叔丁酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯，
5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸叔丁酯，
5-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}-L-正缬氨酸环戊酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲氧基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸叔丁酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸叔丁酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-甲基苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-氟苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸叔丁酯，
(2S)-2-氨基-4-{4-[(4-{[(7R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5，6，7，8-四氢蝶啶-2-基]氨基}-3-氟苯甲酰)氨基]哌啶-1-基}丁酸环戊酯，
以及它们的盐、N-氧化物、水合物或溶剂合物。
17.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
18.如权利要求1-16中任一项所述的化合物在制备用于在体外或体内抑制PLK1活性的组合物中的应用。
19.一种治疗PLK1活性介导的疾病的方法，所述方法包括给予患有所述疾病的对象有效量的如权利要求1-16中任一项所述的式(I)的化合物。
20.如权利要求18所述的应用或如权利要求19所述的方法，其特征在于，用于治疗细胞增殖疾病。
21.如权利要求18所述的应用或如权利要求19所述的方法，其特征在于，用于治疗实体瘤。
22.如权利要求18所述的应用或如权利要求19所述的方法，其特征在于，用于治疗血液肿瘤。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011113293A1 (zh) * 2010-03-19 2011-09-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 二氢喋啶酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
CN103435608A (zh) * 2013-08-22 2013-12-11 中国药科大学 吡啶并嘧啶类plk1抑制剂及其用途
CN105801582A (zh) * 2016-04-12 2016-07-27 合肥工业大学 一类新型二氢蝶啶酮类衍生物及其制备方法和在医药上的用途
CN109879877A (zh) * 2019-03-04 2019-06-14 吉林大学 一种可降解plk1和brd4蛋白的化合物及其应用
WO2021237905A1 (zh) * 2020-05-26 2021-12-02 中科院合肥技术创新工程院 一种用于喉癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011113293A1 (zh) * 2010-03-19 2011-09-22 江苏恒瑞医药股份有限公司 二氢喋啶酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
CN102421779A (zh) * 2010-03-19 2012-04-18 江苏恒瑞医药股份有限公司 二氢喋啶酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
CN102421779B (zh) * 2010-03-19 2015-03-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 二氢喋啶酮类衍生物、其制备方法及其在医药上的应用
CN103435608A (zh) * 2013-08-22 2013-12-11 中国药科大学 吡啶并嘧啶类plk1抑制剂及其用途
CN105801582A (zh) * 2016-04-12 2016-07-27 合肥工业大学 一类新型二氢蝶啶酮类衍生物及其制备方法和在医药上的用途
CN109879877A (zh) * 2019-03-04 2019-06-14 吉林大学 一种可降解plk1和brd4蛋白的化合物及其应用
CN109879877B (zh) * 2019-03-04 2021-08-10 吉林大学 一种可降解plk1和brd4蛋白的化合物及其应用
WO2021237905A1 (zh) * 2020-05-26 2021-12-02 中科院合肥技术创新工程院 一种用于喉癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用

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