CN101538239B - 一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法，其结构式如下。该物质可通过培养链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的发酵液中获得。其主要通过链霉菌Y05A-1065的斜面菌株培养、链霉菌Y05A-1065种子液的制备、链霉菌Y05A-1065发酵液的制备、菌体浓缩得到总提取物、去除菌体的培养液过超滤膜、乙酸乙酯萃取后硅胶柱中进行色谱分离、聚酰胺柱层析分离获得。该方法简单可行，重现性好。该物质具有显著的抗肿瘤活性，该物质和其药学上可接受的盐可与药学上可接受的载体结合制成抗肿瘤类药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的抗生素和其药学上可接受的盐；本发明也涉及这一化合物的微生物发酵方法和其在制造抗肿瘤药物上的用途。
背景技术
肿瘤严重威胁着人类的生命健康，世界各国都投入大量人力物力开发新的高效抗肿瘤药。化学治疗在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。现已经知道有许多经培养不同种微生物所产生的抗生素类物质可表现有抗肿瘤活性。迄今为止，已广泛使用了某些已知的抗肿瘤在临床实践中为治疗肿瘤提供了一种重要的治疗手段。然而，临床上使用的许多已知的抗肿瘤抗生素物质都对人体有明显的毒性，从而在应用上受到很大限制。在这个意义上说，临床上所使用的所有已知抗肿瘤抗生素均不一定是令人完全满意的抗肿瘤药物。因此，目前仍急需找到并提供既对人体毒性低，又有高抗肿瘤活性，而且可有效而安全地用于治疗人体肿瘤或癌症的新的物质。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于治疗肿瘤疾病的新的抗肿瘤类抗生素3-取代-2-吲哚酮类化合物，其分子结构式为C15H12NO2，分子量238，化学结构式如式(I)所示。熔点185.0-186.9℃，外观呈橙黄色粉末，它在药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐或者有机盐。
本发明抗生素的结构采用核磁共振、红外、紫外等光谱学的方法确定。
本发明的另一个目的是提供这种抗肿瘤抗生素的发酵用菌种和制备方法。
经初步测试，该化合物体外能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，其IC50在3-27μg/mL范围内，具有显著的抗肿瘤活性。
式1
本发明的吲哚酮类化合物是从山西省芮城县古魏乡土壤中分离得到链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的发酵培养物中提取得到，所用的链霉菌Y05A-1065已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.：2363，保藏日为2008年2月19日。
制备方法的具体步骤如下：
(1)链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的斜面菌株培养：斜面培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，蒸馏水100，制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-30℃恒温静止培养7-9天；
(2)链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)种子液的制备：种子培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl 0.01-0.05，5K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，水100，制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30℃恒温，220r/min震荡培养24-36小时；
(3)链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的发酵液的制备：发酵培养基按重量比为：玉米淀粉2.0-10.0，黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2，CoCl2·H2O0.01-0.03，pH6.8，水100，28℃2 20r/min摇床振摇培养120-168小时；
(4)将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；
(5)将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；
(6)收集超滤膜过滤后的滤液，加热浓缩(温度不超过50℃)至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHCl3-MeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；
(7)发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60％的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，即得到橙黄色粉末。
经本发明所制备的化合物能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，具有显著的抗肿瘤活性。
本发明所用的链霉菌Y05A-1065已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.：2363，保藏日为2008年2月19日。
具体实施方式
实施例1 化合物(I)的制备
1.链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的斜面菌株培养：斜面培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，蒸馏水100，制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-30℃恒温静止培养7-9天；
2.链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)种子液的制备：种子培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl 0.01-0.05，5K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，水100，制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30℃恒温，220r/min震荡培养24-36小时；
3.链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的发酵液的制备：发酵培养基按重量比为：玉米淀粉2.0-10.0，黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2，CoCl2·H2O0.01-0.03，pH6.8，水100，28℃ 220r/min摇床振摇培养120-168小时；
4.将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；
5.将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；
6.收集超滤膜过滤后的滤液，加热浓缩(温度不超过50℃)至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHCl3-MeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；
7.发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60％的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，即得到橙黄色粉末(I)。
化合物(I)的实验数据：外观为橙黄色粉末，m.p.185-186.9。微溶于水、苯、氯仿、乙醚等溶剂，溶于乙醇、甲醇。FAB-MS：239(M+1)。最大紫外吸收波长：262.8nm(1.171)，355.6nm(1.144)。IRυ/cm-1(KBr)：3548(υO-H)，3356(υN-H)，3185(υC-H)，3144(υC-H)，3066(υC-H)，1699(υC＝O)，1640(υC＝C)。13CNMR(CDCl3)：170.2(C-2)，156.1(C-1’)，141.7(C-9)，133.7(C-3)，131.7(C-10)。
实施例2 MTT还原法检测化合物(I)的抗肿瘤活性
1.材料：
1.1四脞盐(MTT)：用0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiaZol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
1.2靶细胞的制备(以A549细胞为例)：从液氮罐中取出人肺癌细胞株A549细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；加入全培养液(含10％小牛血清的RPMI1640(Gibcol BRL公司))至10mL，1000rpm离心5s，弃上清；重复以上操作一次；以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO2，37℃培养；观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。取对数生长期细胞，胰酶消化，调整细胞数至1×105/mL；将细胞悬液加入到96孔板中，各孔加入A549细胞100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培养8hr。加入不同浓度B6-9(使用全培养液配制)溶液100μL，对照加全培养液100μL，继续培养48hr。每孔加入MTT溶液各10μL，继续培养4hr。去除培养液，每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解。使用酶联免疫仪测定570nm下每孔OD值。计算肿瘤细胞杀伤率和抑制率，以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC50。肺癌细胞株A549，肝癌细胞株HepG-2，胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的试验方法同上。
肿瘤细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％
1.3实验结果
实验结果显示化合物(I)均能有效抑制肺癌细胞株A549，肝癌细胞株HepG-2，胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的生长。其对这些癌细胞的IC50值(μg/mL)见表1。
表1 B6-9的体外细胞毒试验结果(IC50μg/mL)
| 细胞株 | B6-9 |
| 肺癌细胞株A549 | 10.4 |
| 肝癌细胞株HepG-2 | 26.8 |
| 胃癌细胞株HGC-27 | 4.67 |
| 乳癌细胞株MCF-7 | 3.24 |
实施例3 链霉菌Y05A-1065(CGMCC No.：2363)的培养特征
形态特征：孢子丝1-3圈螺旋形。孢子椭圆形。
性状特征：高氏合成1号琼脂：气丝青绿色，有次生白色丛。基丝无色。无可溶色素。淀粉琼脂：气丝青绿色。基丝无色。无可溶色素。纤维素：气丝绿色。基丝好，黄色。无可溶色素。
Claims (5)
1.一种抗肿瘤类抗生素，其特征在于：该化合物的结构式如下所示：
2.如权利要求1所述的抗肿瘤类抗生素药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的抗肿瘤类抗生素药学上可接受的盐，其特征在于：所述的药学上可接受的盐是盐酸盐或硫酸盐。
4.一种如权利要求1所述的一种抗肿瘤类抗生素的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)CGMCC No.2363的链霉菌Y05A-1065的斜面菌株培养：斜面培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，蒸馏水100，制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-30℃恒温静止培养7-9天；
(2)CGMCC No.2363的链霉菌Y05A-1065种子液的制备：种子培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl 0.01-0.05，5K2HPO4·3H2O 0.01-0.3，MgSO4·7H2O 0.01-0.1，水100，制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30℃恒温，220r/min震荡培养24-36小时；
(3)CGMCC No.2363的链霉菌Y05A-1065的发酵液的制备：发酵培养基按重量比为：玉米淀粉2.0-10.0，黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2，CoCl2·H2O0.01-0.03，pH6.8，水100，28℃ 220r/min摇床振摇培养120-168小时；
(4)将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；
(5)将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；
(6)收集超滤膜过滤后的滤液，在温度不超过50℃条件下加热浓缩至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHCl3-MeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；
(7)发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60％的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，得到橙黄色粉末。
5.权利要求1所述的抗肿瘤类抗生素或权利要求2或3所述的药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
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| 杨鸣琦 等.抗肿瘤抗生素研究进展.《西北农林科技大学学报》.2005,第33卷(第12期), * |
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