CN101528247A - 序贯联合治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了治疗血管生成相关疾病的新方法。通过施用Tie1胞外域－结合剂和VEGF拮抗剂治疗血管生成相关疾病。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年10月17日提交的美国临时申请60/852,263号和于2006年11月19日提交的美国临时申请60/875,736号的优先权，其全部内容通过引用的方式并入。
背景技术
血管主要由内皮细胞的内层和周细胞或平滑肌细胞的外层组成。第一管状结构由内皮细胞形成，其随后动员(recruit)周细胞和平滑肌细胞以将它们纳入管状结构中。由来源于中胚层的内皮前体细胞的分散细胞群从头(de novo)形成血管称为血管发生(vasculogenesis)。这种原始的网状结构发生连续的形态形成事件，包括出芽、分裂和重建(remodelling)以生成从大血管到分枝的小血管的分层血管网。这些连续的形态形成事件统称为血管生成(angiogenesis)。以前的研究已经确定了许多内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶(RTK)和其同源配体，其介导血管的血管发生和血管生成发育。血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员和其受体在原始胚胎血管丛的形成过程中起作用，而血管生成素(Ang)和其受体Tie2以及ephrin和其Eph受体参与到随后的重建过程中。参见，例如Jones等人，(2001)Nat.Rev.Molec.Cell Biol.2：257关于参与血管生成和淋巴管生成反应的受体的综述。
Tie1和Tie2是几乎专门在内皮细胞和造血前体细胞中表达的RTK。在胚胎发生过程中血管结构的正常发育需要这两种受体。这两种Tie受体形成一个RTK亚族，这是由于与其它RTK家族成员不同，它们包括细胞外EGF-同源结构域。参见，如Partanen(1992)Mol.Cell Biol.12：1698和WO 93/14124。小鼠中Tie1基因的靶向断裂导致特征为广泛出血和微血管完整性丧失的致死表型。参见，如Puri等人，(1995)EMBO J.14：5884。Tie2不存在的胚胎在血管重建和成熟方面具有缺陷，这由内皮周围支持细胞的不适当的动员产生。血管生成素(Ang，例如Ang 1、Ang2、Ang3和Ang4)是与Tie2相互作用的蛋白质。
血管内皮生长因子(VEGF)也在正常和异常血管生成的调节中起重要的作用。单个VEGF等位基因的缺失导致胚胎致死现象，表明该因子在血管系统的发育和分化方面起到关键作用(Ferrara等人，1997，Endocr.Rev.18：4-25)。VEGF也表现为与肿瘤和眼内疾病(Id.)相关的新血管生成的关键介体。VEGF mRNA被大多数检查到的人类肿瘤过度表达(Berkman等人，1993，J Clin Invest 91：153-159；Brown等人，1995，Human Pathol.26：86-91；Brown等人，1993，Cancer Res.53：4727-35；Mattern等人，1996，Brit.J.Cancer.73：931-34；以及Dvorak等人，1995，Am J.Pathol.146：1029-39)。抗-VEGF中和抗体抑制多种人类肿瘤细胞系在裸鼠中的生长(Kim等人，1993，Nature362：841-44；Warren等人，1995，J.Clin.Invest.95：1789-97；Borgstrom等人，1996，Cancer Res.56：4032-39；以及Melnyk等人，1996，CancerRes.56：921-24)。最近，单克隆抗体VEGF抑制剂，贝伐单抗(bevacizumab)，已被批准用于治疗某些人类癌症。
发明内容
一般而言，本发明的特征是施用Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂以获得期望的治疗效果的给药方案。
在一个方面中，本发明提供血管生成相关疾病的治疗方法，所述方法包括在向对象施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗。在其它实施方式中，VEGF拮抗剂为索拉非尼(sorafenib)。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。在其它实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以小于单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂各自以治疗血管生成相关疾病协同有效的量施用。
在一些实施方式中，血管生成相关疾病为癌症或肿瘤，例如，本文描述的癌症或肿瘤。在一些实施方式中，血管生成相关疾病为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。在一些实施方式中，血管生成相关疾病为前列腺癌或胰腺癌。
在一些实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，且当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出肿瘤脉管系统的变化时施用第二药剂。在一些实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤尺寸变化的步骤。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在其它方面中，本发明描述了提供手术后辅助治疗的方法，该方法包括在施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前，在一段时间内对已手术切除肿瘤的对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。在一些实施方式中，第一药剂在手术的大约5、10、15、20、24、35、40或48小时内施用。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗。在其它实施方式中，VEGF拮抗剂为索拉非尼。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以单独有效地治疗肿瘤再生长的量施用。在其它实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以小于单独有效地治疗肿瘤再生长的量施用。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂各自以治疗肿瘤再生长协同有效的量施用。
在一些实施方式中，肿瘤为本文中描述的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为结肠肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、肝肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤或胰腺肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤为前列腺肿瘤或胰腺肿瘤。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在其它方面中，本发明提供了血管生成相关疾病的治疗方法，该方法包括在向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第二药剂之前，在一段时间内向对象施用包含VEGF拮抗剂的第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie 1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为索拉非尼。
在一些实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，且当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出变化时施用第二药剂。在一些实施方式中，所述方法包括监控肿瘤生长的步骤，且当表现出肿瘤生长时施用第二药剂。
在一些实施方式中，Tie 1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。在其它实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以小于单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂各自以对治疗血管生成相关疾病协同有效的量施用。
在一些实施方式中，血管生成相关疾病为癌症或肿瘤，例如，本文中描述的癌症或肿瘤。在一些实施方式中，血管生成相关疾病为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。在一些实施方式中，血管生成相关疾病为前列腺癌或胰腺癌。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie 1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在其它方面中，本发明描述提供手术后辅助治疗的方法，该方法包括在施用包含Tie1胞外域-结合剂的第二药剂之前，在一段时间内对已手术切除肿瘤的对象施用包含VEGF拮抗剂的第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗。在其它实施方式中，VEGF拮抗剂为索拉非尼。在一些实施方式中，第一药剂在手术的大约5、10、15、20、24、35、40或48小时内施用。
在一些实施方式中，Tie 1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie 1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以单独有效地治疗肿瘤再生长的量施用。在其它实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以小于单独有效地治疗肿瘤再生长的量施用。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂各自以对治疗肿瘤再生长协同有效的量施用。
在一些实施方式中，肿瘤为本文中描述的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤存在于结肠、肺、乳腺、肾、肝、卵巢、前列腺或胰腺中。在一些实施方式中，肿瘤为前列腺肿瘤或胰腺肿瘤。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在其它方面中，本发明提供使肿瘤脉管系统对VEGF的下降敏化的方法，该方法包括在对患有血管生成相关疾病的对象施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie 1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗。
在一些实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，且当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出变化时施用第二药剂。
在一些实施方式中，血管生成相关疾病为癌症或肿瘤，例如，本文中描述的癌症或肿瘤。在一些实施方式中，所述癌症为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌症为前列腺癌或胰腺癌。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在一些方面中，本发明提供降低正施用VEGF拮抗剂的患有癌症的对象中肿瘤再生长速率的方法，该方法包括向对象施用包含Tie 1胞外域-结合剂的第一药剂和包含VEGF拮抗剂的第二药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之前大约1天至35天(如，1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、20、21、28、30或35天，或者其间的任何天数)施用第一药剂。在其它实施方式中，在施用第二药剂之前大约4天(如，3、4或5天)、大约6天(如，5、6或7天)、大约8天(如，7、8或9天)、大约10天(如，8、9、10、11或12天)、大约20天(如，19、20或21天)或大约2周(如，12、13、14、15或16天)施用第一药剂。
在一些实施方式中，在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。在一些实施方式中，在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie 1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗或索拉非尼。
在一些实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤生长和在显示生长迹象时施用第二药剂的步骤。
在一些实施方式中，所述癌症为本文中描述的癌症。在一些实施方式中，所述癌症为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌症为前列腺癌或胰腺癌。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在一些方面中，本发明提供通过在施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂而降低向对象施用VEGF拮抗剂的频率的方法。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为本文中描述的Tie1胞外域-结合剂。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为DX-2240、DX-2220或其组合。
在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为本文中描述的VEGF拮抗剂。在一些实施方式中，VEGF拮抗剂为索拉非尼。
在其它实施方式中，所述方法包括监控对象的肿瘤生长的步骤。
在一些实施方式中，所述癌症为本文中描述的癌症。在一些实施方式中，所述癌症为结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌症为前列腺癌或胰腺癌。
在一些实施方式中，所述方法包括放射治疗或化学治疗。放射和/或化学治疗可以在施用Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂之前、期间或之后进行。
在另一方面中，本发明包括Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂用于制备根据本文公开的方法治疗血管生成相关疾病的药物。
在其它方面中，本发明提供本文中描述的方法，其中使用Tie2胞外域-结合剂代替Tie1胞外域-结合剂或与其结合使用。
在其它方面中，本发明提供一种包括包含Tie 1胞外域-结合剂的第一药剂、包含VEGF拮抗剂的第二药剂和根据本文描述的方法使用的说明书的试剂盒。
在本文描述的方面中，血管生成相关疾病包括，但不限于，肿瘤性疾病(如，实体瘤、瘤转移和良性肿瘤，特别是需要血液供应或血管生成的肿瘤性疾病)；炎性疾病(如，类风湿性关节炎、狼疮、再狭窄、牛皮癣、移植物抗宿主反应或多发性硬化症)；眼部血管生成疾病，例如，糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性(如，湿和/或干性年龄相关性黄斑变性)、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症、虹膜红变(rubeosis)；遗传性出血性毛细血管扩张症(Osier-Webber Syndrome)；心肌血管生成；斑块内新血管形成；毛细管扩张；血友病关节；血管纤维瘤以及创面肉芽形成。
良性肿瘤包括，但不限于，血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼以及脓性肉芽瘤。实体瘤包括，但不限于，各个器官系统的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺瘤和癌瘤，如那些侵袭肺、乳腺、胃肠(如结肠)、和生殖泌尿道(如肾脏、膀胱上皮细胞)、咽的恶性肿瘤以及腺癌，包括如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌和胰腺癌的恶性肿瘤。可被治疗的实体瘤的其它实例还包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃肠系统癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、生殖泌尿系统癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤(Wilms′tumor)、子宫颈癌、内分泌系统癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在本文描述的一些方面中，所述血管生成相关疾病为炎性疾病，例如，类风湿性关节炎、牛皮癣、类风湿性或风湿性炎性疾病、或者其它慢性炎性疾病(如慢性哮喘、动脉或移植后动脉粥样硬化、以及子宫内膜异位症)。可被治疗的其它血管生成相关疾病包括具有异常或不期望的血管生成的那些疾病，如眼部新生血管形成，例如，视网膜病(包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性)、成血管细胞瘤、血管瘤和动脉硬化。
在本文描述的一些方面中，所述对象需要减少血管生成，或经确定需要减少血管生成。例如，对象患有肿瘤性疾病，如转移癌。例如，对象患有血管生成依赖性癌或肿瘤。所述肿瘤可以为实体瘤，如直径至少为1、2、3、5、8或10mm的肿瘤。在一个实施方式中，实体瘤具有缺氧性核。所述方法可以包括在施用拮抗药之前评价对象并检测对象中的实体瘤。
在本文描述的一些方面中，Tie1胞外域-结合剂增加了Tie复合体形成。在本文描述的一些方面中，Tie1胞外域-结合剂增加了Tie1的酪氨酸磷酸化。在本文描述的一些方面中，Tie1胞外域-结合剂诱导细胞表面的Tie1下调。
在本文描述的一些方面中，Tie1胞外域-结合剂为包括至少一个互补决定区(CDR，如HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3)的抗体，该互补决定区来自E3(DX-2240)、E3b(DX-2220)、M0044-A06、M0044-A11、M0044-B04、M0044-B05、M0044-B08、M0044-B09、M0044-B10、M0044-B12、M0044-C07、M0044-D01、M0044-E03、M0044-F03、M0044-F06、M0044-F09、M0044-G06、M0044-G07、M0044-G11；M0044-H03、M0044-H05、M0044-H07、M0044-H09、M0045-A02、M0045-A04、M0045-B01、M0045-B03、M0045-B11、M0045-C02、M0045-C11、M0045-C12、M0045-D01、M0045-D07、M0045-G01、M0045-G10、M0046-A11、M0046-B06、M0046-B10、M0046-G12、M0046-H03、M0046-H10、M0046-H11、M0047-B03、M0047-D01、M0047-D03、M0047-E10、M0047-G09、M0053-A02、M0053-A03、M0053-A05、M0053-A09、M0053-B09、M0053-B11、M0053-D03、M0053-D06、M0053-D12、M0053-E03、M0053-E04、M0053-E08、M0053-F04、M0053-F05、M0053-F06、M0053-F08、M0053-G04、M0053-G05、M0054-A08、M0054-B06、M0054-B08、M0054-C03、M0054-C07、M0054-E04、M0054-G01、M0054-G05、M0054-H10、M0055-A09、M0055-B11、M0055-B12、M0055-C05、M0055-C07、M0055-D03、M0055-D06、M0055-D12、M0055-E04、M0055-E06、M0055-E10、M0055-E12、M0055-F10、M0055-G02、M0055-G03、M0055-H04、M0056-A01、M0056-A06、M0056-B08、M0056-B09、M0056-C03、M0056-C04、M0056-E08、M0056-F01、M0056-F02、M0056-F10、M0056-F11、M0056-G03、M0056-G04、M0056-G08、M0056-G12、M0056-H04、M0056-H12、M0057-B05、M0057-H07、M0058-A09、M0058-D04、M0058-E09、M0058-F03、M0058-G03、M0058-H01、M0059-A02、M0059-A06、M0060-B02、M0060-H01、M0061-A03、M0061-C05、M0061-C06、M0061-F07、M0061-G12、M0061-H09、M0062-A12、M0062-B05、M0062-B07、M0062-C08、M0062-D04、M0062-E02、M0062-E03、M0062-E11、M0062-F10、M0062-G06或M0062-H01。
VEGF拮抗剂是一种以VEGF信号通路作为靶点或负调节VEGF信号通路的物质。后一类的实例包括VEGF抑制剂(例如，如通过与VEGF结合而直接抑制VEGF(如VEGF-A、-B、-C或-D)的物质(例如，抗-VEGF抗体如贝伐单抗(
)或兰尼单抗(ranibizumab，
)，或其它抑制剂如哌加他尼(pegaptanib)、新伐司他(
)、AE-941、VEGF Trap和PI-88))、VEGF表达调节剂(例如，INGN-241、口服四硫钼酸盐、2-甲氧雌二醇、2-甲氧雌二醇纳米晶体分散体、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、PTC-299、Veglin)、VEGF受体抑制剂(如KDR或VEGF受体III(Flt4)，例如，抗-KDR抗体、如CDP-791、IMC-1121B的VEGFR2抗体，如CT-322的VEGFR2阻滞剂)、VEGFR表达调节剂(例如，VEGFR1表达调节剂Sirna-027)或VEGF受体下游信号抑制剂。在本文描述的一些方面中，VEGF拮抗剂为贝伐单抗、哌加他尼、兰尼单抗、索拉非尼、舒尼替尼(sunitinib)、新伐司他、AE-941、VEGF Trap、帕唑帕尼(pazopanib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、塞地兰尼(cediranib)、芬维A胺(fenretinide)、角鲨胺(squalamine)、INGN-241、口服四硫钼酸盐、四硫钼酸盐、Panzem NCD、2-甲氧雌二醇、AEE-788、AG-013958、贝伐西尼钠、AMG-706、阿西替尼(axitinib)、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184或ZK-304709。
在本文描述的一些方面中，Tie 1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂的施用用作辅助治疗。辅助治疗可以是在对象接受切除整个肿瘤或部分肿瘤的手术后(例如，在手术治疗成胶质细胞瘤或结肠直肠、乳腺或肺癌后)向对象施用的手术后治疗。在一些实施方式中，根据本发明的施用在手术的6、12、24、48或100小时内开始。
在本文描述的一些方面中，所述方法包括另外的治疗形式。例如，另外的治疗形式为放射治疗或细胞毒性化学治疗剂，如抗代谢药(例如，5-FU，与甲酰四氢叶酸)、伊立替康(irinotecan)、(或其它拓扑异构酶抑制剂)、多柔比星或所有这些药物的任何组合，包括施用所有这些药物。
所述方法可以进一步包括监控对象的以下的一项或多项下降的步骤：肿瘤尺寸减小；癌症标志物的减少，如癌症特异性抗原水平；新损伤表现的减少，如在骨扫描中；新的疾病相关症状的表现减少；或软组织块的尺寸减小或稳定；或任何与临床结果的改善相关的参数。可以在以下的一个或多个阶段中监控对象：治疗开始前；治疗期间；或已经施用治疗的一个或多个要素后。监控可以用于评价是否需要用相同的Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂进行进一步治疗或用另外的药剂进行另外的治疗。通常，上述的一个或多个参数的下降或稳定预示对象的情况得到改善。关于监控的信息可以用例如电子或数字形式记录。
所述对象可以为哺乳动物，例如，灵长类动物，特别是高等灵长类动物如人类。
本发明的其它特征和优点将通过以下的详细说明和权利要求书变得更加清楚。本发明的实施方式可以包括本文中描述的特征的任何组合。术语“实施方式”决不必然地排除本文(如在另一个实施方式中)公开的一个或多个其它特征。本申请通篇引用的所有参考文献、专利申请以及专利的内容通过引用的方式在此明确地并入本文中。
附图说明
图1显示人Tie1的氨基酸序列。
图2显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-224010天后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图3显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-224020天后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图4显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-224015天后施用索拉非尼的情况的曲线图。
图5显示了描绘在前列腺肿瘤模型中施用DX-2240后施用索拉非尼的情况的曲线图。
图6显示了描绘在前列腺肿瘤模型中施用DX-2240后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图7显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-2240后按不同时间表施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图8显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-224010或20天后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图9显示了描绘在胰腺肿瘤模型中施用DX-2240的同一天或5天后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
图10显示了来自DX-2240处理的小鼠的肿瘤的凝集素染色。
图11显示了描绘在前列腺肿瘤模型中施用DX-224015天后施用不同剂量的贝伐单抗的情况的曲线图。
图12显示了描绘在前列腺肿瘤模型中施用DX-224015天后施用贝伐单抗的情况的曲线图。
具体实施方式
本发明人令人惊讶地发现，当施用第二药剂之前施用第一药剂一段足够长的时间时，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂产生协同效应。例如，在施用VEGF拮抗剂之前施用Tie1胞外域-结合剂时出现协同效应。因此，本发明提供通过在不同的时间向对象施用Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂来治疗血管生成相关疾病(例如，改善血管生成相关疾病的至少一个症状)的方法。例如，在一个方面中，治疗对象的血管生成相关疾病(例如，改善血管生成相关疾病的至少一个症状)的方法包括首先施用Tie1胞外域-结合剂，然后施用VEGF拮抗剂。
施用Tie1胞外域-结合剂(例如，DX-2240或DX-2220)引起表达Tie1和Tie2的细胞(如内皮细胞)表面的Tie1/Tie2异二聚体的下调。因此，本发明还提供通过首先施用Tie1胞外域-结合剂，然后施用VEGF拮抗剂改善血管生成相关疾病的至少一个症状的方法。
术语“治疗”或“处理”指单独或与一种或多种其它药剂(如第二药剂)组合向对象，例如患者，如具有疾病(如本文中描述的疾病)、疾病的症状或患病的体质或者具有易患该病的体质的患者，应用或施用一种药剂以治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、增进或影响所述疾病、疾病的症状或易患病的体质。处理细胞指细胞活性的下降，例如，内皮细胞形成管状体或血管的能力。下降不是必须要活性全部消除，而是如细胞活性或数目的下降，如统计学显著的下降。
如本文中所用的，术语“抗体”指包括至少一个免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白可变区序列的蛋白质。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文中简写为VH)和轻(L)链可变区(本文中简写为VL)。在另一实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab片段、F(ab′)2、Fd片段、Fv片段和dAb片段)以及完全抗体。
VH和VL区可进一步细分为称为“互补决定区”(CDR)的高变区，其中散布有称为“框架区”(FR)的更保守的区。框架区和CDR的范围已被精确地确定(参见Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，美国卫生和福利部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号.91-3242，和Chothia，C.等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。本文使用Kabat定义。各VH和VL典型地由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按照如下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
“免疫球蛋白域”指来自免疫球蛋白分子的可变或恒定域的结构域。免疫球蛋白域通常含有由大约7个β-链形成的2个β-折叠和1个保守的二硫键(参见，如A.F.Williams和A.N.Barclay，1988Ann.Rev Immunol.6：381-405)。如在Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)；和Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14(18)：4628-38中所述的，免疫球蛋白可变区的高变环的正则结构(canonical structure)可以由其序列推断出来。
如本文中所用的，“免疫球蛋白可变域序列”指可以形成免疫球蛋白可变域结构的氨基酸序列。例如，该序列可以包括天然存在的可变域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以略去1个、2个或多个N-或C-末端氨基酸、内部氨基酸，可以包括1个或多个插入或附加的末端氨基酸，或者可以包括其它替换。在一个实施方式中，包括免疫球蛋白可变域序列的多肽可以与另一免疫球蛋白可变域序列结合以形成靶结合结构(或“抗原结合位点”)，例如，与Tie1相互作用(如与Tie1结合或抑制Tie1)的结构。
抗体的VH或VL链可进一步包括重或轻链恒定区的全部或部分，从而分别形成重或轻免疫球蛋白链。在一个实施方式中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链通过如二硫键相互连接。重链恒定区包括3个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包括CL结构域。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以为κ或λ型的。在一个实施方式中，抗体为糖基化的。抗体可以对抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性起作用。
术语“单特异性抗体”指表现出对特定靶点(如表位)的单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”，单克隆抗体指作为单一分子种类产生的，例如，由同质的分离细胞群产生的抗体。“单克隆抗体组合物”指在包括单一分子种类抗体的组合物中的抗体或其片段的制剂。在一个实施方式中，由哺乳动物细胞产生单克隆抗体。可以组合一个或多个单克隆抗体种类。
抗体的一个或多个区可以为人源或实际上人源的。例如，一个或多个可变区可以为人源或实际上人源的。例如，一个或多个CDR可以为人源的，如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。各轻链CDR可以为人源的。HC CDR3可以为人源的。一个或多个框架区可以为人源的，例如，HC或LC的FR1、FR2、FR3和FR4。在一个实施方式中，所有框架区均是人源的，例如，从人的体细胞(如，产生免疫球蛋白的造血细胞，或非造血细胞)得到的。在一个实施方式中，人源序列为胚系序列(germlinesequence)，例如，由胚系核酸编码的。一个或多个恒定区可以为人源或实际上人源的。在另一实施方式中，框架区(例如，FR1、FR2和FR3全体，或FR1、FR2、FR3和FR4全体)或整个抗体的至少70、75、80、85、90、92、95或98％可以为人源或实际上人源的。例如，FR1、FR2和FR3全体可以是至少70、75、80、85、90、92、95、98或99％与编码轻或重链序列的位点的人源胚系V片段编码的人源序列相同。
抗体的全部或部分可通过免疫球蛋白基因或其片段编码。示例性的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白轻链(约25Kd或214个氨基酸)由NH2-端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白重链(约50Kd或446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和其它前述的恒定区基因中的一个，如γ(编码约330个氨基酸)编码。轻链指包括轻链可变域的任何多肽。重链指包括重链可变域的任何多肽。
如本文中所用的，术语全长抗体的“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“片段”)指保持与目标靶点特异性结合的能力的全长抗体的一个或多个片段。术语全长抗体的“抗原结合片段”所包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括由铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH 1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)保持功能性的分离的互补决定区(CDR)。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因编码，但是它们可以采用重组方法通过使它们能够形成为单个蛋白质链的合成接头结合，在该单个蛋白质链中VL和VH区配对形成称为单链Fv(scFv)的单价分子。参见，如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
抗体片段可以采用任何适当的技术(包括本领域技术人员已知的常规技术)获得。术语“单特异性抗体”指表现出对特定靶点(如表位)的单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，其在本文中指单分子组合物的抗体或其片段的制剂。如本文中所用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(如IgM或IgG1)。
在一个实施方式中，抗体的HC或LC包括对应于由人胚系序列编码的氨基酸序列(如，框架区和/或在CDR中)的序列。例如，抗体可以包括来自人DP47抗体的序列。在一个实施方式中，抗体的一个或多个密码子相对于胚系核酸序列发生改变，但被选择以编码相同的氨基酸序列。可以选择密码子，例如，以使特定系统中的表达最优化、产生限制性核酸内切酶位点、产生静止指纹(silent fingerprint)等。
“人源化”免疫球蛋白可变区为包括足够数目的人框架氨基酸位点的免疫球蛋白可变区，从而使该免疫球蛋白可变区在正常人体中不引起免疫反应。“人源化”免疫球蛋白的描述包括如US 6,407,213和US 5,693,762。
“实际上人源的”免疫球蛋白可变区为包括足够数目的人框架氨基酸位点的免疫球蛋白可变区，从而使该免疫球蛋白可变区在正常人体中不引起免疫反应。“实际上人源的”抗体为包括足够数目的人氨基酸位点以使抗体在正常人体中不引起免疫反应的抗体。
如本文中所用的，“Tie复合体”指包括Tie1和Tie2(也可以包括血管生成素(Ang))的异源复合体或Tie1的同源复合体。异源Tie复合体部分地通过Tie1和Tie2的胞外域的联合形成，并且也可以包括Ang。如本文中所用的，“复合体成员”指包括在异源Tie复合体中的蛋白质。因此，Tie1和Tie2以及任选的Ang都为复合体成员。术语“Ang”包括所有的血管生成素，如Ang1、Ang2、Ang3和Ang4。除了Tie1、Tie2和Ang外，异源Tie复合体还可以包括其它蛋白质。
“血管生成”包括脉管发育(例如，血管或淋巴管发育)的所有阶段，包括最初的脉管形成和后来的脉管重建和形态学改变。
如本文中所用的，术语“激动剂”和“拮抗剂”描述其与特定活性或作用有关的性质。例如，E3或E3b抗体可以为与促进Tie1自缔合(如，均二聚化)有关的激动剂，也可以为与减少或抑制Tie复合体形成和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管形成有关的拮抗剂。同样，作为与Tie1信号通路有关的激动剂的物质可以为与内皮细胞出芽、分裂和管形成有关的拮抗剂。
术语“Tie1胞外域”指Tie1蛋白质的胞外区，例如，大致包括图1(SEQ ID NO：1)的氨基酸25-759的区域。其它示例性区域为包括一个或多个EGF-样结构域的区域(例如，图1的214-256、258-303、303-345、214-303、258-345或214-345)；一个或多个Ig-样C2-型结构域(例如，43-105、43-426、372-426)；一个或多个纤连蛋白III型重复序列(例如，图1的446-540、543-639、643-744、446-639、543-744或446-744)；和其组合。术语“第一Ig-样C2-型结构域”和“Ig1”指Tie1或Tie2中相对于其它Ig-样C2-型结构域(第二个这样的结构域)位置最靠近蛋白质氨基端的免疫球蛋白样结构域。例如，对于Tie 1，第一免疫球蛋白样C2-型结构域位于约残基43至约残基105处，而第二Ig-样C2-型结构域位于约残基372至约残基426处。
如本文中所用的，“结合亲和力”指表观缔合常数或Ka。Ka为解离常数(Kd)的倒数。例如，配体对于特定靶分子可以具有至少105、106、107或108M-1的结合亲和力。相对于第二靶点，配体与第一靶点结合的更高亲和力可以由比结合第二靶点的Ka(或数值Kd)更高的结合第一靶点的Ka(或更小的数值Kd)表示。在这种情况下，配体相对于第二靶点具有对第一靶点的特异性。结合亲和力(例如，对于特异性或其它比较)的差别可以至少为1.5、2、5、10、50、100或1000倍。例如，Tie1胞外域-结合剂可以比另一抗原(如，Tie2、EGF、纤连蛋白或人血清白蛋白)至少优先1.5、2、5、10、50、100或1000倍地与Tie1结合。
结合亲和力可以通过包括平衡透析法、平衡结合法、凝胶过滤法、ELISA、表面等离子共振技术或光谱法(例如，采用荧光分析)的多种方法测定。这些技术可用于测量随配体(或靶点)浓度的函数变化的结合和游离配体的浓度。通过以下等式，结合配体([结合])的浓度与游离配体([游离])的浓度和在靶分子上的配体结合位点的浓度相关，其中(N)为每个靶分子的结合位点的数目：
[结合]＝N·[游离]/((1/Ka)+[游离])
尽管Ka的定量测定是常规的，但并不总是必需进行Ka的准确测定，这是由于有时足以获得亲和力的定量测定，例如，使用如ELISA或FACS分析的方法测得，其与Ka成比例，而因此可用于比较，如确定是否更高的亲和力高于参照物的如2、5、10、20或50倍。结合亲和力通常在0.01M HEPES(pH 7.4)、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(v/v)的表面活性剂P20中评价。
“分离的组合物”指从天然样品(由其可以获得分离的组合物)的至少一个组分的至少90％去除的组合物。如果目标物质种类或物质种类群是至少5、10、25、50、75、80、90、95、98或99％纯的(按重量-重量计)，则人工或天然产生的组合物可以为“具有至少一定程度的纯度的组合物”。
“表位”指被配体结合的靶化合物上的位点，所述配体如抗原结合蛋白质(例如，Fab或抗体)。例如，在靶化合物为蛋白质的情况下，表位可以指被配体结合的氨基酸。重叠表位包括至少一个共用氨基酸残基。
如本文中所用的，术语“基本相同”(或“基本同源”)在本文中用于指含有足够数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等效(例如，具有相似的侧链，如保守的氨基酸替换)的氨基酸残基或核苷酸第一氨基酸或核苷酸序列，从而第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。在抗体的情况下，第二抗体具有相同的特异性和至少50％的相同的亲和力。
与本文公开的序列相似或同源(例如，至少大约85％的序列同一性)的序列也是本申请的部分。在一些实施方式中，序列同一性可以为大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当在选择的杂交条件(例如，高度严格的杂交条件)下核酸片段与该链的互补链杂交时存在实质的同一性。核酸可以存在于整体细胞中、细胞裂解产物中、或者以部分纯化或基本纯化的形式存在。
两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(这两个术语在本文中互换使用)的计算如下进行。将序列进行比对而达到最佳比较目的(例如，可以将间隔引入到第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中以达到最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在优选实施方式中，用于比较目的而进行比对的参照序列的长度为参照序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并且还甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置的相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(如本文中所用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比为这两个序列共有的相同位置数目的函数(同时考虑间隔的数目和各间隔的长度，所述间隔需要被引入以达到两个序列的最佳比对)。
序列的比较和两个序列间同一性百分比的确定可以采用数学算法来完成。在优选实施方式中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比采用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法确定，该算法已被加入到GCG软件包的GAP程序中，其使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的间隔权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重(length weight)。在又另一优选实施方式中。两个核苷酸序列之间的同一性百分比采用GCG软件包中的GAP程序确定，其采用NWSgapdna.CMP矩阵，及40、50、60、70或80的间隔权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的一组参数(如果专业人员不确定应采用什么参数来确定是否分子在本文所述的序列同一性或同源性限度内，他应该使用这组参数)是Blossum 62评分矩阵，具有间隔罚分12、间隔延伸罚分(gap extendpenalty)4和移码(frameshift)间隔罚分5。
如本文中所用的，术语“同源的”与“相似性”同义，意思是目标序列由于存在一个或多个氨基酸置换而与参照序列不同(尽管也可以存在适度的氨基酸插入或缺失)。目前计算与参照序列的同源性或相似性水平的优选手段是采用BLAST算法(可从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的美国国家生物技术信息中心(NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI)，Bethesda MD得到)，在各种情况中，使用算法默认或推荐的参数确定计算的序列的关联显著性。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可以采用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法确定，该算法已被加入到ALIGN程序(版本2.0)中，其采用PAM 120残基重量表(weight residue table)、间隔长度罚分12和间隔罚分4。
术语“多肽”或“肽”(其可以互换使用)指由肽键连接的3个或更多个氨基酸的聚合体，例如，长度在3至30之间、12至60之间、或30至300之间、或超过300个氨基酸。多肽可以包括一个或多个非天然氨基酸。通常，多肽只包括天然氨基酸。“蛋白质”可以包括一个或多个多肽链。因此，术语“蛋白质”包括多肽。蛋白质或多肽也可以包括一个或多个修饰，例如，糖基化、酰胺化、磷酸化等等。术语“小肽”可用于描述长度在3至30个氨基酸之间的多肽，例如，长度在8至24个氨基酸之间。
统计学显著性可以通过现有技术中已知的任何方法确定。示例性的统计学检验包括：Students T检验、Mann Whitney U非参数检验和Wilcoxo非参数统计检验。一些统计学显著性关系具有小于0.05或0.02的P值。特定的配体可能表现出统计学显著(例如，P值＜0.05或0.02)的差异，例如，在特异性或结合方面。
“血管生成依赖性癌症和肿瘤”是其生长(体积和/或质量的扩张)需要增加向它们供给血液的血管的数目和密度的癌症和肿瘤。
“退化(regression)”指肿瘤质量和尺寸的减小，例如，减小至少2、5、10或25％。
“肿瘤脉管系统对VEGF下降敏化”指特定的条件，在该条件下脉管暴露于以VEGF信号通路为靶点或负调节VEGF信号通路的物质(如VEGF拮抗剂)时，表现出与脉管系统在不存在这种条件时暴露于所述物质相比生长和/或功能性和下降。
如本文中所用的，术语肿瘤脉管系统的“变化”指肿瘤内部或肿瘤周围的血管发生的生理学和/或功能变化。该变化可以是，但不限于下述的一种或多种：肿瘤血管生长、血流量、血容量、血管通透性、肿瘤代谢、微血管密度(MVD)、周细胞覆盖度或瘤内压力(即，间质液压或IFP)的增大或减小。肿瘤代谢、周细胞覆盖度和血流量的下降表明血管功能的下降。血管通透性和IFP的增加表明血管功能的下降。
以下是可用于评价肿瘤脉管系统变化的已知技术的实例。用造影剂进行的计算机X线断层摄影术(CT)可以测量血流量、血容量和血管通透性。超声(如多普勒超声)也可以评价血流量和血容量。用造影剂进行的磁共振成像(MRI)可以测量血容量和血管通透性。此外，使用一些放射性示踪剂(如H2O15、11CO和18FDG)的正电子发射断层扫描术(PET)可以测定血流量、血容量和肿瘤代谢。内窥镜检查技术(如软式乙状结肠镜检查)可用于测量IFP。用各种抗体染色的肿瘤活组织检查也可以评价肿瘤脉管系统的变化。采用抗例如PECAM、CD34或血管假性血友病因子(von Willebrand Factor)的抗体使血管可见，可以确定肿瘤区域中每平方微米的血管数目，即MVD。用抗PECAM和α-平滑肌肌动蛋白或NG2的抗体双重染色的肿瘤活组织检查可以评价血管的周细胞覆盖度。
本文描述的方法可以包括在施用第一药剂之后监控肿瘤脉管系统，并在显示肿瘤脉管系统发生变化时开始施用第二药剂。例如，在一些方面中，可以在开始施用Tie1胞外域-结合剂(例如，DX-2240或DX-2220)之后监控对象中的肿瘤脉管系统。在出现肿瘤脉管系统变化的迹象时，可以开始施用VEGF拮抗剂(例如，贝伐单抗)。
Tie1胞外域-结合剂
可用于本发明的Tie1胞外域-结合剂与Tie 1的表位(例如，人Tie1胞外域)结合。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂增加Tie复合体的形成。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂增加Tie1的酪氨酸磷酸化。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂诱导细胞表面的Tie1下调。
示例性的Tie1胞外域-结合剂已被预先公开(参见，例如，美国专利第5,955,291号和美国专利公开第2005/0136053、2006/0024297和2006/0057138号，特别是美国专利公开2006/0057138号的图7-39和实施例28-30)，并且包括E3、E3b、M0044-A06、M0044-A11、M0044-B04、M0044-B05、M0044-B08、M0044-B09、M0044-B10、M0044-B12、M0044-C07、M0044-D01、M0044-E03、M0044-F03、M0044-F06、M0044-F09、M0044-G06、M0044-G07、M0044-G11、M0044-H03、M0044-H05、M0044-H07、M0044-H09、M0045-A02、M0045-A04、M0045-B01、M0045-B03、M0045-B11、M0045-C02、M0045-C11、M0045-C12、M0045-D01、M0045-D07、M0045-G01、M0045-G10、M0046-A11、M0046-B06、M0046-B10、M0046-G12、M0046-H03、M0046-H10、M0046-H11、M0047-B03、M0047-D01、M0047-D03、M0047-E10、M0047-G09、M0053-A02、M0053-A03、M0053-A05、M0053-A09、M0053-B09、M0053-B11、M0053-D03、M0053-D06、M0053-D12、M0053-E03、M0053-E04、M0053-E08、M0053-F04、M0053-F05、M0053-F06、M0053-F08、M0053-G04、M0053-G05、M0054-A08、M0054-B06、M0054-B08、M0054-C03、M0054-C07、M0054-E04、M0054-G01、M0054-G05、M0054-H10、M0055-A09、M0055-B11、M0055-B12、M0055-C05、M0055-C07、M0055-D03、M0055-D06、M0055-D12、M0055-E04、M0055-E06、M0055-E10、M0055-E12、M0055-F10、M0055-G02、M0055-G03、M0055-H04、M0056-A01、M0056-A06、M0056-B08、M0056-B09、M0056-C03、M0056-C04、M0056-E08、M0056-F01、M0056-F02、M0056-F10、M0056-F11、M0056-G03、M0056-G04、M0056-G08、M0056-G12、M0056-H04、M0056-H12、M0057-B05、M0057-H07、M0058-A09、M0058-D04、M0058-E09、M0058-F03、M0058-G03、M0058-H01、M0059-A02、M0059-A06、M0060-B02、M0060-H01、M0061-A03、M0061-C05、M0061-C06、M0061-F07、M0061-G12、M0061-H09、M0062-A12、M0062-B05、M0062-B07、M0062-C08、M0062-D04、M0062-E02、M0062-E03、M0062-E11、M0062-F10、M0062-G06和M0062-H01。抗体E3及其变体(例如，DX-2220、DX-2240)和M0044-B08诱导Tie复合体的形成、Tie1酪氨酸磷酸化和细胞表面的Tie1下调。
另外的或可替代的Tie1胞外域-结合蛋白质可以采用本领域中已知的技术分离，包括由被免疫的动物(如小鼠)分离的B细胞制备的杂交瘤产生或从展示文库选择的单克隆抗体。可用于识别Tie1胞外域-结合剂的展示文库可以呈现肽(例如，结构肽，如被二硫键限制的肽，参见，例如美国专利公开2006/0084113号)或抗体(例如，Fab；参见，例如Hoet等人，2005，Nat.Biotech.23(3)：344-48)。Tie1胞外域(或其部分，如EGF域、纤连蛋白重复序列或Ig-超家族域(例如，Ig样C2型2域))可用于识别与Tie1胞外域结合的展示文库成员。例如，Tie1胞外域可以被重组表达、连接到载体上，然后与展示文库(例如，呈现抗体的噬菌体展示文库)混合。与Tie1胞外域靶点结合的那些文库成员随后进行分离并进一步鉴定。这些技术在本领域是已知的并描述于美国专利申请第2006/0057138号中。
另外的/可替代的Tie1胞外域-结合剂的活性可以采用多种分析法测定，包括描述于美国专利公开2006/0057138的实施例2中的Tie1/EpoR嵌合BaF3细胞分析。另外的分析法包括血管发生分析(tubulogenesis assay)(例如，Jones M K等人，1999，Nature Medicine5：1418-1423)、Tie1胞外域-结合剂诱导的Tie1酪氨酸磷酸化(例如，在约氨基酸1117处的基序YVN中酪氨酸的磷酸化)的测量、以及在体内模型中(例如，肿瘤异种移植或原位肿瘤移植)。
Tie1胞外域-结合抗体可以被修饰以使抗体的可变区与一个或多个胚系序列更相似。例如，抗体可以包括1个、2个、3个或更多个氨基酸替换(如，在框架区或CDR区)以使其与参照胚系序列更相似。Vkappa的示例性胚系参照序列包括：O12/O2、O18/O8、A20、A30、L14、L1、L15、L4/18a、L5/L19、L8、L23、L9、L24、L11、L12、O11/O1，A17、A1、A18、A2、A19/A3、A23、A27、A11、L2/L16、L6、L20、L25、B3、B2、A26/A10和A14。参见，例如，Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14(18)：4628-38。HC可变域的胚系参照序列可以基于具有特定正则结构(如，在H 1和H2高变环中的1-3结构)的序列。如在Chothia等人，(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；Tomlinson等人，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)和Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14(18)：4628-38中所述的，免疫球蛋白可变域中高变环的正则结构可以由其序列推断出来。具有1-3结构的示例性序列包括：DP-1、DP-8、DP-12、DP-2、DP-25、DP-15、DP-7、DP-4、DP-31、DP-32、DP-33、DP-35、DP-40、7-2、hv3005、hv3005f3、DP-46、DP-47、DP-58、DP-49、DP-50、DP-51、DP-53和DP-54。
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂为适体。如本文中所用的，术语核酸“适体”指一种核酸分子，其具有包括至少5个核苷酸的内部非双链核酸结构的构象。适体可以是具有自互补区的单链核酸分子。
由于选择的适体可以通过标准核酸扩增程序回收，所以适体可以在体外进行筛选。该方法可以被通过将选择的适体裂解成池(pool)并用可检测的标记物(如荧光团)修饰池中的各适体在，例如后面选择轮中得到增强。具有功能上改变标记物性质的适体的池可以被识别。这些池可以被反复裂解和重复分析以识别具有所需性质的个别适体(参见，例如，Jhaveri等人，Nature Biotechnol.18：1293)。
此外，可以在体内筛选适体的活性。例如，改组核酸(shufflednucleic acid)可以被克隆到引入到细胞的表达载体中。可以对由表达的改组核酸得到的RNA适体的生物活性进行筛选。具有该活性的细胞可以被分离并且回收所筛选的RNA适体的表达载体。
治疗性寡聚物(例如，适体)的一个重要特征是被施用的寡聚物的骨架设计。在一些实施方式中，所述骨架含有在体内稳定的核苷酸间键，且其结构使得寡聚物对内源性核酸酶(如攻击磷酸二酯键的核酸酶)具有抗性。同时，寡聚物保持与靶DNA或RNA杂交的能力(Agarwal，K.L.等人，(1979)Nucleic Acids Res.6：3009；Agarwal，S.等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：7079)。修饰的寡核苷酸可以使用替代的核苷酸间键构建。这些示例性连接键中的几种描述于Uhlmann，E.和Peyman，A.(1990)Chemical Reviews 90：543-584中。其中有甲基膦酸酯类(其中与磷连接的氧中的一个被甲基替代)、硫逐磷酸酯类(其中硫替代这些氧中的一个)和各种酰胺化物(其中NH2或如吗啉化物(morpholidate)或哌嗪化物(piperazidate)的有机胺衍生物替代氧)。这些替代赋予增强的稳定性。WO 91/15500教导了各种寡核苷酸类似物，其中一个或多个核苷酸间键被基于硫的键替代，通常是与磷酸二酯电子等排的和等电位的氨基磺酸二酯(sulfamatediester)。WO 89/12060类似地公开了含有硫化物、亚砜和砜的键。WO 86/05518提出了有规立构的聚合3′，5′键的变体。美国专利第5,079,151号公开了通过2′，5′磷酸二酯键与单链DNA连接的分支RNA的msDNA分子。美国专利第5,264,562号描述了式--Y′CX′2Y′--的修饰键，其中Y′独立地为O或S，并且其中各X′为稳定的取代基并被独立地选择。吗啉型核苷酸间键描述于美国专利第5,034,506号中，并且在一些情况中其使寡聚物对互补靶序列的增强的亲和力得以增加。美国专利第5,264,562和5,596,086号公开了具有能够与靶RNA和DNA强杂交的修饰核苷酸键的修饰寡核苷酸。
VEGF拮抗剂
用于本发明的VEGF拮抗剂为VEGF途径拮抗剂。VEGF途径拮抗剂包括VEGF抑制剂(例如，VEGF-A、-B或-C，如贝伐单抗)、VEGF表达调节剂(例如，INGN-241、口服四硫钼酸盐、2-甲氧雌二醇、2-甲氧雌二醇纳米晶体分散体、贝伐西尼钠(bevasiranib sodium)、PTC-299，Veglin)、VEGF受体抑制剂(例如，如抗-KDR抗体的KDR或VEGF受体III(Flt4)，如CDP-791、IMC-1121B的VEGFR2抗体，如CT-322的VEGFR2阻滞剂)、如hF4-3C5的VEGFR3抗体、VEGFR表达调节剂(例如，VEGFR1表达调节剂Sirna-027)或VEGF受体下游信号抑制剂。
示例性VEGF抑制剂包括贝伐单抗、哌加他尼、兰尼单抗、新伐司他、AE-941、VEGF Trap和PI-88。
示例性VEGF受体拮抗剂包括VEGF受体酪氨酸激酶活性的抑制剂。4-[4-(1-氨基-1-甲基乙基)苯基]-2-[4-(2-吗啉-4-基-乙基)苯基氨基]嘧啶-5-腈(JNJ-17029259)是一种5-氰基嘧啶结构类化合物，5-氰基嘧啶类为血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)的口服给药的、选择性的、纳摩尔的抑制剂。另外的实例包括：PTK-787/ZK222584(阿斯利康)、SU5416、SU11248(辉瑞)和ZD6474([N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺])、凡德他尼、塞地兰尼、AG-013958、CP-547632、E-7080、XL-184、L-21649和ZK-304709。其它VEGF拮抗剂为广谱特异性酪氨酸激酶抑制剂，例如，SU6668(参见，例如，Bergers，B.等人，2003J.Clin.Invest.I 11：1287-95)、索拉非尼、舒尼替尼、帕唑帕尼、瓦他拉尼、AEE-788、AMG-706、阿西替尼、BIBF-1120、SU-14813、XL-647、XL-999、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、OSI-930和TKI-258。还可以使用下调细胞表面的VEGF受体的物质(如芬维A胺)和抑制VEGF受体下游信号的物质(如角鲨胺)。
蛋白质制备
标准重组核酸方法可用于表达Tie1胞外域-结合蛋白质和作为蛋白质的VEGF拮抗剂。参见，例如，描述于Sambrook&Russell，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，N.Y.(2001)和Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (GreenePublishing Associates and Wiley Interscience )，N.Y.(1989)中的技术。通常，将编码该结合蛋白质的核酸序列克隆到核酸表达载体中。如果蛋白质包括多条多肽链，则可将各条链克隆到表达载体中，例如，相同或不同的载体中，所述载体被表达于相同或不同的细胞中。下面还给出了制备抗体的方法。
一些抗体(例如，Fab)可以在细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)中产生。例如，如果Fab由在展示体(display entity)和噬菌体蛋白质(或其片段)之间包括可抑制终止密码子的噬菌体展示载体中的序列编码，则载体核酸可以被混入(shuffle)不能抑制终止密码子的细菌细胞中。在这种情况中，Fab不与基因III蛋白质融合，且被分泌到介质中。
抗体也可以在真核细胞中产生。在一个实施方式中，抗体(例如，scFv′s)表达于如毕赤酵母(Pichia)(参见，例如，Powers等人，(2001)J Immunol Methods.251：123-35)、汉逊酵母(Hanseula)或酵母菌属(Saccharomyces))的酵母细胞中。
在一个实施方式中，抗体在哺乳动物细胞中产生。优选的用于表达克隆抗体或其抗原结合片段的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中的dhfr-CHO细胞，其与如描述于Kaufman和Sharp，(1982)Mol.Biol.159：601-621中的DHFR可选标志物一起使用)；淋巴细胞系，例如，NSO骨髓瘤细胞、SP2细胞、COS细胞、HEK 293T细胞；以及来自于转基因动物(例如，转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞为乳腺上皮细胞。
除了编码免疫球蛋白域的核酸序列之外，重组表达载体可以携带另外的序列，如调节载体在宿主细胞中的复制的序列(例如，复制的起始区)和可选标志基因。可选标志基因有助于选择载体已被引入到其中的宿主细胞(参见，例如，美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，通常，可选标志基因赋予载体已被引入到其中的宿主细胞对药物(如G418、潮霉素或氨甲蝶呤)的抗性。优选的可选标志基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有氨甲蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中)和neo基因(用于G418选择)。另外的示例性表达系统是从Lonza Group Ltd.CH得到的谷氨酰胺合成酶(GS)载体系统(参见，例如，Clark等人，(2004)BioProcess International2(4)：48-52；Barnes等人，(2002)Biotech Bioeng.81(6)：631-639)。
在抗体或其抗原结合部分的重组表达的示例性系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在该重组表达载体内，抗体重链和轻链各自与增强子/启动子调控元件(例如，由SV40、CMV、腺病毒等得到的，如CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)可操作地连接以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带DHFR基因，其允许使用氨甲蝶呤选对/扩增来筛选已用载体转染的CHO细胞。对选择的转化宿主细胞进行培养以允许抗体重链和轻链进行表达并从培养基中回收完整抗体。标准分子生物学技术被用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。例如，一些抗体可以通过亲和色谱法用A蛋白或G蛋白进行分离。
密码子使用可以适合于宿主细胞的密码子偏性(codon bias)，例如，对于CHO细胞，其可以适应于密码子偏性中国地鼠(Cricetulusgriseus)基因。此外，在可能的情况下可以避免非常高(＞80％)或非常低(＜30％)GC含量的区域。在优化过程中，避免以下顺式作用序列基序：内部TATA-盒；chi-位点和核糖体进入位点；富含AT或富含GC的序列延伸段(sequence stretch)；ARE、INS、CRS序列元件；重复序列和RNA二级结构；及(隐含)剪接供体和受体位点、分支点。两个终止(STOP)密码子可用于保证有效的终止。序列的密码子优化可按照Sharp，P.M.和Li，W.H.，Nucleic Acids Res.15(3)，1987进行评价。可以使用标准密码子适应指数(CAI)。稀有密码子包括具有0-40之间的质量级(quality class)的那些密码子。
密码子改变(例如，密码子优化)的序列可用于制备抗体。示例性的方法包括提供包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞并在细胞中表达核酸，例如，保持细胞在蛋白质被表达的条件下。编码抗体的核酸可以在哺乳动物表达载体(例如，引入到细胞的载体)中提供。所述细胞可以为非人类哺乳动物细胞，例如，CHO细胞。
对于包括Fc域的抗体，抗体制备系统优选合成其中Fc域被糖基化的抗体。例如，IgG分子的Fc域在CH2域中的天冬酰胺297处被糖基化。该天冬酰胺是用双触(biantennary)型低聚糖修饰的位点。已证明该糖基化是Fcγ受体和补体C 1q介导的效应子作用所需要(Burton和Woof，(1992)Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等人，(1998)Immunol.Rev.163：59-76)。在优选的实施方式中，Fc域在使对应于天冬酰胺297的残基适当地糖基化的哺乳动物表达系统中产生。Fc结构域还可以包括其它真核的翻译后修饰。
抗体也可以由转基因动物产生。例如，U.S 5,849,992描述了在转基因动物的乳腺中表达抗体的方法。构建包括乳特异性启动子(milk-specific promoter)、编码目标抗体的核酸和分泌的信号序列的转基因。由这种转基因哺乳动物中的雌性动物产生的乳汁包括分泌于其中的目标抗体。该抗体可以从乳汁中被纯化或者在一些应用中直接使用。
也可以通过免疫法(例如，使用动物，如具有天然、人或部分人的免疫球蛋白基因座)产生与Tie1胞外域结合的抗体。这种抗体可以为任何同种异型抗体，例如，a，z同种异型、f同种异型或非A同种异型。非人类抗体也可以被修饰以包括对人免疫球蛋白序列的置换，例如，在特定位置处的共有的人氨基酸残基，例如在以下的一个或多个(优选至少5个、10个、12个或全部)位置处：(在轻链可变域的FR中)4L、35L、36L、38L、43L、44L、58L、46L、62L、63L、64L、65L、66L、67L、68L、69L、70L、71L、73L、85L、87L、98L和/或(在重链可变域的FR中)2H、4H、24H、36H、37H、39H、43H、45H、49H、58H、60H、67H、68H、69H、70H、73H、74H、75H、78H、91H、92H、93H和/或103H(根据Kabat编号)。参见，例如，U.S.6,407,213。
药物组合物
Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂在本发明的方法中典型地作为药物组合物施用。一种物质的“药物组合物”是用药学上可接受的载体配制的药剂。药物组合物包括标记的结合蛋白(例如，用于体内成像)以及治疗组合物。
如本文中所用的，“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何的和所有的溶剂、分散介质、包覆材料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、非肠道、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。根据给药途径的不同，可以将结合蛋白包被于材料中以保护化合物不受可能使化合物失活的酸和其它天然条件的作用。
“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的希望的生物学活性并且不产生任何不希望的毒物学效应的盐(参见，例如Berge，S.M.等人，(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由无毒的无机酸(如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等)以及无毒的有机酸(如脂族单-和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等)得到的那些盐。碱加成盐包括由碱土金属(如钠、钾、镁、钙等)以及无毒的有机胺(如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等)得到的那些盐。
药物组合物可以为各种形式。这些包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、分散体或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的给药模式和治疗应用。对于为蛋白质的Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂，典型的优选制剂是可注射或可输注的溶液形式，如与用于向人体施用抗体的那些制剂相似的组合物。对于这些蛋白质性质的物质，优选的施用模式通常是非肠道(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)形式。在一些实施方式中，蛋白质性质的Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂通过，例如以小于30、20、10、5或1mg/min的速度的静脉输注施用以达到大约1至100mg/m2或7至25mg/m2的剂量，或通过注射施用。在其它实施方式中。蛋白质性质的Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂通过肌内或皮下注射施用。
如本文中所用的，短语“非肠道给药”和“非肠道地施用”意思是除了肠内和局部给药以外的给药模式，通常通过注射，并且非限制性地包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
Tie1胞外域-结合剂和/或VEGF拮抗剂可配制成溶液剂、微乳液、分散体、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的药物加入具有上面列举的成分中的一种或多种成分的组合(根据需要的适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，分散体通过将活性化合物加入到含有基本分散介质和所需的其它成分(来自于上面列举的那些成分)的无菌赋形剂中而制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。溶液剂的适当流动性可以通过，例如使用如卵磷脂的涂层、在分散体的情况下通过保持需要的颗粒大小以及通过使用表面活性剂而得到保持。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的物质(例如，单硬脂酸盐和明胶)而产生。
给药途径和/或模式将根据所需结果发生改变。在某些实施方式中，活性化合物可以用使化合物避免快速释放的载体制备，如控释制剂(包括植入剂)和微囊给药系统。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类和聚乳酸。制备这种制剂的许多方法取得专利权或被普遍知道。参见，例如，缓释和控释给药系统(Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems)，J.R.Robinson编辑，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约，1978。
在某些实施方式中，结合蛋白可以口服施用，例如，与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起。化合物(如果需要，和其它成分)也可以包封在硬或软壳明胶胶囊中、压制成片剂或直接加入到对象的饮食中。对于口服治疗给药，化合物可以与赋形剂合并在一起，并以口服片剂、含片剂、锭剂(troche)、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、圆片剂(wafer)等的形式使用。为了通过除了非肠道给药以外的其它方式来施用本文描述的化合物，用材料包覆该化合物或与材料一起共同施用该化合物以防止其失活可能是必要的。
药物组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，在一个优选实施方式中，药剂可以用无针皮下注射装置施用，如在美国专利第5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556号中公开的装置。植入剂和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，其公开了用于以可控速率给予药物的可植入的微量输液泵；美国专利第4,486,194号，其公开了用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其公开了以精确的输注速率给予药物的药物输液泵；美国专利第4,447,224号，其公开了用于连续给药的变流可植入输液器；美国专利第4,439,196号，其公开了具有多腔室的渗透性给药系统；和美国专利第4,475,196号，其公开了渗透性给药系统。当然，许多其它的这类植入剂、给药系统和模块也是已知的。
在某些实施方式中，本文中描述的结合蛋白可以进行配制以确保在体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水的化合物。为了确保治疗蛋白穿过BBB(如果需要)，其可以被配制在如脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见，例如美国专利第4,522,811、5,374,548和5,399,331号。脂质体可以包括被选择性地转运到特定的细胞或器官中的一个或多个部分，因此增强了靶向药物输送(参见，例如V.V.Ranade，(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单次推注，可以随着时间给予几个分剂量，或者可以按照治疗情况的紧急需要所示而按比例地减少或增加剂量。为使给药容易和剂量均匀，配制单位剂量形式的非肠道组合物是特别有利的。如本文中所用的，单位剂量形式指适合作为用于被治疗对象的单次剂量的物理分离的单位；各个单位含有与需要的药物载体结合的预计产生期望疗效的预定量活性化合物。单位剂量形式的规格可以由(a)活性化合物的独特的性质和要达到的特定的疗效和(b)在配制这种活性化合物用于个体的灵敏治疗的技术中的固有限制支配并直接取决这些因素。
药物组合物可以使用治疗有效量或预防有效量的本文描述的靶结合蛋白制备。组合物的治疗有效量可以根据一些因素进行变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及结合蛋白在个体中引起所需反应的能力。治疗有效量也是治疗的有益效果超过组合物的任何毒性或有害效果的量。治疗有效量优选抑制可测量的参数，例如，相对于未治疗的对象抑制至少约20％、更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％和还更优选至少约80％的炎症或肿瘤生长率。化合物抑制可测量的参数(例如，癌症)的能力可以在能预言人类肿瘤中的有效性的动物模型系统中进行评价。或者，组合物的这一性质可以通过按照本领域技术人员已知的分析方法检查化合物抑制，如体外抑制，的能力进行评价。
包括(a)Tie1胞外域-结合剂，(b)VEGF拮抗剂和(c)根据本文公开的方法的使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。治疗应用的说明书包括在患有(a)癌症或肿瘤性疾病，(b)炎性疾病(例如，类风湿性关节炎)或眼内疾病的患者中使用的建议剂量和/或给药模式。该试剂盒可进一步包含在一个或多个分开的药物制剂中的至少一种另外的试剂，如适当配制的另外的治疗剂(例如，细胞毒性化学治疗剂)。
稳定化和保持
在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂与提高其在循环系统(例如，血液、血清、淋巴或其它组织)中的稳定性和/或保持的成分物理结合。
例如，Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂可以与聚合物结合，例如，基本上非抗原性聚合物，如聚环氧烷烃(polyalkylene oxide)或聚环氧乙烷(polyethylene oxide)。适宜的聚合物重量会变化很大。示例性的聚合物包括具有约200至约35,000、约1,000至约15,000和约2,000至约12,500的数均分子量的聚合物，但是可以在更高的范围内变动(例如，高至约500,000D)，并且在一些实施方式中为至少约20,000D，或至少约30,000D或至少约40,000D。所选择的分子量可以取决于要得到的结合物的有效大小、聚合物的性质(例如结构，如线性或分支的)和衍生化的程度。
可用于Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂修饰的聚合物包括水溶性聚合物，例如，亲水性聚乙烯聚合物(如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮)。这种聚合物的非限制性列表包括聚环氧烷烃均聚物(如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇)、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。其它可用的聚合物包括聚氧化烯烃类(polyoxyalkylenes)，如聚氧乙烯、聚氧丙烯、以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯类；卡波姆；包括如下糖单体的分支或无分支多糖：D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸(如多聚甘露糖醛酸或海藻酸)、D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖以及包括同多糖和杂多糖(如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原、或如透明质酸的酸性粘多糖类的多糖亚单位)的神经氨酸；糖醇的聚合物，如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或乙酰肝素。
其它化合物也可以连接到相同的聚合物上，例如，细胞毒素、标记物、或者另一靶向剂(如，另一靶结合剂)或不相关的物质。单活化的、烷氧基末端的聚环氧烷烃(PAO)，如单甲氧基末端的聚乙二醇(mPEG′s)；C1-4烷基末端的聚合物；和双活化的聚环氧乙烷(二醇类)可用于交联。参见，例如，U.S.5,951,974。
以其最常见的形式，聚乙二醇(PEG)是具有羟基末端的并具有以下通式的直链或支链聚醚：
HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
PEG可以通过由氢氧离子对环氧环的亲核攻击引发的环氧乙烷阴离子开环聚合而合成。特别用于多肽修饰是具有以下通式的单甲氧基PEG(mPEG)：
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
对于进一步描述，参见例如Roberts等人，(2002)Advanced DrugDelivery Reviews，54：459-476。
共价交联可用于将靶结合剂(例如，蛋白质)连接到聚合物上，例如，与赖氨酸残基上发现的N-末端氨基和ε氨基、以及其它氨基、亚胺基、羧基、巯基、羟基或其它亲水基团交联。聚合物可以与靶结合蛋白质直接共价连接而不使用多功能(一般地双功能)交联剂。与氨基的共价结合通过基于氰尿酰氯、羰基二咪唑、醛反应基团(PEG醇盐加溴代乙醛的缩二乙醇、PEG加DMSO和乙酸酐、或PEG氯化物加4-羟基苯醛的酚盐、活化琥珀酰亚胺酯、活化二硫代碳酸PEG、2，4，5-三氯苯基氯甲酸酯或对硝基苯氯甲酸酯活化PEG)的已知化学反应完成。羧基可以通过使用碳二亚胺偶联PEG-胺而衍生。巯基可以通过与马来酰亚胺基取代的PEG(如烷氧基-PEG胺加磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(WO 97/10847)或由Shearwater Polymers，Inc.(亨维尔，亚拉巴马州)购得的PEG-马来酰亚胺偶联)而衍生。或者，结合蛋白质上的游离氨基(如赖氨酸残基上的ε氨基)可以用2-亚氨基-四氢噻吩(thiolane)(Traut ′s试剂)硫醇化，然后与含有马来酰亚胺的PEG衍生物偶联，例如，如Pedley等人，Br.J.Cancer，70：1126-1130(1994)中所述。
可连接Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂的功能化PEG聚合物可从例如Shearwater Polymers，Inc.(亨维尔，亚拉巴马州)得到。这种市售可得的PEG衍生物包括，例如氨基-PEG、PEG氨基酸酯、PEG-酰肼、PEG-硫醇、PEG-琥珀酸酯、羧甲基化PEG、PEG-丙酸、PEG氨基酸、PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、PEG琥珀酰亚胺基丙酸酯、羧甲基化PEG琥珀酰亚胺酯、PEG的琥珀酰亚胺基碳酸酯、氨基酸PEG 的琥珀酰亚胺酯、PEG-氧代羰基咪唑(PEG-oxycarbonylimidazole)、PEG-硝基苯基碳酸酯、PEG三氟乙基磺酸酯(PEG tresylate)、PEG-缩水甘油醚、PEG-醛、PEG乙烯砜、PEG-马来酰亚胺、PEG-二硫化正吡啶、异功能PEG、PEG乙烯基衍生物、PEG硅烷和PEG phospholide。用于偶联这些PEG衍生物的反应条件可以根据所涉及的Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂、希望的PEG化程度和所使用的PEG衍生物而变化。涉及PEG衍生物选择的一些因素包括：希望的连接点(如赖氨酸或半胱氨酸R-基团)；衍生物的水解稳定性和反应性；键的稳定性、毒性和抗原性；对于分析的适合性等。任何特定衍生物的具体使用说明可以从制造商得到。
Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂与聚合物的结合物可以通过例如凝胶过滤或离子交换色谱(例如，HPLC)与未反应的原料分离。结合物的异质种类以相同的方式彼此纯化。不同种类(例如，含有一个或两个PEG残基)的分离也是可能的，例如，由于非反应氨基酸的离子性质的不同。参见，例如，WO 96/34015。
靶结合蛋白质也可以与提供稳定化或保持功能的蛋白质，如白蛋白(例如，人血清白蛋白)物理结合。US 2004/0171794描述了用于将蛋白质与血清白蛋白物理结合的示例性方法。为了示例性目的，人白蛋白序列或其片段参见EP 201239、EP 322094、WO 97/24445、W095/23857，特别是如US 2004/0171794和WO 01/79480中的SEQID NO：18所示的人白蛋白成熟形式，或来自其它脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或变体。其它示例性人血清白蛋白蛋白质可以包括以下点突变组中的一个或两个：Leu-407至Ala、Leu-408至VaI、Val-409至Ala和Arg-410至Ala；或Arg-410至Ala、Lys-413至Gln和Lys-414至Gln(参见，例如，国际公开第WO95/23857号，参考US 2004/0171794中的SEQ ID NO：18)。
使用方法
本发明提供通过在不同的时间开始Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂的施用改善血管生成相关疾病的至少一个病症的方法。在一些方面中，施用Tie1胞外域-结合剂，然后施用VEGF拮抗剂。在第一次施用VEGF拮抗剂之前的一段时间施用Tie1胞外域-结合剂，该段时间可以在第一次施用VEGF拮抗剂之前的1天至最多35天(例如，5、7、10、14、20、21、28或30天)的范围内，或者可以在显示肿瘤脉管系统或肿瘤生长发生变化的迹象时施用Tie1胞外域-结合剂。该段时间可以基于例如对于给定的治疗周期的第一次Tie1胞外域-结合剂施用来计算。
在一些实施方式中，对象需要减少血管生成或经确认为如此。例如，对象患有肿瘤性疾病(如转移癌)。例如，对象患有血管生成依赖性癌症或肿瘤。所述肿瘤可以为实体瘤，例如，直径为至少1、2、3、5、8或10mm的肿瘤。在一个实施方式中，实体瘤具有缺氧性核。所述方法可以包括在施用该拮抗剂之前评估对象并检查对象中的实体瘤。
在一些实施方式中，第一次施用VEGF拮抗剂后继续施用Tie 1胞外域-结合剂，而在其它实施方式中，开始施用VEGF拮抗剂时停止施用Tie1胞外域-结合剂。
在一些实施方式中，以单独有效地减少对象中的血管生成或以别的方式治疗对象中的疾病(例如，改善疾病的症状)的量施用Tie 1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂。在其它实施方式中，Tie 1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以比单独有效减少对象中的血管生成或者以别的方式治疗或预防对象中的疾病的量小的量施用。在其它实施方式中，在一些实施方式中，VEGF拮抗剂以比单独有效减少对象中的血管生成或者以别的方式治疗或预防对象中的疾病的量小的量施用(例如，当VEGF拮抗剂是贝伐单抗且疾病是非鳞状细胞、非小细胞肺癌时，阿瓦斯汀(AVASTIN)的剂量小于15mg/kg)。在一些实施方式中，Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂以协同有效的量(例如，当与单独施用的任一化合物相比时产生协同效应的量)施用。
Tie1胞外域-结合剂(例如，本文中公开的Tie1胞外域-结合蛋白)可以增强以VEGF途径作为靶点的物质(例如，如贝伐单抗的VEGF-A-结合抗体)的活性。因此，在一个用于治疗癌症的联合治疗中，第二治疗是抑制VEGF途径信号传导的物质，如VEGF-A-结合抗体(例如，贝伐单抗)，其以比在没有Tie1胞外域-结合蛋白的情况下施用VEGF-途径抑制剂的剂量小的剂量施用。例如，当Tie1胞外域-结合蛋白在与VEGF拮抗剂(例如，抗-VEGF-A抗体)的联合治疗中一起使用时，VEGF拮抗剂的剂量可以由没有与Tie1胞外域-结合蛋白联合施用时的VEGF拮抗剂剂量下降(例如，比没有与Tie1胞外域-结合蛋白联合施用时的VEGF拮抗剂剂量小至少10％、25％、40％或50％)。例如，当在与Tie1胞外域-结合蛋白(但没有其它化学治疗剂)联合治疗中施用时，贝伐单抗(
)的剂量小于约15、13.5、11.25、9或7.5mg/kg。当与化学治疗剂(例如，推注-IFL(伊立替康125mg/m2IV、5-氟尿嘧啶500mg/m2IV和甲酰四氢叶酸20mg/m2IV，每隔6周的4周内每周1次给药)、FOLFOX4(第一天：奥沙利铂85mg/m2和甲酰四氢叶酸200mg/m2同时IV，然后在5-FU400mg/m2IV推注后600mg/m2持续IV；第二天：甲酰四氢叶酸200mg/m2IV，然后在5-FU 400mg/m2IV推注后600mg/m2持续IV；每2周重复)、或5-FU)联合施用时，贝伐单抗剂量减小至5或10mg/kg。因此，在联合治疗中，当与本文中公开的Tie1胞外域-结合蛋白联合施用时，贝伐单抗的剂量可以减小至低于约10、9、7.5、6或5mg/kg(在没有Tie1胞外域-结合蛋白的情况下，贝伐单抗的剂量为10mg/kg时)，或者低于约5、4.5、3.75、3或2.5mg/kg(在没有Tie 1胞外域-结合蛋白的情况下，贝伐单抗的剂量为5mg/kg时)。
血管生成相关疾病包括，但不限于肿瘤性疾病(如，实体瘤、肿瘤转移和良性肿瘤，特别是需要血液供应或血管生成的肿瘤性疾病)；炎性疾病(如，类风湿性关节炎、狼疮、再狭窄、牛皮癣、移植物抗宿主反应或多发性硬化症)；眼部血管生成疾病，例如，视网膜病(例如，如糖尿病性视网膜病的增殖性视网膜病、缺血性视网膜病或早产儿视网膜病)、脉络膜新血管生成、水晶体新血管生成、角膜新血管生成、虹膜新血管生成、或结膜新血管生成、黄斑变性(如，湿性和/或干性年龄相关性黄斑变性)、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织增生症、虹膜红变；遗传性出血性毛细血管扩张症；心肌血管生成；斑块内新血管生成；毛细管扩张；血友病关节；血管纤维瘤以及创面肉芽形成。
良性肿瘤包括，但不限于，血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼以及脓性肉芽肿。实体瘤包括，但不限于，各个器官系统的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺瘤和癌瘤，如那些侵袭肺、乳腺、胃肠(如结肠)、和生殖泌尿道(如肾脏、膀胱上皮细胞)、咽的恶性肿瘤，以及腺癌，包括如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食道癌和胰腺癌的恶性肿瘤。可被治疗的实体瘤的其它实例还包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃肠系统癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、生殖泌尿系统癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、内分泌系统癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤以及视网膜母细胞瘤。
当血管生成相关疾病为肿瘤性疾病时，疾病症状的改善是如通过临床测量方法(例如，MRI、CT、诊断性放射测量(如骨扫描)等)所确定的肿瘤性疾病的量(例如，肿瘤尺寸)的消除、减少、稳定，或者肿瘤生长速率或数目(例如，转移)的下降。可被影响的其它参数包括日常生活活动，如疼痛(例如，患者使用直观或数字量表报告疼痛)。
在一些实施方式中，血管生成相关疾病为炎性疾病，例如，类风湿性关节炎、牛皮癣、类风湿性或风湿性炎性疾病、或者其它慢性炎性疾病(如慢性哮喘、动脉或移植后动脉粥样硬化、以及子宫内膜异位症)。可被治疗的其它血管生成相关疾病包括具有异常或不期望的血管生成的那些疾病，如眼部新血管生成，例如，视网膜病(包括糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性)、成血管细胞瘤、血管瘤和动脉硬化。
牛皮癣是以脱屑和炎症为特征的慢性皮肤病。当牛皮癣发生时，常见皮肤片增厚、变红并覆盖有银色鳞屑，称为斑块。牛皮癣最常出现在肘、膝、头皮、下背部、面部、手掌和足底。该疾病还可以侵袭指甲、脚趾甲以及口和生殖器内的软组织。大约10％患有牛皮癣的人具有产生关节炎症状的关节炎症。可以采用静态医师整体评价(static Physician Global Assessment，sPGA)对患者进行评估，并且在干净和非常严重之间的6个分类范围内接受分类评分。评分是基于斑块、脱屑和红斑。本发明的治疗方法可用于实现这些指标中的至少一个的改善。
类风湿性关节炎(“RA”)是一种引起疼痛、肿胀、僵硬和功能缺失的慢性炎性疾病，主要是关节。RA经常开始于滑膜，其为包围关节产生保护囊的膜。在许多患有RA的个体中，白细胞从循环系统渗入到滑膜中引起持续的异常炎症(例如，滑膜炎)。结果，滑膜发生炎症，引起发热、发红、肿胀和疼痛。软骨中的胶原逐渐被破坏，使关节腔变窄并最终使骨头损坏。该炎症引起被侵袭区域的侵蚀性骨损伤。在该过程中，滑膜的细胞异常生长并分裂，从而使正常的薄滑膜增厚并导致关节在触碰时肿胀和肥大。RA可以通过各种临床测量评价。一些示例性指标包括总体Sharp评分(total Sharp score，TSS)、Sharp侵蚀评分和HAQ功能障碍指数(HAQ disability index)。本文的治疗方法可用于实现这些指标中的至少一种的改善。
如本文中所用的，对治疗疾病(例如，改善其至少一个症状)有效的Tie 1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂的量，或“治疗有效量”指对对象进行单或多剂量给药时有效地延长治疗、减轻、缓解或改善患有本文所述疾病的患者的情况使其优于在没有这种治疗的情况下所预期的情况的Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂的量。在一些情况中，治疗有效量可以通过评估结合剂相对于未处理的对照小鼠减小裸鼠中异种移植物的肿瘤尺寸的能力而确定。如本文中所用的，“抑制肿瘤或其它赘生物的生长”指减慢、中断、阻滞或终止其生长和转移，而不必须表明赘生物生长的完全消除。
本文中描述的抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20mg/kg，更优选1-10mg/kg。靶结合抗体可以通过静脉输注以小于30、20、10、5或1mg/min的速度施用以达到大约1至100mg/m2或5至30mg/m2的剂量。对于分子量小于抗体的Tie 1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂，适宜的量可以按比例减小。应注意剂量值可以随待减轻的疾病的类型和严重程度而改变。另外还应理解，对于任何特定的对象，应根据个体需求和管理或监控组合物给药的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且应理解本文提出的剂量范围只是示例性的而不意欲限制要求保护的组合物的范围或实施。
可以被治疗的对象包括人类和非人类动物。例如，人类可以为患有特征为异常细胞增殖或细胞分化的疾病的人类患者。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如，非哺乳动物(如家禽、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物(如非人类灵长类、羊、狗、牛、猪等)。
施用Tie1胞外域-结合剂、VEGF拮抗剂和其它物质(例如，细胞毒素化学治疗剂)的方法也描述于“药物组合物”中。所使用分子的适宜的剂量将取决于对象的年龄和体重以及所使用的特定药物。
联合治疗
本文公开的治疗方法可用于与一个或多个另外的治疗模式联合，另外的治疗模式包括，但不限于：手术、放射治疗和化学治疗。
关于本文所述的方法，术语“联合”指使用一种或多种另外的物质或治疗来处理相同的患者，其中所述物质或治疗的使用或作用在时间上重叠。另外的物质或治疗可以在Tie1胞外域-结合蛋白和/或VEGF拮抗剂被施用的同时施用，或以任何顺序顺续施用。序贯施用是在不同时间给予的施用。在一种物质和另一种物质施用之间的时间可以为分钟、小时、天或周。
另外的物质或治疗也可以是另一抗癌剂或治疗。抗癌剂的非限制性实例包括，例如，抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、烷化剂、嵌入剂、能够干扰信号转导途径的物质、能够促进细胞凋亡的物质、放射物和抗其它肿瘤相关抗原的抗体(包括裸抗体、免疫毒素和放射偶联物)。特定类抗癌剂的实例详细给出如下：抗微管蛋白/抗微管剂，例如紫杉醇、长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、多西他赛(taxotere)；拓扑异构酶I抑制剂，例如伊立替康、托泊替康、喜树碱、多柔比星、依托泊苷、米托蒽醌、柔红霉素、伊达比星、替尼泊苷、安吖啶、表柔比星、美巴龙(merbarone)、盐酸吡罗蒽醌；抗代谢物，例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、阿糖胞苷/Ara-C、三甲曲沙、吉西他滨、阿西维辛、阿拉诺新、吡唑呋喃菌素、N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸＝PALA、喷司他丁、5-氮杂胞苷、5-氮杂-2′-脱氧胞苷、ara-A、克拉屈滨、5-氟尿苷、FUDR、噻唑呋林、N-[5-[N-(3，4-二氢-2-甲基-4-氧代喹唑啉-6-基甲基)-N-甲氨基]-2-噻吩甲酰]-L-谷氨酸；烷化剂，例如顺铂、卡铂、丝裂霉素C、BCNU＝卡莫司汀、美法仑、塞替派、白消安、苯丁酸氮芥、普卡霉素、达卡巴嗪、磷酸异环磷酰胺、环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、溴丙哌嗪(pipobroman)、4-甘薯苦醇；通过其它作用机制起作用的物质，例如，二氢仑哌隆(dihydrolenperone)、螺莫司汀和缩肽(desipeptide)；生物反应调节剂，例如，增强抗肿瘤反应(如干扰素)；细胞凋亡剂，如放线菌素D；以及抗激素，例如抗雌激素(如他莫昔芬)，或例如抗雄激素(如4′-氰基-3-(4-氟苯基磺酰基)-2-羟基-2-甲基-3′-(三氟甲基)丙酰苯胺。
联合治疗可以包括施用降低其它治疗的副作用的物质。所述物质可以为降低抗癌治疗的副作用的物质。例如，该物质可以是甲酰四氢叶酸(例如，与5-氟尿嘧啶联用)。联合治疗还可以包括施用降低施用其它治疗的频率的物质。该物质可以为在其它治疗的抗癌效果降低后减少肿瘤生长的物质。
以下实例不应理解为限制本发明。
实施例
实施例1：示例性Tie1胞外域-结合抗体序列
以下为免疫球蛋白轻链和重链可变域的示例性序列：
806C-M0044-B08
L-可变域(AA)：
QDIQMTQSPSFLSASVGDRVTISCRASQYISIYLNWYQQRPGEAPK
LLINAASSLQSGDPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPDDFATYYCQQY
KSYPLTFGEGTKVEIK(SEQ ID NO：2)
L-可变域(DNA)：
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCCGCATC
TGTAGGAGACAGAGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGTAC
ATCAGCATATATTTGAATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGGAAG
CCCCTAAACTCCTGATCAATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGG
GACCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCA
CTCTCACCATCAACAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTAT
TACTGCCAACAGTATAAGAGTTACCCCCTCACTTTCGGCGAGGG
GACCAAGGTGGAGATCAAA(SEQ ID NO：3)
H-可变域(AA)：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYGMGWVRQAPGKG
LEWVSVISPSGGQTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE
DTALYYCAGGDRYGPLHYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)
H-可变域(DNA)：
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGG
TGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTC
TGCTTACGGTATGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTT
TGGAGTGGGTTTCTGTTATCTCTCCTTCTGGTGGCCAGACTTCTT
ATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAAC
TCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGA
GGACACCGCCTTGTATTACTGTGCGGGAGGGGACAGGTATGGA
CCCTTGCACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAG
C(SEQ ID NO：5)
DX-2220为全长、IgG1、胚系的人抗-Tie1抗体E3b。DX-2220的序列如下：
DX-2220轻链氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGHYLAWYQQKPGKVPK
LLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQFN
SYPHTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF
YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：6)
DX-2220重链氨基酸序列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMVWVRQAPGKG
LEWVSVISPSGGNTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE
DTAVYYCARAPRGYSYGYYYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP
SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K(SEQ ID NO：7)
示例性DX-2220轻链核苷酸序列：
GGCGTGCACTCTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCT
GTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCG
AGTCAGGGCATTGGCCATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACC
AGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATACTGCATCCACTTTGC
AATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGAC
AGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTG
CAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCTCACACCTTC
GGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCAC
CATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAG
AGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCG
GGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACA
GCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA
CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG
GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGT
GTTAATAA(SEQ ID NO：8)
示例性DX-2220重链核苷酸序列：
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGG
TGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTC
TATGTACGGTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTT
TGGAGTGGGTTTCTGTTATCTCTCCTTCTGGTGGCAATACTGGTT
ATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAAC
TCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGA
GGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGAGAGCCCCACGTGGATAC
AGCTATGGTTACTACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT
CTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCAC
CCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG
CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG
AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTCCACACCTTCCCGGCTGT
CCTACAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCG
TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG
AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGC
CCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC
ACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA
AACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC
ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA
CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT
CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG
GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA
TCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC
ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG
AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAG
CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC
AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT
CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG
CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCA
CAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT
GA(SEQ ID NO：9)
实施例2：DX-2240的序列：胚系F同种异型的E3抗体
DX-2240(轻、重-可变区、恒定区)。
可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGHYLAWYQQKPGKVPK
LLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDVATYYCQQFN
SYPHTFGQGTRLEIK(SEQ ID NO：10)
轻链恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN
ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT
HQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：11)
DX-2240重链可变区：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMVWVRQAPGKG
LEWVSVISPSGGNTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAE
DTAVYYCARAPRGYSYGYYYWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO：12)
重链恒定区(CH1、铰链区、CH2、CH3)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL
TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR
TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：13)
轻链可任选地进一步包括以下信号序列：MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：14)。重链可任选地进一步包括以下信号序列：MGWSCIILFLVATATGAHS(SEQ ID NO：15)。
实施例3：在乳腺癌异种移植模型中Tie1胞外域-结合蛋白和
VEGF拮抗剂不同给药时间表的评价
在人肿瘤异种移植模型中测试了DX-2240和贝伐单抗(抗-VEGF抗体)或索拉非尼(多激酶抑制剂)联用的抗肿瘤活性。将从携带皮下BxPC-3(人乳腺癌细胞系)肿瘤的宿主裸鼠(nu/nu)收获的BxPC3肿瘤片段皮下植入到雌性裸鼠(试验动物)中并使其形成肿瘤。当肿瘤达到大约100mm3(肿瘤植入后约18天)时将小鼠按照肿瘤尺寸配对并随机分成各种治疗组。将动物分成表1所示的治疗组(“开始”指开始治疗的天数)。DX-2240以20mg/kg腹膜内(IP)注射给予；贝伐单抗以10mg/kg IP注射给予，索拉非尼以60mg/kg口服给予(共9个剂量)，和对照IgG(帕利珠单抗，与DX-2240同种型的抗体)以标明的给药起始日和给药方案以20mg/kg IP注射给予。还包括另外的阳性对照组(组13)：这些动物以40mg/kg Q3d给予吉西他滨共4个剂量。
表1
肿瘤尺寸每隔3天至4天用测径器评估。结果图示地总结于图2-4中。肿瘤体积数据(mm3)示于表2中。
表2
| 天 | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 | 组6 | 组7 | 组11 | 组12 | 组13 |
| 1 | 106.9 | 105.6 | 106.5 | 106.7 | 105.4 | 106.5 | 105.3 | 105.3 | 106.5 |
| 3 | 164.7 | 139.9 | 150.0 | 159.2 | 168.2 | 156.2 | 172.6 | 146.5 | 144.1 |
| 7 | 293.2 | 223.1 | 223.1 | 229.8 | 326.2 | 247.5 | 294.4 | 239.5 | 214.9 |
| 10 | 366.4 | 331.6 | 345.7 | 363.3 | 516.6 | 379.5 | 403.8 | 333.6 | 280.8 |
| 14 | 521.8 | 460.5 | 354.1 | 460.3 | 616.8 | 464.3 | 508.6 | 434.5 | 347.7 |
| 21 | 907.5 | 724.4 | 361.0 | 591.7 | 773.2 | 700.1 | 596.1 | 424.0 | 686.1 |
| 24 | 1062.0 | 954.1 | 386.0 | 570.6 | 927.7 | 777.4 | 522.7 | 348.2 | 848.1 |
| 28 | 1354.0 | 1171.1 | 437.5 | 626.3 | 1058.5 | 799.5 | 815.1 | 532.9 | 1084.8 |
| 31 | 1669.1 | 1351.4 | 535.7 | 777.8 | 1216.5 | 938.0 | 1081.3 | 830.0 | 1325.2 |
作为单个药物，DX-2240、贝伐单抗和索拉非尼与对照相比均减小了肿瘤尺寸。施用DX-2240、随后在第10天开始施用贝伐单抗引起肿瘤尺寸减小的协同改善，而且在第20天开始施用贝伐单抗的相同的药物组合同样表现出协同改善的趋势。特别是，可以注意到DX-2240和贝伐单抗的序贯给药引起肿瘤生长速率减小，从而相对于对照IgG和贝伐单抗组(组6和7)，在具有10或20天的DX-2240预处理的组(即，组3和4)中导致稳定肿瘤的数目和退化增加。表3显示了计算的肿瘤生长速率。
表3
| 阿瓦斯汀(第10 | 阿瓦斯汀之后 | #稳定肿瘤生 |
| 天)之前 | 长或肿瘤退化 | ||
| DX-2240 | 23.9±4.9 | 12.2±3.3* | 1/6 |
| 对照IgG | 41.1±9.0 | 33.3±6.6 | 0/8 |
| 阿瓦斯汀(第21天)之前 | 阿瓦斯汀之后 | #稳定肿瘤生长或肿瘤退化 | |
| DX-2240 | 23.1±6.6 | 18.6±8.0 | 2/8 |
| 对照IgG | 28.3±5.2 | 23.8±8.6 | 1/8 |
DX-2240与索拉非尼的联用导致较小的肿瘤尺寸减小，虽然该效应不大于对照IgG/索拉非尼联用。这可能由于这种肿瘤类型对索拉非尼的超敏性。当给予DX-2240时，预期存在将在一些肿瘤类型中产生协同效应的索拉非尼的最佳剂量。
实施例4：在前列腺癌异种移植模型中Tie1胞外域-结合剂和
VEGF拮抗剂不同给药时间表的评价
将DU 145前列腺癌细胞皮下注射到无胸腺nu/nu小鼠中并使形成肿瘤。将动物分成9-10只小鼠的组，然后进行以下处理：DX-2240(20mg/kg通过IP注射，Q2d)、同种型匹配的抗体对照(A2，20mg/kg通过IP注射，Q2d)、贝伐单抗(12mg/kg通过IP注射，Q5d)、DX-224020mg/kg Q2d+贝伐单抗(DX-224020mg/kg Q2d+贝伐单抗12mg/kg，Q5d，在第25天开始)、DX-224020mg/kg Q4d+贝伐单抗(DX-224020mg/kg Q4d+贝伐单抗12mg/kg，Q5d，在第25天开始)、DX-224010mg/kg Q4d+贝伐单抗(DX-224010mg/kg Q4d+贝伐单抗12mg/kg，Q5d，在第25天开始)、DX-22405mg/kg Q4d+贝伐单抗(DX-22405mg/kg Q4d+贝伐单抗12mg/kg，Q5d，在第25天开始)、DX-22401mg/kg Q4d+贝伐单抗(DX-22401mg/kg Q4d+贝伐单抗12mg/kg，Q5d，在第25天开始)、DX-2240+索拉非尼(DX-224020mg/kg通过IP注射，Q2d，每天索拉非尼100mg/kg口服(PO)共9天(QDx9)在第25和56天开始)或A2+索拉非尼(A220mg/kg通过IP注射，Q2d，索拉非尼100mg/kg PO QDx9在第25和56天开始)。第34天后，只给予DX-2240和只给予A2的组中的小鼠被给予另外的药物，并不再用作该试验的对照。肿瘤体积每周测量两次。
肿瘤体积数据总结于图5和6中。如图5中所示，在该模型中顺序施用DX-2240、施用随后索拉非尼显著降低了肿瘤生长(在DX-2240和索拉非尼共同给药的期间引起肿瘤收缩)，而且该降低看起来在较后的时间点(例如，较大的肿瘤尺寸)是协同的。该模型看起来对贝伐单抗是高度敏感的(以12mg/kg、Q5d单独施用贝伐单抗，引起肿瘤收缩)，因此不能观察到序贯施用Tie1胞外域-结合剂(DX-2240)的协同效应。
实施例5：在胰腺癌模型中DX-2240和VEGF拮抗剂不同给药
时间表的评价
评价了DX-2240在BxPC-3人胰腺癌模型中的程序依赖性(schedule-dependent)抗肿瘤活性。DX-2240和贝伐单抗按各种不同的时间表施用，且活性与用贝伐单抗和对照IgG(帕利珠单抗)共同处理的组比较。此外，我们检查了肿瘤脉管系统的变化并用α-小鼠VEGF结合抗体检测了鼠VEGF的任何潜在效应。
将雌性裸鼠(nu/nu)分成14个组。将从裸鼠宿主中皮下生长的肿瘤收获的BxPC3肿瘤片段用套针皮下植入到组1-12的动物中。将大约1x107个来自组织培养的BxPC-3细胞皮下注射到组13-14的小鼠中。当注射的肿瘤长到尺寸为大约104mm3(植入后大约19天)和植入的肿瘤长到尺寸为大约110mm3(植入后大约22天)时，将动物按照肿瘤尺寸配对成处理和对照组。组1和组2的动物用于评价肿瘤脉管系统。组13和组14的动物用于比较DX-2240对由细胞注射形成的肿瘤的作用。
在动物配对后开始处理(第一天)。所有组中的动物按照体重给药(10ml/kg)。对照IgG和DX-2240以20mg/kg IP注射给药，且贝伐单抗和大鼠α-小鼠VEGF IgG抗体以10mg/kg IP注射给药(每隔3天给药1次)。在第-3、1、5、6、10或20天开始给药。不同给药时间表示于表4中。
表4
| 组 | #动物 | 化合物 | 剂量(mg/kg) | 时间表 |
| 1* | 12 | 对照IgG | 20 | Q2D×10(第1天) |
| 2* | 12 | DX-2240 | 20 | Q2D×10(第1天) |
| 3 | 6 | 对照IgG贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×13(第1天) |
| 4 | 6 | DX-2240贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×13(第1天) |
| 5 | 8 | 对照IgG贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×12(第5天) |
| 6 | 8 | DX-2240贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×12(第5天) |
| 7 | 8 | 对照IgG贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×10(第10天) |
| 8 | 8 | DX-2240贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×10(第10天) |
| 9 | 8 | 对照IgG贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×7(第20天) |
| 10 | 8 | DX-2240贝伐单抗 | 2010 | Q2D×19(第1天)Q3D×7(第20天) |
| 11 | 8 | 对照IgG贝伐单抗大鼠α-小鼠VEGF | 201010 | Q2D×19(第1天)Q3D×7(第20天)Q3D×7(第20天) |
| 12 | 8 | DX-2240贝伐单抗大鼠α-小鼠VEGF | 201010 | Q2D×19(第1天)Q3D×7(第20天)Q3D×7(第20天) |
| 13 | 8 | 对照IgG贝伐单抗 | 2010 | Q2D×21(第-3天)Q3D×11(第6天) |
| 14 | 8 | DX-2240 | 20 | Q2D×21(第-3天) |
| 贝伐单抗 | 10 | Q3D×11(第6天) |
*用于评价肿瘤脉管系统的动物
从第1天直到第39天每周两次记录个体和组平均肿瘤体积。各组的平均肿瘤体积示于表5中并总结于图7中。
表5
| G1 | G2 | G3 | G4 | G5 | G6 | G7 | G8 | G9 | G10 | G11 | G12 | G13 | G14 | |
| -3 | 103.6 | 103.6 | ||||||||||||
| 1 | 107.6 | 107.7 | 109.6 | 107.9 | 108.7 | 110.6 | 109.1 | 110.6 | 109.6 | 109.6 | 109.6 | 108.9 | 140.1 | 139.6 |
| 4 | 180.1 | 157.7 | 161.4 | 145.4 | 163.7 | 166.5 | 178.3 | 177.5 | 184.1 | 162.4 | 181.8 | 163.8 | 179.6 | 163.2 |
| 8 | 237.7 | 194.2 | 243.2 | 231.7 | 203.0 | 232.9 | 322.1 | 264.3 | 290.3 | 241.6 | 255.2 | 237.1 | 158.9 | 158.9 |
| 11 | 249.9 | 199.0 | 282.4 | 308.1 | 263.6 | 286.9 | 403.2 | 283.7 | 408.0 | 326.6 | 410.6 | 330.7 | 155.8 | 167.4 |
| 15 | 355.9 | 308.7 | 394.2 | 433.2 | 319.7 | 358.9 | 470.3 | 383.4 | 576.2 | 394.7 | 506.4 | 418.8 | 166.3 | 164.3 |
| 18 | 300.0 | 289.1 | 472.0 | 561.6 | 408.1 | 431.6 | 514.5 | 406.2 | 800.3 | 549.5 | 777.1 | 541.6 | 235.7 | 216.8 |
| 2-- | 560.0 | 605.3 | 449.1 | 563.1 | 581.0 | 508.6 | 839.5 | 562.4 | 752.7 | 580.8 | 241.9 | 223.7 | ||
| 25 | 634.1 | 767.8 | 545.9 | 573.6 | 708.9 | 484.6 | 986.4 | 553.7 | 847.4 | 678.9 | 282.5 | 202.9 | ||
| 29 | 767.9 | 958.6 | 618.2 | 771.2 | 883.4 | 568.4 | 1092.3 | 624.7 | 1120.3 | 792.6 | 327.1 | 268.5 | ||
| 32 | 871.0 | 1069.1 | 581.8 | 783.6 | 915.5 | 645.6 | 1189.3 | 650.6 | 1242.5 | 820.2 | 309.7 | 273.3 | ||
| 37 | 1046.4 | 1169.6 | 709.0 | 859.4 | 1141.5 | 712.1 | 1602.5 | 708.6 | 1294.4 | 968.4 | 359.8 | 305.0 | ||
| 39 | 1032.2 | 1252.4 | 669.3 | 903.1 | 1255.3 | 755.3 | 1662.7 | 703.0 | 1363 | 996.3 | 391.7 | 323.5 |
如图8中所示，与上面实施例3中的试验结果一致，该试验显示出与对照组相比，施用DX-2240、随后在第10或第20天施用贝伐单抗产生肿瘤尺寸减小的协同改善。如图9中所示，在第1天施用对照IgG或DX-2240并在第1天或第5天开始施用贝伐单抗的共同给药组在肿瘤生长抑制方面没有表现出明显的差别。
α-小鼠VEGF抗体的加入在DX-2240/贝伐单抗处理动物(组12)中引起减小的肿瘤生长抑制，但是与对照IgG/贝伐单抗联用(组11)相比DX-2240/贝伐单抗联用仍减小了肿瘤生长。与具有相似的测得肿瘤体积(～400mm)的植入肿瘤相比，由细胞注射形成的肿瘤(组13和14)对DX-2240/贝伐单抗联用的敏感性较低。然而，不清楚一旦注射的肿瘤达到其体积终点(endpoint)时是否将仍保持该降低的敏感性。
为了测定肿瘤脉管系统中的变化，在第5、10、15和20天从组1和2中各组随机选择3个动物用于破坏性样品(包括肿瘤和血清)收集。对动物IV注射150μL生物素化-凝集素溶液(在第5和15天不注射)。5分钟后，通过心内注射对动物灌注1％多聚甲醛的PBS溶液3分钟。然后收集肿瘤，置于灌注溶液中，并立刻用于分析。通过心脏穿刺收集血液并提取血清，在液氮中速冻，并在-80贮存。凝集素染色试验的数据总结于表6和图10中。
表6
| 对照IgG第10天 | DX-2240第10天 | 对照IgG第20天 | DX-2240第20天 | |
| 高强度(3+) | 19242 | 92134 | 7824 | 5922 |
| 中等强度(2+) | 3148400 | 3468512 | 272402 | 205406 |
| 低强度(1+) | 1214685 | 909706 | 222879 | 122022 |
与来自对照动物的肿瘤相比，来自用DX-2240处理的动物的肿瘤表现出较少的凝集素染色。结果表明在DX-2240处理的动物中有较少的功能性肿瘤脉管系统。
实施例6：在前列腺肿瘤模型中DX-2240和索拉非尼不同给药
时间表的评价
在DU 145人前列腺肿瘤模型中，与用DX-2240和对照IgG(帕利珠单抗)的处理比较，评价了按不同时间表用DX-2240和索拉非尼处理的肿瘤生长抑制。
用从组织培养收集的DU 145细胞对雄性裸鼠(nu/nu)进行皮下注射(～1x107个细胞/小鼠)。当肿瘤长到大约95mm3大小时(注射后大约7天)，按肿瘤尺寸将动物配对成处理组和对照组。
在动物配对后(第1天)开始处理。对照组和处理组中的动物按照体重给药(10ml/kg)。DX-2240和对照IgG(帕利珠单抗)通过IP注射给药，或者从第1天开始每隔1天给药1次进行17次处理，或者从第1天开始每4天给药1次进行9次处理。索拉非尼从第15天开始通过强饲法每天1次口服给药进行9次处理。作为对照，对照IgG从第1天开始每隔1天给药进行17次处理。用于该研究的给药浓度和时间表示于表7中。从第1天直到第57天每周2次记录个体的和组平均的肿瘤体积。结果示于表8中并总结于图11中。
与单独用对照IgG或单独用DX-2240处理的动物相比，用DX-2240和索拉非尼处理的动物表现出肿瘤生长下降。特别地，与共同施用对照IgG和索拉非尼的动物相比，用DX-2240(20mg/kg；Q2Dx17；第1天)结合索拉非尼(100mg/kg；QDx9；第15天)处理的动物在化合物给药终止后继续表现出肿瘤生长的显著下降。
表7
| 组 | #动物 | 化合物 | 剂量(mg/kg) | 途径/时间表 |
| 1 | 10 | 帕利珠单抗 | 20 | IP/Q2D×17(第1天) |
| 2 | 10 | DX-2240 | 20 | IP/Q2D×17(第1天) |
| 3 | 10 | 帕利珠单抗索拉非尼 | 20100 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 4 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 20100 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 5 | 10 | 帕利珠单抗索拉非尼 | 30100 | IP/Q4D×9(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 6 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 1100 | IP/Q4D×9(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 7 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 3100 | IP/Q4D×9(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 8 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 10100 | IP/Q4D×9(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 9 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 30100 | IP/Q4D×9(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 10 | 10 | 帕利珠单抗索拉非尼 | 2060 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 11 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 201 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 12 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 2010 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 13 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 2030 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
| 14 | 10 | DX-2240索拉非尼 | 2060 | IP/Q2D×17(第1天)PO/QD×9(第15天) |
Claims (45)
1.一种治疗血管生成相关疾病的方法，该方法包括在向对象施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约1至35天施用第一药剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约1、4、6、8或10天施用第一药剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约2周施用第一药剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约10天施用第一药剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约20天施用第一药剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之后继续施用第一药剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在施用第二药剂之后停止施用第一药剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240或DX-2220。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是索拉非尼。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂或VEGF拮抗剂以低于单独有效地治疗血管生成相关疾病的量施用。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂和VEGF拮抗剂各自以对治疗血管生成相关疾病协同有效的量施用。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管生成相关疾病是癌症或肿瘤。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管生成相关疾病是前列腺癌或胰腺癌。
17.根据权利要求15所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，并当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出任何变化时施用第二药剂。
18.根据权利要求15所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤尺寸变化的步骤。
19.根据权利要求15所述的方法，进一步包括放射治疗或化学治疗。
20.一种手术后辅助治疗的方法，该方法包括在施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前，向已手术切除肿瘤的对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一药剂在手术的48小时内施用。
23.一种治疗血管生成相关疾病的方法，该方法包括在向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第二药剂之前向对象施用包含VEGF拮抗剂的第一药剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在施用第二药剂之前大约1至35天施用第一药剂。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是索拉非尼。
28.根据权利要求23所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，并当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出任何变化时施用第二药剂。
29.一种使肿瘤脉管系统对VEGF下降敏化的方法，该方法包括在向对象施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗。
32.根据权利要求29所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，并当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出任何变化时施用第二药剂。
33.一种抑制在施用VEGF拮抗剂的对象中的肿瘤再生长的方法，该方法包括在向对象施用包含VEGF拮抗剂的第二药剂之前向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗或索拉非尼。
36.根据权利要求33所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，并当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出任何变化时施用第二药剂。
37.根据权利要求33所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤生长的步骤。
38.一种降低对象的化学治疗剂或放射施用频率的方法，该方法包括向对象施用包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂和包含VEGF拮抗剂的第二药剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Tie1胞外域-结合剂是DX-2240。
40.根据权利要求38所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤脉管系统变化的步骤，并当肿瘤脉管系统与施用第一药剂之前相比表现出任何变化时施用第二药剂。
41.根据权利要求39所述的方法，进一步包括监控对象的肿瘤生长的步骤。
42.一种治疗血管生成相关疾病的方法，该方法包括向对象施用包含Tie2胞外域-结合剂的第一药剂和包含VEGF拮抗剂的第二药剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中在施用第一药剂之后施用第二药剂。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂是贝伐单抗或索拉非尼。
45.一种试剂盒，其包括包含Tie1胞外域-结合剂的第一药剂、包含VEGF拮抗剂的第二药剂和根据权利要求1的方法使用的说明书。
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