CN101518656B - 一种两亲超顺磁性磁共振造影剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种两亲超顺磁性磁共振造影剂，该造影剂是以MnFe₂O₄纳米粒子为核，在MnFe₂O₄纳米粒子的表面均匀地包覆有四甘醇分子，且四甘醇分子外端的部分羟基与9-氯甲酸芴甲酯通过酰氯反应形成两亲性的外壳结构，其制备方法是首先以四甘醇为溶剂，高温热解乙酰丙酮铁及锰得到表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子，然后利用9-氯甲酸芴甲酯与纳米粒子表面的四甘醇羟基发生酰氯反应。本发明的造影剂具有粒径小、高结晶度、饱和磁化率高、驰豫能力强、生物兼容性好、毒性小及稳定性好的优点。本发明的制备方法具有操作简单、成本低廉、对设备的要求低及易于实现工业化生产的优点。

Description

一种两亲超顺磁性磁共振造影剂

技术领域

本发明涉及一种超顺磁性磁共振造影剂，具体说，是涉及一种以MnFe₂O₄纳米粒子为核，具有既亲水又亲油的两亲壳结构，且制备工艺简单、制造成本低、可工业化实施的超顺磁性磁共振造影剂。

背景技术

磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是一种20世纪80年代以后发展起来的最重要的先进医学影像技术，具有分辨率高、成像参数多、使用安全等突出优点，在医学诊断和基础研究方面有着巨大的应用潜力。MRI造影剂是用来缩短成像时间、提高成像对比度和清晰度的一种成像增强对比剂，它能够改变局部组织中水质子的弛豫速率，提高正常与患病部位的成像对比度从而显示体内器官的功能与状态。MRI造影剂主要有顺磁性造影剂和超顺磁性造影剂两大类。超顺磁性造影剂由于其在人体内的分布具有特异性、使用剂量少、安全、毒副作用小以及用途广泛等优点，已成为目前研发的热点。超顺磁性造影剂的磁距远远大于顺磁性物质，弛豫效能高，可通过尺寸选择或特异性表面分子修饰实现对特定组织的靶向，并有独特的跨膜机理，可实现细胞内分子靶向。超顺磁性造影剂的血液半衰期、体内分布状态与其粒子的大小和表面状态有直接的关系。粒径较小的造影剂具有较长的血液循环时间，并且具有穿过血管壁、细胞间隙、细胞膜、血脑屏障等各种生理屏障的能力。制备超顺磁性造影剂的关键在于如何制备出磁性能优异(高饱和磁化强度和初始磁化率)的超顺磁性材料，以及在此基础上对磁性纳米粒子表面进行修饰，形成具有核壳结构的磁性纳米粒子，以增强其稳定性、水溶性和生物相容性，并降低其毒性。

目前已经许可上市和正在临床实验的超顺磁性造影剂绝大多数由四氧化三铁颗粒核心和外面包覆的一层葡聚糖高聚物组成，粒径约为25～40纳米，其合成工艺复杂、制造成本高、粒径较大、结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差、表面包覆层的厚度不均。最近，中国专利文献CN101002951公开了一种表面包覆有多元醇分子的四氧化三铁纳米粒子，粒子的直径为1～20纳米，其制备方法是将含铁化合物在多元醇溶液中经高温反应、冷却、沉淀、分离、分散于水溶液并过滤除菌。虽然此发明在一定程度上解决了该类造影剂合成工艺复杂、制造成本高、粒径较大、结晶度低、饱和磁化强度小、MRI成像效果差、表面包覆层的厚度不均的问题，具有结晶度高、饱和磁化强度大、MRI成像效果好、粒子直径小、表面包覆层薄而均匀的优点及制备方法具有操作简单、容易控制、反应效率高、原料易得、成本低廉、易于实现大规模工业化生产的优点。但研究表明：四氧化三铁(即铁酸铁)纳米材料的磁矩和R2系数都很低，不能适于先进的磁共振成像的应用。要适于先进的磁共振成像的应用，需要一种新型的具有较高的磁化率、可以增强质子核自旋的驰豫过程、特别是可以减少横向驰豫时间T₂的磁性纳米材料。因研究证明在MnFe₂O₄、FeFe₂O₄、CoFe₂O₄、NiFe₂O₄这几种铁酸盐中，MnFe₂O₄的磁性最大，对横向驰豫时间的影响也较大，能可望成为更好的磁共振造影剂，以适于先进的磁共振成像的应用。因此，开发制备工艺简单、制造成本低，且具有粒径小、高结晶度、饱和磁化率高、驰豫能力强、生物兼容性好、毒性小及稳定性好，以MnFe₂O₄纳米粒子为核的超顺磁性磁共振造影剂，是磁共振造影剂的发展方向和需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种粒径小、高结晶度、饱和磁化率高、驰豫能力强、生物兼容性好及在水溶液中分散性好、稳定性好，且制备工艺简单、制造成本低、可工业化实施的，以MnFe₂O₄纳米粒子为核的超顺磁性磁共振造影剂，以克服现有技术的缺陷，满足先进的磁共振成像的需求。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供的两亲超顺磁性磁共振造影剂，是以MnFe₂O₄纳米粒子为核，MnFe₂O₄纳米粒子的表面均匀地包覆有四甘醇分子，且四甘醇分子外端的部分羟基与9-氯甲酸芴甲酯通过酰氯反应形成两亲性的外壳结构，其特征在于，其制备方法的具体操作如下：

将摩尔比为2∶1的三乙酰丙酮铁和二乙酰丙酮锰加入四甘醇中，控制三乙酰丙酮铁在四甘醇中的摩尔浓度为0.04～0.2mol/L；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下加热反应体系，当温度升到100～140℃时，保温反应1～3小时；接着继续升温，当温度升到200～220℃时，保温反应1～3小时；再接着继续升温，当温度升到285～305℃时，保温反应1～3小时；反应完成，自然冷却到室温，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀，于15～30℃真空干燥10～20小时，即得表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子；

称取表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子和9-氯甲酸芴甲酯，溶于无水N-二甲基甲酰胺溶剂中，控制9-氯甲酸芴甲酯与表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子的质量比为1∶2～1∶4，表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子在DMF中的浓度为2g/L～4g/L；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下于15～30℃反应10～12小时；用透析袋透析反应体系，离心透析液，用无水乙醇洗涤沉淀，于15～30℃真空干燥15～20小时。

所述MnFe₂O₄纳米粒子的平均粒径为5～25nm。

本发明以MnFe₂O₄纳米粒子为核，通过使四甘醇分子中的醚氧原子与MnFe₂O₄纳米粒子中的金属离子产生配位，从而使四甘醇分子均匀的包覆在MnFe₂O₄纳米粒子的表面，然后借助四甘醇分子外端的羟基与Fmoc-Cl通过酰氯反应将其修饰成两亲性的外壳结构。因为表面均匀地包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子，其表面的羟基之间具有氢键作用和静电作用，相对而言比较容易沉降，通过Fmoc-Cl修饰，MnFe₂O₄纳米粒子表面的部分羟基与Fmoc-Cl发生酰氯反应，这样得到的纳米粒子的表面是既有亲水基团羟基，也有Fmoc-Cl另一端的疏水基团，即得到的纳米粒子为两亲性的。由于亲水基团和疏水基团之间具有排斥力，使得该纳米粒子在水中的分散性很好，即使在强磁场中也不易沉降。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子，为单晶，具有单分散性、超顺磁性、粒径小、粒径大小均匀可控及良好的可重复性等优点，能为科学研究与临床应用带来巨大的方便。

2、本发明的两亲超顺磁性磁共振造影剂的两亲性外壳结构，使所制备的造影剂具有良好的生物兼容性，在水溶液中具有极高的稳定性和很好的分散性。

3、因本发明是通过使四甘醇分子中的醚氧原子与MnFe₂O₄纳米粒子中的金属离子产生配位，从而使四甘醇分子均匀的包覆在MnFe₂O₄纳米粒子的表面，然后借助四甘醇分子外端的羟基与Fmoc-Cl通过酰氯反应得到两亲性的外壳结构，因此本发明的两亲超顺磁性磁共振造影剂的包覆层外壳具有厚度均匀的优点。

4、因本发明的两亲超顺磁性磁共振造影剂的饱和磁化率达到40emu/g，横向驰豫率R₂达到189.302Fe mM^-1s^-1，且对细胞的毒性很小，可显著降低MRI的T2信号，因此可开发成先进的磁共振成像造影剂，以克服现有技术的缺陷。

5、本发明的方法具有操作简单、成本低廉、对设备的要求低及易于实现大规模工业化生产的优点。

附图说明

图1为本发明中的9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)的化学结构式。

图2为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片。

图3为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)照片。

图4为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的X-射线衍射(XRD)谱图。

图5为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的透射电子显微镜(TEM)照片。

图6为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的红外谱图(IR)。

图7为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂在25℃的磁滞回线图。

图8为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的细胞毒性测试结果图。

图9为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的T₂加权成像图。

图10为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂在水溶液中的T₂驰豫率(1/T₂)相对于Fe³⁺浓度拟合的直线图。

图11为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的活体T₂加权成像图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。实施例中所用的9-氯甲酸芴甲酯(Fmoc-Cl)，其化学结构式见图1所示，该样品是由东京化成工业株式会社制造，分析纯，为纯度大于97.0％的固体粉末。

实施例1

本实施例提供的两亲超顺磁性磁共振造影剂的制备方法，具体操作如下：

将2mmol三乙酰丙酮铁和1mmol乙酰丙酮锰加入30ml的四甘醇中；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下加热反应体系，当温度升到120℃时，保温反应2小时；接着继续升温，当温度升到210℃时，保温反应2小时；再接着继续升温，当温度升到295℃时，保温反应2小时；反应完成，自然冷却到室温，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥15小时，即得黑色的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子。

称取上述制得的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子15mg和9-氯甲酸芴甲酯(Fmol-Cl)60mg，溶于4ml无水N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，进行无水无氧操作，在惰性气体保护下于25℃反应12小时；用透析袋透析反应体系，离心透析液，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥20小时，即得以MnFe₂O₄纳米粒子为核的两亲超顺磁性磁共振造影剂。

图2为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片，由图可见：所制备的MnFe₂O₄纳米粒子尺寸均一，且具有很好的单分散性，平均尺寸大约是10nm，属于超顺磁性的尺寸范围。

图3为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)照片，由图可见：所制备的MnFe₂O₄纳米粒子是单晶。

图4为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子的X-射线衍射(XRD)谱图，是由DMAX 2000 X-射线衍射仪测试得到，该衍射仪为Cu/Kα-辐射(λ＝0.15405nm)(40kV，40mA)，该图进一步说明了本实施例所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的核为MnFe₂O₄纳米单晶。

图5为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的透射电子显微镜(TEM)照片，从该图可以看出所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂仍具有尺寸均一和很好的单分散性，平均尺寸大约还是10nm，仍属于超顺磁性的尺寸范围。

图6为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的红外图谱(IR)，其中1为经过表面修饰后的两亲超顺磁性磁共振造影剂，2为两亲超顺磁性磁共振造影剂的核-MnFe₂O₄纳米粒子。从该图可以看出：经过表面修饰后的MnFe₂O₄纳米粒子的红外谱图发生了明显的变化，其中在1558cm^-1和1419cm^-1处出现了羰基峰，并且在2953cm^-1处的峰也明显增强。

图7为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂在25℃的磁滞回线图，由该图可以看出该造影剂具有超顺磁性，饱和磁化率达到40emu/g。

图8为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的细胞毒性测试结果图，该测试是将人宫颈癌细胞系Hela细胞接入50ml体积的细胞培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5％CO₂孵箱中培养而得，培养体系为含10％FCS的DMEM培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1％谷氨酰胺，pH 7.2～7.4)。由该图可见：当所制备的造影剂的浓度达到100ug/ml时，细胞的存活率达81％，由此表明所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂对细胞的毒性很小。

图9为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的T₂加权成像图，该图是由0.5T的磁共振成像仪测试而得，具体参数为：TR/TE＝4000/60ms，选层厚度为0.6mm，谱宽SW＝50KHz，接收机增益RG＝3。由该图可见：随着造影剂中Fe³⁺浓度的逐渐增加，MRI的T2信号逐渐变暗。

图10为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂在水溶液中的T₂驰豫率(1/T₂)相对于Fe³⁺浓度拟合的直线图，直线的斜率即为横向驰豫率R₂，由该图可见：所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂具有很强的驰豫能力，横向驰豫率R₂达到189.302FemM^-1s^-1。

图11为实施例1所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的活体T₂加权成像图，是将所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂的水溶液通过尾部静脉注入20g的昆明鼠体内，然后测试该造影剂对小鼠体内的不同器官的T2信号的影响情况，所用仪器为MicroMR-25成像仪，(上海纽迈电子科技有限公司生产，脉冲序列：多层自旋回波；TR(重复时间)：360ms；TE(回波时间)：6ms，相位编码步数：128；采样点数：200；累加次数：8；层数：9。其中a图为打造影剂前的横断面扫描照片，b图为打造影剂后的横断面扫描照片，由该图可见：所制备的两亲超顺磁性磁共振造影剂可显著降低MRI的T2信号。

实施例2

本实施例提供的两亲超顺磁性磁共振造影剂的制备方法，具体操作如下：

将2mmol三乙酰丙酮铁和1mmol乙酰丙酮锰加入10ml的四甘醇中；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下加热反应体系，当温度升到100℃时，保温反应3小时；接着继续升温，当温度升到200℃时，保温反应3小时；再接着继续升温，当温度升到285℃时，保温反应3小时；反应完成，自然冷却到室温，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥15小时，即得黑色的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子。

称取上述制得的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子15mg和9-氯甲酸芴甲酯(Fmol-Cl)30mg，溶于7ml无水N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，进行无水无氧操作，在惰性气体保护下于30℃反应10小时；用透析袋透析反应体系，离心透析液，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥20小时，即得以MnFe₂O₄ 纳米粒子为核的两亲超顺磁性磁共振造影剂。

实验结果表明：本实施例所制备的产物仍具有粒径小、高结晶度、饱和磁化率高、驰豫能力强、生物兼容性好及毒性小，可显著降低MRI的T2信号的优点。

实施例3

本实施例提供的两亲超顺磁性磁共振造影剂的制备方法，具体操作如下：

将2mmol三乙酰丙酮铁和1mmol乙酰丙酮锰加入50ml的四甘醇中；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下加热反应体系，当温度升到140℃时，保温反应1小时；接着继续升温，当温度升到220℃时，保温反应1小时；再接着继续升温，当温度升到305℃时，保温反应1小时；反应完成，自然冷却到室温，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥15小时，即得黑色的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子。

称取上述制得的表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子15mg和9-氯甲酸芴甲酯(Fmol-Cl)45mg，溶于5ml无水N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，进行无水无氧操作，在惰性气体保护下于20℃反应12小时；用透析袋透析反应体系，离心透析液，用无水乙醇洗涤沉淀，于25℃真空干燥20小时，即得以MnFe₂O₄纳米粒子为核的两亲超顺磁性磁共振造影剂。

实验结果表明：本实施例所制备的产物仍具有粒径小、高结晶度、饱和磁化率高、驰豫能力强、生物兼容性好及毒性小，可显著降低MRI的T2信号的优点。

Claims (2)

1.一种两亲超顺磁性磁共振造影剂，是以MnFe₂O₄纳米粒子为核，MnFe₂O₄纳米粒子的表面均匀地包覆有四甘醇分子，且四甘醇分子外端的部分羟基与9-氯甲酸芴甲酯通过酰氯反应形成两亲性的外壳结构，其特征在于，其制备方法的具体操作如下：

将摩尔比为2∶1的三乙酰丙酮铁和二乙酰丙酮锰加入四甘醇中，控制三乙酰丙酮铁在四甘醇中的摩尔浓度为0.04～0.2mol/L；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下加热反应体系，当温度升到100～140℃时，保温反应1～3小时；接着继续升温，当温度升到200～220℃时，保温反应1～3小时；再接着继续升温，当温度升到285～305℃时，保温反应1～3小时；反应完成，自然冷却到室温，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀，于15～30℃真空干燥10～20小时，即得表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子；

称取表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子和9-氯甲酸芴甲酯，溶于无水N-二甲基甲酰胺溶剂中，控制9-氯甲酸芴甲酯与表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子的质量比为1∶2～1∶4，表面包覆有四甘醇分子的MnFe₂O₄纳米粒子在DMF中的浓度为2g/L～4g/L；进行无水无氧操作，在惰性气体保护下于15～30℃反应10～12小时；用透析袋透析反应体系，离心透析液，用无水乙醇洗涤沉淀，于15～30℃真空干燥15～20小时。

2.根据权利要求1所述的两亲超顺磁性磁共振造影剂，其特征在于：所述MnFe₂O₄纳米粒子的平均粒径为5～25nm。

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