CN101517395A - 使用基于荧光的dna图像细胞分析术体内检测和/或诊断癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过首先定位活组织的细胞核并随后使用共聚焦扫描显微术测量细胞核UV吸收而体内确定人或动物对象中细胞核DNA的量的方法。本发明还涉及通过激光扫描共聚焦显微术首先鉴定活组织中细胞核的定位并且随后确定细胞核UV吸收而用于体内检测人或动物对象中的癌细胞的方法。此外，本发明涉及依赖于借助激光扫描共聚焦显微术鉴定活组织中细胞核的定位并测量细胞核UV吸收的组合而体内诊断人或动物对象中癌症的方法。
Description
本发明涉及通过体内定位细胞核并测量细胞核的紫外光吸收而体内确定人或动物对象的细胞中细胞核核酸量的方法。
本发明还涉及通过体内定位细胞核并测量细胞核的紫外光吸收而体内检测人或动物对象中癌细胞的方法。
类似地，本发明涉及诊断和/或预测人或动物对象中癌症的方法，其中所述方法在体内进行并且依赖于定位细胞核并测量细胞核的UV光吸收。
癌症早期检测是治疗癌症患者中的关键要素。存在检测生物样品中的癌细胞并因此诊断现有癌症或至少评估未来癌症发生可能性的多种可行方法。这些不同的方法包括癌组织的实体物检查、癌细胞的形态学表征、免疫组织化学染色及细胞结构(如膜和细胞核)表征、测量肿瘤特异性因子的表达等。
检测癌细胞的一种可行方法是所谓DNA细胞分析术，其测量细胞核DNA的量以便检测与正常DNA含量的偏离。假设若细胞因诱变事件而包含比已知的标准物更少或更多的DNA，其中所述的标准物已知是非癌类型，即“健康”或“正常”类型，则DNA含量的这种偏离表示重大染色体重排并因此表示正在进行的癌症发生。
因此，通过核酸特异性染色法量化细胞核DNA正日益在癌症诊断领域的研究和临床应用中进入实践。
通过流式细胞分析术(flow cytometry)或图像细胞分析术(imagecytometry)对细胞核DNA含量的测量尤其基于以下假设：(i)与DNA结合的染色剂的量正比例于存在的DNA的量和(ii)因发射、吸收或透射而从该染色剂中产生的光学信号正比例于染色剂的量。
一般用于通过DNA图像细胞分析术测量细胞核DNA目的的一种DNA特异性染色方法是以Feulgen和Rossenbeck命名的一种基于酸的反应，常简称为Feulgen反应(福尔根反应)。实际上，福尔根反应是其中DNA由酸水解以产生带游离醛基的无嘌呤DNA(即所谓脱嘌呤核酸，APA)的显色反应。这些无嘌呤DNA随后与含有染料的希夫试剂反应，其中所述的染料与游离醛基共价结合。
尽管福尔根反应对于DNA是特异性的，然而它具有多种缺点。福尔根反应是耗时且相当繁琐的反应，需要仔细控制并加以验证以便产生可再现及有意义的结果。一个问题源自如此事实：APA由常见用于去除嘌呤碱基的HCl水解成更小片段。然而，APA分子的片段化导致从细胞核中去除这些片段并且因此导致丢失可染色的DNA物质。
除了对于福尔根染色法而言与生俱来的这些缺点，也不能在体内通过福尔根法使细胞核DNA着色，因为福尔根染色法本身可能是致诱变的并且导致癌症发生。
现有技术的DNA图像细胞分析术的另一个关键特征是这些方法要求这样的操作模式：其中将细胞铺展在例如玻片上旨在允许测量单个细胞。然而，体内进行DNA细胞分析术测量无疑因这样的情况而复杂化，即不能分离标本而不得不在不可能将单个细胞从其生理环境中分离出来的情况下进行DNA测量。相反，当在体内即在人或动物对象中进行DNA图像细胞分析术时，必须找到在不能够使单个细胞从其天然环境物理中分离的情况下测量单个细胞的量的办法。
在本领域中已经尝试考虑通过配置新的显微设备而使得单个细胞在其天然环境中可视化。
WO 2004/113962A2披露了允许观察厚层标本内细胞的微型化共聚焦显微系统。
然而，迄今尚未解决的体内DNA图像细胞分析术的先决条件之一是确定活组织中细胞核DNA的量。
因此，对这样的方法存在持续需求：其中所述的方法提供测量细胞核DNA的量和体内检测人或动物对象中癌细胞和癌症的可靠、快速及有效的途径。
本发明的目的是提供用于体内确定细胞核中双链细胞核核酸(如DNA)的量的方法。
本发明的目的也是提供体内检测人或动物对象中存在癌细胞的方法。
本发明的又一目的是提供允许体内诊断存在癌症或可能发生癌症的方法。
为了实现上述目的，提供如独立权利要求1中定义的方法。
根据本发明，提供了体内确定人或动物对象的至少一个细胞中细胞核核酸的量的方法，其中所述方法包括步骤：
a)体内定位在人或动物对象中所述至少一个细胞的细胞核；
b)体内测量所述细胞核的紫外(UV)光吸收。
在本发明的一个示例性实施方案中，用于体内确定细胞中细胞核核酸的量的前述方法可以用来检测人或动物对象内的至少一个癌细胞。
在前述方法的又一实施方案中，在步骤b)中获得的细胞核UV吸收可以用来计算细胞的(非整)倍性状态。
这可以通过将所获得的细胞核UV吸收与在基本上相同的条件下对如下细胞获得的细胞核UV吸收进行参比而实现，其中所述的细胞已知是非癌类型的，且对于该细胞而言细胞核DNA含量是已知的。在优选的实施方案中，这种计算可以在人体或动物体之外进行。
在本发明的又一个实施方案中，与数值2偏离至少10％的非整倍性状态将视作表示癌细胞。在其于健康状态下总是增殖的细胞的情况下，与数值2和4达至少10％的非整倍性偏离将视作表示正在进行的癌症发生。
在本发明的一个实施方案中，确定如上所述的细胞中细胞核DNA的量的方法用来检测与癌症相关的至少一个癌细胞，其中所述的癌症选自包括下列癌症的组：白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤。
在该实施方案之一中，发明的方法使用共聚焦激光扫描显微术、双光子成像术、光相干断层扫描术、高分辨率超声术或UV显微内镜以在上述方法的步骤a)中定位细胞核。
在本发明的又一个实施方案中，步骤b)中对细胞核UV光吸收的测量通过校准UV光吸收信号并确定所述细胞核的体积而进行。
在优选的实施方案中，通过共聚焦激光扫描显微术进行对细胞核UV吸收的确定。本发明的一个特别优选实施方案为此目的而言使用UV光，其具有大约240nm至大约280nm的波长。
在本发明的另一个实施方案中，提供体内诊断和/或预测人或动物对象中癌症的方法，所述方法包括步骤：
a)体内定位在人或动物对象中所述至少一个细胞的细胞核；
b)体内测量由该细胞核的UV光吸收；
c)通过比较如步骤b)中所测定的细胞核UV吸收与同样使用步骤a)-b)已经获得的非癌性细胞的细胞核UV吸收，测定细胞核核酸的量；
d)根据细胞核核酸的量决定存在癌症或未来可能发生癌症。
在步骤c)中，所述比较可以在人体或动物体之外进行。
本发明的这个方面的又一个实施方案涉及诊断和/或预测人或动物对象中癌症的方法，其中所述的方法包括以上提及的特征，并且其中与数值2偏离至少10％的倍性状态表示癌细胞并且因此表示存在癌症或(未来)可能发生癌症。在其于健康状态下总是增殖的细胞的情况下，与数值2和4至少10％的非整倍性偏离将视作表示正在进行的癌症发生。
在本发明的又一个实施方案中涉及诊断和/或预测具有上述特征的人或动物对象的癌症的方法，所述方法用来检测癌症，其中所述的癌症选自包括下列癌症的组：白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤。
在涉及诊断和预测方面的本发明其它实施方案中，可以如上所述进行步骤a)中对细胞核的定位和步骤b)中对细胞核UV光吸收的测量。
因此，在优选的实施方案中，使用共聚焦激光扫描显微术来测量细胞核UV吸收，优选地用波长大约240nm-大约280nm的UV光。
图1.显示当确定了非癌性细胞群的细胞核DNA含量时通常所获得的柱状图。所述细胞处于非增殖状态。
图2.显示当确定了癌细胞的细胞核DNA含量时如通常所获得的柱状图。在此情况下，当检验通常为非增殖性的细胞时，对应于4的峰表示癌症。
图3.显示对于UV光的所述波长范围，相同浓度的溶解的DNA和蛋白质的吸收因子。
图4.示意性地显示当UV光的光点在细胞的一个平面内从细胞质经细胞核移动到细胞质的其它部分时，反射光的量如何改变并且因此吸光度如何改变。
通过DNA细胞分析术鉴定癌细胞一般使用流式细胞分析术或图像细胞分析术实施。
在也可以称作ICM的DNA图像细胞分析术的情况下，DNA用标记物染色以便使DNA可视化。随后，使用通常称作非整倍性的DNA量的改变来检测癌细胞的存在，因为认为非整倍性是已经有癌性状态或正在发生的癌性状态的特征。因此，DNA非整倍性的检测允许通过检测癌细胞及早且灵敏地诊断癌症，通常在组织活体解剖的形态学和组织学表征之前数年。
然而，如上所提及，已建立的DNA显色反应(如福尔根染色法)是费力且耗时的。此外，不可能在体内使用DNA显色反应(如福尔根染色法)，因为它们本身致诱变并且因此引起癌症发生。
本发明人意外地发现可以通过如此方式体内确定人或动物对象中埋藏在其天然环境中的细胞的细胞核核酸量，即通过首先定位此类细胞的细胞核并且其次测量所述细胞核UV光吸收。
因此，本发明在一个实施方案中涉及体内确定人或动物对象中至少一个细胞的细胞核核酸的量的方法，包括步骤：
a)体内定位人或动物对象中所述至少一个细胞的细胞核；
b)体内测量所述细胞核的紫外(UV)光吸收。
这类方法尤其可以用来确定个体或物种的基因组大小。当然，此类方法也可用来检测例如活组织中的至少一个癌细胞。
对于步骤b)，优选使用波长大约240nm至大约280nm的UV光。特别优选可以是波长250nm、255nm或260nm的UV光。若使用UV光进行细胞核的定位，则同样的波长适用于步骤a)。因此，在一个优选的实施方案中，对于步骤a)和b)用具有前述波长的UV光。
出于本发明的目的，术语“癌细胞”涉及由其中一些或全部细胞包含一定量的如此细胞核DNA的细胞组成的任何细胞、细胞组织或器官，其中所述的细胞核DNA因染色体重复、缺失、插入、易位等而偏离于如对非癌性细胞所确定的细胞核DNA量。
众所周知染色体DNA的插入、重复、缺失和易位在很大程度上导致癌症发生并且因此可以被视为癌细胞的特征。
可由本发明方法研究的细胞可以选自包括以下细胞的组中的细胞：骨髓细胞、淋巴结细胞、淋巴细胞、红细胞、神经细胞、肌细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、粘膜细胞等。
类似地，本发明的方法可以用来体内分析人或动物身体中的各种组织。此类组织可以是器官(如肝脏、心脏、肾脏等)的一部分和/或此类组织具有前述细胞类型。
现在将就单个步骤a)和b)而更详细地描述上文所详述在体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量的方法，该方法优选地用于用于检测至少一个癌细胞。
在以上称作步骤a)的第一步骤中，人或动物对象中的至少一个细胞将就其细胞核定位方面进行体内分析。在优选的实施方案中，所述的至少一个细胞可以是癌性或疑似癌性的，即推定的癌细胞。
通常，对细胞核的定位将在其天然环境下(即活组织内)对细胞进行。对细胞核的定位可以例如使用共聚焦激光扫描显微术、双光子成像术、高分辨率超声术或UV-显微内镜术实现。
若组织的形态学是已知的并且因此细胞核的位置是已知的，则可以开始测量每个细胞中细胞核核酸的量(如DNA含量)(步骤b)。尽管在一个实施方案中，这可以是优选的，不过不需要精确确定细胞核的位置以及因此对细胞核精确定位，而是在开始测量例如细胞DNA之前，近似确定就可以是足够的。甚至知道细胞边界可能就是足够的。出于此原因，可能不需要使用UV光来确定细胞核的定位，即便这可以是优选的实施方案。
共聚焦激光扫描显微术
体内定位细胞核的优选实施方案之一依赖于共聚焦激光扫描显微术的使用，其中在进一步优选的实施方案中所述的共聚焦显微术可以使用UV光源。共聚焦显微术具有胜过常规光学显微术的几个优点：消除了使图像扭曲的离焦信息(最重要优点之一)、景深可调控和亚微米级分辨率。共聚焦显微术的另一个优势是可以滤除处于离焦(out-of-focus)的标本中各个部分的荧光，并且因此不干扰处于焦内(in-focus)的部分或截面，因此产生比通过常规光学显微术获得的可比较图像明显更清晰并且显示更佳分辨率的图像。
共聚焦扫描显微术的基本原理是在显微镜透镜系统的焦点处使用带针孔的屏幕，其中所述的针孔与物镜聚焦的点“共轭”。仅来自物体焦点的光线聚焦在所述针孔处并可以穿过抵达探测器，所述探测器例如可以是电荷耦合器件(CCD)。来自样品中离焦截面的光线将几乎被彻底滤除。
因此，共聚焦显微镜比传统显微镜在x和y方向上具有明显更佳的分辨率。此外，它还在z方向上具有较小景深。通过对整个样品进行扫描来扫描所述焦点，因此可以观察样品的不同平面并随后重建样品的三维图像。此外，共聚焦显微术与不同波长的光兼容。
若共聚焦激光扫描显微镜集成于例如内窥镜装置中，则可以使用执行元件(actuator)来使共聚焦显微镜对整个目的组织进行扫描。随后，第一粗略扫描可以用来确定组织的形态学并且可以从所述屏幕上鉴定目的细胞核。在已经定位细胞核的这个阶段上，随后可以继续进行用于测量细胞核UV光吸收的步骤b)。
为定位细胞核，共聚焦扫描显微镜可以使用单色光或多色光。然而，可以优选波长240nm-280nm的单色UV光。可以特别优选波长250nm、255nm或260nm的UV光。
就共聚焦激光扫描显微镜而言，可以使用显微镜如LEICADMLM并配备Qimaging Retiga 2000R FAST冷却Mono12比特摄像单元(Qimaging，Bumaby，BC，Canada)用于测量荧光信号的信号强度。特别可以优选LeicaDM6000。
出于本发明的目的，在细胞将于其天然组织环境下进行观察的情况下，共聚焦激光扫描显微镜可以集成到内窥镜中。用于此目的已知系统在扫描图像的方式上多半不同。两种非常先进的商业系统是可用的，例如来自Optiscan和Mauna Kir Technology。Mauna Kir仪是一种近端扫描系统，其中将图像用相干光纤束沿内窥镜向下传输。所选的光点或光纤在远端处至采样的组织内成像。这种共聚焦显微内镜可以经内窥镜的工作通道输送。由于显微内镜的视野狭小，故探头的安置由标准视频内窥术引导。因此，内窥镜平台必须包括视频图像仪和共聚焦显微镜。当然，内窥镜单元也可以包含或者与允许对所获得图像加工的计算机设备及软件包偶联。
检测单元可以例如是经BQ6000图像采集卡与计算机连接的OptronicsDEI-700 CE三芯片CCD摄像机。或者，可以使用Hitachi HV-C20三芯片CCD摄像机。用于图像分析的软件包可以例如是Bioquant True ColorWindows 98 v3.50.6图像分析软件包(R&M Biometrics，Nashville，TN)或Image-Pro Plus 3.0图像分析软件。可以使用的另一种系统是Bio View Duet系统(BioView Ltd，Rehovot，Israel，其基于双模式全自动显微镜(Axioplan 2，Carl Zeiss，Jena，Germany)、XY驱动的8-载片平台(Marzhauser，Wetzler，Germany)、3CCD逐行扫描彩色摄像机(DXC9000，Sony，Tokyo，Japan)和用于控制与分析该系统以及数据的计算机。
Optiscan已经开发了采用远端扫描法(distal scanning)的显微内镜。在该系统中，单根光纤沿内窥镜向下传输光线并且远侧头的光纤末端以空间方式被扫描并用镜片成像为组织。Optiscan已经与Pentax共同开发一种内窥镜，其具有集成于所述显微内镜中的共聚焦显微镜，因而不占用工作通道。使用该系统获得的组织图像具有允许鉴定细胞核定位的分辨率。
其它微型共聚焦光学装置在WO 2004/113962A2中描述，该专利通过引用的方式并入。用于对活组织进行共聚焦成像的系统也在WO 02/073246A2和US 2005/0036667中描述，这两个专利也通过引用的方式并入。
光学相干断层照相术
体内定位人或动物对象的活组织中的细胞核的又一种可行方式是使用光学相干断层照相术(OCT)。
OCT是以超高分辨率(几微米)生成实时3-D组织图像的实现至多达数毫米穿透深度(一般1.5至2mm)的成像技术。OCT提供3-D结构图像(组织层、密度变化)用以产生光谱信息并且旨在任意地实现功能性与分子性成像。OCT是能够测量小到-90dB信号的基于干涉测量术的技术。一种标准的基于光纤的OCT设置示于图5。
耦合器分裂来自光源的光。当一条臂充当干涉计的参考臂时，另一条臂输送光至样品并因此被称作样品臂。扫描镜片提供横向扫描能力，从而该OCT设置对每个横向定位获得轴向扫描(A-扫描)。合并的全部A-扫描形成3-D结构图像。
当获得每个A-扫描时，参考镜的位移提供深度信息。还可以通过扫描波长获得深度信息。已经开发了几种更先进的技术旨在在更短时间内获得更高的深度信息。光谱OCT是在提供深度扫描数据而无任何运动部件的那些OCT当中最先进的装置。
目前，最迅速的OCT系统产生可以产生每秒约30帧、每帧超过1,000个A-扫描的图像。横向分辨率仅受限于扫描镜片和聚光系统。轴向分辨率反而是光源依赖性的。目前用在930nm处具备约70nm带宽的商用超级发光二极管可达到的常见轴向分辨率是大约5μm。通过使用Ti:蓝宝石飞秒激光器实现约1.5μm的一个最佳演示分辨率。
出于本发明的目的，可以使上述OCT装置并且尤其光谱OCT装置微型化，从而它们可以用在内窥镜系统中。对于微型化OCT技术，可以例如参考在Optics Letters 29，2261(2004)的出版物中所提出的建议。一般，能够用在内窥系统中的微型化OCT装置将配置：
-光源。它决定与该光源带宽成正比的轴向分辨率。市售SLD(超级发光二极管)获得约5μm的轴向分辨率。若使用Ti:蓝宝石飞秒激光器或钨灯(极低功率)，可获得更佳分辨率(接近1μm的分辨率)。对于傅里叶域OCT而言，需要可调谐激光器。
-提供纤维光学部件以提供光输送、光纤耦合器和/或循环器以实现迈克尔逊干涉仪。
-检测部件。这将取决于OCT类型。一般将使用光电二极管，但在光谱OCT的情况下，将需要光谱解析检测法(与线性CCD阵列联合的光谱分析仪)。
-在偏振或相OCT的情况下，引擎和探测部件必须能够维持光的偏振特性。
高分辨率超声术
如上所述，细胞核的定位也可以使用高分辨率超声术进行。
双光子成像术
当然，细胞核也可以使用双光子成像技术定位。此双光子方法允许在体内实时三维地对组织成像。在本项技术中的基础作用原理是组织内的荧光团通过吸收低能量的两个光子而受到激发，导致荧光发射。这与常规(共聚焦)显微术相反，在后者中单个较高能量光子引起荧光团激发。
为了使双光子过程出现，需要相对高能的光子流，这种光子流通常在共聚焦显微镜的焦点内获得。因此，共聚焦显微术的优点也适用于双光子成像术，如三维成像和高分辨率(横向约0.2微米且轴向约0.5微米)。
因为激发光子的低能量，从而组织的单光子吸收是相对低的，这使组织中光诱导的损伤最小化。这对于体内应用是一个明显优势。另外，低吸收率导致光子更深地穿透组织，产生深达0.5mm的成像深度。
总之，双光子成像术结合高分辨率共聚焦显微术的优势，具有大的成像深度和小量的光诱导损伤。其允许在体内实时地表征组织至细胞水平，并且已经证实适用于诊断疾病。
返回上述方法的步骤b)，可以通过不同方法实现体内测量细胞核的紫外(UV)光吸收。
使用共聚焦显微镜设置，可以使细胞核内部的探针聚焦。通常，使此共聚焦设置的探测光点(probe spot)小于细胞核。
如通过此共聚焦设置所测量的从细胞核反射回来的UV光的量反相关于由被该光点探测的区域所吸收的光量。假定透过细胞核的吸收几乎是相等的，则剩下的唯一事情就是校准测量并确定细胞核的大小。
校准
校准由确定在相同的共聚焦扫描平面内因细胞核所致及因细胞核外的区域所致的UV光吸收组成。对于细胞核内部和外部的测量而言，光线在抵达目的细胞之前穿过几乎相同量和距离的组织，从而在两种测量中产生可比较的且相似的背景信号。因此，可以将细胞核吸收的测量结果与非细胞核吸收的测量结果之间的比率作为细胞核吸收的绝对测量结果。
在优选的实施方案中，将使用波长大约240nm-大约280nm的UV光。在特别优选的实施方案中，将使用波长大约250nm、255nm或260nm的UV光。在波长的上下文中，术语“大约”涉及偏离1.5％、优选1％并最优选0.5％。使用UV光并且尤其使用波长大约240nm-大约280nm的UV光的原因是细胞核中存在的DNA在该波长范围内比蛋白质显出高得多的吸收(见图3)。
含有蛋白质和DNA的细胞核因此将比主要含有蛋白质而不含DNA的细胞剩余部分吸收更多UV光。
优选地使用共聚焦激光扫描显微镜，可以测量由细胞核内部物质所致的UV光反射并将它与由细胞核外部物质所致的UV光反射比较。通过计算由细胞核吸收的UV光和由细胞核外部区域吸收的UV光，获得一种信号，该信号是如用共聚焦扫描所获得在单一平面内的DNA密度的量度。
确定细胞核体积
在确定细胞核内细胞核核酸量的第二步骤中，必须确定细胞核的总体积。这可以如下做到。
通过对整个细胞核以3-D方式扫描光点，可以在校准测量结果时如上所述确定反射光的强度。反射光的强度将告知所述光点是否仍在细胞核内、是否已经抵达细胞核边缘或是否它已经处在细胞核外。这在图4中反映。
如上已述，在显微镜光点聚焦于细胞核内时，可反射UV光的信号与显微镜光点处在细胞核外时不同。当聚焦的光点处于细胞核外时，UV吸收是相对低的并且测量到高强度的反射光。当光点的中心移动穿过细胞并经过细胞核边缘时，反射光强度逐步下降，因为更多光在细胞核内被吸收。只要光点完全在细胞核内，则反射光信号是恒定且相对低的，直至再次抵达细胞核的另一边缘。随后，信号将连续地升高至其先前高值。如此运动方向的距离测量了细胞核的局部厚度，其中在所述运动方向上信号是相对低的。
如图4显示在细胞核的单一平面中的单个扫描，这些1-D扫描可以通过对不同平面进行相同的测量而扩展至3-D以获得细胞核的完整形状。在不同坐标(x，y)上，测量了在z方向上的细胞核的局部厚度。因此，通过从不同多种平面的1-D图像中重构3-D图像，可以重构并计算出细胞核的外观及体积。
因此，根据本发明，可通过校准在细胞核内的UV吸收信号并确定细胞核体积获得对细胞核UV吸收的测量。为了校准，将细胞核内区域的UV光吸收与细胞核外区域的UV光吸收之间的比率考虑用于单一平面。
随后，通过加总对细胞核的每一平面所获得的校准UV吸收而确定细胞核的体积。
优选地以波长大约240nm-大约280nm的UV光使用共聚焦激光扫描显微术完成全部测量。在特别优选的实施方案中，将使用波长大约250nm、255nm或260nm的UV光。
因此，通过使用共聚焦扫描显微术确定细胞核的不同平面的UV吸收，可以确定细胞核的紫外光吸收。由于细胞核所吸收光的量与细胞核DNA的量成正比，故而可以确定细胞核内DNA的量，这是DNA图像细胞分析术所需要。
细胞核吸收信号与细胞核内DNA量的关联可以根据标准DNA成像细胞学方法(例如由Hardie等(The Joumal of Histochemistry and Cytochemistry(2002)，50(6)(735-749)，见下文)所述)进行。
一旦已经确定并测量细胞核的紫外光吸收并且已经对几个细胞重复该过程，则例如可以对多个细胞中所含的DNA的量计算统计量。从这些统计量中，可以得出有关于组织的癌性或非癌性状态的结论，如常规的DNA图像细胞分析术中通常所做到的那样。
本领域技术人员当然十分清楚记录UV吸收信号以及使用这些信号来计算例如细胞核图像的方法。
将利用如通常为这些目的而使用的仪器确定信号强度(即吸收光或透射光的量)。
因此，可以例如使用与显微镜孔连接的电荷耦合器件或数字摄像机，其中所述的显微镜孔用于在细胞暴露于以上所述光源时观察该细胞。当然还可以使用胶片等。
荧光测量可以用任何标准滤光块(filter cube)(由阻挡滤光片、激发滤光片和二向色镜组成)或用于特定引用的任何专用滤光块进行，前提是发射光谱处于系统灵敏度的光谱范围内。光谱成像也可以与任何空间过滤方法(如暗视野法和相差法)甚至与偏振光显微术联合使用。
检测单元可以例如是经BQ6000图像采集卡与计算机连接的OptronicsDEI-700CE三芯片CCD摄像机。或者，可以使用Hitachi HV-C20三芯片CCD摄像机。用于图像分析的软件包可以例如是Bioquant True ColorWindows 98 v3.50.6图像分析软件包2(R&M Biometrics，Nashville，TN)或Image-Pro Plus 3.0图像分析软件。可以使用的另一种系统是Bio View Duet系统(BioView Ltd，Rehovot，Israel，其基于双模式全自动显微镜(Axioplan 2，Carl Zeiss，Jena，Germany)、XY驱动的8-载片平台(Marzhauser，Wetzler，Germany)、3CCD逐行扫描彩色摄像机(DXC9000，Sony，Tokyo，Japan)和用于控制与分析该系统以及数据的计算机。
在更详细地描述计算DNA含量并将DNA含量与细胞的癌性或非癌性状态关联之前，描述了本发明的其它实施方案。这些实施方案给出不同实例，其中技术和方法可以用来定位活组织的细胞中的细胞核并测量由这些细胞核所致的紫外光吸收。
在一个实施方案中，可以使用共聚焦激光扫描显微术进行细胞核定位以及对细胞核UV吸收的测量。
在该实施方案中，共聚焦显微镜集成至例如内窥镜装置内。该装置还与光学记录装置具有相似性。执行元件用来使共聚焦显微镜扫描整个目的组织。第一轮扫描用来确定形态学。从这个扫描中，鉴定目的细胞核。随后，细胞核UV吸收测量并且因此在细胞核上的DNA细胞分析术测量如上所述进行。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及共聚焦激光扫描显微术光学装置用于体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量的用途。在优选的实施方案中，本发明涉及共聚焦激光扫描显微术光学装置用于体内鉴定人或动物中癌细胞的用途。细胞核核酸的量可以通过定位细胞核并测量细胞核UV吸收而如上所述加以确定。所述装置可以是例如集成至内窥镜装置内的微型共聚焦激光扫描显微术装置，如WO 02/073246、US 2005/0036667和WO2004/113962A2中描述。
在另一个实施方案中，组织的形态学可以由这样的显微内镜确定，其中所述的显微内镜是集成在内窥镜顶端的显微镜。在优选的实施方案中，该显微内镜可以用UV光操作。显微内镜(如WO 02/073246中所述的一种显微内镜)将用来定位细胞核。可以使用扫描共聚焦显微术进行DNA细胞分析术测量。添加该显微内镜的优势在于可以实时获得细胞形态学图像，因为共聚焦显微术无需扫描过程。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及整合了用于显微内镜(如WO02/073246中所述)的装置的设备的用途，其可以用UV光和共聚焦激光扫描显微术操作，旨在体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量。在优选的实施方案中，本发明涉及所述设备用于体内鉴定人或动物中癌细胞的用途。细胞核核酸的量可以通过定位细胞核并测量细胞核UV吸收而如上所述加以确定。
由于这种实时成像的缘故，用共聚焦显微镜来确定细胞核UV吸收的细胞核扫描法可以高度精确地进行。当然，用于测量细胞核UV吸收的共聚焦显微镜应当与显微内镜匹配，旨在确保测量相同的细胞核。
在第三实施方案中，细胞核的形态学并且因此细胞核的定位由光学相干断层照相术确定，并且扫描共聚焦显微术作出细胞核探测并且因此测量细胞核UV吸收。当这两种不同方法用于细胞核定位并用于确定细胞核吸光度，则DNA细胞分析术的精度提高。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及整合了用于光学相干断层照相术和共聚焦激光扫描显微术的装置的设备的用途，用于体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量。在优选的实施方案中，本发明涉及此种设备用于体内鉴定人或动物中癌细胞的用途。细胞核核酸的量可以通过定位细胞核并测量细胞核UV吸收而如上所述加以确定。
在第四实施方案中，高于100MHz的换能器使用高分辨率超声术来确定组织内的细胞核定位。在这些条件下，将可以获得能够分辨组织中的细胞的分辨率。用共聚焦激光扫描显微术再次进行细胞核扫描及对细胞核UV吸收的测量。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及整合了用于高分辨率超声波应用和共聚焦激光扫描显微术的装置的设备的用途，用于体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量。在优选的实施方案中，本发明涉及此种设备用于体内鉴定人或动物中癌细胞的用途。细胞核核酸的量可以通过定位细胞核并测量细胞核UV吸收而如上所述加以确定。
在第五实施方案中，可以通过上述方法(因此例如通过激光扫描显微术、通过显微内镜术、通过光学相干断层照相术和通过高分辨率超声术)实现对细胞核形态学并且因此对其定位的确定。然而，不使用共聚焦扫描显微术，而在双光子成像法中测量细胞核UV光吸收。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及整合了用于共聚焦激光扫描显微术、显微内镜术、光学相干断层照相术和/或高分辨率超声术和双光子成像术的装置的设备的用途，用于体内确定人或动物对象中细胞核核酸的量。在优选的实施方案中，本发明涉及此种设备用于体内鉴定人或动物中癌细胞的用途。细胞核核酸的量可以通过定位细胞核并测量细胞核UV吸收而如上所述加以确定。
在双光子成像法的情况下，使激光束聚焦于目的细胞。探测器模块检测因双光子吸收所诱导的荧光。在此情况下，必须依赖于DNA的自发荧光。当使用双光子成像技术时，原则上可以实施如对共聚焦激光扫描显微术所述的相同设置。然而，在寻找因双光子吸收所产生的荧光时，在该探测器前方安放一个滤光片以滤除与双光子荧光的波长具有不同波长的任何光。使用这种方法，DNA细胞分析术的精度可以提高。
在大部分上述的实施方案中，已经通过用共聚焦激光扫描显微镜进行一个相当粗略的扫描，随后进行旨在测量细胞核UV吸收的精度扫描而实现鉴定所研究组织的形态学并且因此定位所述组织的细胞中细胞核的第一步骤。然而，也可以仅进行一个高分辨率扫描，其中使用共聚焦激光扫描显微术来定位细胞核并测量细胞核吸收。
前述方法可以用于人或动物对象中的体内DNA细胞分析术测量，旨在提供例如体内实时癌检测。该方法因此可以用于例如检测皮肤癌、粘膜表面(如口腔、肺、咽、甲状腺和子宫颈)癌。若使用侵入性最小的方法(如内窥镜法)，则该方法也可以用来检测内部癌。
由于本发明的方法允许实时检测癌细胞，与现有已知方法相比，DNA图像细胞分析术显著加快，其中所述的现有已知方法主要依赖在分离的细胞群体上的DNA图像细胞分析术。
因为仅考虑细胞核吸收，即由细胞核吸收的UV光，本发明的方法允许快速而精确地确定细胞核中细胞核核酸的量，如将在下文解释。
众所周知大部分哺乳动物细胞包含一式两份的每条染色体。因此，染色体的数目可以计算为2n，其中n是染色体数目。然而，在细胞复制时，细胞在分裂成子代细胞之前将染色体数目加倍。
在DNA复制且在细胞分裂之前，哺乳动物细胞因此将包含众多条染色体，其可以计算为4n，其中n是染色体数目。
若哺乳动物细胞的DNA量参照染色体数目，则又可称作“健康”或“正常”细胞的非癌性细胞的DNA含量可以因此根据细胞的复制状态赋予数值2或4。
在本发明的上下文中，术语“倍性状态”指正常的非癌性细胞的DNA含量，并且可以具有如上解释的数值2和4。
本领域众所周知如何使用前述福尔根染色方法确定非癌性细胞的倍性状态。在上下文中，将Hardie等(The Journal of Histochemistry&Cytochemistry(2002)，50(6)，735-749)的出版物通过引用的方式并入，因所述的出版物描述使用DNA染色方法确定细胞的DNA含量。
在Hardie等参考文献第738页上的部分“图像分析光密度测定法(ImageAnalysis Densitometry)”中，解释如何可以将由福尔根染色方法或荧光标记物获得的信号强度转换成光密度测定值。同样内容应当适用于由本发明方法测量的吸收信号。如上所述，健康的非癌性细胞将包含2n或4n条染色体，其中n是染色体数目。因此，对如福尔根染色方所获得的信号强度和如本发明中所用的吸收信号的光密度测定分析将产生具有两个峰面积的光密度测定曲线。
这两个峰面积分别被赋予数值2或4。在图1中提供这种光密度测定曲线的实例。在这个具体实例中，分析了非增殖细胞，这解释为何不存在对应于4的峰。
简而言之，对于图像分析光密度测定法，通过连接至计算机的显微镜装配的CCD(电荷耦合器件)检测装置或数字摄像机捕获用于观察细胞并测量吸收信号的显微镜视野。将作为数字化图像的画面记录为一系列像素，赋予每个像素特征性色彩和强度。随后，一般通过基于计算机的算法将强度转换成吸收值，后者随后由图像分析软件显示为前述的光密度测定曲线(densitogram)。
本领域技术人员当然明白正常的非癌性细胞的有意义及可靠的光密度测定曲线应当优选地从含多个细胞(一般25-100个细胞足够)的群体中计算。在本发明的优选实施方案中，细胞核DNA的量因此将如上所述通过在约至少30、40、50或60个细胞上测量细胞核UV吸收进行确定。
使用本发明上述方法确定推定的癌细胞的核DNA含量或倍性状态可以实现对癌细胞存在的确定。确定的倍性状态随后与非癌性细胞的倍性状态比较，其中所述的非癌性细胞的倍性状态已经从通过相同方法获得的细胞核吸收强度中确定。在本发明的一个实施方案中，全部这些计算可以在人体或动物体之外进行。
为确定推定的癌细胞是否的确是易癌变细胞，因此如上所述确定光密度测定曲线。将观察到的非癌细胞的光密度测定曲线命名为“标准”或“参考”光密度测定曲线。
优选地，这种参考光密度测定曲线将使用与用于检测癌细胞的相同方法进行测量，不过将确保仅使用非癌性细胞。这可以通过使用来自相同个体但是来自除疑似癌性的那些组织部位之外的其它组织部位的细胞实现。备选或另外，可以使用来自同一组织中相同或可比较的细胞类型，其中所述同一组织的形态学显示非癌性状态。应当优选地使用可比较的细胞类型，只要确保这些细胞是非癌性的。待研究旨在获得标准光密度测定曲线的细胞的数目和类型完全处于本领域技术人员的知识范围内，并且将在25-100个细胞之间变化，并优选是约30、40、50或60个细胞。
出于本发明的目的，术语“可比较的细胞类型”因此涉及具有与疑似癌细胞可比较的来源以及可比较的细胞特征的细胞类型。例如，若将对粘膜细胞测试癌症发生，则标准参考细胞应当是粘膜来源的。另一方面，若将淋巴样细胞测试癌症发生，则标准参考细胞应当具有淋巴来源以便成为可比较的细胞。
若可能，可比较的细胞类型的细胞核UV吸收应当在高度相似(若不是完全相同)的条件下测量，其中所述的可比较的细胞类型已知是非癌性的并且用作针对推定的癌细胞所获得的细胞核UV吸收的标准参考。
若在推定癌组织中分析了足够大量的细胞核，与2和4对应的峰的“宽度”和额外峰的出现也可以表示癌症发生。
若对于某种细胞，确定了偏离于前述数值2或4的倍性状态，则这表示巨大重复、插入、缺失或染色体重排并且因此表示癌细胞。如在这种情况下，此种细胞的倍性状态偏离于数值2和4，也可以说是非整倍性状态。当然，假定考虑了这样的细胞类型，其通常是增殖性的，即便在其正常状态下也是如此。
因此，若检验通常已知是非增殖的细胞，则倍性值4可以表示癌症发生。
若检验已知在其正常状态下是增殖性的细胞，则将不认为倍性值4表示癌症发生。在这种情况下，偏离数值2和/或4将表示癌症发生。
在本发明上下文中，术语“非整倍性状态”因此涉及细胞中异常量的细胞核DNA。
当然，也从细胞群体中计算推定的癌细胞的细胞核UV吸收并且因此计算其光密度测定曲线，并且一般测量大约100-700个并且优选地测量约100-300个细胞。
若例如检验来自肝组织的癌细胞，可以获得具有两个主峰的光密度测定曲线，其中所述两个主峰赋予数值2和/或4。然而，在非癌性细胞以外的情况下，所述的两个主峰光密度测定曲线不是那么陡峭而狭窄，而是相当宽的。另外，在光密度测定曲线中观察到峰和信号，其低于2，高于2，低于4和高于4。在图2中提供实例。
因为任何样品内的大多数细胞将具有2的DNA含量，与这个大多数偏离也可能被视作异常或可疑的。在癌组织的情况下，其中正常细胞居于少数，则仍存在DNA含量的巨大偏离，其中所述的偏离可以用来标记该样品为可疑。
若基于细胞核UV吸收计算的光密度测定曲线显示了处在与数值2(和数值4，在细胞于其正常状态下为增殖性的情况下)对应的峰之外的峰信号，其中所述的细胞核UV吸收根据本发明如上所述获得，则细胞因此定级为癌性的。
然而，与数值2(和4)对应的峰本身可以表示细胞的致癌潜力，若它们显示相当宽阔的曲率。为了在考虑与数值2(和4)对应的峰形式时决定光密度测定曲线是否的确表示或不表示癌症发生，将把推定的癌细胞样品的光密度测定曲线与如上所述的标准参考光密度测定曲线叠合。
将表示标准光密度测定曲线的数值2和4的光密度测定曲线的峰的曲线下面积(AUG)视作表示非癌性细胞，并且推定的癌细胞光密度测定曲线的相应峰的AUC达至少10％的任何偏离将视作表示癌细胞或癌状态。在优选的实施方案中，偏离将是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％。
也可以采用Haroske等“1997 ESACP consensus report on diagnostic DNAimage cytometry”，Analytical Cellular Pathology 17(1998)189-200的出版物中阐述的标准，其中详细解释何时将细胞视为正常或癌性的。
因此，与对可比较的非癌性细胞类型所获得的细胞核UV吸收比较，疑似癌细胞核UV吸收的显著偏离表示正在发生或将来可能的癌症发生。
出于本发明的目的，若疑似癌细胞倍性状态偏离倍性值2(或4)达至少10％，则DNA含量的显著偏离将视为表示癌症发生。在优选的实施方案中，偏离将是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％。在光密度测定曲线中的峰将赋予该峰的这个部分值2或4，其中所述的部分与参考光密度测定曲线中的相应峰是相同的。
根据建立的惯例，若与参考光密度测定曲线的峰值2对应的峰处于1.8-2.2范围内，可以将细胞的DNA含量称作近二倍体(peridiploid)。
若与参考光密度测定曲线的峰值4对应的峰处于3.6-4.4范围内，细胞的DNA含量将视作是近四倍体(peritetraploid)。
在这些范围之外的任何数值将视作X-倍体。
出于本发明的目的，将具有近二倍体、近四倍体和X-倍体值的细胞或组织视作是癌细胞。
因此，上述方法可以用来通过如此方式计算推定的癌细胞的倍性(非整倍体性)状态，即通过如根据本发明方法对推定的癌细胞所获得的细胞核UV吸收与使用相同方法对已知是非癌性的可比较的细胞类型所获得的细胞核UV吸收参比。
出于本发明的目的，术语“非癌性”涉及已知不显示癌症发生指征的细胞。
在本发明的一个实施方案中，癌细胞可以与选自包括以下癌症的组中的癌症相关：白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口及咽喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤。
在本发明的另一个实施方案中，提供体内诊断和/或预测人或动物对象中癌症的方法，所述方法包括步骤：
a)体内定位人或动物对象中所述至少一个细胞的细胞核；
b)体内测量细胞核的紫外光吸收；
c)通过比较如步骤b)中确定的细胞核UV吸收与同样使用步骤a)-b)已经获得的非癌性细胞核UV吸收而确定细胞核核酸的量；
d)根据细胞核核酸的量，决定存在癌症或将来可能出现癌症。
在步骤c)中的比较可以在人体或动物体外进行。
步骤a)-c)可以如上对人或动物对象中体内确定细胞核核酸量的方法所述进行。
因此，对于步骤b)，优选使用波长大约240nm-大约280nm的UV光。特别优选可以是波长大约250nm、255nm或260nm的UV光。若使用UV光定位细胞核，则前述波长范围同样适用于步骤a)。因此，在一个优选实施方案中，步骤a)和b)使用具有前述波长的UV光。
当然，对确定推定的癌细胞以及参考光密度测定曲线或标准光密度测定曲线如上文给出解释的情况下，术语如“癌细胞”、“非癌性细胞”、“倍性”、“非整倍体性”、“近二倍体”、“近四倍体”、“X-倍体”、“AUG”等的含义同等地适用于体内诊断或预防癌的本发明的方法。
在上文称作步骤d)的最后步骤中，根据在检验下的细胞核DNA含量或倍性状态，决定存在癌或将来可能出现癌。
若对推定的癌细胞所确定的细胞核DNA含量或倍性值偏离可比较的细胞类型的细胞核DNA含量或倍性值2(和4)达至少10％，其中细胞核UV吸收已经在高度可比较的相同条件下对所述的可比较的细胞类型测量，并且所述的可比较的细胞类型已知是非癌性的，则可以认为癌诊断是阳性的。在优选的实施方案中，偏离将是至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少40％或至少50％。
将表示标准光密度测定曲线的数值2和4的光密度测定曲线的峰的曲线下面积(AUG)视作表示非癌性细胞，并且推定的癌细胞光密度测定曲线的相应峰的AUC达至少10％的任何偏离将视作表示癌细胞，并且因此产生阳性诊断。在优选的实施方案中，偏离将是至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％或至少50％。
根据建立的惯例，若与参考光密度测定曲线的峰值2对应的峰处于1.8-2.2范围内，可以将细胞的DNA含量称作近二倍体。
若与参考光密度测定曲线的峰值4对应的峰处于3.6-4.4范围内，细胞的DNA含量将视作是近四倍体。
在这些范围之外的任何数值将视作X-倍体。
已经定级为近二倍体、近四倍体或X-倍体的任何细胞或组织将视作是癌性的并将产生阳性诊断。
诊断和/或预测癌的方法可以用来诊断和/或预测选自包括以下癌症的组中的癌：白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口及咽喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤。
Claims (11)
1.体内确定人或动物对象的至少一个细胞中细胞核核酸的量的方法，包括步骤：
a)体内定位人或动物对象中所述至少一个细胞的细胞核；
b)体内测量该细胞核的紫外(UV)光吸收。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法用来检测人或动物对象中的至少一个推定的癌细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中细胞核核酸的量通过将如权利要求1步骤b)中所确定的细胞核的UV吸收与同样使用权利要求1步骤a)至b)已获得的至少一个非癌性细胞的细胞核的UV吸收进行比较而确定。
4.根据权利要求3所述的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量与数值2偏离至少10％表示癌细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其中1.8-2.2的倍性状态或细胞核DNA含量表示近二倍体状态，3.6-4.4的倍性状态或细胞核DNA含量表示近四倍体状态，而在这些范围之外的倍性状态或细胞核DNA含量表示X-倍体状态。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述的至少一个癌细胞与癌症相关，所述的癌症选自包括下列癌症的组：白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口及咽喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤。
7.根据权利要求1所述的方法，其中使用共聚焦激光扫描显微术、双光子成像术、扫描光学相干断层照相术、高分辨率超声术或UV显微内镜术进行步骤a)中细胞核的定位。
8.根据权利要求1所述的方法，其中使用共聚焦激光扫描显微术在步骤b)中测量细胞核的UV光吸收。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述UV光的波长是大约240nm至大约280nm并且优选地是250nm、255nm或260nm。
10.一种设备用于体内确定人或动物对象的至少一个细胞中细胞核核酸量的用途，其中所述设备包含用于以下应用的装置：
a)用于进行权利要求1步骤a)的共聚焦激光扫描显微术、显微内镜术、光学相干断层照相术和/或高分辨率(high profile)超声；和
b)用于进行权利要求1步骤b)的共聚焦激光扫描显微术和/或双光子成像术。
11.根据权利要求10的用于进行步骤a)和b)的设备的用途，所述的设备包含用于共聚焦激光扫描显微术的装置。
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