CN101508974B - 一种体外干眼模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
一种体外干眼模型的建立方法，涉及一种干眼模型。提供一种不仅简便易行、重复性好、较动物模型成本低，而且具有与干眼相似的许多组织病理学特征的体外干眼模型的建立方法以及在模拟、研究和防治干眼中的应用。将包含结膜上皮和结膜下基质的结膜组织剪下置于培养基内；将结膜组织修剪成为结膜组织块；将结膜组织块置于I型胶原包被的培养皿插件上，结膜上皮面朝上；将培养基加入插件外的培养皿中，使培养基气液界面处于结膜组织块的结膜上皮与结膜下组织交界处；将结膜组织块置于培养箱内培养即得。可用于干眼鳞状上皮化生、眼表上皮屏障破坏、眼表上皮粘蛋白改变、干眼发病中炎症介质的参与以及凋亡在干眼发生发展中的作用等相关研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种干眼模型，尤其是涉及一种采用结膜组织培养制备体外干眼模型的方法以及在模拟、研究和防治干眼中的应用。
背景技术
干眼为任何原因所致泪液质和量及动力学的异常，从而导致泪膜不稳定和/或眼表面的异常，并伴有眼部不适症状的一类疾病。根据维持稳定泪膜的要素，干眼可以分为：蒸发过强型干眼(脂质层异常为主)、水液缺乏型干眼(
综合征以及非
综合征)、粘蛋白异常型干眼(眼表上皮细胞受损为主)、泪液动力学异常型干眼及混合型干眼([1]刘祖国.干眼的诊断.中华眼科杂志，2002，38(5)：318-320)。临床调查显示，干眼是目前最为常见的眼表疾病(据估算我国的干眼患者超过8千万)，影响人民的生活质量，严重者可以引起角膜炎、角膜新生血管以及角膜溃疡等，因此也是重要的致盲性眼病之一，是近年来眼科的研究重点及难点([2]The epidemiology of dry eye disease：report of the Epidemiology Subcommittee of theInternational Dry Eye WorkShop(2007).Ocul Surf2007；5：93-107)。然而，由于干眼发病的复杂性及多样性，目前关于干眼的发病机制、诊断和治疗的一系列问题的基础以及临床研究尚有待进一步深入。
虽然各种类型的干眼其发病机制各有不同，但是干眼发病的病生理特征却有较多共同点，包括：眼表上皮屏障破坏，结膜杯状细胞减少或消失，眼表上皮鳞状上皮化生，眼表上皮的膜结合型粘蛋白及分泌型粘蛋白改变，结膜上皮更新加速以及炎症介质及凋亡参与疾病的发生发展等([3]Research in dry eye：report of the Research Subcommittee of the International DryEye WorkShop(2007).Ocul Surf2007；5：179-193)。由于结膜占据了眼表面的大部分区域，而且杯状细胞及某些特异性粘蛋白在眼表面为结膜上皮所特有，因此结膜在干眼发生发展中的变化就尤为重要。
疾病模型的建立是研究干眼的发病机制，探索治疗方法的有效且实用的手段。目前已报道的建立干眼动物模型的方法包括：通过营养因素、环境因素、毒性物质、药物作用、改变动物性激素分泌水平、去除泪腺或眼表的神经支配、诱导泪腺产生自身免疫反应及手术摘除泪腺等([3]Research in dry eye：report of the Research Subcommittee of the International Dry EyeWorkShop(2007).Ocul Surf 2007；5：179-193)。这些干眼动物模型的建立往往需要较高的技术条件或较长的时间，而且变异性较大。
发明内容
本发明的目的在于针对影响干眼动物模型制作的影响因素众多，而通过眼表上皮细胞培养进行干眼的发病机制研究及药物筛选的方法缺乏组织学的相关证据，现有的各种干眼疾病研究模型均存在其相应局限性等问题，提供一种不仅简便易行、重复性好、较动物模型成本低，而且具有与干眼相似的许多组织病理学特征的体外干眼模型的建立方法以及在模拟、研究和防治干眼中的应用。
本发明的技术方案是将结膜组织在气液界面环境下培养，即将结膜上皮于空气暴露条件下培养，从而获得具有结膜上皮鳞状上皮化生、结膜上皮杯状细胞减少并消失、结膜上皮细胞粘蛋白改变、培养体系内炎症介质增高以及结膜组织细胞凋亡等特征的体外模型。
本发明所述的体外干眼模型的建立方法的具体步骤如下：
1)将包含结膜上皮和结膜下基质的结膜组织剪下，置于培养基内备用；
2)用眼科手术器械将置于培养基内的结膜组织修剪成为合适大小的结膜组织块，得含有结膜上皮和结膜下组织的结膜组织块；
3)将修剪后的结膜组织块置于I型胶原包被的培养皿插件上，结膜上皮面朝上；
4)将培养基加入插件外的培养皿中，使培养基气液界面处于结膜组织块的结膜上皮与结膜下组织交界处；
5)将结膜组织块置于培养箱内培养至少4～20d，即得体外干眼模型。
在步骤1)中，所述培养基选自上皮细胞培养液(SHEM培养基)或细胞培养基；所述培养基内可添加抗生素，进行防污染处理。
在步骤2)中，所述结膜组织块的大小一般为(3～6)mm×(3～6)mm，或者为直径(3～8)mm大小，结膜组织块的大小也可以根据具体实验调整组织块大小。
在步骤4)中，所述培养基选自上皮细胞培养液(SHEM培养基)或细胞培养基；所述培养基内可添加抗生素，进行防污染处理。
在步骤5)中，所述将结膜组织块置于培养箱内培养至少4～20d期间，最好定期更换培养基，更换培养基的时间最好每1～3d更换一次。
可对气液界面环境下培养2、4、6、8、10、12和14d后的结膜组织块进行组织病理检查，如发现本方法制备的体外结膜组织块具有与干眼发病时结膜组织改变相类似的多项病理学特征，表明本方法制备的体外结膜组织块即为体外干眼模型，并可将此体外干眼模型应用于干眼的模拟、研究和防治。
采用本发明建立的体外干眼模型具有如下特点：
1)制作简单，可重复性高，价格相对低廉。
2)在培养过程中，自培养2d起，结膜上皮细胞逐渐出现鳞状上皮化生的病理学特征改变：包括上皮层数明显增加，具有高增殖能力的细胞明显增加(通过细胞增殖能力标志物的免疫组织化学等方法证明)，细胞正常分化标志物(如结膜上皮特异性标志物角蛋白K19)表达下降，并出现异常分化标志物的阳性表达(如皮肤上皮细胞特异性标志物角蛋白K10)。
3)在培养过程中，结膜上皮细胞中的杯状细胞逐渐减少并消失，可以用特异性标志物MUC5AC免疫组织染色证实。
4)在培养过程中，结膜上皮细胞的膜结合型粘蛋白及分泌型粘蛋白的量发生改变。
5)在培养过程中，培养液以及结膜组织中炎症介质的量增高，如基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。
6)在培养过程中，结膜组织的上皮及基质内出现凋亡细胞，且其数量逐渐增加。
本发明还扩展到干眼发病的相关机制的研究。如前所述，各种类型的干眼虽然病因不尽相同，但是具有其高度相似的病生理特征。而本发明所建立的体外干眼模型也具有上述干眼的组织病理学特征。本发明可以用于干眼鳞状上皮化生、眼表上皮屏障破坏、眼表上皮粘蛋白改变、干眼发病中炎症介质的参与以及凋亡在干眼发生发展中的作用等相关研究。
本发明的体外干眼模型，对于测试用于干眼治疗的新药或者新治疗方法也是有用的，因此本发明还扩展到干眼治疗中对有效治疗药物及方案的筛选、鉴定方法。
附图说明
图1为本发明实施例的结膜组织块在培养皿插件上于气液界面环境下培养的模式图。在图1中，1为培养皿，2为I型胶原包被的培养皿插件，3为培养基液气界面，4为结膜组织块的结膜上皮部分，5为结膜组织块的结膜下组织部分。
图2为本发明实施例的结膜组织块在培养皿插件上于气液界面环境下培养的大体照片。
图3为本发明实施例的结膜组织块在所述的条件下培养后的苏木素伊红染色图片(200倍)。D2、D4、D8、D12、D14分别代表培养第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
图4为本发明实施例的结膜组织块在上述条件下培养后进行粘蛋白MUC5AC染色图片(200倍)。D0、D2、D6、D8、D12、D14分别代表培养即刻、培养第2d、第6d、第8d、第12d以及第14d。
图5为本发明实施例的结膜组织块在上述条件下培养后进行P63染色图片(400倍)。D0、D2、D4、D8、D12、D14分别代表培养即刻、培养第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
图6为本发明实施例的结膜组织在所述的条件下培养后进行角蛋白K10染色图片(200倍)。D0、D2、D4、D8、D12、D14分别代表培养即刻、培养第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
图7为本发明实施例的结膜组织气液界面环境下培养2～12d培养基中白介素-1β浓度曲线。在图7中，横坐标为培养天数(d)，纵坐标为白细胞介素-1β(pg/ml)。
图8为本发明实施例的结膜组织气液界面环境下培养2～12d培养基中基质金属蛋白酶9(MMP-9)浓度曲线。在图8中，横坐标为培养天数(d)，纵坐标为基质金属蛋白酶-9(ng/ml)。
图9为本发明实施例的结膜组织气液界面环境下培养2～12d培养基中炎症介质肿瘤坏死因子α(TNF-alpha)浓度曲线。在图9中，横坐标为培养天数(d)，纵坐标为肿瘤坏死因子α(pg/ml)。
图10为本发明实施例的结膜组织气液界面环境下培养2～14d的凋亡试剂盒末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术染色(TUNEL)检测结果(100×)。在图10中，行A为细胞核染色结果，行B为TUNEL阳性细胞；点线所示为结膜上皮和结膜下组织交界位置；D2、D4、D8、D12、D14分别代表培养第2d、第4d、第8d、第12d以及第14d。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。
实施例1
本发明所述的结膜组织在气液界面环境下培养而建立的干眼模型的制备方法，其具体步骤如下：
①将眼库获得的捐赠尸眼的球结膜连同结膜下组织剪下，用含有抗生素的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，置于加入3X抗生素的上皮细胞培养液(SHEM培养基)中30min，再转移到含有普通抗生素浓度的SHEM培养基中备用。
②用I型胶原包被培养皿插件底部：胶原浓度为1mg/ml，每个插件内使用0.3ml。
③将结膜组织修剪成5mm见方大小，置于包被好的培养皿插件的中央，上皮面朝上。
④将SHEM培养基加入培养皿内插件外部，并让液面维持于结膜组织的上皮与基质交界处。
⑤将上述结膜组织培养体系置于含5％二氧化碳的培养箱内培养，每2d更换培养基。
结果显示，将培养基液面维持于结膜组织块的上皮与基质交界处，结膜组织能够良好附着于I型胶原包被的培养皿插件上，且组织块边缘于培养1～3d可见到向外生长的结膜上皮细胞，见图1和2。结膜上皮细胞在上述条件下培养6～14d达到融合。
实施例2
分别冷冻包埋上述条件下培养2～14天的结膜组织并进行冰冻切片，进行组织病理学及免疫组织化学染色观察，具体如下：
主要试剂与仪器：鼠抗人单克隆抗角蛋白K19抗体、抗角蛋白K10抗体及抗P63抗体(美国Dako公司)，鼠抗人单克隆抗粘蛋白MUC5AC抗体(美国Abcam公司)，FITC标记的山羊抗鼠IgG二抗(美国Sigma公司)，OCT包埋剂(美国SAKURA公司产品，型号OCT4583)。Leica CM1850冰冻切片机(德国Leica公司)，Nikon TE2000倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。
苏木素-伊红染色：上述条件下培养的结膜组织标本在不同时间点取下后立即用OCT包埋，液氮预冷1min，置-80℃低温冰箱保存。将低温保存的标本作连续冰冻切片，片厚6μm。将组织切片用4％多聚甲醛固定15min，稍水洗后苏木素染色5min，流水洗去苏木素液，1％盐酸酒精分化10s，流水返蓝15min，0.5％伊红染色1min，蒸馏水水洗后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。
免疫荧光组织化学染色法：上述条件下培养的结膜组织标本在不同时间点取下后立即用OCT包埋，液氮预冷1min，置-80℃低温冰箱保存。将低温保存的标本作连续冰冻切片，片厚6μm。超薄组织切片用4％多聚甲醛固定15min，PBS加2％小牛血清去除非特异性染色，加第一抗体(K10，K19，MUC5AC工作浓度均为1∶200)置于4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5min，加荧光素标记的第二抗体(工作浓度1∶100)，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min。加封片剂后盖盖玻片，置荧光显微镜观察结果，照相。
免疫酶组织化学染色法：组织切片用4％多聚甲醛固定15min，0.3％过氧化氢甲醇溶液30min，以灭活内源性过氧化物酶的活性，PBS洗涤3次，每次5min；加入血清稀释液稀释的第一抗体(P63工作浓度1∶50)，4℃冰箱内孵育过夜，吸去抗体，PBS洗涤3次，每次5min；滴加血清稀释液稀释的生物素标记兔抗鼠二抗(工作浓度1∶100)，室温孵育1h；吸去二抗，PBS洗涤3次，每次5min；加入亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(Avidin-biotin-peroxidase comples，ABC)，孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min；二氨基联苯胺(Diamlnobenzidinl，DAB)溶液显色2min，终止反应；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；盖盖玻片，置光镜下观察结果，照相。阴性对照以PBS代替一抗。
结果显示，苏木素-伊红染色(图3)显示所述条件下培养的结膜组织在第2～14d出现上皮细胞层数较正常明显增加，且其高峰为第6～8d，上皮基底层细胞呈波浪状排列，部分结膜上皮基底区域呈指状突起伸入基质层中，基质层中可见呈团簇状的结膜上皮细胞团。MUC5AC组织免疫荧光染色(图4)证实了所述条件下培养2～8d的结膜组织中杯状细胞数量逐渐减少并消失。P63免疫酶组织化学染色法(图5)证实了所述条件下培养2～8d的组织中具有高度增殖能力的结膜上皮细胞数量增加。角蛋白K10组织免疫荧光染色(图6)证实了所述条件下培养2～14d的结膜组织上皮细胞发生异常分化，其结膜上皮特征性角蛋白K19的表达量减少，而皮肤角化上皮特征性角蛋白K10在所述条件下培养的的结膜组织的表层逐渐到基底上层细胞出现阳性表达。
实施例3
本发明所述的结膜组织在气液界面环境下培养而建立的干眼模型的制备方法，其具体步骤如下：
①将眼库获得的捐赠尸眼的球结膜连同结膜下组织剪下，进行必要的防止污染处理后转移到含有普通抗生素浓度的培养基中备用。
②用I型胶原包被培养皿插件底部：胶原浓度为1mg/ml，每个插件内使用0.3ml。
③将结膜组织用直径为7mm的环钻取下大小一致的组织块，置于包被好的培养皿插件的中央，上皮面朝上。
④将培养基加入培养皿内插件外部，并让液面维持于结膜组织的上皮与基质交界处。
⑤另外设置对照组，即将培养液加入培养体系中并完全覆盖环钻获取的等同大小的结膜组织块。
⑥将上述2组结膜组织培养体系置于含5％二氧化碳的培养箱内培养，每2d更换培养基，收集更换的培养基，100,000转/min离心10min后分装并储存于-80℃冰箱内备用。
⑦取适量收集分装的培养基按试剂盒说明进行酶联免疫夹心法检测炎症介质MMP-9、IL-1β及TNF-α的浓度。
结果显示，每2d收集的所述气液界面环境下培养结膜组织的条件培养基中炎症介质，包括MMP9、IL-1β及TNF-α的浓度较正常培养基以及对照组明显增高，其中MMP-9的高峰出现在第10d，IL-1β的高峰出现在第8d，而TNF-α的高峰出现在第6d。具体详见图7～9。
实施例4
每2d将本发明所述的气液界面环境下培养的结膜组织标本包埋并进行冰冻切片，并按凋亡试剂盒说明进行DNA断端末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞，具体如下：
①用4％多聚甲醛固定30min。
②磷酸盐缓冲液洗涤2次，每次10min。
③加入含0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲液，孵育10min。
④按说明书要求配制TUNEL检测液：每1个样品需要TUNEL检测液50μl，其中含有TdT酶2μl，荧光标记液48μl，需充分混匀。
⑤用磷酸盐缓冲液洗涤2次。
⑥在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60min。注意：孵育时需注意保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
⑦磷酸盐缓冲液洗涤3次。
⑧用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
结果显示，在所述条件下培养的结膜组织标本切片TUNEL法染色后可见结膜上皮及基质内出现阳性的凋亡细胞(图10，A行为DAPI获得的核染色，B行为凋亡阳性细胞染色)，且凋亡细胞数量随气液界面环境下培养时间的延长而明显增加。
Claims (8)
1.一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于具体步骤如下：
1)将包含结膜上皮和结膜下基质的结膜组织剪下，置于培养基内备用；
2)用眼科手术器械将置于培养基内的结膜组织修剪成为合适大小的结膜组织块，得含有结膜上皮和结膜下组织的结膜组织块；
3)将修剪后的结膜组织块置于I型胶原包被的培养皿插件上，结膜上皮面朝上；
4)将培养基加入插件外的培养皿中，使培养基气液界面处于结膜组织块的结膜上皮与结膜下组织交界处；
5)将结膜组织块置于培养箱内培养至少4d，即得体外干眼模型。
2.如权利要求1所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养基选自上皮细胞培养液。
3.如权利要求1或2所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养基内添加抗生素，进行防污染处理。
4.如权利要求1所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤2)中，所述结膜组织块的大小为(3～6)mm×(3～6)mm，或者为直径3～8mm大小。
5.如权利要求1所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养基选自上皮细胞培养液。
6.如权利要求1所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养基内添加抗生素，进行防污染处理。
7.如权利要求1所述的一种体外干眼模型的建立方法，其特征在于在步骤5)中，所述将结膜组织块置于培养箱内培养至少4d期间，定期更换培养基，更换培养基的时间每1～3d更换一次。
8.如权利要求1所述的建立方法所得到的一种体外干眼模型在筛选防治干眼药物中的应用。
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