CN101506377A - 设计用于以高灵敏度检测扩增子的捕获分子 - Google Patents
设计用于以高灵敏度检测扩增子的捕获分子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及设计和/或制备多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶，所述方法包括以下步骤：a)选择引物对定义扩增子；b)在扩增子内选择10－100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基。
Description
发明背景
1.发明领域
本发明属诊断领域，涉及设计和/或制备捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测和/或定量样品中由引物对扩增所产生的潜在的核苷酸序列。
通过本发明的方法设计出的捕获分子尤其适用于鉴定和/或定量同一属或科的微生物或鉴定和/或定量存在于生物样品中的特定生物体中的相关基因。
2.背景技术
生物芯片技术的发展使可在给定实验中同时检测多个核苷酸序列，从而使可鉴定相应生物体或部分生物体。阵列是在表面含有一系列载有捕获分子(或探针)的离散区域的固体支持物，可结合(通过杂交)可能存在于待分析样品中的相应靶核苷酸序列。如果靶序列在反转录过程中或在所述序列的扩增过程中被经修饰的核苷酸标记，便可在结合位置检测和测量到信号。可通过所述信号强度估计样品中靶序列的存在量。此技术使得可诊断或筛选目的鉴定和/或定量物种或基因。
Affymetrix Inc.公司已开发出一种在固体支持物的特定位置直接合成寡核苷酸的方法，此过程的每一步都使用罩子。所述方法包括，向延伸中的寡核苷酸加入新核苷酸，以在所需位置得到所需序列。此方法源自光刻技术，并结合使用了于新核苷酸加入前释放的光保护基团(EP-A1-0476014，美国专利No.5,445,934、美国专利No.5,143,854和美国专利No.5,510,270)。然而，只有小的寡核苷酸存在于表面上，所述方法主要被应用于测序或鉴定阳性样点图谱，所述阳性样点图谱对应于结合于阵列上的每个特定寡核苷酸。可通过比较所述图谱与参照而鉴定靶序列。所述技术被应用于鉴定结核分枝杆菌rpoB基因(WO97/29212和WO98/28444)，其中所述捕获分子含有少于30个核苷酸，且可分析两个相差一个核苷酸的不同序列(SNP或基因型的鉴定)。优选小捕获分子(长度10-20核苷酸之间)，因为长度越短，相差一个碱基的两个寡核苷酸之间的差别越大。
所述方法的局限性在于无法直接检测由基因扩增(PCR)产生的扩增子。在使用具有T3或T7序列的引物进行双扩增后，使用RNA聚合酶反转录至单链RNA后方可进行检测。在阵列上检测前，将所述RNA序列切成约40个碱基的片段(WO 97/29212的实施例1)。长DNA或RNA片段与表面上的捕获分子杂交甚慢，或根本不杂交。因此，使用所述方法检测同源序列较复杂，因为同源性随序列而变，使得部分所述片段可杂交至同一捕获分子。所以所述方法需要有复合的计算机软件以重建序列及解析结果。
当使用小捕获分子阵列时，基于mRNA的cDNA拷贝的基因表达阵列也遇到了同样的问题：杂交速度低。因此，片段被切成更小的片段库，且所述方法要求使用几个捕获分子，以得到证实给定基因存在的信号图谱(WO97/10364和WO97/27317)。所述切割也降低经标记的核苷酸数，从而降低所得信号。在这种情况下，使用长捕获分子可提供更好的检测灵敏度。在多基因表达应用中，当待检测的cDNA源自序列不同的基因时，由于相互之间无交叉反应，所以使用长捕获分子不是个问题。虽然长捕获分子可提供所需灵敏度，但当存在同源序列存在的可能性时，它们不能被使用，因为它们会杂交至同一捕获分子而使检测非特异。
已有人建议使用膜和尼龙支持物，通过在支持物和捕获分子间掺入间隔区，以提高固体支持物上检测的灵敏度。Van Ness等人(NucleicAcids Research，Vol.19，p.3345，1991)描述了用于结合DNA与尼龙膜的聚(乙撑亚胺)臂。欧洲专利申请EP-0511559描述了用于结合小寡核苷酸与膜的作为间隔区的六乙二醇衍生物。当将膜(如尼龙)用作支持物时，无法控制固体支持物和寡核苷酸间的结合位点。已观察到polydT尾增加固定产率，所得杂交产率也增加(WO 089/11548)。使用存在于多聚物中的重复捕获序列也可得到相似结果(美国专利No.5,683,872)。
Guo等人(Nucleic Acids Research，Vol.22，p.5456，1994)教导了以更高杂交灵敏度将寡核苷酸结合至玻璃的15个碱基的polydT作为间隔区的用途。
PCT申请WO99/16780描述了尼龙载波片上基因FemA的4个同源序列的检测。但没有提供有关方法和检测的灵敏度的数据。在所述文件中，捕获分子含有15-350个碱基，与共有序列的同源性小于50％。
Anthony等人的文章(Journal of clinical microbiology，Vol.38，p.7817，2000)描述了膜阵列在以低灵敏度分辨源自几种相关生物体的同源序列中的用途。待检测的靶是通过共有PCR从细菌扩增出的rDNA，可在含有用于所述细菌的捕获分子的尼龙阵列上检测到，其中使所述捕获分子长20-30个碱基，并共价连接到尼龙上。无法控制可杂交的序列部分。
Peytavi等人的文章(Bio Techniques，Vol.39，p.89，2005)讨论了有关402和432bp ermB产物与20-mer寡核苷酸捕获分子的杂交效率的实验。报道的结果表明，由于游离的5’突出端与第二条扩增子链复性，导致被捕获的链不稳定。
因此，仍然需要设计捕获分子的方法，所述方法需要在保持检测特异性的同时，以高产量高速度地在被固定的捕获分子上检测存在于溶液中的双链扩增序列。所述设计方法同时应该考虑由于引物对的选择对其造成的限制。
本发明通过提供简单有效的设计捕获分子的方法应对所有所述限制，所述捕获分子被用于检测经固定的捕获分子上的PCR扩增序列。
发明目的
本发明旨在提供设计和/或制备捕获分子的新方法，所述捕获分子被用于通过引物对扩增后或过程中的大量(微)生物体或部分(微)生物体的简便鉴定(检测和/或定量)。
本发明还旨在提供允许要求在扩增步骤中使用单个引物的简化的技术，允许通过在所述微阵列上鉴定和/或记录单个点信号鉴定(检测和/或定量)特异的靶序列，所述信号只来自靶序列与它对应的捕获分子的特异结合。
发明概述
本发明在一个实施方案中涉及设计多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶，所述方法包括以下步骤：
a)选择引物对定义扩增子；
b)在扩增子内选择10-100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；
c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；
d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基。
本发明在另一个实施方案中设计制备多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶，所述方法包括以下步骤：
a)选择引物对定义扩增子；
b)在扩增子内选择10-100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；
c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；
d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基；
e)合成所述捕获分子。
本发明还在另一个实施方案中涉及可通过上述方法得到的捕获分子。
本发明在第4个实施方案中涉及在检测扩增子的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含通过本发明的方法设计的捕获分子。
附图简述
可参照下列附图更好地理解本发明的特征和优点，其中：
图1示在实施例1的实验中使用的靶扩增子链中的不同捕获分子的位置。图示具有互补的反义特异捕获部分(CAS)的捕获分子上的正义靶链(S)的位置和具有互补的正义特异捕获部分(CS)的捕获分子上的反义靶(AS)的位置。指示了每个构型的游离非间隔区末端和游离间隔区末端的长度(核苷酸)。所有已描述的相互作用的扩增子和捕获分子链的5’-3’方向都相同。不同的捕获分子的间隔区部分(90个核苷酸)和捕获部分(27个核苷酸)长度相同。
图2示荧光强度与正义靶链(图2A)和反义链(图2B)在各自捕获分子(1a，2a，3a)和(1s，2s，3s)上的游离间隔区末端(核苷酸)长度间的相关性。所述实验设计显示于图1。
图3示间隔区部分长度(核苷酸)对如实施例2中提供的杂交产率(荧光强度)的影响。使用本发明的间隔区部分长度不同的捕获分子进行所述实验。间隔区部分长度为20-95个核苷酸及特异于靶分子的27个碱基的恒定捕获部分。
实施方案详述
以下结合实施例(仅用作实施例)与附图描述本发明的某些实施方案。
术语“核酸”、“寡核苷酸”、“阵列”、“探针”、“靶核酸”、“基本结合”、“特异杂交”、“背景”和“定量”如通过引用并入本文的国际专利申请WO97/27317中所述。
术语“核苷三磷酸”、“核苷酸”和“引物序列”如通过引用并入本文的文献WO00/72018中所述。
术语“同源序列”和“共有序列”如通过引用并入本文的欧洲专利申请WO01/77372中所述。术语“同源性”指一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列间的同一性程度。两个或多个多核苷酸之间可完全同源(即，100％的同一性)。可在序列比对后通过本领域技术人员熟知的任何方法测定而计算同源性程度。
本文所述“捕获分子”指能够特异性结合一个靶分子或一个家族的靶分子或多个靶分子中的一个或多个成员或其部分的分子、或分子的复合体或组合体。捕获分子优选是核酸，既可在支持物表面原位化学合成，也可易位合成后随即固定在支持物上。核酸结合是通过两个多核苷酸间的碱基配对实现的，其中一个是经固定的捕获分子，另一个是待检测的靶。捕获分子也包括核酸的衍生物，如PNA或LNA，只要其可特异性结合靶多核苷酸分子。
术语“单个捕获分子种(sigle capture molecule species)”是用于通过碱基配对杂交或通过多肽或蛋白质之间的分子识别检测给定序列的相关多核苷酸的组合物。多核苷酸可化学合成或酶学合成，或从样品中分离，但合成或分离并不总是完美的，捕获分子会被其他相关分子，如较短的多核苷酸污染。本发明的捕获库的基本特征是整个库都可用于捕获给定靶核苷酸分子。
本文描述的术语“与一个或多个基因或基因组序列互补的多核苷酸序列”指在严格条件下可与所述基因或基因组或其拷贝的至少部分核苷酸序列杂交的多核苷酸。多核苷酸也包括可用于特定的条件的寡核苷酸(含有2个以上，100个以下的碱基)。所述可杂交多核苷酸一般在核苷酸水平表现出与所述基因或基因组至少约75％的序列同一性，优选与所述基因或基因组约80％或95％的序列同一性或优选95％以上的核苷酸序列同一性。根据实验的特异性和敏感性要求，它们一般由15-30个碱基，或更长的30-100个碱基，或再长的100-800个碱基长的小序列构成。
“微阵列”指固定有多个捕获分子以可结合给定的特定靶分子的支持物。微阵列优选由存在于支持物表面或内部或覆盖支持物的基质上特异定位区域中的捕获分子构成。特异定位区域是含有特异于已确定的靶分子的结合有捕获分子的表面上的区域。特异定位区域是通过建立微阵列的方法知晓的，或在检测过程中或检测后确定的。样点是有特异靶分子固定于其捕获分子上的，可通过检测器观察到的区域。样点是有特异靶分子固定于其捕获分子上的，可通过检测器观察到的区域。在本发明的特别的申请中，只要不同的支持物含有特定的捕获分子并可相互区分，以可定量特定靶分子，捕获分子的微阵列也可提供在不同的支持物上。这可通过使用具有特别特征和能相互识别以定量结合的分子的珠混合物来实现。然后可将一个珠或一群珠作为具有特异于靶分子的捕获分子的样点。
本发明的“扩增子”指由存在于生物材料中的核苷酸分子的PCR扩增产生的靶核苷酸分子。
发明人发现大幅度地简化在许多其他具有同源序列的(微)生物体中鉴定一个和几个(微)生物体的过程是可能的，方法是通过：
将使用通用引物对进行单一扩增与通过检测和可能记录阵列上只来自捕获序列及其相应靶序列间的结合的单个信号的存在而进行的可能的(微)生物体的鉴定结合，并
将所检测的靶序列的存在与特异于所述(微)生物体的遗传序列的鉴定相关联。
本发明的方法和装置尤其允许容易地在同源序列中鉴定/检测特定序列，及可能定量(鉴定许多拷贝或在生物样品中所述生物体的存在)靶序列，所述靶序列具有特异于所述(微)生物体的核苷酸序列。
可通过检测或可能记录特定位置处(有捕获分子预先结合)的单个样点信号直接或在洗掉可能的污染物(未结合序列)后得到所述鉴定结果。特定序列的鉴定结果不是通过进行本领域现有技术推荐的微阵列分析特定图谱得到的。因此，所述方法和装置无需通过图像处理和软件分析对所述图谱进行详细分析。
如果捕获分子具有本发明公开的特别的特征，可通过使用结合的所述捕获分子以高灵敏度阵列区分靶序列与其它同源序列，所述捕获分子由至少两部分构成，一部分是通过单个且优选预定(定义的)的连接子结合至支持物(优选非多孔支持物)上的间隔区部分，其他部分是可与核苷酸靶序列杂交的特异性核苷酸序列(捕获部分)，以上发现使得所述检测成为可能。
本发明公开经特定设计的捕获分子的特别的特征，有助于以高灵敏度并快速检测存在于溶液中的扩增子。
发明人发现，欲使用固定的捕获分子以高灵敏度、高速检测包括PCR扩增产物在内的扩增子，需特定设计捕获分子。
本发明涉及设计和/或制备多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶。
所述方法包括以下步骤：
a)选择引物对定义扩增子；
b)在扩增子内选择10-100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；
c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；
d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基。
本发明在第二个实施方案中涉及制备捕获分子的方法。
本发明在第三个实施方案中涉及可通过上述方法得到的捕获分子。
本发明在第四个实施方案中涉及使用所述捕获分子检测扩增子的方法。
本发明在第五个实施方案中涉及检测扩增子的试剂盒，所述试剂盒包含捕获分子。
应理解，在许多情况下，引物对的选择很大程度受到期望的反应条件和对共有引物的需要的影响。引物的选择反过来限定了待产生的扩增子。
接下来，在扩增子上鉴定用于与捕获分子的选择性杂交的序列。需要在扩增子上选择可能与同源扩增子的对应区域不同的区域。为达本发明的目的，有必要将选定的序列定位在与扩增子末端确定的距离处。选定的序列确定了扩增子的两个末端，一个末端比另一个长。较长的末端将成为间隔区末端；较短的末端将成为非间隔区末端。间隔区末端比非间隔区末端长至少50个碱基。
捕获分子包含捕获部分和间隔区部分。捕获部分一般与所述扩增子的选定序列互补，以保证扩增子与捕获分子的最佳杂交。间隔区部分也是多核苷酸，但不与扩增子的间隔区末端互补(当然也不与非间隔区末端互补)。
在优选的实施方案中，捕获分子固定在固体支持物上，其间隔区部分定位于支持物一侧，而特异于扩增子的捕获分子的序列(即，捕获部分)定位于游离末端。换言之，间隔区部分定位于固体支持物和捕获部分之间。可通过任何本领域已知方法附着于固体支持物上。
应理解，捕获分子的间隔区部分可从捕获部分的5’末端或其3’末端延伸。这是由需要扩增子的间隔区末端比其非间隔区末端更长(至少长50个碱基)决定的。
如果捕获分子的间隔区部分在捕获部分的5’末端，则捕获分子附着于固体表面是在捕获分子的5’末端或附近。相反，如果间隔区部分在捕获部分的3’末端，则捕获分子通过其3’末端或附近附着于固体支持物上。
在另一个实施方案中，捕获分子的间隔区部分的远端具有含有游离氨基的核苷酸，待用于在优选含有胺可在其上反应的醛或环氧化合物官能团或其他化学基团的活化的支持物上反应，以能在捕获分子和支持物之间或在覆盖支持物的材料上形成共价键。
本发明的方法给出的最佳结果是检测长度至少200个核苷酸，优选至少300个，更优选多于400个核苷酸的扩增子。所以优选所述长度的扩增子。
发明人发现使用长间隔区部分可显著提高检测速度和产率。捕获分子的捕获部分与固体支持物表面优选被至少约6.8nm(相当于在双螺旋形式的至少20个碱基对长的核苷酸的距离)的间隔区部分隔开。
在优选的实施方案中，捕获分子的间隔区部分是由至少20个核苷酸，优选40个以上，更优选60个以上和最优选90个核苷酸以上的核苷酸序列构成的多核苷酸链。
在优选的实施方案中，捕获分子具有与如下序列具有至少60％同源性的间隔区部分：
5’GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG3′(SEQ ID NO：1)(40个碱基)。所述同源性更优选至少80％，最优选至少90％。
在另一个实施方案中，捕获分子具有与如下序列具有至少60％的同源性的间隔区部分：
5’AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGT
CTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3’(SEQ ID NO：2)(90个碱基)。所述同源性更优选至少80％，最优选至少90％。
在优选的实施方案中，捕获分子具有与如下序列具有至少60％的同源性的间隔区部分：
5’ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATT
CACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3’
(SEQ ID NO：3)(95个碱基)。所述同源性更优选至少80％，最优选至少90％。
本发明的另一个重要方面是使用固体支持物的表面上的特定浓度的捕获分子。如果这一浓度太低，结合产率就低，还可能检测不到。将捕获分子固定到固体支持物的过程中，点样溶液中捕获分子的浓度优选约600-约3000nM。但在有利的情况(当共价固定的产率高；或当待检测的靶是单链，并以高浓度存在时)下，低如约100nM浓度仍可给出阳性结果。所述低点样浓度给出的捕获分子的密度低如20fmoles/cm2。另一方面，更高密度在测定中只受到捕获溶液浓度的限制，但高于3000nM的浓度仍可给出好结果。表面密度通常不超过2000fmoles/cm2。
如本发明所述使用所述非常高的浓度、长间隔区部分和特别设计的捕获分子是本发明出乎意料的特征。DNA杂交理论提示，溶液中两个DNA互补序列之间的杂交速度与DNA长度的平方根成正比，较小的是限制因素(Wetmur and Davidson，J.MoI.Biol，Vol.3，p.584，1968)。为达到所需检测特异性，捕获分子的特定序列(捕获部分)不得不短于靶，因为较长的序列有更多机会与非特异序列发生交叉反应。因为它们小，所以其与互补序列的反应速度低。另外，捕获分子还在支持物上，由于扩散限制，固体表面的存在甚至更加降低了反应速度。由于靶是PCR扩增得到的，并是双链，所以它们在溶液中复性比它们与固定于固体支持物上的小序列杂交快得多，在固体支持物上的扩散较小，从而甚至更加减低了反应速度。本发明出乎意料地观察到扩增子在如此短的特异序列上有如此大的杂交产率。
这样出乎意料的效果的原因还不清楚。可能的解释之一是以下列方式由所述间隔区部分的核苷酸序列的扩增子链稳定化的出乎意料的效果。DNA杂交过程分为两步：成核和扣紧。在成核步骤中，靶的约5个碱基的短序列伸展沿着捕获分子序列相互作用，直到发现完美的匹配。这一步骤是杂交的限制步骤。多核苷酸间隔区部分的存在可在成核过程中起稳定因子的作用。即便间隔区部分不与靶互补，它也将与在邻近定位并将导致一些相互作用的稳定化的靶的一些碱基相互作用。一旦完成成核，邻近碱基的杂交就非常快(zippering，扣紧)，且双螺旋的增殖稳定杂交。
本发明的方法可通过提供包含实施本方法所必需的特定成分的试剂盒来实施。
所述试剂盒特别包含通过本发明的方法设计的捕获分子。所述试剂盒还可包含固体支持物。所述固体支持物可经预处理，以与捕获分子的间隔区部分反应，或者所述固体支持物可有捕获分子固定于其上。另外，所述试剂盒还可含有用于进行扩增子与捕获分子的杂交的工具和/或用于进行PCR的引物和标记工具和/或洗涤溶液。
在优选的实施方案中，所述试剂盒至少含有不可溶的固体支持物，其是以微阵列形式固定于所述支持物的特定区域中的单链捕获分子(优选通过直接共价键或通过间隔区部分中间体结合于固体支持物表面)，其中所述微阵列为至少4个捕获分子/cm2，优选至少10，16，20，50，100，1000，4000，10000或更多不同捕获分子/cm2固体支持物表面。
捕获分子长度优为约30-约600个碱基，优选30-300个碱基，更优选40-150个碱基(包括间隔区部分)，并含有约10-约100个碱基的捕获部分，所述捕获部分特异于靶(这意味着所述序列的所述碱基可通过互补杂交与其靶序列上的互补碱基结合)。所述杂交优选在严格条件下(在本领域技术人员熟知的条件下)进行。
在本发明的方法中，与所述靶互补的捕获分子的所述部分(或其部分)含有10-100个核苷酸，优选15-40个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。所述核苷酸优选为位于或靠近捕获分子末端的连续序列。这一序列被认为是用于检测的特异序列(捕获部分)。
在优选的实施方案中，捕获部分可区分靶序列与至少与所述靶的同源性不到85％的另一个序列。在另一个实施方案中，用于检测两个不同的扩增子的两个捕获分子的所述捕获部分相差10％以上，甚至优选20％以上。
本发明设计的捕获分子可使鉴定从(微)生物体或其部分得到的靶序列，尤其是可能存在于来自至少4个其他同源(微)生物体或其部分的生物样品中的基因，所述其他(微)生物体可能存在于所述相同的生物样品中并具有与靶同源的核苷酸序列。
通过首先使用通用引物对所述核苷酸序列(靶及其同源序列)进行基因扩增，然后再(洗涤后)区分所述经扩增的可能不同的靶而进行所述鉴定。可优选通过在给定位置含有特异于靶(特异于每个可能存在于生物样品中的(微)生物体)的捕获分子的阵列表面进行杂交，再通过鉴定和可能的记录来自所述靶与其对应的捕获分子在预期位置上的特异性结合的信号(特异于靶的单个定位信号)鉴定所述特异靶而进行所述区分。
根据本发明，优选的基因扩增的方法是使用可识别所有所述靶同源核苷酸序列的两个反向共有引物的PCR。选择所述引物，从而使得到的扩增子至少含有200bp，优选至少300bp，更优选至少400bp；所述扩增子优选不超过2000bp。
本发明的方法还包括将所述检测信号(可能记录)与下列的存在相关联的步骤：特定(微)生物体、序列的遗传特征、序列多态性、遗传疾病的诊断诱因或演化(检测)，所述遗传疾病包括已从中得到生物样品的患者(包括人)的癌症。
(微)生物体可存在于任何得到遗传物质的生物物质(病毒，真菌，细菌，植物，或动物细胞，包括人)中。生物样品也可为任何培养基质，其中存在微生物、异生素，污染物，以及从植物或动物(包括人)器官、组织、细胞或生物液体(血液，血清，尿等)得到的提取物。
本发明的方法尤其适用于鉴定可能存在于至少存在4，12，15或甚至更多的同源序列的生物样品中的靶，所述靶优选是(微)生物体或其部分。由于高度同源，可使用通用引物扩增所述序列，从而可通过靶与相应的捕获分子结合后的所述区分特异性地鉴定所述靶，其中所述捕获分子预先结合于所述微阵列的给定位置上。若将捕获分子通过机器手高密度阵列点样于固体支持物表面，也可大大提高灵敏度。本发明的优选实施方案在于将可至约0.01-5pmole序列等同物/cm2固体支持物表面的捕获分子点样到阵列上。
本发明的试剂盒也可掺入各种用于实施本发明的方法的介质或装置。所述试剂盒(或装置)也可包含于用于检测和/或定量存在于待分析的生物样品中的多个核苷酸序列的自动仪器(如高通量筛选仪器)中。可使所述试剂盒或仪器适用于实施本发明的方法的所有步骤或仅几个特定步骤。
如果待检测的序列之间同源性低(30-60％)，可将每个序列中均特异的部分序列用于设计结合各个不同靶序列的捕获分子的捕获部分。但更难寻找足够保守至可设计可扩增或拷贝所有所需序列的“共有”序列的部分序列。如果一对共有引物不足以扩增所有同源序列，则为了完成所需扩增，可加入两个或多个引物对的混合物。在共有扩增中，通过所述相同共有引物扩增的同源序列的最小数是2，但此数无上限。
如果所述序列显示出高度同源性(大于60％，甚至大于90％)，则容易寻找共有引物的通用序列，但选择捕获部分将变得更难。
在优选的实施方案中，用于共有扩增的引物对可扩增至少同源性达60％以上，甚至90％以上的两个靶同源序列，且所述捕获分子可特异性检测两个同源的靶。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述捕获分子是化学合成的寡核苷酸序列(易于在程序化的自动合成仪上合成)。所述序列可带有用于以高浓度共价附着于支持物上的官能团，且通常短于200个碱基。
优选通过PCR扩增(对掺入含有捕获分子的特异部分(捕获部分)和非特异部分(间隔区部分)的质粒中的序列)合成更长的捕获分子。
本发明的方法适用于检测和/或定量由DNA或RNA(包括在总长度上部分或完全同源的序列)构成的靶。
甚至当靶与其他分子间的同源性(或序列同一性)大于30％，大于60％，甚至大于80％时，仍可实施本发明的方法。
在本发明的方法中，所述捕获分子益如下文所述优选通过其末端共价结合(或固定)至不溶的固体支持物上。
本发明的方法给出了显著的结果，允许鉴定(检测和定量)溶液中浓度低于约10nM，低于约1nM，优选低于0.1nM及更优选低于约0.01nM(＝1fmole/100μl)的扩增子。
“结合”至样点的靶量相比存在的捕获分子量是非常小的。因此捕获分子大大过量，甚至如果捕获分子量更大，也没有理由得到结合。
可于扩增或拷贝后检测全长序列，且当通过掺入标记核苷酸进行标记时，已杂交的靶上存在的更多标记，使检测变得更加灵敏。
基因检测也是本发明优选的应用。可通过先反转录mRNA，再使用如本发明所述的共有引物进行扩增来检测同源基因。
本发明给出的杂交速度及产量的提高尤其适用于检测存在于溶液中的单链DNA或RNA；本发明益应用于检测来自mRNA的cDNA转录物，用于检测使用T7聚合酶测定进行扩增产生的RNA。
在微生物领域，可使用特异于微生物各科或属的共有引物，再使用本发明的捕获分子鉴定阵列中的所述各科的一些或所有种。益于同一阵列上检测其他序列(即，通过使与用于定量的标准核苷酸序列、与用于相同或不同的微生物菌株的共有捕获分子、与可通过微生物检测可能的抗生素抗性基因或或用于杂交的阳性或阴性对照序列杂交)。阵列上也可存在用于与来自相同科或属的微生物的所有序列杂交的作为共有捕获分子的长捕获分子，从而给出生物样品中是否存在所述科、属的微生物的信息。
所述阵列也可载有特异于细菌组(革兰氏阳性或革兰氏阴性菌株或甚至所有细菌)的捕获分子。
另一应用是使用特定捕获分子(含或不含用于可能存在于生物样品中的所有细胞色素的共有捕获分子)检测来自同种共有蛋白(如各种细胞色素P450)的同源基因。通过反转录成cDNA而在基因水平进行所述检测。
本发明的固体支持物可为选自下列的材料，或可由选自下列的材料制成：凝胶层、玻璃、电子装置、硅或塑料支持物、多聚物、致密圆盘、金属支持物或其混合物(参见EP 0 535 242，美国专利No.5,736,257、WO99/35499、美国专利No.5,552,270等)。所述固体支持物益为可包括其他配置(条码，标记等)或用于改进本发明的方法的介质的单个载波片。所述固体支持物优选珠形式。
用于本发明的方法的扩增步骤益使用本领域熟知的扩增方法，优选选自：PCR、RT-PCR、LCR、CPT、NASBA、ICR或雪崩DNA(Avalanche DNA)技术。
在特定实施方案中，所述捕获分子检测PCR扩增过程中的扩增子。在另一个特定实施方案中，使所述捕获分子跟踪PCR循环过程中产生的扩增子。
在一个实施方案中，所述捕获分子被用于实时PCR检测扩增子。实时检测在连续PCR循环过程中产生的扩增子。
在另一个实施方案中，所述捕获分子被用于阵列上的实时PCR检测。在PCR扩增过程中检测扩增子是本发明的主要特征之一。通过设计所述捕获分子可使其结合在不同扩增循环中形成的扩增子。所述结合除需要在PCR循环过程中以任何方式进行的两条链的解离及为得到特异和快速杂交的正确条件(温度和盐浓度)外，无需对所述扩增子进行任何特殊处理。本领域技术人员可易于确定所述条件。由于本发明避免了为在捕获分子上检测而切割扩增子的可能性，使所述实施方案成为可能。
可以与单链捕获分子杂交前，标记所述待鉴定的靶。优选于变性(如果本方法包括扩增步骤)前在所述扩增序列上进行所述标记(用本领域技术人员已知的技术)。
根据本发明的再一方面，本发明的方法益被用于鉴定一起或分别生物样品的同源器官的不同的葡萄球菌种或变体，优选为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌或溶血性葡萄球菌，通过优选使用FemA基因序列中的通用位置来检测所述不同种中的FemA基因的遗传变体而进行所述检测。
所述用于得到扩增产物的引物和FemA序列的特异部分优选为下文实施例1和2中描述的引物和FemA序列的特异部分。已将所述引物选为用于扩增所有15个被测试的葡萄球菌的FemA基因的共有引物，所述引物可能会扩增所有其它可能的葡萄球菌种的FemA(实施例3)。
实施例4中描述了根据本发明检测12个MAGE-A。所述阵列允许通过观察载有特定捕获分子信号的阳性线读取MAGE数量。
本发明另一方面涉及含有本发明的捕获分子的生物芯片或微阵列的任何部分。再一方面是用于鉴定特异于科型微生物的靶序列(通过任何方法在任何类型的微阵列或生物芯片上与同源序列区分开的序列)的通用筛选方法。
可在阵列上杂交后，通过现有技术检测所述靶序列。无需标记，优选的方法是通过已适用于阵列的质谱分析法(美国专利No.5,821,060)，或通过嵌入剂，随即用荧光检测(WO97/27329或Fodoret al，Nature，Vol.364，p.555，1993)来鉴定所述靶。
有许多基于标记的检测方法。有关不同标记分子的综述见WO97/27317。它们是使用经标记的引物或在拷贝或扩增过程中掺入经标记的核苷酸而得到的。也可通过将可检测的部分连至待测RNA或DNA(通过连接酶连于序列末端的经标记的寡核苷酸)而进行标记。也可使用激酶、转移酶或类似酶将经标记的核苷酸掺于RNA或DNA片段的5’OH或3’OH末端。
最常用的标记是适用于在商品化的阵列扫描仪(GeneralScanning，Genetic Microsystem)上分析阵列的荧光染料，如Cy3、Cy5和Cy7。常用方法为放射性标记、冷标记或使用小分子间接标记后使用特定配体(链霉抗生物素或抗体)识别。所得固定于阵列上的靶信号是扩散得到的荧光或色度、电子发光、生物或化学发光、磁、电(如阻抗或电压电流)(美国专利No.5,312,527)。优选的方法使用金标记结合的靶以得到沉淀或易于随后用扫描仪检测和定量的银染。
定量需考虑的不仅是阵列上的杂交产率和检测规模(对靶和参比序列是相同的)，而且还要考虑提取、扩增(或拷贝)及标记步骤。
本发明的方法还可包括通过使用以已知浓度加入的标准核苷酸序列(外部或内部标准物)定量靶核苷酸序列的工具。阵列上也可存在捕获分子，以在与所述靶相同的条件下固定所述标准物(可能在扩增或拷贝后)；为定量生物样品中待检测和/或定量的原核苷酸序列的存在，所述方法包括：定量来自通过捕获分子和所述标准物之间的互补碱基配对形成的双链核苷酸序列形成所得信号的步骤，和对所述双链核苷酸序列形成所得信号与来自通过捕获分子和靶之间的互补碱基配对形成的双链核苷酸序列所得信号进行相关性分析的步骤。
可以将所述标准物加入初始生物样品中，或在提取步骤后加入所述初始生物样品中，并使用相同的引物进行扩增或拷贝，和/或所述标准物与所述靶的长度和GC含量相同，或相差不超过20％。可更优选将所述标准物设计成具有文献WO 98/11253所述内部标准物的特征的竞争性内部标准物。所述内部标准物，其部分序列与靶相同，特异部分与靶不同。其两端或靠近两端的序列与用于扩增或拷贝靶的两个引物互补，且GC含量相似(WO 98/11253)。在本发明的优选实施方案中，所述标准物和靶的共同部分指与使用相同引物扩增的所有靶同源的核苷酸序列(即属于待定量的相同科或生物体)。
所述标准物通过所述特异序列的杂交产率优选与靶序列的杂交产率相同或相差不超过20％，并如WO 98/11253所述进行杂交。
也可以将所述标准核苷酸序列、外部和/或内部标准物包含于本发明的试剂盒中，可能含有实施本发明的不同步骤必需的所有介质和工具(杂交和培养介质、聚合酶及其他酶、标准序列、标记分子等)。
生物芯片也可以载有含有各种浓度(实施例4)经标记的捕获分子的样点。用已知浓度的溶液点样所述经标记的捕获分子。可通过其信号将杂交结果转化为绝对量。也可评估所述检测的再现性。
可将所述固体支持物(生物芯片)通过基于显微流技术的溶液控制插入与另一个室和自动机器连接的支持物中。由于被插入所述微型实验室系统中，因此可对其进行自动化的温浴、加热、洗涤和标记，甚至可以及之前的步骤(如DNA提取，PCR扩增)或之后的步骤(标记和检测)。所有这些步骤均可在相同的固体支持物上进行。
以下将参考附图与下列非限制性实施例详细说明本发明。
实施例
实施例1.捕获分子在扩增子链内的位置对其在微阵列上的杂交效率的影响
在此实施例中，我们检测了捕获分子相比扩增子序列的位置对本发明所述的杂交效率的影响。将促旋酶基因用作基因靶。我们制备了定位于扩增子的不同区域的捕获分子的捕获部分(27个核苷酸)靶定的915bp的促旋酶扩增子(图1)。这些捕获分子也包括90bp的间隔区部分。将所述捕获分子阵列固定于固体支持物上。将所述捕获分子中的3个(1a、2a、3a)设计为与正义链互补，而使3个其他的捕获分子(1s，2s，3s)靶定同一区域，但与反义链杂交(图1)。
细菌菌株
参比菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923得自Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ，德国)。
DNA纯化
在需氧条件下，37℃，于LB培养基(10g蛋白胨，5g酵母提取物，和5g NaCl/1)中，从单菌落过夜生长细菌菌株。通过离心(5000g，5min)沉淀过夜培养物的等分试样(0.1ml)。将细菌沉淀重悬于300μl的含有100μg的溶葡萄球菌素(Sigma，Mo，USA)和100μg的RNase的溶菌缓冲液(50mM Tris HCl pH8.0、100μM EDTA、150mMNaCl、1％SDS)中，并在37℃温浴30分钟。在200μg蛋白酶K(Boehringer，Mannheim，德国)存在下，于37℃，温浴30分钟及煮沸5分钟完成溶菌。于4000g离心溶菌物5分钟，根据产品说明书，通过吸附于Nucleospin C+T柱(Macherey-Nagel，Duren，德国)上，从200μl上清液提取DNA。用200μl的无菌水洗脱DNA，并保存于-20℃。
PCR扩增
使用下列共有引物PCR扩增部分gyrase A(GYR)基因：
gyr1 5’GCNGCDGCRATGCGTTATAC3’
gyr3 5’GAACCHYKACCTGTTTCATA3’
N＝A、G、T、C
D＝G、A、T
R＝A、G
H＝A、T、C
Y＝C、T
K＝G、T
所述引物是为扩增来自不同细菌的多个促旋酶而设计的共有引物。
用于检测促旋酶扩增子的捕获分子的捕获部分的序列如下：
| 捕获分子名 | 促旋酶A基因的捕获部分(5’->3’) |
| 1a | TTCTTGTCACGAACGAGCT |
| 2a | GAAAGTTTGAAGCGTTGTTG |
| 3a | TCCTCTAAGTCTTCAAATCC |
| 1s | AGCTCGTTCGTGACAAGAA |
| 2s | CAACAACGCTTCAAACTTTC |
| 3s | GGATTTGAAGACTTAGAGGA |
微阵列装配
于捕获部分的5‘末端延伸如下序列的90bp的间隔区部分：
5’胺-
AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTA
TATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3’(SEQ ID NO：2)
间隔区的最后一个核苷酸在其5’末端被胺化。所述阵列也含有杂交阳性对照和杂交阴性对照，前者是杂交至其对应的捕获分子上的CYP2B2扩增子，后者是CYP2B2不能结合于其上的NFKB序列的捕获分子。在所述阵列上还有对应于生物素化的CMV DNA的检测对照捕获分子。
捕获分子的固定
根据Schena等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，p.10614，1996)所述方案，将胺化的DNA接合到醛化玻璃(aldehyde derivatizedglass)上。用浓度为3000nM的溶液中的于5’末端被胺化的捕获分子进行点样。使用自制的机器手装置(250μm pin，Genetix(英国))将捕获分子印到微型载波片上。所述微型载波片是如申请WO 02/18288所述带有醛基的载波片。样点直径为400μm，分配的体积约0.5nl。在室温下干燥载波片，于4℃保存，待用。
PCR扩增
在含有4mM MgCl2、10mM Tris pH8.4、50mM KCl、0.5μM每种引物、50μM每种dNTP、10μM生物素-16-dATP和生物素-16-dCTP、1.5U的TaqDNA聚合酶超级工具、10μl提取的DNA的50μl体系中，对从参比菌株提取的DNA进行PCR。样品首先于94℃变性3分钟。然后进行35个循环的扩增，所述扩增由94℃ 30秒，55℃30秒，72℃ 1分钟构成，最后于72℃延伸10分钟。将水对照用作扩增的阴性对照。靶扩增子的大小是915bp。
杂交
向35μl的杂交溶液(Eppendorf，Hamburg，德国)中加入20μl的扩增子，并在杂交室框定的阵列上加载所述溶液。对于阳性对照，向所述溶液中加入50nM的375bp的生物素化的CYP2B2扩增子；将其对应的捕获分子点样于阵列。用盖子盖住所述室，并于95℃变性载波片5分钟。于65℃杂交2小时。用洗涤缓冲液洗涤样品4次。
荧光检测
于室温下用经缀合Cy3的IgG抗生物素(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc #200-162-096)稀释1/1000X的缀合物-Cy3，于阻断缓冲液中避光温浴玻璃样品45分钟。将载波片经洗涤后干燥，并于室温下保存。用激光共聚焦扫描仪“ScanArray”(Packard，美国)进行检测。然后，使用特定的定量软件定量每个载波片。
经洗涤和分析后观察到每个捕获分子的荧光信号都不相同。绘出杂交荧光强度对被捕获分子识别的扩增子区域的关系曲线，发现在荧光强度和扩增子游离间隔区末端长度之间具有相关性(图2)。
最强的杂交信号总是与靶定在间隔区部分侧具有非常长的游离末端的扩增子链的捕获分子(捕获分子1a和3s)相关。在捕获分子3a和1s的情况中，靶的游离末端非常短，几乎不与间隔区部分接触。在捕获分子2a和2s的情况中，靶的游离末端是中间体，间隔区部分的稳定子效果是可变的。如下表格概括了捕获分子的捕获部分与正义或反义扩增子链的间隔区末端(3’末端)和非间隔区末端(5’末端)的距离。也显示了荧光信号强度。
| 捕获分子名 | 靶链 | 与靶的间隔区末端的距离(核苷酸) | 与靶的非间隔区末端的距离(核苷酸) | 荧光信号强度 |
| 1a | 正义 | 764 | 124 | 53786 |
| 2a | 正义 | 365 | 523 | 532 |
| 3a | 正义 | 116 | 772 | 214 |
| 1s | 反义 | 124 | 764 | 1834 |
| 2s | 反义 | 523 | 365 | 42201 |
| 3s | 反义 | 772 | 116 | 56975 |
实施例2：间隔区部分的长度对在阵列上检测同源FemA序列的灵敏度的影响
在这一实施例中，我们检测了在根据本发明的捕获分子的设计中，间隔区部分的长度对杂交效率的影响。
将FemA基因用作基因靶。我们制备了定位于距离正义扩增子链的游离3’末端(间隔区末端)415bp处的27个碱基的捕获分子的互补捕获部分靶定的585bp的表皮葡萄球菌扩增子。27个碱基的捕获部分于其5’末端含有不同长度(20、40、85和95个碱基)的间隔区部分。
PCR扩增
所述靶是使用如下共有引物进行PCR扩增产生的表皮葡萄球菌的FemA基因序列的片段：
APcons3-1：5′TAAYAAARTCACCAACATAYTC3′
APcons3-2：5′TYMGNTCATTTATGGAAGATAC3′
Y＝C、T
R＝A、G
M＝A、C
N＝A、G、T、C
在含有：3mM MgCl2、1mM Tris pH8、1μM每种引物、200μMdATP、dCTP和dGTP、150μM dTTP、50μM生物素-16-dUTP、2.5U的Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，德国)、1U的不耐热的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(Boehringer Mannheim，德国)、1ng含有FemA基因的质粒的100μl体系中进行所述PCR。样品首先在94℃变性5分钟。然后进行40个循环的扩增，所述循环由94℃ 1分钟、50℃1分钟、72℃ 1分钟构成，最后于72℃延伸10分钟。将水对照用作扩增的阴性对照。当捕获分子是47，67，112或122个碱基的含有27个碱基的捕获部分和长度可变(20，40，85或95个碱基)的间隔区部分的单链DNA时，靶扩增子长585bp。
微阵列装配
所用捕获分子序列如下：
命名序列(5’->3’)捕获分子
ATepi03 GAATTCAAAGTTGCTGAGAAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAG
ATepi04
GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCGATTAAGCACATTTCT
TTCATTATTTAG
ATepi06
ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAA
CATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCAATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAG
Atepi08
ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAA
CATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTAATTAAGCACATTTCTTT
CATTATTTAG
间隔区部分的序列有下划线。
生物芯片也含有阳性对照和阴性对照，前者是与其对应的捕获分子杂交的CMV扩增子，后者是CMV不能结合于其上的HIV-I序列的捕获分子。如实施例1所述固定所述捕获分子。
杂交
向65μl的杂交溶液(Eppendorf，Hamburg，德国)中加入5μl的扩增子，向杂交室框定的阵列上加载所述溶液。对于阳性对照，向溶液中加入2nM的437bp的生物素化的CMV扩增子；将其对应的捕获分子点样于阵列。用盖子盖住所述室，于95℃变性所述载波片5分钟。于60℃杂交2小时。用洗涤缓冲液洗涤样品4次。
荧光检测
于室温下将所述玻璃样品与800μl经花青苷3或花青苷5标记的链霉抗生物素温浴45分钟。将所述载波片经洗涤后干燥，再于室温下保存。用阵列扫描仪GSM 418(Genetic Microsystem，Woburn，Mass.，美国)进行检测。然后使用特定的定量软件定量每个载波片。
如图3所示，当相对扩增子的捕获部分的设计保持不变时，95个核苷酸的间隔区部分的杂交速度比20个核苷酸的间隔区部分高5倍。
实施例3：设计用于在阵列上检测15个同源FemA序列的捕获分子
我们制备了定位于距离正义扩增子链的游离的3’末端415bp的27个碱基的捕获分子的互补捕获部分靶定的585bp的葡萄球菌扩增子。其构型与图1的捕获分子1a相似。
如实施例2所述进行扩增、杂交和检测。
捕获分子的捕获部分如下：
| 种特异性捕获分子 | fem A基因捕获部分的序列(5’->3’) |
| 金黄色葡萄球菌(S.aureus) | ATTTAAAATATCACGCTCTTCGTTTAG |
| 表皮葡萄球菌(S.epidermidis) | ATTAAGCACATTTCTTTCATTATTTAG |
| 溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus) | ATTTAAAGTTTCACGTTCATTTTGTAA |
| 人葡萄球菌(S.hominis) | ATTTAATGTCTGACGTTCTGCATGAAG |
| 腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) | ACTTAATACTTCGCGTTCAGCCTTTAA |
| 头葡萄球菌(S.capitis) | ATTAAGAACATCTCTTTCATTATTAAG |
| 科氏葡萄球菌(S.cohnii) | ACTTAACACTTCACGCTCTGACTTGAG |
| 鸡葡萄球菌(S.gallinarum) | ACTTAAAACTTCACGTTCAGCAGTAAG |
| 中间葡萄球菌(S.intermedius) | GTGGAAATCTTGCTCTTCAGATTTCAG |
| 路邓葡萄球菌(S.lugdunensis) | TTCTAAAGTTTGTCGTTCATTCGTTAG |
| 施氏葡萄球菌(S.schleiferi) | TTTAAAGTCTTGCGCTTCAGTGTTGAG |
| 松鼠葡萄球菌(S.sciuri) | GTTGTATTGTTCATGTTCTTTTTCTAA |
| 模仿葡萄球菌(S.siinulans) | TTCTAAATTCTTTTGTTCAGCGTTCAA |
| 瓦氏葡萄球菌(S.warneri) | AGTTAAGGTTTCTTTTTCATTATTGAG |
| 木糖葡萄球菌(S.xylosus) | GCTTAACACCTCACGTTGAGCTTGCAA |
捕获分子含有于5’末端固定于支持物上的40个碱基的间隔区部分(5’胺-GAATTCAAAGTTGCTGAGAATAGTTCAATGGAAGGAAGCG-3’)(SEQ ID NO：1)，及随后的特异于来自不同葡萄球菌的各FemA基因的捕获部分。
下表概括了捕获分子的捕获部分与扩增子链的间隔区末端(3’末端)和非间隔区末端(5’末端)之间的距离。同时显示了与图1关联的捕获分子构型。
| 种特异性捕获分子 | 靶链 | 与靶的间隔区末端的距离(核苷酸) | 与靶的非间隔区末端的距离(核苷酸) | 图1的捕获分子构型 |
| 金黄色葡萄球菌(S.aureus) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 表皮葡萄球菌(S.epidermidis) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 溶血性葡萄球菌(S.hacmolyticus) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 人葡萄球菌(S.hominis) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 头葡萄球菌(S.capitis) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 科氏葡萄球菌(S.cohnii) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 鸡葡萄球菌(S.gallinarum) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 中间葡萄球菌(S.intermedius) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 路邓葡萄球菌(S.lugdunensis) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 施氏葡萄球菌(S.schleiferi) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 松鼠葡萄球菌(S.sciur) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 模仿葡萄球菌(S.simulans) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 瓦氏葡萄球菌(S.warneri) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
| 木糖葡萄球菌(S.xylosus) | 正义 | 415 | 143 | 1a |
用比色法进行检测。
比色法检测
于室温下使所述玻璃样品与800μl用阻断缓冲液(马来酸缓冲液100mM pH7.5、NaCl 150mM、Gloria奶粉0.1％)稀释1000倍的胶态金标记的链霉抗生物素温浴45分钟。在用洗涤缓冲液洗涤5次后，将金的存在用于使用染色显示溶液(Eppendorf，汉堡，德国)催化银还原作用。使载波片与800μl的显示混合物温浴3次，10分钟，然后用水漂洗，干燥并用微阵列读数仪分析。然后使用特定的定量软件定量每个载波片。
结果显示清楚地鉴定了15个葡萄球菌序列。
实施例4：设计用于在微阵列上检测同源MAGE-A序列的捕获分子
cDNA克隆
MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、A8、A9、A10、A11、MAGE-A6和A12的cDNA克隆得自Ludwig研究院的布鲁塞尔分院。
PCR扩增
使用如下共有引物对含有MAGE-A1、A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11或A12的cDNA的重组质粒进行PCR扩增。
正义引物
DPSCONS2 5′GGGCTCCAGCAGCCAAGAAGAGGA3″Tm＝78℃，定位于每个MAGE-A基因的起始于ATC密码子的位置234-321的核苷酸，。
为了提高一些MAGE的PCR效率，加入其他引物作为正义引物。
DPSMAGE1 5′GGGTTCCAGCAGCCGTGAAGAGGA3′Tm＝78℃
DPSMAGE8 5′GGGTTCCAGCAGCAATGAAGAGGA3′Tm＝74℃
DPSMAGE12 5′GGGCTCCAGCAACGAAGAACAGGA3′Tm＝76℃
反义引物
DPASCONB45′CGGTACTCCAGGTAGTTTTCCTGC3′Tm＝74℃，，定位于每个MAGE-A基因的起始于ATG密码子的核苷酸位置734-838。
根据MAGE序列，扩增产物的大小约530bp。
在含有2.5μL的cDNA、1X PCR缓冲液(75mmol/L Tris pH9、50mmol/L KCl、20mmol/L(NH4)2SO4、2.5mmol/L MgCl2)、200μmol/L每种dATP、dCTP、和dGTP、150μmol/L dTTP、50μmol/L生物素-16-dUTP(罗氏)、1μmol/L反义共有引物、0.25μmol/L包括共有正义引物DPSCONS2(Eurogentec，Seraing，比利时)的每种正义引物、0.625U的DNA聚合酶(Biotools，Madrid，西班牙)，和为防止前面留下的污染而加入的0.2U的尿嘧啶-DNA Glysosylase(罗氏)的25μL反应体系中进行扩增。用PTC-200热循环仪(Biozym，Landgraaf，荷兰)进行循环。PCR反应物加热到95℃ 5分钟，然后进行30个循环的扩增(94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒)，最后于72℃延伸10分钟。
微阵列装配
选择以下27个核苷酸的捕获部分用于特异捕获MAGE序列。
如实施例3中提供，捕获分子含有40个碱基的间隔区部分。
杂交
将15μl完全PCR反应物与55μl含有5nmol/L的生物素化的DNA对照的杂交溶液(AAT)混合，将所述混合物加载到杂交室(MJResearch Inc.，Watertown，MA，USA)框定的阵列上。用盖玻片盖住所述室。于65℃温浴所述载波片2小时，然后用洗涤缓冲液(AAT)洗涤4次，每次2分钟。
如实施例2所述进行荧光检测。
下表概括了捕获分子的捕获部分与扩增子链的间隔区末端(3’末端)和非间隔区末端(5’末端)的距离。同时显示了与图1关联的捕获分子的构型。
| 捕获分子名称 | 靶链 | 与靶的间隔区末端的距离(核苷酸) | 与靶的非间隔区末端的距离(核苷酸) | 图1的捕获分子构型 |
| DTAS01(MAGE-A1) | 正义 | 471 | 32 | 1a |
| DTAS02(MAGE-A2) | 正义 | 471 | 32 | 1a |
| DTS0306(MAGE-A3) | 反以 | 449 | 54 | 3s |
| DTAS04(MAGE-A4) | 正义 | 440 | 63 | 1a |
| DTAS05(MAGE-A5) | 正义 | 441 | 62 | 1a |
| DTS06(MAGE-A6) | 反以 | 336 | 167 | 3s |
| DTAS07(MAGE-A7) | 正义 | 465 | 38 | 1a |
| DTAS08(MAGE-A8) | 正义 | 465 | 38 | 1a |
| DTAS09(MAGE-A9) | 正义 | 465 | 38 | 1a |
| DTAS10(MAGE-A10) | 正义 | 459 | 44 | 1a |
| DTAS11(MAGE-A11) | 正义 | 461 | 42 | 1a |
| DTAS12(MAGE-A12) | 正义 | 459 | 44 | 1a |
除MAGE-A6扩增子稍交叉杂交至MAGE-A3捕获部分上外，杂交是特异性的。所述交叉杂交的原因是由于这些序列享有96％的同一性。
参考如上讨论的一些实施方案描述了本发明。需知可对所述实施方案施以本领域技术人员熟知的各种修改或替代形式。
只要不脱离本发明的精神和范围，还可对本文所述结构和技术作除上所述之外的诸多修改。因此，尽管描述了特定实施方案，但仅用于示例，非为限制本发明的范围。
序列表
<110>EPPENDORF ARRAY TECHNOLOGIES，SA
<120>设计用于以高灵敏度检测扩增子的捕获分子
<130>02492.0006.00EP00
<140>EP06114113.1
<141>2006-05-17
<150>PCT/EP2005/012382
<151>2005-11-18
<160>49
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>1
<210>2
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Claims (27)
1.设计多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶，所述方法包括以下步骤：
a)选择定义扩增子的引物对；
b)在扩增子内选择10-100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；
c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；
d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基。
2.制备多核苷酸捕获分子的方法，所述捕获分子被用于检测与之杂交的扩增子，所述扩增子的一条链作为待检测和/或定量的靶，所述方法包括以下步骤：
a)选择定义扩增子的引物对；
b)在扩增子内选择10-100个核苷酸的特异序列，使所述特异序列定义扩增子的两个非互补末端；
c)定义具有捕获部分和间隔区部分的捕获分子，所述捕获部分与步骤b)中选择的特异序列互补，所述间隔区部分含有至少20个核苷酸；
d)在扩增子的两个非互补末端中分别鉴定出间隔区末端和非间隔区末端，使所述间隔区末端不与所述捕获分子的所述间隔区部分互补，且所述间隔区末端比所述非间隔区末端多出至少50个碱基。
3.可通过权利要求2的方法得到的捕获分子。
4.检测扩增子的方法，包括使扩增子与权利要求3的捕获分子杂交的步骤。
5.权利要求4的方法，其中所述捕获分子被固定在固体支持物上，从而使间隔区部分定位于固体支持物与捕获部分之间。
6.权利要求5的方法，其中所述捕获分子的5’末端被固定。
7.权利要求5的方法，其中所述捕获分子的3’末端被固定。
8.权利要求5-7中任一项的方法，其中所述捕获分子的间隔区部分的远端具有含有游离氨基的核苷酸。
9.权利要求4-8中任一项的方法，其中所述扩增子长度至少为200bp，优选至少为300bp、更优选至少为400bp。
10.权利要求4-9中任一项的方法，其中所述扩增子长度不超过2000bp。
11.权利要求4-10中任一项的方法，其中所述间隔区部分是多核苷酸链，长度至少为40个核苷酸、优选至少为90个核苷酸。
12.权利要求4-11中任一项的方法，其中所述捕获分子包含间隔区，所述间隔区与如下序列具有至少60％同源性，优选具有至少80％同源性，更优选具有至少90％同源性，5’AAAGTTGAGTCCATTTGTGATGCTAGAAAAGTTGGAACTTTCTTGAACGTCTCCTATATGTCATACATGAATAGGTTGATTTTACTGTAC3’(SEQ ID NO：2)(90个碱基)。
13.权利要求4-12中任一项的方法，其中所述捕获分子包含间隔区，所述间隔区与如下序列具有至少60％同源性，优选具有至少80％同源性，更优选具有至少90％同源性，5’ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAATAATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATTA3’(SEQ ID NO：3)(95个碱基)。
14.权利要求4-13中任一项的方法，其中所述捕获部分含有10-100个核苷酸、优选15-40个核苷酸，更优选20-30个核苷酸。
15.权利要求5-14中任一项的方法，其中所述捕获分子在支持物上的密度是20-2000fmoles/cm2。
16.权利要求5-15中任一项的方法，其中所述捕获分子以微阵列形式被固定在固体支持物的具体定位的区域中，其中所述微阵列为至少4个间隔区分子/cm2，优选至少20个间隔区分子/cm2、更优选至少100个间隔区分子/cm2。
17.权利要求5-16中任一项的方法，其中所述固体支持物是珠形式。
18.权利要求4-17中任一项的方法，其中用至少两种捕获分子检测至少两种扩增子，其中所述至少两种捕获分子的所述捕获部分相差至少10％、优选至少20％。
19.权利要求4-18中任一项的方法，其中所述捕获部分能够区分靶序列和与所述靶具有少少85％的同源性的其他序列。
20.权利要求4-19中任一项的方法，包括使用共有引物对和捕获分子，所述共有引物对能够扩增同源性大于60％、优选大于90％的至少两种靶序列，所述捕获分子能够检测两种靶序列中的一种。
21.权利要求4-20中任一项的方法，其中在所述扩增子于溶液中的浓度小于10nM，优选小于1nM，更优选小于0.1nM及更加优选小于0.01nM时予以检测。
22.权利要求4-21中任一项的方法，其中随着在系列PCR循环过程中产生所述扩增子而实时予以检测。
23.在检测扩增子的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求3的捕获分子。
24.权利要求23的试剂盒，还包含用于固定捕获分子的固体支持物，预处理所述固体支持物以使其与捕获分子的间隔区部分反应。
25.权利要求23的试剂盒，还包含固定有捕获分子的固体支持物。
26.权利要求23-25中任一项的试剂盒，还包含进行扩增子与捕获分子的杂交所必要的工具。
27.以上权利要求中任一项的试剂盒，还包含用于进行PCR的引物对和标记工具。
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