CN101505786A

CN101505786A - 涉及能量内稳态的新肽

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Publication number: CN101505786A
Application number: CNA2006800359751A
Authority: CN
Inventors: A·A·巴特勒; J·L·特里瓦斯基斯
Original assignee: Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Current assignee: Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2006-08-07
Publication date: 2009-08-12
Also published as: EP1928487A4; JP2009502208A; CA2618047A1; AU2006278406B2; RU2010119559A; US20130231280A1; CA2618047C; AU2010202600A1; US20100299769A1; IL189065A0; US8518892B2; WO2007019426A3; RU2409590C2; IL207764A0; US20090253619A1; AU2006278406A1; WO2007019426A2; US20160102126A1; KR101004662B1; EP1928487A2

Abstract

编码推测的76个氨基酸的分泌性蛋白质(“Swir1”)mRNA的表达被发现与空腹甘油三酯和胆固醇水平呈负相关。在两种肥胖症的小鼠模型(KK－Ay和Lepob/Lepob小鼠)中，应用重组腺病毒来增加Swir1 mRNA的表达。在两种模型中通过注射腺病毒过表达Swir1显著地并且可重复地降低空腹甘油三酯和胆固醇水平。此外，制备了过表达Swir1蛋白的转基因小鼠品系。而且，在Lepob/Lepob小鼠中通过SWIR1腺病毒治疗降低了涉及脂肪形成的关键基因(脂肪酸合酶)的表达和FAS蛋白水平。全长的SWIR1肽或其肽衍生物、同源物、类似物或模拟物，通过口服、注射、皮下贴剂或鼻内途径给药，可作为高胆固醇血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病和/或能量失衡的治疗或诊断试剂应用。

Description

涉及能量内稳态的新肽

在所有国家适用的合约和协定下要求享有于2005年8月5日提交的美国临时专利申请系列号60/705,940的优先权。在美国，根据35U.S.C.§119(e)，要求享有于2005年8月5日提交的临时专利申请系列号60/705,940的优先权。

技术领域

本发明涉及被命名为“受到胰岛素抵抗1抑制”(suppressed withinsulin resistance 1)(Swir1)的新基因和产生的蛋白质，其被发现涉及肥胖症与胰岛素抵抗和脂血症的联合症以及能量内稳态的改变。

技术背景

肥胖症是日益流行的全球性疾病并且已达到流行病的比例。目前的估算提示至少50％的西方人口超重或者肥胖。肥胖症，特别是腹部肥胖症，与其它情况例如胰岛素抵抗、血脂障碍、肝脂肪变性以及高血压结合，是众所周知的代谢的或胰岛素抵抗的综合征。与胰岛素抵抗和2型糖尿病相伴的血脂障碍的主要病理生理特征是在极低密度脂蛋白(VLDL)中血浆甘油三酯(TG)升高、以及高密度脂蛋白(HDL)胆固醇降低。通常，升高的循环甘油三酯(TG)被水解为游离脂酸(FFA)并被包括肝的周缘组织吸收，而且可能导致肝脂肪变性、或非酒精性脂肪肝。对肥胖症和代谢性疾病的几个突变小鼠模型的研究提示在胰岛素抵抗和失调的TG之间的联系是复杂的并且涉及周围的和中枢的因子。

胰岛素抵抗指的是在骨骼肌和脂肪中胰岛素刺激的葡萄糖吸收降低，以及肝葡萄糖输出抑制受到损害(2)。在2型糖尿病的病理生理中高血糖症和高血脂症既是副作用又是致病因素。由于抑制胰岛素作用和来自β细胞的分泌，葡萄糖毒性和脂毒性进一步促进胰岛素抵抗和2型糖尿病。高胰岛素血症起初在抑制肝葡萄糖输出中是成功的，然而胰岛素升高的有害作用抵消了与维持正常血糖水平相关的益处(2)。在一系列的代谢异常中，包括高血压、非酒精性脂肪肝(NAFLD)疾病和冠状动脉性心脏病(2)，高胰岛素血症被认为是一种影响因素。NAFLD疾病通常是与胰岛素抵抗相伴，并需要两种转录因子：甾醇调节因子结合蛋白-Ic(SREBPIc)和过氧化物酶体增殖子受体-γ(PPARγ)(3-6)。肝中缺乏SREBPIc或PPARγ信号时抑制发生于肥胖的胰岛素抵抗小鼠中的肝脂肪变性的发展(5-7)。

定义解释胰岛素抗性的共同机制一直是困难的，这是由于胰岛素受体(IR)信号系统的复杂性，以及认识到不是一种而是多种因子促成该机能紊乱的发生。在胰岛素刺激的葡萄糖吸收中两种衔接蛋白质IRS1和IRS2的酪氨酸磷酸化是关键的早期步骤(8-11)。IRS1和IRS2没有内在的酶活性，并且认为它们是作为分子骨架的一部分，其通过促进具有激酶、磷酸酶或泛素连接酶功能的蛋白质形成复合体而发挥作用。在胰岛素刺激的葡萄糖吸收中，通过与IRS的作用刺激磷酸肌醇3’激酶(PI3K)是关键的步骤。PI3K的p110催化亚基的活化激活脂肪激酶结构域，其磷酸化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸。虽然还可能有其它的途径参与，对于胰岛素对葡萄糖吸收的完全刺激作用，PI3K的活化是必需的(12)。

胰岛素抵抗的发展的代谢状态据认为是由伴随氧化代谢的热量吸收的不平衡引起(13，14)。研究提示在与肥胖症相关的胰岛素抵抗的发展中肌肉中线粒体的功能下降是一个因素(14，15)。在肥胖症和2型糖尿病的小鼠模型中，能量消耗的刺激和食欲的抑制都导致葡萄糖代谢的改善。其已经良好表征的实例是脂肪细胞因子瘦蛋白(leptin)。瘦蛋白作用于下丘脑和后脑抑制食欲，并通过刺激自主神经系统，增强骨骼肌内的氧化代谢(16-20)。然而，瘦蛋白也能不依赖于对食物摄取或者体重的显著影响改善肝胰岛素敏感度(17)。

输注脂肪酸(FA)与肌肉中胰岛素敏感性在4-6小时内快速降低相关(21-23)。脂肪酸降低胰岛素刺激的葡萄糖吸收的确切机制仍然存在争论。最近的资料提示脂肪酸干扰IR信号转导途径，该途径刺激葡萄糖的吸收(21，22，24)。一种假说是细胞内脂肪酸和二酰基甘油的浓度升高导致丝氨酸激酶，蛋白质激酶Cθ(PKCθ)的活化(25)。PKCθ对IRSl Ser³⁰⁷位的磷酸化抑制IR对IRS-1的磷酸化，导致降低PI3K活性以及降低胰岛素对葡萄糖吸收的刺激。

分泌性多肽的异常活性作为肥胖症与胰岛素抵抗之间的联系：联系肥胖症与胰岛素抵抗的决定性机制对开发新的降低葡萄糖的治疗方法是重要的。最近对胰岛素抵抗的研究已经聚焦于脂肪细胞。肥胖症是与脂肪细胞分泌的多肽(脂肪细胞因子)的调控网络的异常调节和功能相关。脂肪细胞因子例如瘦蛋白、脂连蛋白和抵抗素调控肝葡萄糖生成、肌肉中葡萄糖处理和脂肪细胞中脂类的增加和存储(26)。瘦蛋白通过影响位于下丘脑和后脑(其调控摄食行为、自主神经活动和控制代谢的神经内分泌系统(甲状腺、肾上腺))的神经元调控能量内稳态(16)。瘦蛋白抵抗或者与肥胖相关的血清脂连蛋白降低，通过降低胰岛素增敏作用和升高发生脂肪变性(细胞内脂肪酸堆积)的危险(27，28)，构成促进胰岛素抵抗的因素。非脂肪组织也分泌影响能量代谢和胰岛素敏感性的肽，例如肌肉来源的肌肉素(musclin)(29)和肝来源的血管生成素相关生长因子(30)。这些因子也可能是治疗代谢综合征的靶标。

黑皮质素受体敲除用于研究肥胖症和胰岛素抵抗之间的联系：在中枢神经系统区域表达的两种黑皮质素受体涉及能量内稳态。打靶删除小鼠(MC4R)基因(Mc4r-/-或Mc4rKO小鼠)中神经元的黑皮质素-4受体导致肥胖症和高胰岛素血症，并且与肝脂肪生成基因表达和肝脂肪变性相关。缺乏另一种神经元的黑皮质素受体的小鼠(Mc3r-/-或Mc3rKO小鼠)当饲喂高脂膳食时发生肥胖症，达到与Mc4r-/-小鼠类似的程度，但不表现出同样水平的胰岛素抵抗、高脂血症和肝脂肪变性升高。用Mc3rKO和Mc4rKO品系研究已经显示二者都展示出严重的膳食诱导肥胖症，然而Mc4rKO中胰岛素敏感性的恶化更快和更严重(31，32)。图1A-1E显示以体重作为低脂膳食或者高脂膳食的函数的方式，在野生型小鼠(C57BL/6J)和两种敲除小鼠中的一些已知的差别(31，32)。在小鼠和人类中严重的胰岛素抵抗与肝肿大和伴随肝脂肪形成增加的脂肪变性相关(33)。Mc4rKO在肥胖状态下发生肝胰岛素抵抗和肝肿大，并在高脂膳食(HFD)时表现出与严重的葡萄糖和胰岛素不耐受相关的葡萄糖自身稳定的显著恶化。图2A-2E显示在两种小鼠品系中肝肿大和脂肪变性的差异，以及在涉及脂代谢的基因表达中的差异(4，17，57)。另一方面，与Mc4rKO脂肪量(FM)匹配的Mc3rKO表现出葡萄糖自身稳定的非常轻微的损害。

与SWIR1序列类似的cDNA序列。参与cDNA大规模测序的几个团体先前已经发表了编码与SWIR1序列同源的推测蛋白质的cDNA的序列和推测的开放阅读框。参见R.L.Stausberg等“超过15000个全长人和小鼠cDNA序列的产生和初步分析”，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，99卷，16899-16903页(2002)(基因库登录号：BC021944，具有完整编码序列的cDNA)；以及H.F.Clark等，“分泌性蛋白质的主动发现(SPDI)，新的人分泌性和跨膜的蛋白质的大规模鉴定：生物信息学评估”，Genome Res.，13卷，2265-2270页(基因库登录号：NM_198573，具有完整编码序列的cDNA)”。与SEQ ID NO：2的起始37个氨基酸残基具有类似同源性的蛋白质已经被鉴定。然而，由于在cDNA测序中单个核苷酸的错误，上述蛋白质的核苷酸和氨基酸序列可能是不正确的。在此对该蛋白质先前未发表的功能予以描述。

发明内容

基于两种肥胖症转基因小鼠模型的研究，我们已经发现了新的分泌肽(Swir1)。应用微列阵基因表达分析和实时定量PCR鉴定，发现在严重的胰岛素抵抗和葡萄糖不耐受的Mc4rKO和缺乏瘦蛋白的(Lep^ob/Lep^ob)小鼠中，编码推测的76个氨基酸的mRNA(基因库登录号：AK009710)的表达，分泌的蛋白质减少10倍。相反，在中等程度的葡萄糖不耐受、但对胰岛素表现正常反应的肥胖症Mc3rKO小鼠中，发现在Swir1蛋白的表达中有中等程度30-40％的减少。在C57BL/6J小鼠中，发现Swir1 mRNA在肝中的表达与空腹葡萄糖水平之间存在负相关。与肥胖症和胰岛素抵抗相伴，在下丘脑中Swir1的表达下降。我们还证明了该mRNA编码分泌性蛋白质。基于在肝和脑中膳食诱导的肥胖症和胰岛素抵抗对Swir1 mRNA表达的负效应，编码该蛋白质的基因被命名为“Swir1”(“受到胰岛素抵抗1抑制”)。在肥胖症小鼠模型中，使用重组的腺病毒增加Swir1的表达。通过注射腺病毒过表达Swir1显著并可重复地减少空腹胰岛素、甘油三酯和胆固醇水平。此外，在Lep^ob/Lep^ob小鼠中通过Swir1腺病毒处理，减少涉及脂肪生成的关键基因的表达(脂肪酸合酶)和FAS蛋白水平。

应用由在所有组织中表达的人β-肌动蛋白启动子调控的Swir1 DNA(SEQ ID NO：1)，制造了过表达Swir1蛋白的小鼠转基因FVB/NJ品系。过表达Swir1的雌性FVB/NJ小鼠在脂肪量方面有显著减少，以及应用间接热量计(Oxymax，Columbus Instruments，哥伦布，俄亥俄)通过测定氧的消耗(VO2)测得更高的代谢率。基于注射表达Swir1的重组腺病毒的小鼠试验结果，已经预言了在转基因小鼠中观察到的代谢率的升高。感染了表达Swir1的重组腺病毒的小鼠在过夜禁食期间体重减轻更多，提示禁食期间补偿降低的代谢率的能力受损。FVB/NJ Swir1转基因小鼠在禁食期间显示了同样严重的体重减轻，伴随着更高的代谢率。因此，Swir1的抗糖尿病作用组分可能参与激活涉及氧化代谢的途径。即Swir1可能部分通过使热量(KJ)的消耗与卡路里消耗的平衡正常化(通过身体活动、基础代谢率、或者二者结合的效应)，改善肥胖症、胰岛素抵抗个体的代谢谱。

全长Swir1肽，或者其肽片段、衍生物、同源物、类似物、或者其模拟物，通过口服、注射、皮下贴剂或鼻内的途径给药，可以被用作高胆固醇血症、高甘油三脂血症、胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病和/或能量失衡紊乱的治疗剂或诊断剂。

针对衍生自BC021944预测的开放阅读框架的肽段而制备抗体(AB1(SEQ ID NO：8)和AB2(SED ID NO：9))，如图5所示。应用这些抗体证明在人血清和大鼠脑中存在Swir1-免疫活性，强烈支持预测的BC021944的开放阅读框架编码小分泌肽的结论。在人血浆中检测了Swir1-免疫反应性(数据未显示)。在大鼠脑中，在下丘脑的弓状核中鉴定出神经元具有Swir1-免疫反应性。这个观察的重要性是在下丘脑的弓状核中的神经元通过对兼性生热作用和体力活动两者的影响、和对葡萄糖自身稳定的影响已经涉及了能量消耗的调控。[Cone RD.中枢黑皮质素系统的解剖学和调控。NatNeurosci.200 5May；8(5)：571-8；Coppari R，Ichinose M，Lee CE，Pullen AE，Kenny CD，McGovern RA，Tang V，Liu SM，Ludwig T，Chua SC Jr，Lowell BB，Elmquist JK.下丘脑的弓状核：调节瘦蛋白对葡萄糖自身稳定和活动能力影响的关键部位。Cell Metab.2005 Jan；1(1)：63-72.]。因此，该FVB/NJ Swir1转基因小鼠的增加的能量消耗和体力活动可能涉及中枢神经系统中的活动，并且更具体的是通过基于下丘脑的弓状核中神经元的调控活性发挥作用。

附图简述

图1A显示在野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)三种不同的品系中，在饲喂低脂膳食(LF)或高脂膳食12周之后，6月龄雌性小鼠的体重差异。(膳食的显著性作用以“＊”(p<0.001)或者“#”(p<0.05)表示；膳食内部的显著性作用以字母表示，组间显著性差异(p<0.05)以不同字母表示；显著性基于双因素方差分析(2-wayAVOVA))。

图1B显示在野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)三种不同的品系中，在6月龄雌性小鼠中经12周饲喂低脂膳食(LF)或者高脂膳食后，以初始体重的百分比表示的体重增加的差异。(膳食的显著性作用以“＊”(p<0.001)或者“#”(p<0.05)表示)；膳食内部的显著性作用以字母表示，组间显著性差异(p<0.05)以不同字母表示；显著性基于双因素方差分析)。

图1C显示在野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)三种不同的品系中，在6月龄雌性小鼠中经12周饲喂低脂膳食(LF)或者高脂膳食后，体脂肪百分比的差异。(膳食的显著性作用以“＊”(p<0.001)或者“#”(p<0.05)表示)；膳食内部的显著性作用以字母表示，组间显著性差异(p<0.05)以不同字母表示；显著性基于双因素方差分析)。

图1D显示在野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)三种不同的品系中，在6月龄雌性小鼠中经12周低脂膳食(LF)或者高脂膳食饲喂后，脂肪量的差异。(膳食的显著性作用以“＊”(p<0.001)或者“#”(p<0.05)表示)；膳食内部的显著性作用以字母表示，组间显著性差异(p<0.05)以不同字母表示；显著性基于双因素方差分析)。

图1E显示在野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)三种不同的品系中，在6月龄雌性小鼠中经12周饲喂低脂膳食(LF)或者高脂膳食后，无脂肪体重的差异。(膳食的显著性作用以“＊”(p<0.001)或者“#”(p<0.05)表示)；膳食内部的显著性作用以字母表示，组间显著性差异(p<0.05)以不同字母表示；显著性基于双因素方差分析)。

图2A显示肝组织的比较，如在苏木精和伊红染色的肝横切面中所示，其来源于三种小鼠品系，野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)中饲喂高脂膳食的雌性小鼠。

图2B显示在三种小鼠品系，野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)中，在饲喂低和高脂膳食的小鼠中作为肥胖症(体脂肪百分比)函数的肝重量的差异。

图2C显示在三种小鼠品系，野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)中，饲喂中等高脂肪膳食的雄性和雌性小鼠平均肝重量(n＝5-6/组)的差异。(“＊”表示p<0.05，对于野生型和Mc3rK0小鼠)。

图2D显示在三种小鼠品系，野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)中，饲喂高脂膳食的小鼠肝中硬脂酰-辅酶A去饱和酶1(SCD1)表达的差异。数据以任意单位(a.u.)表示。(“＊”表示p<0.05，对于野生型和Mc3rK0小鼠)。

图2E显示在三种小鼠品系，野生型(WT)、Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)和Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)饲喂高脂膳食的小鼠肝中载脂蛋白A4(ApoA4)表达的差异。(对于野生型和Mc3rK0小鼠，“＊”表示p<0.05；对野生型小鼠，在同性别内，“#”表示p<0.05)。

图3A显示在野生型(WT)小鼠和肥胖症Mc3r-/-缺陷小鼠(Mc3rKO)中肝AK009710 mRNA表达(以野生型表达的百分比给出)的量。

图3B显示在野生型小鼠(WT)、Mc4r-/-缺陷小鼠(Mc4rKO)和瘦蛋白缺陷的Lep^ob/Lep^ob小鼠(肥胖症的两个模型)中肝AK009710mRNA表达(以野生型表达的百分比给出)的量。

图3C显示用盐水或瘦蛋白(0.5mg/g)注射4次(超过2天)的瘦蛋白缺陷的Lep^ob/Lep^ob小鼠中肝AK009710 mRNA表达(以与用盐水时表达的百分比给出)的量。

图4显示Swir1基因(BC021944；SEQ ID NO：1)的mRNA序列，其具有编码Swir1蛋白(带下划线)的开放阅读框架，以及显示其推测的氨基酸翻译产物Swir1(SEQ ID NO：2)。

图5显示小鼠(SEQ ID NO：2)、人(SEQ ID NO：14)、大鼠(SEQ ID NO：12)、狗(SEQ ID NO：15)、猪(SEQ ID NO：16)、母牛(SEQ ID NO：17)、绵羊(SEQ ID NO：18)以及猩猩(SEQ ID NO：13)的推测的Swir1蛋白序列的比对，显示用于产生多克隆抗体(pAB1(SEQ ID NO：8)和pAB2(SEQ IDNO：9))的推测的分泌性多肽的区域。

图6A显示用编码Swir1蛋白的AK009710DNA序列的放射性标记部分对人组织样本的RNA印迹分析结果(1-8道分别表示来源于心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾和胰腺的RNA)。

图6B显示从用全长的小鼠AK009710 DNA探针对小鼠组织样本进行RNA印迹分析得到的Swir1mRNA带的相对强度。

图6C显示在从转染pCMV-Swir1:FLAG、pCMV-GFP的人肾衍生的HEK293细胞来源的培养基(M)和细胞裂解液(Pel)中，或者从感染表达Swir1:Flag融合蛋白的腺病毒载体的HEK293细胞来源的培养基中对FLAG的免疫反应性进行蛋白质印迹分析的结果。[未转染的DNA(第1、2道)；转染pCMV-Swir1:FLAG构建体(第3、4道)；转染pCMV-Swir1(第5、6道)；或转染pCMV-GFP(第7、8道)；感染Ad5Swir1:FLAG(第9道)；感染Ad5Swir1(第10道)；或感染Ad5GFP(第11道)]。为了使Swir1蛋白显影，制备了具有C-末端FLAG-表位标签的融合蛋白。

图6D显示对来源于测定前4天注射Ad5-Swir1:FLAG的Mc4r-/-小鼠的多种组织(肝、肌肉和脑)、连同阳性的(感染Ad5-Swir1:FLAG的HEK293细胞)和阴性的(来源于未注射的Mc4r-/-小鼠)对照的组织Swir1的蛋白质印迹分析结果。

图7A显示用来源于感染重组的Ad5Swir1(天然蛋白质)或Ad5Swir1:FLAG(C-末端带FLAG标签的融合蛋白)的HEK293细胞的裂解液在与抗Swir1的N-端(如图5所示)的多克隆抗体(pAB1)孵育后蛋白质印迹分析的结果。

图7B显示用来源于感染了重组的Ad5Swir1(天然蛋白质)或Ad5Swir1:FLAG(C-末端带FLAG标签的融合蛋白)的HEK293细胞的裂解液在与抗Swir1的C-端(如图5所示)的多克隆抗体(pAB2，SEQ ID No：9)孵育后，蛋白质印迹分析的结果。

图7C显示将Ad5Swir1或Ad5-GFP注射入多个品系小鼠的尾静脉以测试Swir1处理对小鼠代谢的影响的处理方案(结果列于表1)。

图8A显示用Ad5-Swir1或Ad5-GFP注射后8天的肥胖的瘦蛋白缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠肝脏中的脂肪酸合酶(Fasn)mRNA的表达水平。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。

图8B显示硬脂酰-辅酶A去饱和酶(Scd1)蛋白在肝中的表达水平，该肝来源于Ad5-Swir1或Ad5-GFP注射8天后的肥胖的瘦蛋白的缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。

图8C显示乙酰辅酶A羧化酶(Acc)mRNA在肝中的表达水平，该肝来源于在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP后8天的肥胖的瘦蛋白缺陷的(Lep^ob/Lep^ob)小鼠。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。

图8D显示涉及胰岛素抵抗(细胞因子信号的抑制因子)的基因在肝中的表达水平，该肝来源于在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP后8天的肥胖的瘦蛋白缺陷的(Lep^ob/Lep^ob)小鼠。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。

图9A显示用于产生过表达Swir1的转基因小鼠的转基因(BAP-Swir1)构建体。

图9B显示FVB/NJ建立者(founder)来源的转基因小鼠幼仔(用图9A的转基因产生)在第5周时肝中Swir1的表达量。

图9C显示FVB/NJ建立者来源的转基因小鼠幼仔(用图9A的转基因产生)在第9周时血清的空腹甘油三酯(TG)。

图9D显示FVB/NJ建立者来源的转基因小鼠幼仔(用图9A的转基因产生)在第5和9周时，与对照相比，通过测定体脂肪百分比(％体脂肪；左图)和脂肪量(显示游离脂肪量(FFM)和脂肪量(FM)；右图)得到的机体组成。

图9E显示FVB/NJ建立者来源的转基因小鼠幼仔(用图9A的转基因产生)在60％高脂肪膳食饲喂7天后的脂肪量(显示游离脂肪量(FFM)和脂肪量(FM))的变化。

图10显示PCR筛选BAP-Swir1整合入C57BL/6J幼仔(来源于注射入BAP-Swir1的C57BL/6J卵母细胞)的基因组得到的结果，显示23只幼仔中的6只幼仔带有整合所转基因的基因组。

图11A显示在应用分泌性蛋白质Swir1(Swir1^34-76；SEQ ID NO：10)后15分钟，在3T3-L1脂肪细胞中Erk磷酸化升高。

图11B显示在应用分泌性蛋白质Swir1(Swir1^34-76；SEQ ID NO：10)后15分钟，在HepG2肝细胞中Erk磷酸化升高。

图12A显示在从三种品系(C57BL/6J(野生型)、Mc3rKO(Mc3r)或Mc4rKO(Mc4r)，以两种膳食(LF＝10％kJ/脂肪；HF＝60％kJ/脂肪)之一饲喂三个月)来源的六月龄小鼠下丘脑Swir1mRNA表达与体重之间的联系。

图12B显示在从三种品系(C57BL/6J(野生型)、Mc3rKO(Mc3r)或Mc4rKO(Mc4r)，以两种膳食(LF＝10％kJ/脂肪；HF＝60％kJ/脂肪)之一饲喂三个月)来源的六月龄小鼠下丘脑Swir1mRNA表达与HOMA-IR[(空腹胰岛素×葡萄糖)/22.5]之间的联系。

图12C显示在三种品系(C57BL/6J(野生型)、Mc3rKO(Mc3r)或Mc4rKO(Mc4r)，以两种膳食(LF＝10％kJ/脂肪；HF＝60％kJ/脂肪)之一饲喂三个月)来源的六月龄小鼠中HOMA-IR[(空腹胰岛素×葡萄糖)/22.5]与下丘脑Socs3(细胞因子信号3的抑制因子)mRNA表达之间的联系。

图13A显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过3天的体力活动(按脑电活动图中断(beam breaks)/10分钟测量)。

图13B显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过24小时期间在黑暗期和光照期的体力活动(按脑电活动图中断平均数/10分钟测量)。

图13C显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过24小时期间在黑暗期和光照期的全部体脂肪氧化(RER)。

图13D显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过24小时期间在黑暗期和光照期的代谢率(按V02(ml/h×10³)测量)。

图13E显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过24小时期间在黑暗期和光照期的代谢率作为游离脂肪量函数(按VO2(ml/h/gFFM×10³)测量)。

图13F显示在野生型(WT)和BAP-Swir1转基因小鼠(FVB.Tg)中超过24小时期间在黑暗期和光照期的代谢率作为体重函数(按VO2(ml/h/gBW×10³)测量)。

本发明公开新的分泌性蛋白质(Swir1)并且鉴定了它的一些功能。该蛋白质被发现在多种哺乳动物物种之间高度保守，以及该序列显示于SEQ IDNO：2和12-18之中。此外使用编码该蛋白质的核苷酸制备过表达Swir1蛋白的小鼠，其或者通过表达Swir1的重组的腺病毒感染或者使用由肌动蛋白启动子调控的Swir1 DNA制备转基因品系。

在一个实施方案中，该Swir1蛋白、片段、衍生物或类似物在治疗上被用于预防与体重增加相关的病理生理，例如肥胖症、高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高脂血症以及非胰岛素依赖2型糖尿病。

在另一个实施方案中，该纯化的Swir1蛋白、片段、衍生物或类似物是从多种哺乳动物中分离或通过合成制造或者通过应用编码至少20个源自SEQ ID NO：1中的开放阅读框架的氨基酸表达该蛋白质、片段、衍生物或类似物的细胞培养物制造，并且如图4所示。

在另一个实施方案中，制备该Swir1蛋白、它的片段、衍生物或类似物的抗体。这些抗体可被用于试剂盒中以鉴定来自多种样本包括体液的Swir1蛋白。

在另一个实施方案中，通过连接该Swir1序列至有活性启动子，例如肌动蛋白启动子，制备过表达该Swir1蛋白的转基因动物。

在另一个实施方案中，制备包含至少SEQ ID NO：1(在图4中下划线部分)的开放阅读框架的转化载体。

实施例

实施例1

Swir1蛋白及其功能的发现

使用来自16,463-18,400的70-个(mer)寡核苷酸(Mouse Array-ReadyOligo Set Version 2.0，Qiagen Operon，Alameda，加拿大)的文库印迹的微列阵，对瘦的和肥胖的Mc3rKO小鼠中肝基因表达进行基因微列阵分析(34-36)。该基因微列阵数据表明涉及脂代谢(载脂蛋白)和肥胖症续发的氧化应激的基因表达升高。有趣的是，与年龄、性别和肥胖症无关，在Mc3rKO小鼠的肝中仅仅三个基因的表达降低。两个基因编码已知功能的蛋白质：神经氨(糖)酸苷酶3(neu3)，其编码从糖蛋白和糖脂中剪切唾液酸的酶，以及溶质载体家族21(slc21a1)，其编码有机阴离子运载体。第三个基因(AK009710)是新的并且在数据库中尚无确定的功能。

实时定量PCR确认了基因微列阵数据，显示在Mc3rKO肝中AK009710的表达中度降低(图3A)。引起兴趣的是，在严重的胰岛素抵抗Mc4rKO和瘦蛋白缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠的肝中观察到AK009710的表达更剧烈的降低(图3B)。此外，用瘦蛋白短期治疗(超过2天4次注射0.5mg/g瘦蛋白)，Lep^ob/Lep^ob小鼠肝中Swir1显著升高(图3C)。在6周龄的瘦的Mc4rKO中AK009710的表达是正常的(数据未给出)，表明Mc4rKO在肝中表达的下降是续发于年龄相关的肥胖症发病、胰岛素抵抗和肝脂肪变性(32)。而且，在膳食诱导的肥胖症C57BL/6J小鼠中AK009710的表达与空腹葡萄糖呈负相关(n＝13，R²＝0.67，P<0.001)(数据未显示)。

总的说来，这些结果表明鉴定了小的分泌性蛋白质，其在肝中的表达随胰岛素敏感性和肝脂肪变性而下降。基于所观察到的肝中AK009710的表达与肝脂肪变性和胰岛素抵抗的严重程度相关，并且这种下降被胰岛素增敏剂逆转，故选择将其命名为“受到胰岛素抵抗1抑制”(Swir1)。

使用靶向AK009710mRNA的寡核苷酸引物用于测定来自肥胖症和胰岛素抵抗的多种小鼠模型的肝脏cDNA中AK009710基因的表达。引物序列是：正义引物5′-cctgagggtgctgtctgtcatg-3′(SEQ ID NO：3)、反义引物5′-cagtagcagcaagaagcctacg-3′(SEQ ID NO：4)、探针5′-6FAM-ctctcatcgccatcgtctgca-BHQ-3′(SEQ ID NO：5)。与野生型小鼠比较，与最初的基因微列阵结果一致，在Mc3r-/-小鼠肝中AK009710 mRNA下调(以55％，p<0.05；图3A)。接下来在两种其它肥胖症模型：Mc4r-/-小鼠和瘦蛋白缺陷Lep^ob/Lep^ob小鼠中检测AK009710肝脏mRNA的表达。与野生型小鼠(WT)比较，在这两种模型中AK009710 mRNA都以大约低10倍的水平表达(图3B)。当所有的动物归类在一起时，观察到在AK009710mRNA表达与葡萄糖和胰岛素数值之间呈负相关(数据未显示)。在不限制饲喂、禁食16小时或禁食24小时并再饲喂4小时的年幼的和年老的野生型小鼠肝脏中，AK009710基因表达没有改变(数据未显示)。一般相信AK009710不被营养状况改变。

为了测定是否胰岛素抵抗的发展继发的调节AK009710 mRNA，对年幼的、血胰岛素正常的(normoinsulinemic)和更老的胰岛机能亢进的Mc4r-/-小鼠的AK009710 mRNA进行测定。观测到在年幼的Mc4r-/-小鼠(平均～7周龄)中AK009710 mRNA与野生型小鼠的类似，然而在更老的(～16周)Mc4r-/-小鼠中其显著降低(数据未显示)。此外，还在少量(n＝4)的来自糖尿病和非糖尿病受试者的人衍生肝细胞中测定了AK009710mRNA。虽然在糖尿病样本中该表达倾向于更低，但在统计上没有显著性差异(数据未显示)。

因此，虽然Mc3r-/-和Mc4r-/-小鼠的肥胖症是类似的，已知Mc4r-/-小鼠胰岛素抵抗和血清脂类(甘油三酯、胆固醇)升高严重得多。在Mc4r-/-小鼠中肝中AK009710基因表达降低与已知的胰岛素抵抗和高脂血症严重程度相关。

实施例2

序列和生物信息学分析

AK009710是长度为1247bp的小鼠舌cDNA克隆，并属于Unigene簇Mm.34074，2310040A07Rik：RIKEN cDNA 2310040A07基因。假设从紧邻该序列的5’末端其可编码534个氨基酸的蛋白质。设定这种推测的蛋白质不是从甲硫氨酸残基起始，其被以截短的产物列出。在NCBI数据库中对同源的EST或cDNA序列进行BLAST分析，显示与NM198573显著匹配；NM198573是通过大规模分泌性蛋白质发现初步发现的人转录本，其编码假想的87个氨基酸的蛋白质(UNQ470/GAAI470)(37)。与人序列-NM_198573的匹配性是在跨392个核苷酸的范围内具有85％的同一性，p＝5e^-83。该人序列在一个外显子中编码87个氨基酸。在六个框架中进行的AK009710翻译显示其具有编码76个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)的开放阅读框架。在这个由NM_198573(GAAI470、或UNQ470)编码的推测的小鼠蛋白质和人蛋白质之间的比对，显示在最前面37个残基具有高同源性。UNQ470/GAAI470定位于染色体图谱9p13.2.并与纤毛神经营养因子受体(CNTFR)基因相邻。

使用从小鼠肝分离的cDNA证实AK009710的序列。而且，通过国立卫生研究院哺乳动物基因采集(MGC)方案从小鼠肝克隆868bp cDNA，登录号为BC021944，最近在NCBI数据库上发布，与我们的测序数据一致。(图4，SEQ ID NO：1)BLAST分析显示预测的小鼠76个氨基酸序列(SEQID NO：2)在多种哺乳动物品系(图5；SEQ ID NO：12(大鼠)；SEQ IDNO：13(猩猩)；SEQ ID NO：14(人)；SEQ ID NO：15(狗)；SEQ ID NO：16(猪)；SEQ ID NO：17(母牛)；SEQ ID NO：18(绵羊))中高度保守。在图5中，pAB1(SEQ ID NO：8)和pAB2(SEQ ID NO：9)指的是用于产生多克隆抗体的推测的分泌多肽的区域。预测的信号序列带有下划线。此外合成相应于该小鼠蛋白质SEQ ID NO：2的氨基酸34至76(Swir1^34-76；SEQ ID NO：10)，以及相应于氨基酸39至76(Swir1^39-76；SEQ ID NO：11)的肽段。

对来自AK009710的推测的小鼠序列和人GAAI470进一步的分析显示在基因库中该人类序列中存在单核苷酸缺口。因此，小鼠AK009710PCR产物被克隆并双向测序以确证该序列(小鼠或者人的)是正确的。AK009710小鼠克隆的已验证序列显示其具有76个氨基酸的翻译产物(SEQ IDNO：2)(图4)。对可公开得到的人GAAI470Origene克隆进行分析并且显示不含有核苷酸缺口，表明在基因库上NM_198573序列有测序错误。对从包括人的不同物种来源的AK009710序列的比对显示在大鼠、人、小鼠和黑猩猩的序列之间在蛋白质水平上有100％的同源性(图5)。

生物信息学分析显示该蛋白质极有可能是分泌性肽(87％的可能性，SignalP3.0)，最可能的切割位点在33位和34位之间。该人序列含有1个可能的丝氨酸位点和1个可能的苏氨酸磷酸化位点，全部位于所预测的切割位点的3’端；还有6个可能的糖基化位点，也都位于切割位点的3’端。

实施例3

Swir1的组织分布

为了检测AK009710 mRNA的组织分布，用含有76个氨基酸的蛋白质SWIR1的210个核苷酸的序列和人多组织RNA印迹(BD生物科学，Palo Alto，加利福尼亚)进行RNA印迹。如图6所见，仅在人脑和肝脏样本中检测到～1.35kb的单一条带，在肝中检测到最高水平表达。然而，如图6B所见，在小鼠肝、脑和肌肉中发现了Swir1。

实施例4

证明Swir1是分泌性多肽

生物信息学分析预言存在推测的信号序列，提示AK009710是分泌性肽。为了对此进行测试，应用带有限制性酶切位点Not1(5′-ggggcggccgcaccatgggggcagccatctcccaa-3′(SEQ ID NO：6))和Xho1(5′-gggctcgagggccagagcccttcagggctgcag-3′(SEQ ID NO：7))的引物，通过PCR从小鼠肝脏cDNA中扩增此编码76个氨基酸蛋白质的序列。该产物被连接到C-末端带有FLAG表位的pCMV-Tag1载体(pCMV-Swir1:FLAG)中，然后瞬时转染至HEK人肾衍生的细胞。该产物也被用于制备两个腺病毒构建体-一个有附带FLAG表位的Swir1(Ad-Swir1:FLAG)，和另一个没有FLAG表位(Ad-Swir1)的构建体。

用pCMV-Swir1或pCMV-Swir1:FLAG转染HEK293细胞。在16小时后收集培养基，免疫沉淀，然后在20％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用抗-FLAG抗体显影。用表达天然的或者带FLAG标签的Swir1的重组腺病毒(Ad5)重复这些试验。

当HEK293细胞是未转染的(第1、2道)，或用空载体(第5、6道)或包含GFP的载体(第7、8道)转染时，没有可见的FLAG-免疫反应条带(图6C)。然而，当pCMV-Swir1:FLAG构建体被转染进入HEK293细胞(第3、4道)，在培养基和细胞沉淀物中都检测到FLAG-阳性的免疫反应，表明至少某些转染的Swir1产物被细胞主动分泌到培养基中。在感染了Ad-Swir1:FLAG的HEK293细胞的培养基中观察到类似的结果(图8，第9道)。第10和11道显示在分别感染包含无FLAG表位或者带GFP的Swir1的细胞培养基中没有FLAG免疫反应。因此在转染了表达带表位标签的融合蛋白(pCMV-Swir1 FLAG)的表达载体的HEK-293细胞培养基中存在FLAG免疫反应，证明该76个氨基酸的蛋白质的未明确部分被分泌。

大多数注射入尾静脉的腺病毒感染肝脏(38)。为了测试腺病毒的尾静脉注射是否导致肝脏以及其它组织中Swir1 mRNA表达升高，三只Mc4r-/-小鼠被注射Ad5-Swir1:FLAG腺病毒并在四天后收集该组织。通过蛋白质印迹分析显示在肝脏、肌肉和脑组织中存在FLAG免疫反应，表明在这些组织中存在Swir1。(图6D)在感染Ad5-Swir1 FLAG的小鼠组织中Swir1FLAG免疫反应的分布与从肝脏分泌至循环系统的多肽一致。这两种测试都表明Swir1是分泌性蛋白质。

实施例5

用Ad5-Swir1:Mc4rKO治疗肥胖的胰岛素抵抗小鼠。

重组腺病毒载体介导的表达已经被用于研究肝脏代谢和胰岛素敏感性的调控(39-41)。构建表达76个氨基酸的蛋白质(Ad5-Swir1)、C末端带FLAG标签的融合蛋白(Ad5-Swir1:FLAG)或作为阴性对照的绿色荧光蛋白(Ad5-GFP)的三种重组腺病毒载体。应用抗-FLAG抗体证明了在尾静脉注射之后蛋白质的表达(图6D以及数据未显示)。用抗推测的分泌蛋白质的N-和C-末端区域的多克隆抗体(在图5中pAB1(SEQ ID NO：8)和pAB2(SEQ ID NO：9))证明在转染Ad5-Swir1的HEK293细胞中Swir1的合成(图7A，B)。

为了研究Swir1是否涉及葡萄糖的代谢，将Ad5-SWIR1或Ad5-GFP(5×10⁸pfu)注射入20周龄的雄性和雌性的Mc4r-/-小鼠的尾静脉(每组每种性别n＝3)。在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP之前，两组动物都按照体重、葡萄糖水平和葡萄糖耐量配对。在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP之前一周完成腹膜内的葡萄糖耐量试验(IPGTT)，并且观察到所有的小鼠是葡萄糖不耐受的。在禁食过夜后对小鼠进行葡萄糖耐量试验(IPGTT)，用1g葡萄糖/kg单次腹腔注射，并在多个时间间隔以动物尾血用血糖仪和试验带(精品血糖测量仪(Glucometer Elite)，贝尔公司(Bayer Corp.)，Elkhart，印地安那州)测量血糖，如W.Fan等所描述的，“中枢黑皮质素系统能直接调控血清胰岛素水平”，内分泌学，第141卷，页码：93072-3079(2000)。

将在100μl稀释剂(DMEM)中的5×10⁸pfu的Ad5-Swir1或Ad5-GFP注射入小鼠尾静脉。在整个4天的试验中，观察动物并每日称重。在第4天时给予动物另一次葡萄糖耐量试验(IPGTT)(0.4mg葡萄糖/g体重)。

在注射Ad5-Swir1四天后，如用IPGTT测定的，证明该小鼠葡萄糖耐量改善(数据未显示)。试验中体重、血糖或胆固醇水平没有改变。胰岛素和血清甘油三酯水平有下降趋势(表1)。

表1.腺病毒输注后4天Mc4r-/-小鼠的特性。

实施例6

用AdS-Swir1:B6Ay/a治疗肥胖的胰岛素抵抗小鼠

通过将Ad5-Swir1或Ad5-GFP注入一直维持很高的脂肪膳食达3个月的雄性C57BL6 Ay/a小鼠(每组n＝9)的尾静脉进行第二次的腺病毒试验。给予小鼠1周从注射中恢复，然后进行葡萄糖耐量试验(IPGTT)。然后再给予小鼠一周以恢复，并进行胰岛素耐量试验(ITT)。

在注射后20天观测到在体重(Ad5-Swir1小鼠为40.3±1.3g；Ad5-GFP小鼠为41.4±1.2g)、空腹胰岛素(Ad5-Swir1小鼠为0.97±0.2ng/mL；Ad5-GFP小鼠为1.13±0.2ng/mL)或空腹葡萄糖水平(Ad5-Swir1小鼠为126±7mg/dL；Ad5-GFP小鼠为139±8mg/dL)方面没有不同。在注射后7天进行的葡萄糖耐量试验(IPGTT)，在Ad5-Swir1组中在30分钟(p＝0.06)和45分钟(p＝0.15)时间点显示出葡萄糖耐量的中度改善。在注射后14天的血糖水平的变化存在组间的显著性差异，在Ad5-Swir1组中显著下降(数据未显示)。在注射后14天进行的胰岛素耐量试验(ITT)，显示在任意时间点胰岛素敏感性无显著性差异；然而Ki(按照在注射胰岛素后30分钟的葡萄糖扣除基线葡萄糖，除以30计算)存在显著性差异。

在注射后14天在这些小鼠中观察到更低的空腹血糖水平，在注射后21天时不明显。与在Mc4r-/-小鼠中的第一个腺病毒试验一致，在Ad5-Swir1组中血清甘油三酯有下降趋势(表2)。

实施例7

应用AdS-Swir1治疗肥胖的胰岛素抵抗小鼠：刺豚鼠(Agouti(KK-A^y))(遗传上的肥胖和高脂血症小鼠)

为了更具体的阐明腺病毒输注在血脂测量上的效应，进一步纯化该腺病毒构建体以除去任何污染的病毒颗粒和细胞碎片。然后通过应用Ad5-SWIR1或Ad5-GFP进行另一腺病毒试验。将Ad5-GFP注射入遗传上肥胖的和高脂血症的KK-A^y小鼠(每组n＝6只雌鼠)的尾静脉。在注射病毒后给小鼠进行5天IPGTT试验，然后在2天后禁食过夜之后将其处死。

IPGTT显示，与Ad5-GFP治疗比较通过Ad5-SWIR1治疗没有显著改善葡萄糖耐量。与Ad5-GFP对照比较，在Ad5-SWIR1组中观察到循环系统中的甘油三酯(达28％，p＝0.04)和胆固醇(达20％，p＝0.02)在统计学上显著降低(表1)。Ad5-SWIR1小鼠的肝重倾向于比Ad5-GFP对照更低(表2)。在Ad5-SWIR1和Ad5-GFP对照之间，体重和血清葡萄糖以及胰岛素水平没有显著性差异(表2)。

表3.用Ad5-Swir1或Ad5-GFP治疗8天的KK-A^y小鼠的特性

与Ad5-GFP治疗小鼠比较，KK-A^y Ad5-Swir1治疗小鼠的肝脏中Swir1 mRNA升高大约4倍(数据未显示)。

实施例8

用Ad5-Swir1治疗肥胖的胰岛素抵抗小鼠：Lep^ob/Lep^ob小鼠

为了证明腺病毒介导的Swir1过表达的降脂效应，进行了另一个试验，其中将Ad5-Swir1或Ad5-GFP注入Lep^ob/Lep^ob(OBOB)小鼠的尾静脉(每组n＝7-8雄鼠)，该小鼠为高脂血症、脂肪变性和胰岛素抵抗的另一种小鼠模型。被注射的小鼠未进行IPGTT，但监测了其体重的变化，并禁食过夜，然后注射，7天后将其处死。

在超过7天时间后，Ad5-GFP处理的小鼠体重增加约1g。然而，Ad5-Swir1处理阻抑了这些肥胖的小鼠重量增加(数据未显示)。组间平均体重在统计学上无差异，食物的摄取未测定。还观察到与KK-A^y小鼠(见以上实施例7)中所观察到的类似的表型改变。在Ad5-Swir1组中血清甘油三酯被降低40％(Ad5-GFP 63±6mg/dL(Ad5-GFP)；38±4mg/dL(Ad5-Swir1)，p＝0.006；表2)。在血清胆固醇水平中还观察到15％的降低(173±6mg/dL(Ad5-GFP)；146±8mg/dL(Ad5-Swir1)，p＝0.02；表2)。观察到肝脏重量的下降趋势，当以体重的百分比来表示时其无显著性意义(p＝0.12)。在Ad5-Swir1组中空腹葡萄糖和胰岛素水平的降低趋势未达统计学上的显著性。

在应用KK-A^y小鼠和Lep^ob/Lep^ob(OBOB)小鼠的试验中，腺病毒构建体的纯化以及更大样本量的使用，证明了与对照小鼠比较，Swir1过表达7-8天导致循环的甘油三酯和胆固醇水平降低(表2)。在先前的试验中，应用未纯化的腺病毒在更晚的时间点观察，发现了这些效应的趋势。在这些试验的Ad5-Swir1处理组中，肝中Swir1基因表达升高，而先前在较晚时间点的试验未检测到升高。不希望被这些理论所束缚，一般认为Swir1基因表达升高导致Swir1蛋白的循环水平升高。

实施例9

应用Ad5-Swir1治疗肥胖的胰岛素抵抗小鼠的结果摘要

简要地，将5×10⁹pfu的Ad5-Swir1或Ad5-GFP注入购于杰克森实验室的KK-A^y、B6 Ay/a或OBOB小鼠的尾静脉(Bar Harbor，缅因州)。该治疗方案，如图7C所示，是基于预试验，其证明了在此期间Ad5-Swir1:FLAG的峰值表达(数据未显示)。每日记录动物和食物的重量。感染Ad5-Swir1的小鼠在治疗期间体重与感染Ad5-GFP的对照比较没有显著不同(表2)。与Ad5-GFP处理的对照比较，在感染Ad5-Swir1的小鼠中Swir1mRNA升高4-5倍(数据未显示)。

在感染Ad5-Swir1的小鼠中肝的重量与脂类含量始终是减少的。在KK-A^y和OBOB小鼠中，观察到空腹甘油三酯和总胆固醇显著降低(≈40％)。在Ay/a小鼠中观察到降低更少。应用肥胖的OBOB、KK-A^y和Ay/a小鼠的多个试验数据进行综合数据分析，提示：在OBOB、KK-A^y和Ay/a小鼠中HOMA-IR[(空腹胰岛素×葡萄糖)/22.5]下降40％(表4)。在Ay/a小鼠中应用Ad5-Swir1空腹胰岛素水平显著降低(2.6±0.4相对3.9±0.3ng/ml，P<0.05)；血糖水平无差异(175±12相对162±11mg/dL)。

表4.HOMA-IR的综合数据分析，从感染Ad5-GFP或Ad5-Swir1的OBOB，KK-A^y和Ay/a小鼠，按空腹胰岛素乘以葡萄糖计算。

数据以对照组的％±SEM表示。

实施例10

Swir1过表达对涉及脂类生物合成的基因的影响

肝脂肪变性被脂肪细胞因子逆转至少部分归因于肝脂肪形成的抑制和脂肪酸氧化作用的刺激(42，43)。为了研究Swir1降低肝脂肪含量的机制，用定量RT-PCR测定涉及脂肪形成的基因的表达(图8A-8D)。在感染Ad5-Swir1的OBOB和KK-A^y小鼠肝中涉及脂肪形成的多个基因的表达同等降低40-50％。Swir1因此可以，至少部分的通过抑制肝的脂肪形成来降低肝脂肪含量。

与Ad5-GFP对照比较，观察到在Ad5-Swir1处理组中脂肪酸合酶(Fasn)mRNA显著降低(图8A，p＝0.02)，在蛋白质水平上也降低(数据未显示)。Fasn mRNA和蛋白质水平是应用实时定量PCR和蛋白质印迹法(蛋白质印迹)测定的，如D.C.Albarado等文中所述，“在黑皮质素-4受体敲除小鼠中营养摄入量与底物氧化的协同作用受到损害”，内分泌学，第145卷，页码：243-252(2004))。在Ad5-Swir1组中脂肪酸移位酶CD36的基因表达也显著升高(p＝0.02，数据未显示)。图8A显示肥胖的瘦蛋白缺陷(Lepob/Lepob)小鼠，在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP 8天后，其肝中脂肪酸合酶(Fasn)mRNA的表达水平。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。Swir1过表达导致Fasn降低。图8B显示肥胖的瘦蛋白缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠，在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP8天后，其肝中硬脂酰-辅酶A去饱和酶(Scd1)蛋白的表达水平。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。Swir1过表达再次导致Scd1降低。图8C显示肥胖的瘦蛋白缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠，在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP8天后，其肝中乙酰辅酶A羧化酶(Acc)mRNA的表达水平。数据以任意单位(AU)表示(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。有Swir1的小鼠再次显示更低水平的肝Acc。图8D显示肥胖的瘦蛋白缺陷(Lep^ob/Lep^ob)小鼠，在注射Ad5-Swir1或Ad5-GFP8天后，其肝中涉及胰岛素抵抗(细胞因子信号3的抑制因子或Socs3)的基因表达水平。(n＝6-8/组；“＊”p<0.05)。Swir1的存在再次降低Socs3的基因表达。

实施例11

Swir1(BAP-Swir1)的转基因过表达

应用构建体(BAP-Swir1)，其含有人β-肌动蛋白启动子、合成的外显子1和内含子以及编码Swir1蛋白76个氨基酸的开放阅读框架(图9A；参见图4，该开放阅读框架带下划线)，制备过表达Swir1的转基因品系。得到8个建立者(2个FVB/NJ、6个C57BL/6J)，其中该FVB品系之一为[FVB/NJ.Tg-(BAP-Swir1)AAB20]，此后称之为FVB.Tg，在5-6周龄表现出肝Swir1表达升高(图9B)。图10显示在第一轮注射BAP-Swir1进入C57BL/6J卵母细胞中PCR筛选幼仔的结果，显示具有整合到基因组中的转基因的6个幼仔(6、8、14、19、21和22)。

在FVB.Tg中在5-6周龄时血清中TG和TC已经明显降低(表5，图9C。相对于同窝出生的野生型小鼠，转基因的FVB.Tg的体重(表5)和脂肪量(FM)(图9D)降低。饲喂高脂膳食(60％kJ/脂肪)的小鼠的体重增加也降低，表明避免了膳食诱导的肥胖症(图9E)。在饲喂高脂膳食(HFD)1个月后，仍然观察到与野生型对照比较，BAP-Swir1转基因小鼠体重和脂肪含量伴随着空腹胰岛素水平的降低趋势而降低(180±60相对310±40pg/ml，双尾学生t-检验P＝0.085)。

如上所示，观察到Swir1过表达损害对禁食的代谢适应，可能提示升高的能量消耗。为了测定Swir1是否升高能量消耗，用间接测热法测定耗氧量(VO2)和呼吸换气率(RER)(15、46、50)。Pennington生物医学研究中心有放置于温控保温箱中的16室实验动物综合监测系统(CLAMS)。该CLAMS同时测定耗氧量(VO2)、呼吸换气率(RER，整个动物底物氧化的指示剂)、在X和Z轴中的体力活动和食物摄取量。将小鼠放置在CLAMS系统中，记录72小时内所显示的参数。将小鼠无限制饲喂48小时，最后禁食24小时。FVB.Tg的结果如图13A-13F.所示。在肥胖的KK-A^y、表达Ad5Swir1的肥胖的B6Ay/a小鼠中(在禁食过夜后Ad5-Swir1相对Ad5-GFP的％体重减轻：5.5±0.4％相对3.5±0.4％，P<0.01)，以及在9周龄的FVB.Tg瘦鼠中(13.6±1.1％相对10.0±0.7％，P<0.05)观察到在禁食过夜后体重减轻增加。在一个月的高脂肪饲喂后，通过间接测热法测量的能量代谢表明耗氧量(VO2按ml/h：BAP-Swir1 Tg 4551±240；WT FVB3807±145，P<0.05)以及关灯期间的体力活动(每小时X脑电活动图中断：BAP-Swir1 Tg 1431±181；WT FVB 2678±327，P<0.01)显著升高。因此能量消耗的升高可能是通过Swir1改善膳食诱导的肥胖症和胰岛素抵抗的一个因素。

实施例12

Swir1对脂肪细胞的影响

为测定重组的或合成的分泌短肽Swir1^34-76(SEQ ID NO：10)的用途进行试验。研究细胞外调节激酶(ERK)的变化来分析脂肪细胞和肝细胞(两个潜在的Swir1作用位点)对合成的Swir1^34-76的应答。在脂肪细胞中ERK1/2和p38α在脂解作用和热生成的调控中是重要的。

在完全分化的3T3-L1脂肪细胞(图11A)和HepG2细胞(图11B)中应用1g/ml Swir1^34-76伴随着Erk1磷酸化显著升高。这些结果表明在脂肪细胞和肝细胞中Swir1^34-76的功能受体是有活性的，提示该合成肽生物学上是有生物活性的。此外，使用SEQ ID NO：2的39至76位氨基酸合成了第二种更短的肽并称为“Swir1^39-76”(SEQ ID NO：11)。应用脂肪细胞和肝细胞观察这种肽得到类似的结果。缺失四个氨基酸似乎不影响Swir1的功能。

实施例13

Swir1在下丘脑中的功能

下丘脑的Swir1可能涉及能量内稳态的调控。应用pAB1的初步分析证明在下丘脑弓状核神经元中存在Swir1-免疫反应性(数据未显示)。预示在下丘脑Swir1表达和肥胖症和胰岛素抵抗之间存在负相关。换言之，在肥胖症情况下肝和下丘脑中Swir1合成的降低可能是促进肥胖症和胰岛素抵抗的因素。

通过定量RT-PCR测定从对照(低脂膳食)和膳食诱导的肥胖症C57BL/6J、Mc3rKO和Mc4rKO小鼠的下丘脑中底部(mediobasalhypothalamic)中Swir1 mRNA的表达(图12A-12B)。如所预期，在肥胖的状态下，下丘脑中Swir1 mRNA丰度降低(图12A)。在HOMA-IR值(胰岛素抵抗的指标)升高的小鼠中Swir1也是低表达的(图12B)。

相反，在肥胖和胰岛素抵抗的状态下，Socs3 mRNA表达升高(图11C)。这个数据表明在肥胖症状态下Swir1合成减少不局限于肝。在下丘脑中Swir1活性的降低也将促进肥胖症和胰岛素抵抗的发展。

总之，用编码预测的76个Swir1残基(在BC021944的核苷酸207和437之间；SEQ ID NO：2)的部分cDNA序列构建表达载体，附带插入羧基末端的表位标签以使该蛋白质在使用可商购的抗体进行蛋白质印迹时显影。应用这个构建体证明所报告的序列编码分泌性蛋白质。然后用该表达载体和编码不带表位标签的天然蛋白质构建用于小鼠研究的重组腺病毒(Ad5-Swir1)。注射5×10⁸pfu的腺病毒进入尾静脉主要导致肝脏感染，以及脾脏较低程度的感染。用表达带表位标签的Swir1的腺病毒，证明在注射病毒5天后，Swir1蛋白在肝、脑和骨骼肌中有广泛的分布。应用这种表达天然形式Swir1的腺病毒，该分泌蛋白质显示新的功能(降低空腹血清甘油三酯和胆固醇)。在患高脂血症的肥胖小鼠中观察到肝中Swir1mRNA表达的降低，降低的幅度与总胆固醇和甘油三酯的升高相关。应用表达天然形式的Swir1的腺病毒，显示在有高胆固醇和甘油三酯的肥胖症小鼠模型中升高编码Swir1蛋白的mRNA表达有效地降低胆固醇和甘油三酯至正常水平。Ad5-Swir1感染以降低甘油三酯和总胆固醇的效应是可重复的，可在三种不同小鼠品系(Lep^ob/Lep^ob、KK-A^y和C57BL/6J)中观察到。在某些小鼠中，在空腹胰岛素和葡萄糖降低的趋势中观察到在胰岛素的敏感性方面的改善，以及在葡萄糖耐量试验中结果的改善。后者的观察提示在肥胖的、胰岛素抵抗的病人中Swir1也可能有效地改善胰岛素的敏感性。

该数据强烈提示全长的Swir1肽(SEQ.ID.NO.2)或肽衍生物、同源物、类似物或其模拟物，通过口服吸收、注射、皮下贴剂或鼻内途径给药，可能被用作高胆固醇血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病和/或能量不平衡的治疗或诊断试剂。通过现有的已知方法，在天然的编码序列之中进行替换可以制造稳定性和/或生物学效能升高的Swir1的衍生物。而且，Swir1肽可用于鉴定其细胞受体，作为尚未鉴定的Swir1受体是用于开发针对降低总胆固醇、甘油三酯、胰岛素抵抗、肥胖症、糖尿病和/或能量不平衡的潜在药物靶点。

在中度至重度糖尿病肥胖症的小鼠模型中通过对基因表达进行的基因微列阵分析，已经鉴定新的分泌肽-Swir1，是在肥胖状态下胰岛素抵抗和肝脂肪变性的病因学中的重要因子。Swir1显著地降低HOMA-IR(空腹胰岛素和葡萄糖的指标)，和在2型糖尿病小鼠模型中血清脂类，并且显著降低提示肝脂肪变性的可逆性的肝脂肪。转基因过表达Swir1与瘦的表型相关。可以按照与瘦蛋白和脂连蛋白类似的方式，通过刺激能量消耗和升高氧化代谢改善肥胖症胰岛素状态下的代谢谱。

实施例14

Swir1治疗将逆转肝胰岛素抵抗

从Ad5-Swir1和BAP-Swir1转基因的预实验数据(如上所示)提示胰岛素的作用和脂类代谢得到改善。在FVB.Tg小鼠中，升高的氧化代谢是解释这些效应的可能因子。从那些续发的脂肪量的降低是不能够分析Swir1的抗糖尿病作用的。用重组腺病毒的预实验数据提示Swir1降低高胰岛素血症和高脂血症，不依赖于肥胖症的影响。因此，用重组腺病毒和合成肽的另外的实验可以提供关于Swir1对肝代谢和胰岛素敏感性直接效应的重要信息。

通过测量胰岛素受体信号进行试验以确定用Ad-Swir1治疗的肝脂肪变性的逆转是否与肝和骨骼肌中胰岛素的敏感性改善相关。这些将包括远离胰岛素受体酪氨酸激酶的胰岛素受体底物1和2磷酸化的分析。磷脂酰-3’激酶下游涉及调控葡萄糖转运的蛋白质激酶B(PKB)/Akt、丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，也将作为测定胰岛素受体活化的指标(44，45)。预试验数据显示感染Ad5-Swir1的小鼠体重减轻更多，提示基础代谢率升高。用间接测热法测定Ad5-Swir1是否升高餐后和空腹状态下的整体代谢率。还测定来源于肝、骨骼肌和褐脂组织的组织裂解液中的氧化代谢。

腺病毒治疗的基本方案如图7C所示。简要地，对所有小鼠尾静脉注射5×10⁹pfu的Ad5-Swir1或Ad5-GFP(n＝12/组，共24只)。在用于后续试验前将允许小鼠有4天恢复。最后取肝样本，用于通过实时PCR和RNA印迹分析测定Swir1 mRNA评估感染。在预试验中，观察到感染4-7天后Swir1 mRNA升高4倍。还将通过蛋白质印迹或应用尚在开发的测定法(RIA/ELISA)测量Swir1蛋白。在腺病毒注射当天和空腹前后对小鼠称重。如果可能，用核磁共振(NMR)测定机体组成(15，32，46)。如前所述，将小鼠关在铁丝笼中使之适应，以便测定食物摄取和排泄(15)。

如果FVB.Tg的性别二态表型是可重复的并可在C57BL/6J背景的BAP-Swir1转基因小鼠中观察到，将修改该Ad5试验以研究雄性和雌性小鼠的应答。研究肥胖的胰岛素抵抗小鼠对Ad5-Swir1治疗应答的大多数试验使用雄性；可能雌性将表现出不同的应答，也许除了改善胰岛素敏感性之外表现出体重减轻。这不可能没有先例，例如在雄性和雌性大鼠中已观察到对胰岛素和瘦蛋白厌食作用应答的性别二态现象(47，48)。

测定肝脂肪变性是否与胰岛素敏感性升高有关。本试验涉及KK-A^y和Ay/a小鼠，分为两组，基因型内各12只(Ad5-Swir1、Ad5-GFP对照)(24只KK-A^y小鼠、24只Ay/a小鼠)。在禁食过夜后5天，将Ad5-Swir1和Ad5-GFP组的6只进行单次腹膜内胰岛素(1U/kg)注射，余下6只接受盐水注射。在注射后10或20分钟将小鼠安乐死(n＝3/组)，并收集组织样本(肝、四头肌)，将其迅速冻存于液氮中。如前所述对IRS磷酸化、PKB活性和FoxO1磷酸化进行测定(15，49)。本试验每组仅用8只小鼠做胰岛素和葡萄糖耐受试验，重复两次以上。

可以预期Ad5-Swir1的抗-脂肪变性效应将升高肝中胰岛素受体酪氨酸激酶级联激活的胰岛素活性。Ad5-Swir1还可以改善肌肉和/或脂肪组织中的胰岛素信号。也许由于是亚-最佳实验设计[即少量小鼠(n＝4-5)；在注射腺病毒后不同时间(长达两周)进行试验]，研究葡萄糖廓清率的初始探索导致混合的结果(数据未显示)。可以预期响应葡萄糖/胰岛素注射，Ad5-Swir1将改善葡萄糖廓清率。

测定Swir1是否升高整体能量消耗和氧化代谢。为了测定肝Swir1表达是否升高能量消耗，将用间接测热法测量感染Ad5-Swir1或Ad5-GFP(n＝8/组)的肥胖的Ay/a和瘦的以及膳食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠的VO2和RER(15，46，50)。Pennington生物医学研究中心有放置于温控保温箱中的16室实验动物综合监测系统(CLAMS)。该CLAMS同时测定耗氧量(VO2)、呼吸换气率(RER，整个动物底物氧化的指示剂)、在X和Z轴中的体力活动和食物摄取量。在注射腺病毒后96小时，将小鼠放置在CLAMS系统中，记录72小时所显示的参数。将小鼠无限制饲喂48小时，最后24小时空腹。在单独的试验中，收集从感染Ad5-Swir1或Ad5-GFP(n＝8/组)的Ay/a和C57BL/6J小鼠来源的肝、腓肠肌和褐脂组织，测定其中的脂肪酸氧化(C¹⁴-软脂酸盐)和线粒体酶功能(柠檬酸合成酶、细胞色素C氧化酶)。收集肝的部分并迅速冻存，用于转录因子(即SREBP1c、PPARγ)和涉及脂肪形成的酶的mRNA和蛋白质表达的测定(32)。

感染Ad5-Swir1的小鼠体重减轻增加表明基础代谢率升高，通过从BAP-Swir1转基因鼠来源的空腹体重减轻和间接测热法的数据确证了此发现(参见图13A-F)。可以预见感染Ad5-Swir1将升高VO2，虽然这可能只是空腹期间的证据。肝中线粒体氧化酶活性的升高与Swir1作为自分泌/旁分泌因子的作用将是一致的。在骨骼肌和褐脂组织中线粒体氧化酶活性的升高提示内分泌功能，或者通过自主神经系统或者通过在肌肉和/或褐脂组织中表达的受体发挥作用。如果Ad5-Swir1明显升高能量消耗(如在FVB.Tg中所观察到的)而不影响体重，那么可预期食物摄取的补偿性升高。如在用Ad5-Swir1治疗的OBOB小鼠中所观察到的，涉及脂肪形成的基因表达下降，也将是可预期的(图8A-8D)。

实施例15

Swir1的转基因表达预防肥胖症和胰岛素抵抗

过表达瘦蛋白(51，52)和脂连蛋白(53，54)的转基因小鼠已经证明过表达二者中的任一蛋白质具有抗糖尿病作用。期待Swir1的过表达与用脂连蛋白和瘦蛋白过表达所观察到的结果具有可比性；亦即在膳食和遗传诱导的肥胖症的情况下改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性以及降低空腹脂类。也预示Swir1通过增强在肝、骨骼肌和/或褐脂组织中的氧化代谢使能量消耗增加。综合分析Swir1的生理作用对未来集中于通过该多肽调控能量代谢和胰岛素信号机制的试验是重要的。

转基因：已将编码该76个氨基酸的蛋白质的序列连接至由人β-肌动蛋白启动子调控的合成的转基因(BAP)(图9A)。Swir1是分泌性多肽(图4)，因此组织选择性对这些转基因研究并不重要。在内源基因大量表达之处，组织特异性的启动子一直未被使用，因为抑制内源基因可能限制过表达的功效(53，54)。应用如前所述(31，32，46)的定量RT-PCR(qRT-PCR)和RNA印迹分析完成mRNA表达的综合分析。应用两种抗Swir1^34-76的N-和C-端的多克隆抗体(pAB1(SEQ ID NO：8)、pAB2(SEQ ID NO：9))通过蛋白质印迹测定蛋白质水平(图5)。这可能要求用免疫沉淀检测蛋白质。或者，如果手头的或在开发的抗体对于开发灵敏的定量测定法有用，则使用这些抗体。通过DNA印迹分析测定转基因拷贝数。因此本试验的次要目标是对小鼠组织(肝、下丘脑、前脑、后脑、骨骼和心肌、腹膜后的和腹股沟的脂肪贮存库、胃、肠、胰腺、肾)中Swir1 mRNA的表达进行更综合的分析。对主要的器官(心、肾、肠、肝)称重，并对主要的形态学变化进行组织学检查。

我们已经指出Swir1是小类的分泌性多肽(瘦蛋白、脂连蛋白)之一，当其过表达，在肥胖症和胰岛素抵抗的小鼠模型中改善代谢谱(即提高胰岛素敏感性、降低肝脂肪形成)。Swir1过表达在能量代谢上具有瘦蛋白样效应，保护免患膳食诱导的肥胖症和胰岛素抵抗。Swir1给药能够逆转与膳食和遗传诱导的肥胖症相关的胰岛素抵抗和血脂障碍，并能预防或延迟2型糖尿病的发生。

多方面的情况。

此处以及在权利要求中使用的术语“Swir1”是指Swir1蛋白(SEQ.ID.NO.2)、它的功能肽(例如Swir1^34-76)、衍生物和类似物。术语“衍生物”和“类似物”理解为与Swir1结构上类似的蛋白质并显示出与未修饰的Swir1性质上的类似作用。术语“功能肽”是指仍然与Swir1受体结合或者能够激活体细胞(如脂肪细胞或肝细胞)内部变化的Swir1蛋白片段。

根据本发明施用Swir1、它的功能肽、类似物和衍生物可用于逆转胰岛素抵抗和血脂障碍，和预防或延迟肥胖症的发生。这些化合物也可用作高胆固醇血症、高甘油三酯血症、胰岛素抵抗、肥胖症和糖尿病的治疗或诊断试剂。

此处所用到的术语“治疗的有效剂量”是指Swir1蛋白、片段或衍生物或类似物足以或者增加身体能量消耗、降低血清甘油三酯、降低血清胆固醇、降低高脂血症，或者降低胰岛素抵抗达到统计上有显著性意义的程度(p<0.05)的剂量。Swir1的用药剂量范围是产生预期效应的那些剂量。通常，剂量将随病人的年龄、体重、状态和性别而改变。现有普通技术人员，在给予本说明书的教导下，可以容易地确定合适的剂量范围。在任何的禁忌症情况中可由内科医师个人调节剂量。在任何情况下，可应用本领域已知的方法通过监测身体代谢、体重或者血清葡萄糖、甘油三酯、胆固醇水平测定治疗的效果。而且，Swir1可在目前已知的可药用载体中应用。

该治疗方法可能在脊椎动物包括人和非人的哺乳动物中广泛应用。可以将根据本发明的肽通过任何合适的方式，包括口服、静脉注射、非肠道的、皮下、肺内和鼻内给药施用于患者。

胃肠外灌输包括肌肉的、静脉内的、动脉的或腹膜内给药。该肽也可以经皮肤给药，例如以皮下种植缓释的形式，或以胶囊、粉末或颗粒形式口服。也可以经吸入给药。

用于胃肠外施用的可药用的载体制备包括无菌的水性或非水性溶液、混悬液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄榄油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性的载体包括水、醇的/水性的溶液；乳剂或混悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格(Ringer’s)右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格或不挥发性油。可以将可药用并与活性成份相容的赋形剂与该肽混合。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油和乙醇，或其组合。静脉注射载体包括流体和营养补充物、电解质补充剂，例如那些基于林格右旋糖的载体，等等。也可以存在防腐剂和其它的添加剂，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。

可以根据施用途径改变剂型。例如，可以以安瓿形式提供用于注射的组合物，每个安瓿含有单位剂量的量，或以含有多倍剂量的容器形式提供。

该化合物可以如可药用的盐配制成治疗组合物。这些盐包括用无机酸生成的酸加成盐，例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、草酸或酒石酸等等。盐也包括那些从无机碱例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等形成的那些。该组合物可经静脉内、皮下、或肌肉内施用。

通过将该肽与适当的大分子例如聚酯、多氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-醋酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、醇溶蛋白硫酸盐或丙交酯/乙交酯共聚物混合，可以完成受调控的输送。可以通过改变大分子的浓度调控有活性化合物的释放速率。

控制作用持续时间的另一种方法包括将肽掺入多聚体物质的颗粒中，例如聚酯、肽、水凝胶、多乳酸化合物/乙交酯共聚物，或乙烯-醋酸乙烯酯共聚物。可选择地，可以将有效化合物包装在例如通过凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊中，例如，通过分别使用羟甲基纤维素或凝胶微胶囊或聚(异丁烯酸甲酯)微胶囊，或包装在胶体药物递送系统。胶态分散系统包括大分子复合物、纳米囊、中心球、珠子和基于脂类的系统包括水包油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体。

此外，可以使用所有的或部分的核酸序列(SEQ ID NO：1)(例如，在图4中下划线的开放阅读框架)制备质粒或载体，从而将Swir1基因掺入有机体以增加Swir1蛋白的生成。现有的那些技术人员将了解SEQ ID NO：1的核酸序列不是能用于产生Swir1蛋白的唯一序列。那些编码同一蛋白质的核酸序列，但由于遗传密码的简并性而具有不同的核苷酸序列也是可预期的。可以在关于遗传学或生物学的大量参考文献中找到遗传密码，包括，例如B.Lewin，基因VI(牛津大学出版社，纽约，1997)的214页的图9.1。Lewin的216页的图9.3直接说明了遗传密码的简并性。例如，天冬氨酸的遗传密码可以是AAT或AAC。

本发明还包含编码Swir1蛋白的核苷酸序列，该Swir1蛋白在不参与受体结合或蛋白质分泌的分子部分有一个或多个沉默氨基酸改变。例如，在核苷酸序列中给定位点导致产生化学上等同的氨基酸的改变是令人期待的；因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密码可以被编码另一个疏水性残基例如甘氨酸的密码取代，或者被更疏水的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个的改变，例如天冬氨酸取代谷氨酸，或者一个带正电荷的残基取代另一个，例如赖氨酸取代精氨酸，产生生物学上等同的产物也是可期待的。参见，例如Lewin(1997)的第10页图1.8，显示遗传密码编码的20种“标准氨基酸”侧链的性质。(还要注意在该出版图片中的一个印刷错误，即谷氨酰胺的缩写应为“Gln”。)

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在本说明书中引用的所有参考文献的全部公开，在此被引入作为参考。然而，与其它文献的矛盾之处，以本说明书为准。

序列表

<110>路易斯安那州州立大学及农业机械学院管理委员会

<120>涉及能量内稳态的新肽

<130>Butler 05P02W

<140>PCT/US2006/______

<141>2006-08-07

<150>60/705,940

<151>2005-08-05

<160>18

<170>专利版本3.3

<210>1

<211>868

<212>DNA

<213>某种小鼠(mus sp.)

<400>1

<210>2

<211>76

<212>PRT

<213>某种小鼠

<400>2

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>3

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>5

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>6

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的引物

<400>7

<210>8

<211>14

<212>PRT

<213>某种小鼠

<400>8

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>某种小鼠

<400>9

<210>10

<211>43

<212>PRT

<213>某种小鼠

<400>10

<210>11

<211>38

<212>PRT

<213>某种小鼠

<400>11

<210>12

<211>76

<212>PRT

<213>黑家鼠(Rattus rattus)

<400>12

<210>13

<211>76

<212>PRT

<213>黑猩猩(Pan troglodytes)

<400>13

<210>14

<211>76

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>14

<210>15

<211>76

<212>PRT

<213>家犬(Canis familiaris)

<400>15

<210>16

<211>76

<212>PRT

<213>猪(Sus sp.)

<400>16

<210>17

<211>76

<212>PRT

<213>牛(Bovidae)

<400>17

<210>18

<211>76

<212>PRT

<213>绵羊(Ovis aries)

<400>18

Claims

1.纯化的Swir1肽，及其片段、同源物、类似物和衍生物，其中该肽具有下列特性：

a.它是基本均质的制剂；和

b.其与SEQ ID NO：2、10、11、12-18中提出的任一序列有至少70％的同源性；其中

2.权利要求1的肽，其中该肽为哺乳动物的肽。

3.权利要求1的肽，其中该肽为鼠的肽。

4.权利要求1的肽，其中该肽为人的肽。

5.权利要求1的肽，其中该肽为合成的肽。

6.权利要求1的肽，其中与SEQ ID NO：2、10、11、12-18中的任一序列的所述同源性高于85％。

7.权利要求6的肽，其中该同源性高于95％。

8.药用组合物，其包含权利要求1-7中的任一Swir1肽和可药用的载体。

9.用于治疗与体重自身稳定相关的病理生理的方法，包括向受试者施用治疗有效量的药用组合物，该组合物包含Swir1肽、或其片段、同源物、类似物和衍生物。

10.用于预防与体重自身稳定相关的病理生理的方法，包括向受试者施用治疗有效量的药用组合物，该组合物包含Swir1肽、或其片段、同源物、类似物和衍生物。

11.权利要求9或10中的任一项的方法，其中Swir1肽与SEQ ID NO：2和10-18中的任一序列有至少70％的同源性。

12.权利要求9或10中的任一项的方法，其中该病理生理是肥胖症。

13.权利要求9或10中的任一项的方法，还包括向受试者施用选自瘦蛋白和脂连蛋白组成的组的化合物。

14.权利要求9或10的任一项的方法，其中该病理生理与肥胖症相关，包括高甘油酯血症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗、高脂血症和2型糖尿病的任一种。

15.权利要求9或10的任一项的方法，其中向受试者施用的步骤包括腹膜内的施用。

16.包含核酸的载体，该核酸编码SEQ ID NO：1的开放阅读框的至少20个氨基酸。

17.培养的细胞，其产生根据权利要求1-7的任一项的Swir1肽。

18.权利要求17的细胞，其中该细胞选自细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞组成的组。

19.制备Swir1肽的方法，其包括：

a.在提供肽表达的条件下培养细胞，该细胞含有编码SEQ ID NO：1的开放阅读框架的至少20个氨基酸的核酸；和

b.回收表达的肽。

20.药用组合物，其包含编码SEQ ID NO：1的开放阅读框架的至少20个氨基酸的核酸，其中该核酸编码Swir1肽，和可药用的载体。

21.抗体，及其片段、衍生物、同源物和类似物，其与权利要求1-7的任一项的肽免疫特异性地结合。

22.使用可检测的标签标记的权利要求21的抗体。

23.权利要求21的抗体，其中使用任一种的SEQ ID NO：2和8-18的肽、以及所述肽的片段、衍生物、同源物和类似物产生所述抗体。

24.权利要求21的抗体或片段，其中该抗体是多克隆抗体。

25.权利要求21的抗体或片段，其中该抗体是单克隆抗体。

26.试剂盒，其在一个或更多容器中包含根据权利要求1-7的任一项的Swir1肽、SEQ ID NO：1的核酸序列部分、或识别根据权利要求21-25的任一项的Swir1蛋白的抗体。

27.含有核酸的重组的非人动物，其中该核酸是分离的核酸，其包含编码任一种的SEQ ID NO：2和8-18的Swir1相关肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物的核苷酸序列。

28.在受试者中改善或降低胰岛素抵抗的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有在SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

29.在受试者中改善或治疗糖尿病症状的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有在SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

30.在受试者中预防或延迟肥胖症发生的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

31.在受试者中改善或降低高脂血症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

32.在受试者中降低血清总胆固醇的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

33.在受试者中降低血清甘油三酯的方法，包括向受试者施用治疗有效量的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物，所述Swir1肽具有SEQ ID NO：2和8-18给定的序列。

34.权利要求28-33的任一项的方法，还包括向受试者施用选自瘦蛋白和脂连蛋白组成的组的化合物。

35.非人转基因动物，其具有的细胞携带外源启动子和与核酸对应的cDNA，所述核酸编码SEQ ID NO：1的开放阅读框架的至少20个氨基酸，其中所述细胞组成型的过表达具有在SEQ ID NO：2和8-18中给定序列的Swir1肽、以及那些肽的片段、衍生物、同源物和类似物。

36.权利要求35的转基因动物，其中所述外源启动子是肌动蛋白启动子。

37.权利要求35的转基因动物，其中所述非人动物是小鼠。

38.包含核酸的转化载体，该核酸编码在SEQ ID NO：1的开放阅读框架中的至少20个氨基酸。

39.包含核酸的宿主细胞，该核酸编码在SEQ ID NO：1的开放阅读框架中至少20个氨基酸。

40.包含核酸的核酸构建体，该核酸编码在SEQ ID NO：1的开放阅读框架中至少20个氨基酸，其中所述序列被可操作的连接于哺乳动物中有功能的启动子上。

41.如在权利要求40中所述的核酸构建体，其中所述启动子是肌动蛋白启动子。

42.用如在权利要求40中所述的核酸构建体转化的动物。