KR20080042866A

KR20080042866A - 에너지 항상성에 관여하는 신규한 펩티드

Info

Publication number: KR20080042866A
Application number: KR1020087005454A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 에이. 버틀러; 제임스 엘. 트레바스키스
Original assignee: 더 보드 오브 수퍼바이저스 오브 루이지애나 스테이트 유니버시티 앤드 애그리컬춰럴 앤드 미케니칼 칼리지
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2006-08-07
Publication date: 2008-05-15
Also published as: WO2007019426A3; CA2618047A1; AU2006278406B2; EP1928487A4; US20160102126A1; IL189065A; US20090253619A1; IL207764A0; AU2006278406A1; WO2007019426A2; EP1928487A2; CA2618047C; CN101505786A; IL189065A0; RU2409590C2; US20130231280A1; US8518892B2; KR101004662B1; RU2010119559A; AU2010202600A1

Abstract

분비된 단백질("Swir1")인 추정상 76개의 아미노산을 코딩하는 mRNA의 발현은 공복시의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수치와 음의 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 2가지 마우스 비만 모델인 KK-A^y 및 Lep^ob/Lep^ob 마우스에서 Swir1 Mrna의 발현을 증가시키기 위해, 재조합 아데노바이러스를 이용하였다. 아데노바이러스 주사에 의한 Swir1의 과다발현은 2가지 모델에서 공복시의 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수치를 현저하고, 재현가능한 양상으로 감소시켰다. 또한, Swir1 단백질을 과다발현하는 형질전환 마우스 종을 제조하였다. 아울러, 지질형성에 참여하는 주요 유전자(지방산 합성효소)의 발현과 FAS 단백질 수준이 Lep^ob/Lep^ob 마우스에 Swir1 아데노바이러스 처리에 의해 감소되었다. 경구 섭취, 주사, 피하 패치 또는 비강내 경로에 의해 전달된 전장 Swir1 펩티드나 또는 이의 유도체, 상동체, 유사체 또는 모방체는 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 인슐린 내성, 비만, 당뇨병 및/또는 에너지 불균형에 대한 치료제 또는 진단제로서 사용할 수 있다.

Description

에너지 항상성에 관여하는 신규한 펩티드{A NOVEL PEPTIDE INVOLVED IN ENERGY HOMEOSTASIS}

2005년 8월 5일자 미국 가출원번호 60/705,940호에 대한 우선권을 모든 국가들에서 해당 조약 및 협의하에 주장한다. 미국에서는 2005년 8월 5일자 가출원번호 60/705,940호에 대한 우선권을 35 U.S.C. §119(e)를 기초로 주장한다.

본 발명은 비만과 인슐린 내성 및 지혈증에 공동으로 참여하는 것으로 확인된, "인슐린 내성으로 억제된 1"(Swir1)이라고 하는 신규한 유전자 및 그 단백질에 관한 것이다.

비만은 점점 만연하고 있는 세계적인 질환으로, 전염병 수준에 이르고 있다. 현재, 서양인의 50% 이상이 과체중이거나 비만인 것으로 추산되고 있다. 인슐린 내성, 이상지혈증, 간 지방증 및 고혈압과 같은 다른 증상이 복합적인 비만, 특히 복부 비만은 대사성 증후군 또는 인슐린 내성 증후군으로 알려져 있다. 인슐린 내성 및 2형 당뇨병과 관련된 이상지혈증의 병태생리학적 주된 특징은 극저밀도 지단백질(VLDL)내 혈장 트리글리세라이드(TG)의 증가 및 고밀도 지단백질(HDL)내 콜레스테롤의 감소이다. 일반적으로, 증가된 순환성 TG는 유리 지방산(FFA)으로 가수분해되어 간 등의 말초 조직에 흡수됨으로써, 간 지방증 또는 비-알코올성 지방 간 을 유발할 수 있다. 비만 및 대사성 장애에 대한 몇 가지 돌연변이 마우스 모델을 이용한 연구로, 인슐린 내성과 이상 조절된 TG 간의 연결 관계가 복잡하며, 말초 및 중추 인자 둘다를 포함하는 것으로, 나타났다.

인슐린 내성은 골격근 및 지방에서의 인슐린-자극에 의한 글루코스 흡수 감소와, 간에서의 글루코스 생산 억제 손상을 의미한다(2). 고혈당과 고지혈증 모두 2형 당뇨병의 병태생리학적인 부작용이며, 원인이다. 또한, 당독성 및 지독성도 인슐린 작용의 억제 및 베타 세포에서의 인슐린 분비로 인해, 인슐린 내성과 2형 당뇨병을 촉진시킨다. 고인슐린혈증은 먼저 간에서의 글루코스 생산 억제에는 성공적이지만, 인슐린 증가로 인한 유해한 작용이 정상 혈당 수치 유지와 관련하여 얻는 이득을 상쇄시킨다(2). 고인슐린혈증은 고혈압, 비-알코올성 지방 간 질환(NAFLD) 및 관상 심장 질환 등의 일군의 대사성 이상에 요인인 것으로 생각된다(2). NAFLD 질병은 일반적으로 인슐린 내성과 관련 있으며, 2개의 전사 인자, 즉 스테롤 조절 인자 결합 단백질-1c(SREBP1c) 및 페록시좀 증폭자 수용체-γ(PPARγ)를 필요로 한다(3-6). 간에서 SREBP1 또는 PPARγ 시그널링이 없으면, 비만 인슐린 내성 마우스에서 발병하는 간 지방증의 발생이 저해된다(5-7).

인슐린 수용체(IR) 시그널링 시스템의 복잡성과 질병 발생에 기여하는 인자가 하나가 아닌 다수라는 인식으로 인해, 인슐린 내성을 설명하는 공통된 기전을 규명하기 어렵다. 어댑터 단백질 IRS1 및 IRS2 2종의 티로신 인산화는 인슐린에 의한 글루코스 흡수 자극에 있어 중요한 초기 단계이다(8-11). IRS1과 IRS2는 고유 효소 활성을 가지고 있진 않지만, 키나제, 포스파타제 또는 유비퀴틴 리가제 기 능을 가진 단백질들의 복합체 형성을 용이하게 하는 분자 스캐폴드의 일부분으로서 작용하는 것으로 여겨진다(12). IRS과의 조합에 의한 포스포이노시티드 3' 키나제(PI3K)의 자극은 인슐린-자극에 의한 글루코스 흡수에 중요한 단계이다. PI3K의 p110 촉매 서브유닛의 활성화는 지질 키나제 도메인을 활성화시키는데, 상기 도메인은 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트를 인산화한다. 다른 경로가 관여할 수도 있지만, PI3K의 활성화는 인슐린에 의한 글루코스 흡수를 충분히 자극하는데 필수적이다.

인슐린 내성의 발현에 이바지하는 대사적 상태는 산화 대사에 의한 칼로리 흡수의 불균형으로 초래되는 것으로 생각된다(13, 14). 근육에서의 미토콘드리아 기능 감소가 비만과 관련된 인슐린 내성의 발병 요인인 것으로, 연구를 통해 시사되었다(14, 15). 에너지 소모의 자극 및 식욕의 억제 모두 비만 및 2형 당뇨병에 대한 마우스 모델들에서 글루코스 대사를 개선시킨다. 이러한 잘 파악된 예로는 아디포사이토카인인 렙틴이 있다. 렙틴은 시상하부와 후뇌에 작용하여 식욕을 억제하며, 자율 신경계를 자극하여 골격근에서의 산화 대사를 증가시킨다(16-20). 그러나, 렙틴은 또한 음식물 섭취 또는 체중에 대한 현저한 효과와는 독립적으로 간의 인슐린 감수성을 개선시킬 수 있다(17).

지방산(FA)의 주입은 4-6시간 이내에 근육에서의 신속한 인슐린 감수성 감소와 관련있다(21-23). FA가 인슐린 자극에 의한 글루코스 흡수를 감소시키는 정확한 기전은 논의 중에 있다. 현재, 실험 결과들은, FA가 글루코스 흡수를 자극하는 IR 신호 전이 경로를 간섭하는 것으로, 나타난다(21, 22, 24). FA 및 디아실글리 세롤의 세포내 농도 증가가 세린 키나제, 단백질-키나제 C θ(PKCθ)의 활성화를 유도한다는 가설이 있다(25). PKCθ에 의한 Ser³⁰⁷에서의 IRS1 인산화는 IR에 의한 IRS-1 인산화를 저해하여, PI3K의 활성화 감소 및 인슐린에 의한 글루코스 흡수 자극을 경감시킨다.

비만과 인슐린 내성을 연결하는 분비된 폴리펩티드의 비정상적인 활성. 비만과 인슐린 내성을 연결시키는 기전을 결정하는 것은 새로운 글루코스 강하 요법을 개발하는데 있어 중요하다. 인슐린 내성에 대한 최근 연구는 지방세포에 집중되어 있다. 비만은 지방세포로부터 분비된 폴리펩티드(아디포사이토카인)의 조절 네트워크의 비정상적인 조절 및 작용과 관련 있다. 렙틴, 아디포넥틴 및 리지스틴(resistin)과 같은 아디포사이토카인은 간에서의 글루코스 생산, 근육에서의 글루코스 이용 및 지방세포에서의 증식과 지질 저장을 조절한다(26). 렙틴은 식이 행동, 자율 신경 활성 및 대사(갑상선, 부신)(16)를 관리하는 신경내분비 시스템(neuroendocrine system)을 조절하는, 시상하부 및 후뇌에 위치된 신경원에 대한 작용을 통해 에너지 항상성을 조절한다. 비만과 관련된 렙틴 내성 또는 혈청내 아디포넥틴 감소는 인슐린-감작 작용 소실을 통해, 그리고 지방증 발병 위험성 증가에 의해(세포내 지방산 축적), 인슐린 내성에 기여하는 인자이다(27, 28). 비-지방 조직 역시, 근육에서의 무스클린(musclin)(29) 및 간에서의 안지오포이에틴(angiopoietin)-관련 성장 인자(30)와 같은 에너지 대사 및 인슐린 감수성에 작용하는 펩티드를 분비한다. 또한, 이들 인자들은 대사성 증후군 치료에 타겟이 될 수 있다.

비만과 인슐린 내성간의 연결성을 조사하기 위한 멜라노코르틴 수용체의 낫 아웃( knockout ): 중추 신경계 영역에서 발현되는 2종의 멜라노코르틴 수용체는 에너지 항상성에 관여한다. 마우스(Mc4r-/- 또는 Mc4rKO 마우스)에서 신경의 멜라노코르틴-4 수용체(MC4R) 유전자를 타겟하여 제거하면, 비만과 고인슐린혈증이 유발되며, 또한 간에서의 지방형성 유전자의 발현 증가 및 간 지방증 증가와도 관련있다. 신경의 다른 멜라노코르틴 수용체가 결핍된 마우스(Mc3r-/- 또는 Mc3rKO 마우스)에서는, 고 지방식이에서 Mc4r-/- 마우스와 유사한 수준으로 비만이 나타나지만, 동일한 수준의 인슐린 내성, 고지혈증 및 간 지방증의 증가는 나타나지 않는다. Mc3rKO 및 Mc4rKO 종을 이용한 연구에서, 상기 균주 모두 과도한 식이-유발성 비만을 보이지만, Mc4rKO에서의 인슐린 감수성 악화가 보다 빠르고 심각한 것으로, 확인되었다(31, 32). 도 1A-1E에, 천연형 마우스(C57BL/6J)와 2종의 낫 아웃 마우스에서의 저 지방식 또는 고 지방식 중 어느 하나에 대한 함수로서 체중에 대한 공지된 차이점 몇 가지가 예시되어 있다(31, 32). 마우스와 인간에서의 심각한 인슐린 내성은 간비대와 관련 있으며, 지방증은 간의 지방형성 증가와 관련있다(33). Mc4rKO는, 비만 상태에서는 간의 인슐린 내성 및 간비대가 나타나고, 고 지방식(HFD)에서는 심각한 글루코스 및 인슐린 불내성(intolerance)과 관련된 현저한 글루코스 항상성 악화가 나타난다. 도 2A-2E는, 2종의 마우스 종에서의 간비대 및 지방증에 대한 차이와, 지질 대사에 참여하는 유전자의 발현 차이를 나타낸 것이다(4, 17, 57). 한편, Mc3rKO의 지방량(FM)을 Mc4rKO에 매치시키면, 매우 약한 글 루코스 항상성 손상이 나타난다.

Swir1 유사 cDNA 의 서열. Swir1과 상동한 추정의 단백질을 코딩하는 cDNA의 서열 및 추정의 오픈 리딩 프래임은, 대규모의 cDNA 서열 분석을 포함한 여러가지 컨소시엄에 의해, 이미 공개되어있다. R. L. Stausberg et al ., "Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse cDNA sequences," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, pp. 16899-16903 (2002)(Genbank accession number: BC021944, cDNA with complete coding sequence); 및 H. F. Clark et al ., "The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment," Genome Res., vol. 13, pp. 2265-2270 (Genbank accession number: NM_198573, cDNA with complete coding sequence)을 참조한다. 서열번호 2의 처음 37개의 아미노산 잔기들과 유사한 상동성을 보이는 단백질들을 동정하였다. 그러나, 이러한 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은, cDNA의 서열분석에서 단일 뉴클레오티드의 에러로 인해, 정확하지 않을 수도 있다. 본원에 기재된 단백질은 기능에 대해서는 공개되어 있지 않다.

발명의 개요

본 발명자들은, 비만에 대한 형질전환 설치류 모델 2가지를 이용한 연구를 기초로, 신규한 분비된 펩티드(Swir1)를 발견하였다. 실시간 정량 PCR에 의한 마이크로어레이 유전자 발현 분석 및 검정을 이용하여, 추정의 76개의 아미노산으로 이루어진 분비된 단백질을 코딩하는 mRNA(유전자은행 수납 번호: AK009710)의 발현이, 심각한 인슐린 내성 및 글루코스 불내성을 보이는 Mc4rKO 및 렙틴-결핍(Lep ^ob / Lep ^ob ) 마우스에서 10배 감소됨을 확인하였다. 반대로, 적당한 수준의 글루코스 불내성을 보이지만 정상적인 인슐린 반응을 보이는 비만 Mc3rKO 마우스에서는, Swir1 단백질의 발현이 적당하게 30-40% 감소되었다. C57BL/6J 마우스에서, 간에서의 Swir1 mRNA 발현과 공복혈당 수치 간에 음의 상관관계가 확인되었다. 시상하부에서의 Swir1 발현 역시 비만 및 인슐린 내성을 감소시켰다. 또한, 본 발명자들은, mRNA가 분비된 단백질을 코딩함을 확인하였다. 간 및 뇌에서의 Swir1 mRNA 발현에 대한 식이-유발성 비만 및 인슐린 내성의 부정적인 작용을 바탕으로, 이 단백질을 코딩하는 유전자를 "Swir1"("인슐린 내성에 의한 억제 1")이라고 칭하였다. 재조합 아데노바이러스를 이용하여 비만 마우스 모델에서 Swir1 발현을 증가시켰다. 아데노바이러스 주입에 의한 Swir1의 과다 발현으로, 공복 인슐린, 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수치가 현저하고도 재현가능한 양상으로 감소되었다. 아울러, Lep^ob/Lep^ob 마우스에 Swir1 아데노바이러스를 처리하면, 지질형성(지방산 합성효소)에 관여하는 주된 유전자의 발현과 FAS 단백질 수준이 감소되었다.

Swir1 단백질을 과다 발현하는 형질전환 FVB/NJ 마우스 종을, 모든 조직에서 발현되는 인간 베타-액틴 프로모터에 의해 조절되는 Swir1 DNA(서열번호 1)을 이용하여 만들었다. Swir1을 과다발현하는 암컷 FVB/NJ 마우스는 지방량의 현저한 감소 및 간접 칼로리 측정법(Oxymax, Columbus Instruments, Columbus, Ohio)을 이용한 산소 소모량(VO2)을 측정하여 결정되는 대사율의 증가를 보였다. 형질전환 마우스에서 관찰되는 대사율 증가는 Swir1을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 주입한 마우스를 이용한 실험 결과를 근거로 예측되었다. Swir1을 발현하는 재조합 아데노바이러스가 감염된 마우스는 철야 금식하는 동안 체중이 많이 감소되었는데, 이는 금식중에 이를 보상하기 위한 대사율을 감소시키는 능력이 손상되었음을 시사한다. FVB/NJ Swir1 형질전환 마우스도, 보다 높은 대사율과 관련된 공복 기간 동안의 동일한 과도한 체중 감소를 보였다. Swir1의 항-당뇨병 작용은, 산화적 대사에 연루된 경로의 자극을 포함할 수 있다. 즉, Swir1은 칼로리(kJ) 소모 균형을 신체 활동, 기초 대사율 또는 이들의 조합에 대한 작용을 통한 칼로리 소모로 표준화함으로써, 부분적으로 비만인 인슐린 내성 개체의 대사 프로파일을 개선시킬 수 있다.

전장 Swir1 펩티드 또는 이의 펩티드 단편, 유도체, 상동체, 유사체 또는 모방체는, 경구 섭취, 주사, 피하 패치 또는 비강내 경로에 의해 전달되며, 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 인슐린 내성, 비만, 당뇨병 및/또는 에너지 불균형 장애들에 대한 치료제 또는 진단제로서 사용할 수 있다.

도 5에 나타낸, BC021944로부터 예측되는 오픈 리딩 프래임으로부터 파생된 펩티드 단편에 대한 항체(AB1 (서열번호 8) 및 AB2 (서열번호 9))를 만들었다. 이들 항체를 사용하여, 인간의 혈청과 랫의 뇌에서의 Swir1-면역반응성 존재를 확인하였으며, 이러한 결과는 BC021944로 예측된 상기 오픈 리딩 프래임은 분비된 작은 펩티드를 코딩한다는 결론을 강력하게 뒷받침하였다. 인간 혈장에서 Swir1-면역반응성을 검출하였다(데이타 미기재). 랫의 뇌에서, Swir1 면역반응성을 가진 신경원이 시상하부의 궁상 핵(arcuate nucleus)에서 확인되었다. 이러한 결과의 의미는, 시상하부의 궁상 핵에 있는 신경원이, 조건적 발열(facultative thermogenesis) 및 신체 활동과, 글루코스 항상성에 대한 작용을 통해, 에너지 소모의 조절과 연관되어 있다는 것이다[Cone RD. Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nat Neurosci. 2005 May;8(5):571-8; Coppari R, Ichinose M, Lee CE, Pullen AE, Kenny CD, McGovern RA, Tang V, Liu SM, Ludwig T, Chua SC Jr, Lowell BB, Elmquist JK. The hypothalamic arcuate nucleus: a key site for mediating leptin's effects on glucose homeostasis and locomotor activity. Cell Metab. 2005 Jan;1(1):63-72]. FVB/NJ Swir1 마우스에서의 에너지 소모 증가 및 신체 활동 증가는, 따라서, 중추신경계에서의 작용, 보다 상세하게는 시상하부의 궁상 핵에서 신경원의 활성 조절을 기초로 한 작용을 포함할 수 있다.

본 발명을 수행하는 모드

본 발명은 신규한 분비된 단백질(Swir1)과 이의 일부 기능 동정에 관한 것이다. 상기 단백질의 서열은 여러 종의 포유류들에서 매우 보존적인 것으로 확인되었으며, 서열은 서열번호 2 및 12-18에 나타내었다. 아울러, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 이용하여, Swir1을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 감염시키거나, 또는 액틴 프로모터에 의해 통제되는 Swir1 DNA를 이용하여 형질전환 종을 제조함으로써, Swir1 단백질을 과다 발현하는 마우스를 제조하였다.

일 예로, Swir1 단백질, 단편, 유도체 또는 유사체를 치료적으로 사용하여, 체중 증가와 관련된 병태생리 상태, 예컨대 비만, 고혈당, 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 고지혈증 및 인슐린 비-의존적인 2형 당뇨병을 예한다.

다른 예로, 정제된 Swir1 단백질, 단편, 유도체 또는 유사체는 다양한 포유류로부터 분리하거나, 합성하거나, 또는 도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1에서 오픈 리딩 프래임으로부터 파생된 20개 이상의 아미노산을 코딩하는 핵산을 이용하여 단백질, 단편, 유도체 또는 유사체를 발현하는 세포 배양물을 이용함으로써, 제조한다.

다른 예로, Swir1 단백질, 이의 단편, 유도체 또는 유사체에 대한 항체를 만든다. 이러한 항체는 체액을 포함한 여러가지 샘플들에서 Swir1 단백질을 동정하기 위하여 키트에 사용할 수 있다.

다른 예로, Swir1 서열을 활성 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터에 연결하여 Swir1 단백질을 과다 발현하는, 형질전환 동물을 제조한다.

다른 예로, 서열번호 1의 적어도 오픈 리딩 프래임(도 4에서 밑줄친 부분)을 포함하는 형질전환 벡터를 제조한다.

도 1A는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식(LF) 또는 고 지방식(HF)으로 12주간 식이한 후, 6달된 암컷 마우스에서의 체중 차이를 예시한 것이다(식이의 유의한 효과는 "*" (p<0.001) 또는 "#" (p<0.05)로 표시하고, 식이들에서 유의한 효과는 문자로 표시하고, 그룹에서 유의한 차이(p<0.05)는 다른 문자로 표시하고, 유의성은 2원 AVOVA를 기초로 함).

도 1B는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식(LF) 또는 고 지방식(HF)으로 12주간 식이한 후, 6달된 암컷 마우스에서의 초기 체중에 대한 백분율로서 체중 증가 차이를 예시한 것이다(식이의 유의한 효과는 "*" (p<0.001) 또는 "#" (p<0.05)로 표시하고, 식이들에서 유의한 효과는 문자로 표시하고, 그룹에서 유의한 차이(p<0.05)는 다른 문자로 표시하고, 유의성은 2원 AVOVA를 기초로 함).

도 1C는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식(LF) 또는 고 지방식(HF)으로 12주간 식이한 후, 6달된 암컷 마우스에서의 체지방% 차이를 예시한 것이다(식이의 유의한 효과는 "*" (p<0.001) 또는 "#" (p<0.05)로 표시하고, 식이들에서 유의한 효과는 문자로 표시하고, 그룹에서 유의한 차이(p<0.05)는 다른 문자로 표시하고, 유의성은 2원 AVOVA 를 기초로 함).

도 1D는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식(LF) 또는 고 지방식(HF)으로 12주간 식이한 후, 6달된 암컷 마우스에서의 지방량 차이를 예시한 것이다(식이의 유의한 효과는 "*" (p<0.001) 또는 "#" (p<0.05)로 표시하고, 식이들에서 유의한 효과는 문자로 표시하고, 그룹에서 유의한 차이(p<0.05)는 다른 문자로 표시하고, 유의성은 2원 AVOVA를 기초로 함).

도 1E는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식(LF) 또는 고 지방식(HF)으로 12주간 식이한 후, 6달된 암컷 마우스에서의 제지방량(fat-free mass) 차이를 예시한 것이다(식이의 유의한 효과는 "*" (p<0.001) 또는 "#" (p<0.05)로 표시하고, 식이들에서 유의한 효과는 문자로 표시하고, 그룹에서 유의한 차이(p<0.05)는 다른 문자로 표시하고, 유의성은 2원 AVOVA를 기초로 함).

도 2A는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 고 지방식(HF)으로 식이한 암컷 마우스의 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 간 횡단면을, 조직 비교한 것이다.

도 2B는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 저 지방식 및 고 지방식으로 식이한 경우 지방세포(체지방율%) 함수로서 간 중량 차이를 예시한 것이다.

도 2C는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결 핍 마우스(Mc4rKO)에서, 중간 수준의 고 지방식으로 식이한 수컷 및 암컷 마우스(n=5-6/그룹)의 평균 간 중량 차이를 예시한 것이다("*"는 WT 및 Mc3rK0 마우스에 대해 p<0.05임을 의미함).

도 2D는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 고 지방식이한 마우스 간에서의 스테로일-CoA 불포화화효소(desaturase) 1 (SCD1)의 발현 차이를 예시한 것이다. 데이타는 임의 단위(a.u.)로 나타낸다("*"는 WT 및 Mc3rK0 마우스에 대해 p<0.05임을 의미함).

도 2E는 3종의, 천연형(WT), Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO) 및 Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO)에서, 고 지방식이한 마우스 간에서의 아포리포단백질 A4 (ApoA4)의 발현 차이를 나타낸 것이다("*"는 WT 및 Mc3rK0 마우스에 대해 p<0.05임을 의미하며; "#"는 동일 성에서, WT 마우스에 대해 p<0.05임을 의미함).

도 3A는 천연형(WT) 마우스와 비만 Mc3r -/- 결핍 마우스(Mc3rKO)에서, 간에서의 AK009710 mRNA 발현량(WT 발현량에 대한 백분율로 기재)을 나타낸 것이다.

도 3B는 천연형 마우스(WT), Mc4r -/- 결핍 마우스(Mc4rKO), 및 렙틴-결핍성 Lep^ob/Lep^ob 마우스(2가지 비만 모델)에서, 간에서의 AK009710 mRNA 발현량(WT 발현량에 대한 백분율로 기재)을 나타낸 것이다.

도 3C는 염수나 렙틴을 2일간 4번 주사한(0.5 mg/g) 렙틴-결핍성 Lep^ob/Lep^ob 마우스에서, 간에서의 AK009710 mRNA 발현량(염수를 주사한 마우스에서의 발현량에 대한 백분율로 기재)을 나타낸 것이다.

도 4는 밑줄 친 Swir1 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프래임이 포함된 Swir1 유전자의 핵산 서열(BC021944; 서열번호 1)와 추정의 아미노산 번역 산물 Swir1(서열번호 2)를 나타낸 것이다.

도 5는 마우스(서열번호 2), 인간(서열번호 14), 랫(서열번호 12), 개(서열번호 15), 돼지(서열번호 16), 소(서열번호 17), 양(서열번호 18), 및 침팬지(서열번호 13)에서 추정되는 Swir1 단백질 서열을 정렬한 것으로, 다클론 항체(pAB1 ((서열번호 8) 및 pAB2(서열번호 9))를 제조하기 위해 사용한 추정의 분비된 폴리펩티드의 영역이 표시된다.

도 6A는 인간 조직 샘플에서의 Swir1 단백질을 코딩하는 AK009710 DNA 서열의 방사능 표지된 부분을 이용한 노던 블롯 분석 결과이다(레인 1-8은 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격근, 신장 및 췌장 각각으로부터 추출한 RNA임).

도 6B는 전장 마우스 AK009710 DNA 프로브를 이용한 마우스 조직 샘플에 대한 노던 블롯 분석에서 Swir1 mRNA 밴드의 상대적인 세기를 나타낸 것이다.

도 6C는 pCMV-Swir1:Flag, pCMV-GFP로 형질감염된 HEK293 인간-신장 유래 세포의 용혈물(Pel)과 배지(M) 또는 Swir1:Flag 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 HEK293 세포의 배지[비-형질감염된 DNA(레인 1,2); pCMV-Swir1:FLAG 구조체로 형질감염됨(레인 3, 4); pCMV-Swir1로 형질감염됨(레인 5,6); 또는 pCMV-GFP로 형질감염됨(레인 7,8); Ad5Swir1:FLAG로 형질감염됨(레인 9); Ad5Swir1로 형질감염됨(레인 10); 또는 Ad5GFP로 형질감염됨(레인 11)]에서의, FLAG 면역반응성에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. Swir1 단백질을 가시화하기 위해, 융합 단백질에 C-말단 FLAG-에피토프 테그를 붙였다.

도 6D는 분석하기 4일 전에 Ad5-Swir1:FLAG를 주사한 Mc4r-/- 마우스 유래의 다양한 조직(간, 근육 및 뇌)과 대조군들 즉, 양성(Ad5-Swir1:FLAG를 감염시킨 HEK293 세포) 및 음성(주사하지 않은 Mc4r-/- 마우스의 간)에서의, Swir1 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.

도 7A는 Swir1의 N-말단에 대한 다클론 항체(pAB1)와 인큐베이션한 후(도 5에서와 같이), 재조합 Ad5Swir1(천연 단백질) 또는 Ad5Swir1:FLAG(C-말단에 FLAG이 달린 융합 단백질)로 감염된 HEK293 세포의 용혈물을 이용한 웨스턴 블롯의 분석 결과이다.

도 7B는 Swir1의 C-말단에 대한 다클론 항체(pAB2, 서열번호 9)와 인큐베이션한 후(도 5), 재조합 Ad5Swir1(천연 단백질) 또는 Ad5Swir1:FLAG(C-말단에 FLAG이 달린 융합 단백질)로 감염된 HEK293 세포의 용혈물을 이용한 웨스턴 블롯의 분석 결과이다.

도 7C는 마우스 대사에 대한 Swir1 처리 효과를 테스트하기 위한, 여러가지 마우스 종의 꼬리 정맥에 Ad5Swir1 또는 Ad5-GFP를 투여하는데 사용한 처리 프로토콜을 예시한 것이다(결과는 표 1에 나타냄.).

도 8A는 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한 후 8일째, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 지방산 합성효소(Fasn) mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다. 데이타는 임의 단위(AU)로 나타낸다(n=6-8/그룹; "*" p<0.05).

도 8B는 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하고 8일 후, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 스테아로일-CoA 불포화화효소(Scd1) 단백질의 발현 수준을 나타낸 것이다. 데이타는 임의 단위(AU)로 나타낸다(n=6-8/그룹; "*" p<0.05).

도 8C는 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하고 8일 후, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 아세틸 CoA 카복실라제(Acc) mRNA의 발현 수준을 나타낸 것이다. 데이타는 임의 단위(AU)로 나타낸다(n=6-8/그룹; "*" p<0.05).

도 8D는 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하고 8일 후, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 인슐린 내성에 참여하는 유전자(사이토카인 시그널링 억제자)의 발현 수준을 나타낸 것이다. 데이타는 임의 단위(AU)로 나타낸다(n=6-8/그룹; "*" p<0.05).

도 9A는 Swir1을 과다 발현하는 형질전환 마우스 종을 제조하는데 사용한 트랜스진(BAP-Swir1)의 구조를 나타낸 것이다.

도 9B는 5주째에 FVB/NJ 시조(founder)의 형질전환 마우스 새끼의 간에서의 Swir1 발현량을 나타낸 것이다.

도 9C는 9주째에 FVB/NJ 시조의 형질전환 마우스 새끼(도 9A의 트랜스진을 이용하여 제조)로부터 유래된 혈청에서의 공복 트리글리세라이드(TG)의 농도를 나타낸 것이다.

도 9D는 5주 및 9주째에 FVB/NJ 시조의 형질전환 마우스 새끼(도 9A의 트랜스진을 이용하여 제조)에서, 대조군과 비교하여 체지방율(체지방율%; 좌측 그래프) 및 지방량(제지방량(FFM) 및 지방량(FM) 둘다를 나타냄; 우측 그래프)로 측정한, 신체 구성을 나타낸 것이다.

도 9E는 60%의 고 지방식이하고 7일 후에 FVB/NJ 시조의 형질전환 마우스 새끼(도 9A의 트랜스진을 이용하여 제조)에서, 지방량(제지방량(FFM) 및 지방량(FM) 둘다를 나타냄)의 변화를 나타낸 것이다.

도 10은(BAP-Swir1을 C57BL/6J 난모세포에 주입하여 수득한) C57BL/6J 새끼의 게놈내 BAP-Swir1 삽입에 대한 PCR 스크리닝 결과로, 게놈에 트랜스진을 삽입한 23마리의 새끼 중 6마리에서 삽입이 확인된다.

도 11A는 단백질 Swir1의 분비된 부분(Swir1³⁴ ^-76; 서열번호 10)을 적용한 후 15분 동안의 3T3-L1 지방세포에 대한 Erk 인산화 증가를 나타낸 것이다.

도 11B는 분비된 단백질 Swir1(Swir1³⁴ ^-76; 서열번호 10)을 적용한 후 15분 동안의 HepG2 간세포에 대한 Erk 인산화 증가를 나타낸 것이다.

도 12A는 3달간 2가지 식이(LF = 10% kJ/fat; HF = 60% kJ/fat) 중 어느 하나를 식이한 3가지 종(C57BL/6J(WT), Mc3rKO(Mc3r), 또는 Mc4rKO(Mc4r)) 유래의 6달된 마우스에서, 시상하부에서의 Swir1 mRNA 발현과 체중 간의 관계를 나타낸 것이다.

도 12B는 3달간 2가지 식이(LF = 10% kJ/fat; HF = 60% kJ/fat) 중 어느 하나를 식이한 3가지 종(C57BL/6J(WT), Mc3rKO(Mc3r), 또는 Mc4rKO(Mc4r)) 유래의 6달된 마우스에서, 시상하부에서의 Swir1 mRNA 발현과 HOMA-IR[(공복 인슐린 x 글루 코스)/ 22.5] 간의 관계를 나타낸 것이다.

도 12C는 3달간 2가지 식이(LF = 10% kJ/fat; HF = 60% kJ/fat) 중 어느 하나를 식이한 3가지 종(C57BL/6J(WT), Mc3rKO(Mc3r), 또는 Mc4rKO(Mc4r)) 유래의 6달된 마우스에서, HOMA-IR[(공복 인슐린 x 글루코스)/ 22.5]과 시상하부의 Socs3 (사이토카인 시그널링의 억제자 3) mRNA 발현 간의 관계를 나타낸 것이다.

도 13A는 3일간 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(FVB.Tg)에서의 신체 활동성(10분간 평균 빔 차단(beam break) 횟수로 측정)을 나타낸 것이다.

도 13B는 24시간동안 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(Tg)에서 신체 활동성(10분간 평균 빔 차단(beam break) 횟수로 측정)을 주야 기간으로 나타낸 것이다.

도 13C는 24시간 동안 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(FVB.Tg)에서의 총 체지방 산화(RER)를 주야 기간으로 나타낸 것이다.

도 13D는 24시간 동안 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(FVB.Tg)에서의 대사율(VO2 (ml/h x 10³)로 측정)을 주야 기간으로 나타낸 것이다.

도 13E는 24시간 동안 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(FVB.Tg)에서의 제지방량의 함수로서 대사율(VO2 (ml/h/gFFM x 10³)로 측정)을 주야 기간으로 나타낸 것이다.

도 13F는 24시간 동안 천연형(WT) 및 BAP-Swir1 형질전환 마우스(Tg)에서의 체중에 대한 함수로서 대사율(VO2 (ml/h/gBW x 10³)로 측정)을 주야 기간으로 나타 낸 것이다.

실시예 1

Swir1 단백질과 이의 기능 발견

마른 및 비만 Mc3rKO 마우스에서의 간 유전자 발현을 분석하는 마이크로어레이를, 16,463-18,400개의 70-mer 올리고뉴클레오티드로 구성된 라이브러리가 프린트된 어레이(Mouse Array-Ready Oligo Set Version 2.0, Qiagen Operon, Alameda, CA)를 이용하여 수행하였다(34-36). 마이크로어레이 데이타는, 비만에 부차적인 지질 대사(아포리포단백질) 및 산화 스트레스에 관여하는 유전자의 발현 증가를 나타내었다. 흥미롭게도, 단 3개의 유전자만 연령, 성별 및 지방증과 상관없이 Mc3rKO 마우스의 간에서 발현이 감소되었다. 유전자 2종은 기능이 알려진 단백질을 코딩한다: 당단백질 및 당지질로부터 시알릭산을 절단하는 효소를 코딩하는 뉴르아미니다제 3(neu3)와, 유기 음이온 트랜스포터를 코딩하는 용질 캐리어 패밀리 21(slc21a). 3번째 유전자(AK009710)는 신규한 유전자이며, 데이타베이스에 그 기능은 등재되어 있지 않았다.

정량 실시간 PCR로, Mc3rKO의 간에서의 적절한 수준의 AK009710 발현 감소 경향을 보이는 마이크로어레이 데이타를 확인하였다(도 3A). 흥미롭게도, 심각한 인슐린 내성을 보이는 Mc4rKO 마우스 및 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)에서, 보다 급격한 AK009710 발현 감소가 관찰되었다(도 3B). 아울러, 렙틴을 단기 처리(2일 간 0.5 mg/g의 렙틴을 4번 주사)하면, Lep^ob/Lep^ob 마우스의 간에서 Swir1이 현저하게 증가하였다(도 3C). 6주령의 마른 Mc4rKO에서의 AK009710 발현은 정상이며(데이타 미기재), 이는 Mc4rKO의 간에서의 발현 감소가 노화 관련 비만 발병, 인슐린 내성 및 간 지방증에 부차적임을 나타낸다(32). 또한, 식이-유발성 비만 C57BL/6J 마우스(n=13, R²=0.67, P<0.001)에서, AK009710 발현은 공복 글루코스와 음의 관계를 갖는다(데이타 미기재).

종합하여, 이러한 결과들은, 간에서의 이의 발현으로 인슐린 감수성 및 간 지방증을 감소시키는 소형의 분비된 단백질 동정을 나타낸다. 간에서의 AK009710 발현 감소는 간 지방증 및 인슐린 내성의 중증도와 상호 관련성이 있으며, 인슐린 감작제에 의해 감소가 반전된다는 결과를 토대로, "인슐린 내성으로 억제된 1"(Swir1)이라는 명칭을 선정하였다.

AK009710 mRNA을 타겟으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 다양한 마우스 비만 및 인슐린 내성 모델의 간 cDNA에서 AK009710 유전자 발현을 측정하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 센스 5'-cctgagggtgctgtctgtcatg-3'(서열번호 3), 안티센스 5'-cagtagcagcaagaagcctacg-3'(서열번호 4), 프로브 5'-6FAM-ctctcatcgccatcgtctgca-BHQ-3'(서열번호 5). 첫 마이크로어레이 결과와 일치되게, Mc3r-/- 마우스의 간에서의 AK009710 mRNA는 WT 마우스에 비해 하향 조절되었다(55%, p<0.05; 도 3A). 이후, 다른 2가지 비만 모델: Mc4r-/- 마우스 및 렙틴-결핍성 Lep^ob/Lep^ob 마우스에서의 간내 AK009710 mRNA 발현을 측정하였다. 이들 모 델 둘다에서 AK009710 mRNA의 발현은 천연형 마우스(WT) 보다 약 10배 낮았다(도 3B). 모든 동물을 그룹화하였을 때, AK009710 mRNA 발현과 글루코스 및 인슐린 수치 간의 음의 관계가 관찰되었다(데이타 미기재). 자유롭게 식이한 다음, 16시간 또는 24시간 절식시키고, 다시 4시간 재식이한, 어린 및 노화된 WT 마우스에서, 간내 AK009710 유전자 발현은 변하지 않았다(데이타 미기재). AK009710은 영양 상태에 따라 바뀔 수 있는 것으로 생각되지 않는다.

AK009710 mRNA가 인슐린 내성 발현을 이차적으로 조절할 수 있는지를 결정하기 위해, AK009710 mRNA를 어린 정상 인슐린혈증 및 노화된 고인슐린혈증 Mc4r-/- 마우스에서 측정하였다. AK009710 mRNA는 어린 Mc4r-/- 마우스(평균 연령 ~7 주령)에서는 천연형 마우스와 유사한 것으로 관찰되었지만, 노화된(~ 16주령) Mc4r-/- 마우스에서는 현저하게 감소되었다(데이타 미기재). 또한, AK009710 mRNA를 당뇨병 및 비-당뇨병 개체의 수 개의 인간 유래 간세포(n=4)에서 측정하였다. 발현은 당뇨병 샘플에서 낮은 경향이 있지만, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(데이타 미기재).

그러므로, Mc3r-/- 및 Mc4r-/- 마우스의 비만도는 비슷하였고, 인슐린 내성 및 증가된 혈청 지질(트리글리세라이드, 콜레스테롤)은 Mc4r-/- 마우스에서 보다 심한 것으로 알려져 있다. 간에서의 AK009710 유전자 발현 감소는 Mc4r-/- 마우스 에서의 인슐린 내성 및 고지혈증의 공지된 중증도와 상호 관련 있었다.

실시예 2

서열 및 생물정보 분석

AK009710은 1247 bp의 마우스 혀 cDNA 클론으로, Unigene cluster Mm.34074, 2310040A07Rik: RIKEN cDNA 2310040A07 유전자에 속한다. 가설에 의하면, 이는 서열의 5' 말단 바로 옆에서부터 534개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩할 수 있다. 이러한 추정 단백질은 메티오닌 잔기로 시작되지 않는다는 것을 고려하여, 절단형 산물(truncated product)로 기재되어 있었다. NCBI 데이타베이스에서의 상동성 EST 또는 cDNA 서열에 대한 AK009710의 BLAST 분석은, 87 aa (UNQ470/GAAI470)의 가정의 단백질을 코딩하는 대규모의 분비된 단백질 발견 선도(Secreted Protein Discovery Initiative)에 의해 발견된 인간 전사체인, NM198573와 유의적으로 매치되는 것으로 확인되었다(37). 인간 서열과의 매치 - NM_198573은 392개의 뉴클레오티드, p=5e^-83와 85% 동일하였다. 인간 서열은 하나의 엑손이 87개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하였다. 6개의 프래임에서의 AK009710의 번역은 76개의 아미노산으로 구성된 단백질(서열번호 2)을 코딩하는 오픈 리딩 프래임인 것으로 확인되었다. 이러한 추정의 마우스 단백질과 NM_198573 (GAAI470, 또는 UNQ470)에 의해 코딩된 인간 단백질 간의 정렬을 통해, 처음 37개의 잔기가 매우 상동한 것으로 확인되었다. UNQ470/GAAI470은 염색체 9p13.2에 위치되며, 이는 CNTFR(ciliary neurotrophic factor receptor) 유전자와 인접되어 있 다.

AK009710의 서열은 마우스 간에서 분리된 cDNA를 이용하여 검증하였다. 또한, National Institutes of Health Mammalian Gene Collection (MGC) 프로그램에 의해 마우스 간에서 868 bp cDNA를 클로닝하였는데, NCBI 데이타베이스에 최근에 등록된 등재 번호 BC021944와 본 실험의 서열분석 데이타와 일치된다(도 4, 서열번호 1). BLAST 분석을 통해, 예측된 마우스의 76 aa 서열(서열번호 2)이 수종의 포유류(도 5; 서열번호 12 (랫), 서열번호 13 (침팬지); 서열번호 14 (인간); 서열번호 15 (개); 서열번호 16 (돼지); 서열번호 17 (소); 서열번호 18 (양))에서 매우 보존적인 것으로 확인되었다. 도 5에서, pAB1 (서열번호 8) 및 pAB2 (서열번호 9)는 다클론 항체를 제조하기 위해 사용한 추정의 분비된 폴리펩티드의 영역이다. 예측된 신호 서열은 밑줄로 표시되어 있다. 또한, 마우스 단백질인 서열번호 2의 아미노산 34-76(Swir1³⁴ ^-76; 서열번호 10) 및 아미노산 39-76(Swir1³⁹ ^-76; 서열번호 11)에 해당되는 펩티드를 합성하였다.

AK009710 및 인간 GAAI470 서열로부터 추정의 마우스 서열의 추가적인 분석을 통해, GenBank의 인간 서열에서 하나의 뉴클레오티드 갭이 확인되었다. 따라서, AK009710 PCR 산물을 클로닝하였고, 양 방향으로 서열분석하여, 마우스 또는 인간 서열이 어느 쪽이 맞는지를 검증하였다. 서열로 검증된 AK009710 마우스 클론은 76개의 아미노산 번역 산물이었다(서열번호 2)(도 4). 공개적으로 이용가능한 인간 GAAI470 Origene 클론을 분석하였으나, 뉴클레오티드 갭을 포함하지 않는 것으로 나타났으며, 이는 GenBank의 NM_198573 서열에 서열분석 에러를 의미한다. 인간을 포함한 여러가지 종들에서의 AK009710 서열 정렬로, 랫, 인간, 마우스 및 챔팬지는 단백질 수준에서 100%의 상동성이 확인되었다(도 5).

생물정보 분석에 의해, 이 단백질은 분비된 펩티드와 매우 유사하며(87% 확률, SignalP 3.0), 33번 및 34번 사이에 대부분 절단 부위가 있을 수 있다는 것이 확인되었다. 인간 서열은, 예측된 절단 위치의 3'에 모두 있는 하나의 가능성 있는 세린 부위와 하나의 가능성 있는 트레오닌 인산화 부위, 뿐만 아니라 역시 절단 부위의 3'에 있는 6개의 가능성 있는 당화 부위를 포함한다.

실시예 3

Swir1 의 조직 분포

AK009710 mRNA의 조직 분포를 평가하기 위해, 76개의 아미노산으로 구성된 단백질 Swir1을 포함하는 210 nt 서열과 인간 다중 조직 노던 블롯(BD Biosciences, Palo Alto, California)을 이용하여, 노던 블롯을 수행하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, ~1.35 kb의 단일 밴드가 인간의 뇌 및 간 샘플에서만 검출되었고, 간에서 가장 높은 수준으로 검출되었다. 그러나, 도 6B에서와 같이, Swir1은 마우스의 간, 뇌 및 근육에서 발견되었다.

실시예 4

Swir1 이 분비된 폴리펩티드임을 검증

생물정보학적 분석으로, AK009710이 분비된 펩티드임을 제시하는, 추정의 신호 서열의 존재가 예측되었다. 이를 조사하기 위해, 76개의 아미노산으로 구성된 단백질의 코딩 서열을, 제한 효소 부위가 부착된 Not1 (5'-ggggcggccgcaccatgggggcagccatctcccaa-3' (서열번호 6)) 및 Xho1 (5'-gggctcgagggccagagcccttcagggctgcag-3' (서열번호 7)) 프라이머를 이용한 PCR로 마우스 간의 cDNA로부터 증폭시켰다. 이 산물을 C 말단에 FLAG 에피토프가 있는 pCMV-Tag1 벡터에 연결하고(pCMV-Swir1:FLAG), HEK-인간 신장 유래 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 또한, 이 산물을 사용하여 2개의 아데노바이러스 구조체를 제조하였다 - 하나는 Swir1에 FLAG 에피토프(Ad-Swir1:FLAG)를 부착시키고, 다른 하나는 FLAG 에피토프(Ad-Swir1)를 부착하지 않음.

HEK293 세포에 pCMV-Swir1 또는 pCMVSwir1:FLAG를 형질감염시켰다. 16시간 후 배지를 수집하고, 면역침강한 다음, 20% 폴리아크릴아미드 겔에 전개시켜 항-FLAG 항체로 가시화하였다. 이 실험은 천연 또는 FLAG-달린 Swir1을 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ad5)를 이용하여 반복하였다.

HEK293 세포에, 빈 벡터(레인 5, 6) 또는 GFP를 포함하는 벡터(레인 7, 8)를 형질감염시키거나 형질감염하지 않았을 때, FLAG-면역반응 밴드는 나타나지 않았다(도 6C). 그러나, pCMV-Swir1:FLAG 구조체를 HEK293 세포(레인 3, 4)에 형질감염시켰을 때에는, FLAG-양성 면역반응성은 배지 및 세포 펠렛 모두에서 검출되었으며, 이는 형질감염된 Swir1 산물의 적어도 일부는 세포에서 배지로 능동적으로 분비되었음을 의미한다. 유사한 결과는, Ad-Swir1:FLAG를 형질감염시킨 HEK293 세포의 배지(도 8, 레인 9)에서 관찰되었다. 레인 10 및 11에서는, FLAG 에피토프가 없거나 또는 GFP가 있는 각각의 Swir1을 포함하는 아데노바이러스로 감염된 세포의 배지에서는, FLAG 면역반응성이 나타나지 않았다. 에피토프-달린 융합 단백질을 발현하는 발현 벡터(pCMV-Swir1FLAG)로 형질감염된 HEK-293 세포의 배양 배지내의 FLAG 면역반응성의 존재는, 76개의 아미노산으로 구성된 단백질의 미확인된 부분이 분비됨을 뒷받침하였다.

꼬리 정맥에 주사된 대부분의 아데노바이러스는 간에 침범한다(38). 아데노바이러스의 꼬리 정맥 주사가 간 뿐만 아니라 다른 조직들에서의 Swir1 mRNA의 발현 증가를 유도하는지를 조사하기 위해, 3마리의 Mc4r-/- 마우스에 Ad5-Swir1:FLAG 아데노바이러스를 주사하고, 4일 후 조직을 수집하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해, 간, 근육 및 뇌 조직에서의 FLAG 면역반응성의 존재가 확인되었으며, 이는 이들 조직내 Swir1의 존재를 의미한다(도 6D). Ad5-Swir1FLAG로 감염된 마우스 조직에서의 Swir1FLAG 면역반응성 분포는, 간에서 순환계로 분비된 폴리펩티드와 일치된다. 이들 두가지 조사는 Swir1이 분비된 단백질임을 시사하였다.

실시예 5

비만 인슐린 내성 마우스의 Ad5 - Swir1 : Mc4rKO 처리

재조합 아데노바이러스 벡터-매개 발현을 이용하여, 간 대사 및 인슐린 감수성의 조절을 평가하였다(39-41). 76 aa 단백질(Ad5-Swir1), C-말단에 FLAG이 달린 융합 단백질(Ad5-Swir1:FLAG), 또는 음성 대조군으로 푸른 형광 단백질(Ad5-GFP)을 발현하는 3개의 재조합 아데노바이러스 벡터를 제작하였다. 꼬리 정맥에 주사한 후, 단백질의 발현은 항-FLAG 항체를 이용하여 검증하였다(도 6D a및 데이타 미기재). Swir1의 합성은, Ad5-Swir1으로 형질감염된 HEK293 세포에서 추정의 분비된 단백질의 N- 및 C-말단 영역에 대한 다클론 항체(pAB1 & pAB2, 도 5)를 이용하여 검증하였다(Sigma Genosys, The Woodlands, TX)(도 7A, B).

Swir1이 글루코스 대사에 관여하는지를 확인하기 위해, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP (5x10⁸ pfu)를 20주령의 수컷 및 암컷 Mc4r-/- (각 그룹 당 n=3) 마우스의 꼬리 정맥에 조사하였다. 2가지 동물 그룹은 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하기 전에, 체중, 혈당 및 글루코스 허용성을 매치시켰다. IPGTT(intraperitoneal glucose tolerance test)를 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP 주사하기 일주일 전에 수행하였으며, 모든 마우스가 글루코스에 불내성인 것으로 관찰되었다. 철야 금식한 후 글루코스를 1g/kg으로 1회 복막내 주사하는, IPGTT를 마우스에 대해 수행하였고, W. Fan et al ., "The Central Melanocortin System Can Directly Regulate Serum Insulin Levels," Endocrinology, vol. 141, pp. 9 3072-3079 (2000)에 언급된 바와 같이, 수 일 간격으로 동물의 꼬리 혈액으로부터 혈중 글루코스 미터 및 테스트 스트립(Glucometer Elite, Bayer Corp., Elkhart, Indiana)을 이용하여 혈중 글루코스를 측정하였다.

마우스의 꼬리 정맥에 100 ㎕의 희석제(DMEM) 중의 5x10⁸pfu의 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하였다. 4일간의 실험동안, 동물을 매일 관찰하고 체중을 측정하였다. 4일째에, 동물은 다시 IPGTT 하였다(0.4 mg 글루코스/g 체중).

Ad5-Swir1를 주사한 후 4일 후에, IPGTT로 측정된 바와 같이 마우스는 개선된 글루코스 허용성을 보였다(데이타 미기재). 실험동안 체중, 혈당 또는 콜레스 테롤 수치 변화는 없었다. 인슐린과 혈청 트리글리세라이드 수치는 감소되는 경향이 있었다(표 1).

표 1. 아데노바이러스 주입 4일 후 Mc4r -/- 마우스의 특징

그룹	체중 (g)	글루코스 (mg/dL)	인슐린 (ng/ml)	콜레스테롤 (mg/dL)	트리글리세라이드 (ng/ml)
Ad5-Swir1	50.4 ± 1.8	184 ± 10	5.9 ±1.5	91 ± 7	26 ± 4
Ad5-GFP	49.5 ± 2.2	169 ± 16	10.4 ± 2.0	82 ± 6	38 ± 6

실시예 6

비만 인슐린 내성 마우스의 Ad5 - Swir1 : B6 Ay /a 처리

~3달 동안 매우 고지방식을 유지한 수컷 C57BL6 Ay/a 마우스(n=9/그룹)의 꼬리 정맥에 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사하는, 2번째 아데노바이러스 실험을 수행하였다. 마우스는 주사 후 회복을 위해 1주일 두었으며, 이후 IPGTT를 수행하였다. 다시 회복하는데 1주일을 준 후, 인슐린 허용성 테스트(ITT)를 수행하였다.

주사 후 20일째에, 체중(40.3 ± 1.3 g, Ad5-Swir1 마우스; 41.4 ± 1.2 g, Ad5-GFP mice), 공복 인슐린(0.97 ± 0.2 ng/mL, Ad5-Swir1 마우스; 1.13 ± 0.2 ng/mL, Ad5-GFP 마우스), 또는 공복 혈당 수치(126 ± 7 mg/dL, Ad5-Swir1 마우스; 139 ± 8 mg/dL, Ad5-GFP 마우스)의 변화는, 관찰되지 않았다. 주사 후 7일째의 IPGTT에 의해, 30분(p=0.06) 및 45분(p=0.15)에 Ad5-Swir1 그룹에서 글루코스 허용성에 매우 작은 개선이 확인되었다. 주사 후 14일째의 혈당 수치 변화는 그룹들간에 현저하게 차이가 있었으며, Ad5-Swir1 그룹에서 현저하게 감소되었다(데이타 미기재). 주사 후 14일째의 ITT에서, 어떤 시간대에서도 인슐린 감수성에 유의한 차 이는 나타나지 않았지만, (인슐린 주사 후 30분째의 혈당에서 베이스라인 혈당을 제하고 30으로 나눈) Ki는 유의하게 상이하였다.

이들 마우스에서 관찰된 주사 후 14일째의 낮은 공복 혈당 수치는 주사 후 21일째에는 나타나지 않았다. Mc4r-/- 마우스에서의 1차 아데노바이러스 실험과 일치되게, Ad5-Swir1 그룹에서는 혈청 트리글리세라이드가 감소되는 경향이 있었다(표 2).

표 2. Ad5 - Swir 감염은 마우스 비만 및 인슐린 내성 모델에서의 대사 프로파일 개선을 입증하는 증거와 관련 있다.

* Ad5-GFP 처리 대조군(종내)과 비교하여 P<0.05, n=5-8/그룹.

종	처리	주사전 체중	주사후 체중	간 중량(g)	체중 대비 간 중량%	간 지질 함량( mg /g)	간 총 지질( mg )	혈청 TG ( mg / dL )	혈청 TC ( mg / dL )	HOMA - IR
*OBOB*	GFP Swir1	64.0 +1.9 65.0 +2.2	64.8 +2.0 64.6 +2.0	4.7 +0.2 4.3 +0.2	7.4 +0.3 6.7 +0.3	142+8 128+7	654 +25 552 +50	63+6 38+4*	173+6 146+8 *	308+114 157+18
KK - A ^y	GFP Swir1	48.0 +1.9 46.6 +1.2	46.7 +1.7 45.3 +0.8	2.1 +0.2 1.8 +0.1	4.7 +0.3 4.3 +0.1	57+10 33+2*	117 +24 58 +5 *	435+53 315+16*	214+13 172+9	98+19 62+11
Ay /a	GFP Swir1	45.2 +2.5 44.8 +1.4	44.6 +2.1 44.5 +1.1	2.2 +0.2 1.8 +0.2	5.1 +0.2 4.2 +0.3*	119+11 81+20	282 +39 145 +41*	71+18 53+4	79+3 72+2	40+6 28+4

실시예 7

비만 인슐린 내성 마우스의 Ad5 - Swir1 처리: Agouti ( KK -A ^y ) 마우스(유전적 으로 비만이고 고지혈증인 마우스)

혈중 지질 측정값에 대한 아데노바이러스 감염 효과를 보다 구체적으로 알아보기 위해, 아데노바이러스 구조체를 추가적으로 정제하여, 바이러스 입자 및 세포 파편 오염원을 제거하였다. 이후, 유전적으로 비만이고 고지혈증인 KK-A^y(그룹 당 n=6) 마우스의 꼬리 정맥에 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFPAd5-GFP를 주사하는, 다른 아데노바이러스 실험을 수행하였다. 바이러스를 주사한 후, 5일째에 IPGTT를 수행하고, 철야 금식시킨 후 2일째에 희생시켰다.

IPGTT로, 글루코스 허용성은 Ad5-GFP 처리시에 비하여 Ad5-Swir1 처리시에 현저하게 개선되지 않았다. Ad5-GFP와 비교하여, 순환성 트리글리세라이드(28%, p=0.04) 및 콜레스테롤(20%, p=0.02)에서의 통계적으로 유의한 감소가 Ad5-Swir1 그룹에서 관찰되었다(표 1). Ad5-Swir1 마우스의 간 중량은 Ad5-GFP 대조군의 간 중량보다 낮은 경향이 있었다(표 2). Ad5-Swir1와 Ad5-GFP 대조군 사이에, 체중, 혈청 글루코스 및 인슐린 수치는 유의하게 상이하지 않았다(표 2).

표 3. 8일간 Ad5 - Swir1 또는 Ad5 - GFP 를 처리한 KK - A ^y 마우스의 특징

처리	체중 (g)	간 중량 (g)	체중 대비 간%	글루코스 (mg/dL)	인슐린 (ng/mL)
Ad5-Swir1	41.9 ± 0.9	1.8 ± 0.1	4.3 ± 0.1	239 ± 19	4.3 ± 0.7
Ad5-GFP	44.1 ± 1.5	2.1 ± 0.2	4.6 ± 0.2	246 ± 41	5.1 ± 0.9

KK-A^y Ad5-Swir1-처리 마우스의 간에서의 Swir1 mRNA는 Ad5-GFP-처리 마우스에 비해 약 4배 증가되었다(데이타 미기재).

실시예 8

비만 인슐린 내성 마우스의 Ad5 - Swir1 처리: Lep ^ob / Lep ^ob 마우스

아데노바이러스-매개의 Swir1 과다발현의 지질 강하 효과를 확인하기 위해, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 Lep^ob/Lep^ob (OBOB) 마우스(그룹당 n=7-8의 수컷), 다른 고지혈증, 지방증 및 인슐린 내성의 마우스 모델의 꼬리 정맥에 주사하는 다른 실험을 수행하였다. 주사한 마우스는 IPGTT를 하지 않고, 체중 변화를 모니터링하였고, 철야 금식시킨 후 7일째에 죽였다.

Ad5-GFP-처리한 마우스는 7일동안 체중 약 1 g이 증가되었다. 그러나, Ad5-Swir1을 처리하면, 이들 비만 Lep^ob/Lep^ob 마우스에서의 체중 증가는 차단되었다(데이타 미기재). 평균 체중은 이들 그룹들 간에는 통계적으로 상이하지 않았으며, 음식물 섭취는 측정하지 않았다. 또한, KK-A^y 마우스(상기 실시예 7 참조)에서 관찰된 바와 유사한 표현형 변화도 관찰되었다. 혈청 트리글리세라이드는 Ad5-Swir1 그룹(Ad5-GFP 63 ± 6 mg/dL (Ad5-GFP); 38 ± 4 mg/dL (Ad5-Swir1), p=0.006; 표 2)에서 40% 감소되었다. 또한, 혈청 콜레스테롤 수치도 15% 감소되었다(173 ± 6 mg/dL (Ad5-GFP); 146 ± 8 mg/dL (Ad5-Swir1), p=0.02; 표 2). 체중에 대한 백분율로 표시하면, 간 중량 감소 경향은 유의하지 않았다(p=0.12). Ad5-Swir1 그룹에서 공복 혈당 및 인슐린 수치 감소 경향은 통계적으로 유의하지 않았다.

KK-A^y 마우스 및 Lep^ob/Lep^ob 마우스를 이용한 실험에서의 아데노바이러스 구 조체의 정제 및 보다 큰 샘플 집단을 이용하여, 7-8일간 Swir1의 과다 발현이 대조군 마우스에 비해 순환성 트리글리세라이드 및 콜레스테롤 수치 감소를 유도한다는 것을 입증하였다(표 2). 이러한 작용 경향은 미정제 아데노바이러스를 이용한 이후 시간대에 관찰한 이전의 실험에서 관찰되었다. 간에서의 Swir1 유전자 발현은 이들 실험들에서 Ad5-Swir1-처리 그룹에서 증가되었지만, 이후 시간대에 대한 이전의 실험에서는 증가가 검출되지 않았다. 이러한 이론에 결부되고자 하지 않으며, Swir1의 유전자 발현 증가는 Swir1 단백질의 순환성 농도 증가를 유도할 것으로 생각된다.

실시예 9

비만 인슐린 내성 마우스 Ad5 - Swir1 의 결과 종합

종합적으로, 5x10⁹ pfu의 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 잭슨 레보레이토리(Bar Harbor, Maine)에서 구입한 KK-A^y, B6 Ay /a, 또는 OBOB 마우스의 꼬리 정맥에 투여하였다. 도 7C의 처리 프로토콜은, 이 기간동안 Ad5-Swir1:FLAG의 피크 발현을 입증하는 파일롯 실험을 토대로 하였다(데이타 미기재). 동물의 체중 및 음식물 무게를 매일 기록하였다. Ad5-Swir1 감염은 이 실험에 사용한 마우스 종에서 매우 허용적이었다. 처리 기간동안, Ad5-GFP 감염시킨 대조군과 비교하여 Ad5-Swir1 감염시킨 마우스의 체중(표 2)은 현저한 차이가 없었다. Ad5-GFP 처리 대조군에 비해, Ad5-Swir1 감염 마우스에서는 Swir1 mRNA의 4-5배 증가가 관찰되었다(데이타 미기재).

간 중량 및 지질 함량은 Ad5-Swir1로 감염시킨 마우스에서 일관되게 감소되었다. KK-A^y 및 OBOB 마우스에서, 공복 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤의 현저한 감소(40%)가 관찰되었다. Ay /a 마우스에서는 보다 소폭 감소가 관찰되었다. 비만 OBOB, KK-A^y 및 Ay/a 마우스를 이용한 여러차례의 실험으로부터 얻은 데이타의 메타-분석은, OBOB, KK-A^y 및 Ay/a 마우스에서 HOMA-IR[(공복 인슐린 x 글루코스)/ 22.5]의 40% 감소를 시사하였다(표 4). Ay/a 마우스에서, 공복 인슐린 수치는 Ad5-Swir1 이용시 현저하게 감소되었지만(2.6 ± 0.4 vs. 3.9 ± 0.3 ng/ml, P<0.05), 혈당 차이는 없었다(175 ± 12 대 162 ± 11 mg/dL).

표 4. Ad5 - GFP 또는 Ad5 - Swir1 으로 감염시킨 OBOB , KK - A ^y 및 Ay /a 마우스에서, 공복 인슐린과 혈당을 곱하여 계산한 HOMA - IR 의 메타 -분석.

데이타는 대조군의 % ± SEM으로 표시함.

Ad5 - GFP	Ad5 - Swir1	Student ' t - test
100 ± 12%	62 ± 4%	P<0.005

실시예 10

지질 생합성에 관여하는 유전자에 대한 Swir1 과다발현 효과

아디포사이토카인에 의한 간 지방증의 반전은 간의 지질형성 억제 및 지방산의 산화 자극을 적어도 부분적으로 원인으로 볼 수 있다(42, 43). Swir1이 간 지 질 함량을 감소시키는 메카니즘을 조사하기 위해, 지질형성에 참여하는 유전자의 발현을 정량 RT-PCR로 측정하였다(도 8A-8D). Ad5-Swir1을 감염시킨 OBOB 및 KK-A^y 마우스에서, 간에서의 지방형성에 참여하는 수종의 유전자의 발현은, 대등한 40-50% 감소가 있었다. 따라서, Swir1은 적어도 부분적으로 간 지방 형성 저해에 의해 간의 지질 함량을 낮출 수 있다.

지방산 합성효소(Fasn) mRNA의 현저한 감소(도 8A, p=0.02) 및 단백질 수치 감소(데이타 미기재)는 Ad5-GFP 대조군에 비해, Ad5-Swir1-처리 그룹에서 관찰되었다. Fasn mRNA 및 단백질 수치는 D.C. Albarado et al., "Impaired Coordination of Nutrient Intake and Substrate Oxidation in Melanocortin-4 Receptor Knockout Mice", Endocrinology, vol. 145, pp. 243-252(2004)에 언급된 바와 같이, 실시간 정량 PCR 및 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 지방산 전위효소 CD36의 유전자 발현은 Ad5-Swir1 그룹에서 현저하게 증가되었다(p=0.02, 미기재). 도 8A에, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한 후 8일째에, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 지방산 합성효소(Fasn) mRNA의 발현 수준을 나타낸다. 데이타는 임의 단위(AU)(n=6-8/그룹; "*" p<0.05)로 표시한다. Swir1 과다발현은 Fasn 감소를 유발하였다. 도 8B에, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한 후 8일째에, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 스테아로일-CoA 불포화화효소(Scd1) 단백질의 발현 수준을 나타낸다. 데이타는 임의 단위(AU)(n=6-8/그룹; "*" p<0.05)로 표시한다. 또한, Swir1 과다발현은 Scd1 감소를 유발하였다. 도 8C에, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한 후 8일째에, 비만 렙티-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 아세틸 CoA 카르복실라제(Acc) mRNA의 발현 수준을 나타낸다. 데이타는 임의 단위(AU)(n=6-8/그룹; "*" p<0.05)로 표시한다. 또한, Swir1을 가진 마우스에서는 간 Acc의 수치가 보다 낮았다. 도 8D에, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한 후 8일째에, 비만 렙틴-결핍성 마우스(Lep^ob/Lep^ob)의 간에서의 인슐린 내성에 참여하는 유전자(사이토카인 시그널링의 억제자 3 또는 Socs3)의 발현 수준을 나타낸다. 데이타는 임의 단위(AU)(n=6-8/그룹; "*" p<0.05)로 표시한다. Swir1의 존재는 Socs3의 유전자 발현을 감소시켰다.

실시예 11

Swir1 의 형질전환성 과다발현( BAP - Swir1 )

인간 베타-액틴 프로모터, 합성 엑손 1 및 인트론, 및 Swir1 단백질로서 76 aa를 코딩하는 오픈 리딩 프래임을 포함하는 구조체(BAP-Swir1)를 이용하여, Swir1을 발현하는 형질전환주를 제조하였다(도 9A; 도 4 참조, 오픈 리딩 프래임은 밑줄). 8개의 첫 제조물을 수득하였고(2 FVB/NJ, 6 C57BL/6J) FVB 종들 중 하나[FVB/NJ.Tg-(BAP-Swir1)AAB20]를 이하 FVB . Tg라 하며, 이는 5-6 주령에 간에서의 Swir1 발현 증가를 보였다(도 9B). 도 10은 C57BL/6J 난모세포에 BAP-Swir1를 처음 주사한 단계에서 게놈에 트랜스진이 삽입된 6마리의 새끼들(6, 8, 14, 19, 21 및 22)의 PCR 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.

5-6 주령에, 혈청 TG 및 TC 감소는 FVB.Tg에서 이미 입증되었다(표 5, 도 9C). FVB.Tg 형질전환주의 체중(표 5) 및 FM(도 9D)은 WT 한배 새끼에 비해 감소되었다. FVB.Tg의 체중 증가량은 HFD (60% kJ/fat)에서 감소되었으며, 이는 식이-유발성 비만이 예방됨을 의미한다(도 9E). WT 대조군과 비교하여, BAP-Swir1 형질전환체에서의 공복 인슐린 수치의 감소 경향과 조합된, 체중 및 지방 함량 감소는 1달 후에 HFD에서 여전히 관찰되었다(180 ± 60 vs. 310 ± 40 pg/ml, 2-tailed Student's t-test P=0.085).

표 3. FVB . Tg 마우스의 첫 3마리 새끼로부터 얻은 데이타 마우스 모두 약 4.5주령의 암컷이고, 그룹당 n=3-5이다. ^* P<0.05, 대조군 대비
	체중 (g)	간중량 (g)	체중 대비 간 중량%	글루코스 ( mg / dL )	트리글리세라이드( mg / dL )	콜레스테롤 ( mg / dL )
FVB WT	20.5±1.1	0.88±0.01	4.3±0.4	151±14	105±3	219±7
FVB.Tg	17.8±0.1 ^*	0.69±0.01 ^*	3.9±0.2	105±6 ^*	82±6 ^*	198±4 ^*

전술한 바와 같이, Swir1의 과다발현이 공복에 대한 대사 적응을 손상시키는 것으로 관찰되었으며, 아마 이는 에너지 소모 증가를 의미한다. Swir1이 에너지 소비를 증가시키는지를 결정하기 위해, 간접 열량 측정법으로 VO2 및 RER을 측정하였다(15, 46, 50). 페닝턴 생화학 연구 센터에는 온도가 조절되는 인큐베이터에 있는 16 CLAMS(chamber comprehensive laboratory animal monitoring system)이 있다. 이 CLAMS는 산소 소모(VO2), 호흡 교환 비율(RER, 동물의 기질 총 산화의 표시자), 신체 활동을 X 및 Z 축에서, 그리고 음식물 섭취를 동시에 측정한다. 마우스를 이 CLAMS 시스템에 두고, 72시간 동안 이들 파라미터를 기록하였다. 마우스는 48시간 동안 자유롭게 식이가능하게 하였으며, 마지막 24시간 동안은 절식시켰 다. FVB.Tg에 대한 결과는 도 13A-13F에 나타낸다. 체중 감소량의 증가는, 하룻밤 절식한 후, 비만 KK-A^y, Ad5Swir1를 발현하는 비만 B6 Ay/a 마우스(철야 절식 후 체중 감소량%, Ad5-Swir1 대 Ad5-GFP: 5.5 ± 0.4% 대. 3.5 ± 0.4%, P<0.01), 및 9주령의 마른 FVB.Tg(13.6 ± 1.1% 대 10.0 ± 0.7%, P<0.05)에서, 관찰되었다. 고지방식이를 한 달한 후, 간접 열량 측정법에 의한 형질전환 마우스에서의 에너지 대사값은, 대조군에 비해 산소 소모량(VO2, ml/h: BAP-Swir1 Tg 4551 ± 240, WT FVB 3807 ± 145, P<0.05) 및 점등 기간동안의 신체 활동(시간 당 X 빔 차단: BAP-Swir1 Tg 1431 ± 181; WT FVB 2678 ± 327, P<0.01)이 현저하게 증가되었다. 에너지 소모 증가는 따라서 Swir1에 의한 식이-유발성 비만 및 인슐린 내성 완화에 요인일 수 있다.

실시예 12

Swir1 은 지방세포에 작용한다.

분비된 짧은 폴리펩티드 Swir1³⁴ ^-76(서열번호 10)의 재조합형 또는 합성형의 용도를 테스트하기 위한 실험을 구축하였다. (Swir1이 작용할 가능성이 있는 2가지 부위인) 지방세포 및 간세포의 합성 Swir1³⁴ ^-76에 대한 반응을 세포외 조절된 키나제(ERK) 변화로 분석하였다. ERK1/2 및 p38α는 지방세포에서의 지방분해 및 열발생 조절에 중요하다.

1 ㎍/ml Swir1³⁴ ^-76의 적용은, 완전히 분화된 3T3-L1 지방세포(도 11A) 및 HepG2 세포(도 11B)에서 Erk1의 인산화의 강력한 증가와 관련 있다. 이러한 결과는, Swir1³⁴ ^-76에 대한 기능적 수용체가 지방세포과 간세포에서 활성형임을 의미하며, 이는, 합성 펩티드가 생물학적으로 활성임을 시사한다. 또한, 짧은, 제2 펩티드를 서열번호 2의 39-76 아미노산을 이용하여 합성하였고, 이를 "Swir1³⁹ ^-76"(서열번호 11)이라고 하였다. 지방세포 및 간세포을 이용한 유사한 결과가 이 펩티드에서도 관찰되었다. 4개의 아미노산 결손은 Swir1 기능에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다.

실시예 13

시상하부에서의 Swir1 의 기능

시상하부에서의 Swir1은 에너지 항상성 조절에 관여할 수 있다. pAB1(서열번호 8)을 이용한 예비 분석에서, 시상하부의 궁상 핵에 위치된 신경원에 Swir1-면역반응성 존재가 입증되었다(데이타 미기재). 시상하부에서의 Swir1 발현과 비만 및 인슐린 내성 사이에 음의 관계가 있는 것으로 예상되었다. 즉, 비만 상태에서 간 및 시상하부에서의 Swir1의 합성 감소는 비만 및 인슐린 내성에 기여하는 요인일 수 있다.

Swir1 mRNA 발현은, 대조군(저 지방식) 및 식이-유발성 비만 C57BL/6J, Mc3rKO 및 Mc4rKO 마우스(도 12A-12B)의 중저기저 시상하부에서의 정량 RT-PCR에 의해 측정하였다. 예상한 바와 같이, 시상하부에서의 다량의 Swir1 mRNA는 비만 상태에서는 감소되었다(도 12A). 또한, Swir1 발현은 인슐린 내성의 표시자인 HOMA-IR 수치가 상승된 마우스에서 감소되었다(도 12B).

반대로, Socs3 mRNA 발현은 비만 및 인슐린 내성 상태에서 증가하였다(도 11C). 이러한 결과는, 비만 상태에서의 Swir1의 합성 감소는 간에만 국한되지 않음을 의미한다. 또한, 시상하부에서의 Swir1 활성 감소는 비만 및 인슐린 내성 발현에 기여할 수 있을 것이다.

개괄하여, 예상되는 Swir1의 76개의 잔기를 코딩하는 부분 cDNA 서열(BC021944의 뉴클레오티드 207에서 437 뉴클레오티드)을 이용하고, 상업적으로 이용가능한 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 단백질의 가시화가 가능하도록 카르복시말단에 에피토크-텍을 삽입하여, 발현 벡터를 구축하였다. 이 구조체를 이용하여, 보고된 서열이 분비된 단백질을 코딩함을 검증하였다. 이 발현 벡터와 에피토프가 표지되지 않은 천연 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 사용하여, 마우스 실험에 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스(Ad5-Swir1)를 구축하였다. 꼬리 정맥에 아데노바이러스 5x10⁸ pfu를 주사하여, 먼저 간에 감염시켰고, 비장에도 낮은 수준으로 감염시켰다. 에피토프가 달린 Swir1을 발현하는 아데노바이러스를 이용하여, 바이러스 감염 5일 후에 간, 뇌 및 골격근에 Swir1 단백질이 광범위하게 분포되어있음을 확인하였다. 천연형의 Swir1을 발현하는 아데노바이러스를 이용하여, 분비된 단백질에서 새로운 기능을 확인하였다(공복시의 혈청 트리글리세라이드 및 콜레스테롤의 감소). 고지혈증이 있는 비만 마우스에서 간의 Swir1 mRNA 발현 감소가 관찰되었으며, 감소 폭은 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 증가와 상호 상관관계였다. 천연형 Swir1을 발현하는 아데노바이러스를 이용하여, 고 콜레스테롤 및 트리글리세라이드를 보이는 마우스 비만 모델에서 Swir1 단백질을 코딩하는 mRNA 발현 증가가 정상 수준으로 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 모두를 감소시키는데 효과적임을 확인하였다. 트리글리세라이드 및 총 콜레스테롤을 감소시키기 위한 Ad5-Swir1 감염 효과는 재현가능하였으며, 3마리의 다른 마우스 종(Lep ^ob / Lep ^ob , KK-A ^y , 및 C57BL/6J)에서 관찰되었다. 일부 마우스에서, 공복 인슐린 및 글루코스의 강하 경향에서 인슐린 감수성 향상이 관찰되었으며, 글루코스 허용성 테스트 결과의 개선이 관찰되었다. 후자의 결과는, Swir1이 비만, 인슐린-내성 환자에서 인슐린 감수성을 향상시키는데 효과적일 수 있음을 제시하였다.

경구 복용, 주사, 피하 패치 또는 비강내 경로에 의해 전달된 전장 Swir1 펩티드(서열번호 2) 또는 펩티드 유도체, 상동체, 유사체 또는 모방체를, 고콜레스페롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 인슐린 내성, 비만, 당뇨병 및/또는 에너지 불균형에 대한 치료제 또는 진단제로 사용할 수 있음을, 강력하게 시사한다. 당업계에 공지된 방법에 의해, 천연 코딩 서열내 치환을 수행하여 안정성 및/또는 생물학적 효능이 증가된 Swir1 유도체를 만들 수 있었다. 또한, Swir1 펩티드를 사용하여 이후 아직 동정되지 않은 Swir1에 대한 수용체(들)로서 사용할 수 있는 이의 세포 수용체를 동정할 수 있으며, 이는 총 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인슐린 내성, 비만, 당뇨병 및/또는 에너지 불균형을 강하하고자 하는 치료법 개발에 있어 잠재 적인 약물 타겟(들)이다.

신규 분비된 단백질인 Swir1은 비만 상태에서 인슐린 내성 및 간 지방증의 병인의 중요한 인자로서, 중간 내지 중증도의 당뇨비만(diabesity) 마우스 모델에서 마이크로어레이 유전자 발현 분석에 의해 동정되었다. Swir1은 2형 당뇨병 마우스 모델에서 HOMA-IR, 공복 인슐린 인덱스 및 글루코스, 및 혈청 지질을 현저하게 감소시키며, 간 지질을 현저하게 감소시키는데, 이는 간 지방증 회복을 의미한다. 형질전환에 의한 Swir1의 과다발현은 마른 표현형과 관계있다. Swir1은 렙틴 및 아디포넥틴과 유사한 방식으로 작용하여, 에너지 소모 자극 및 산화 대사 증가에 의한 비만 인슐린 상태에서의 대사 프로파일을 향상시킬 수 있다.

실시예 14

Swir1 처리는 간의 인슐린 내성을 반전시킬 것이다.

Ad5-Swir1 및 BAP-Swir1 형질전환(상기 언급)의 예비 데이타는, 인슐린 작용 및 지질 대사 개선을 나타내었다. FVB.Tg 마우스에서, 산화적 대사 증가는 이러한 효과를 설명하는 가능성 있는 인자이다. 이들의 이차적인 FM 감소로부터 Swir1의 항-당뇨병 작용을 분석하기 어려울 수 있다. 재조합 아데노바이러스를 이용한 예비 데이타는, Swir1이 비만에 대한 효과의 고인슐린혈증 및 고지혈증을 독립적으로 감소시킴을 시사한다. 따라서, 재조합 아데노바이러스 및 합성 펩티드를 이용한 추가적인 실험으로, 간 대사 및 인슐린 감수성에 대한 Swir1의 '직접' 작용에 관한 중요한 정보를 제공할 수 있다.

Ad-Swir1 처리에 의한 간 지방증의 반전이 간 및 골격근에서의 인슐린 감수 성 개선과 관련 있는지를, 인슐린 수용체 시그널링 측정에 의해 결정하기 위한 실험을 구축할 수 있을 것이다. 이는, 인슐린 수용체 기질 1 및 2의 인산화 분석을 포함할 것이며, 이는 인슐린 수용체 티로신 키나제에 말단이다. 또한, 포스파티딜-3' 키나제의 하류인 글루코스 수송 조절 단백질 키나제 B (PKB)/Akt, 세린/트레오닌 키나제의 활성(44, 45)은, 인슐린 수용체 활성화의 표시자로서 측정될 것이다. Ad5-Swir1로 감염된 마우스에서의 현저한 체중 감소를 보이는 파일롯 데이타는, 기초 대사율 증가를 시사한다. Ad5-Swir1이 식후 및 공복 상태 동안의 전체 체대사율을 증가시키는지는 간접 열량 측정법으로 결정될 것이다. 또한, 간, 골격근 및 갈색 지방세포의 조직 용혈물내 산화 대사가 결정될 것이다.

도 7C에 아데노바이러스 처리의 기본 프로토콜이 나타나 있다. 간략하게 설명하면, 모든 마우스에 꼬리 정맥을 통해 5x10⁹ pfu의 Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP를 주사한다(n=12/그룹, 총 24마리). 마우스는 다음 실험에 사용하기 전에 4일간 회복시킨다. 실험 후에 취한 간 샘플을 이용하여, 실시간 PCR 및 노던 블롯 분석으로 Swir1 mRNA를 측정함으로써 감염을 조사한다. 예비 실험으로, Swir1 mRNA는 감염 후 4-7일째에 4배 증가가 관찰되었다. 또한, Swir1 단백질을 웨스턴 블롯이나 현재 재발중인 분석법(RIA / ELISA)을 이용하여 측정한다. 아데노바이러스를 주사한 당일, 공복전 및 공복후에 마우스 체중을 측정한다. 가능하다면, 핵자기 공명(NMR)을 이용하여 신체 구성을 측정한다(15, 32, 46). 마우스는 음식물 섭취 및 배출 측정이 가능한 전술한 바(15)와 같이 와이어 메쉬 케이지에 사육하도록 적응 시켜야 한다.

FVB.Tg의 성별에 따른 이형성(dimorphism) 표현형이 재현가능하고, 그리고 C57BL/6J 백그라운드의 BAP-Swir1 형질전환체에서 관찰된다면, 수컷 및 암컷에서의 반응을 조사하기 위해 Ad5 실험을 변형시킨다. Ad5-Swir1 처리에 대한 비만 인슐린 내성 마우스의 반응을 조사하는 대부분의 실험에는 수컷을 사용하였고, 암컷은 다른 반응, 아마 인슐린 감수성 향상 뿐만 아니라 체중 감소를 보일 수 있다. 이는, 전례가 없는 일은 아니며, 예컨대 성적 이형성은 인슐린 및 렙틴의 식욕감퇴 작용에 대한 수컷 및 암컷 랫의 반응에서 관찰되었다(47, 48).

간 지방증의 반전이 인슐린 감수성 증가와 관련 있는지를 결정. 본 실험에는 12가지 유전자형 중 2 그룹의 KK-A^y 및 Ay/a 마우스(Ad5-Swir1, Ad5-GFP 대조군)(24 KK-A^y, 24 Ay/a)가 참여된다. 하룻밤 절식시킨 후 5일째에, Ad5-Swir1 및 Ad5-GFP 그룹들 중 6 마리에 인슐린(1 U/kg)을 1회 복막내 투여하고, 나머지 6마리에는 염수를 투여한다. 주사한 후 10분 또는 20분 후에(n=3/그룹) 마우스를 안락사시키고, 조직 샘플(간, 대퇴 사두근)을 채집하고, 액체 질소에 순간 냉동시켰다. IRS 인산화, PKB 활성 및 FoxO1 인산화를 기존에 언급된 바와 같이 측정한다(15, 49). 본 실험은 인슐린 및 글루코스 허용성 테스트를 위해 그룹 당 8마리씩 2번 더 반복하였다.

Ad5-Swir1의 항-지방증 작용이 간에서 인슐린 수용체 티로신 키나제 케스케이드의 인슐린-자극 활성을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한, Ad5-Swir1은 근육 및/또는 지방세포에서 인슐린 시그널링을 향상시킬 수 있다. 글루코스 제거(glucose clearance)를 시험하는 초기 연구로 혼재된 결과(데이타 미기재)가 나타났는데, 아마도 차선의 실험 디자인으로 인한 것일 것 같다[즉, 마우스 마리 수가 적고(n=4-5); 아데노바이러스 주입 후 가변적인 시간대에 수행함(최대 2주)]. Ad5-Swir1이 글루코스/인슐린 주사에 대한 반응으로 글루코스 제거를 향상시킬 것으로 예상된다.

Swir1 이 총 체에너지 소비 및 산화적 대사를 증가시키는지를 결정. Swir1의 간에서의 발현이 에너지 소모를 증가시키는지를 결정하기 위해, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP (n=8/그룹)로 감염된 비만 Ay/a 및 마른 및 식이-유발성 비만 C57BL/6J 마우스의 VO2 및 RER을, 간접 열량 측정법으로 측정한다(15, 46, 50). 페닝턴 생화학 연구 센터에는 온도 조절되는 배양기에 장착된 16 CLAMS(comprehensive laboratory animal monitoring system)이 있다. 이 CLAMS는 산소 소모(VO2), 호흡 교환 비율(RER, 동물의 기질 총 산화의 표시자), 신체 활동을 X 및 Z 축에서, 그리고 음식물 섭취를 동시에 측정한다. 마우스에 아데노바이러스를 주사한 후 96시간 동안 이 CLAMS 시스템에 두고, 72시간 동안 상기 파라미터를 기록하였다. 마우스는 48시간 동안 자유롭게 식이가능하게 하였으며, 마지막 24시간 동안은 절식시켰다. 다른 실험으로, Ad5-Swir1 또는 Ad5-GFP (n=8/그룹)를 감염시킨 Ay/a 및 C57BL/6J 마우스로부터 취한 간, 비복근 및 갈색 지방세포에서, 지방산 산화(C¹⁴-팔미테이트) 및 미토콘드리아 효소 작용(사이트레이트 합성효소 활성, 시토크롬 c 옥 시다제)을 측정한다. 간 일부를 취하고, 지질형성에 참여하는 전사 인자(즉, SREBP1c, PPARg) 및 효소의 mRNA 및 단백질 발현을 측정하기 위해 순간 냉동한다(32).

Ad5-Swir1으로 감염된 마우스에서 증가된 체중 감소는, 기초 대사율 증가를 의미하며, 이는 BAP-Swir1 형질전환으로부터 공복시의 체중 감소 및 간접 열량 측정법에 의해 뒷받침된다(도 13A-F 참조). 금식하는 동안에만 명백할 수 있지만, Ad5-Swir1 감염은 VO2를 증가시킬 것으로 예상된다. 간에서 미토콘드리아의 산화 효소 활성 증가는 오토크린/파라크린(autocrine/paracrine) 인자로서 작용하는 Swir1과 일치된다. 골격근 및 갈색 지방 조직에서의 미토콘드리아 산화 효소 활성 증가는, 자율 신경계 또는 근육 및/또는 갈색 지방 조직에서 발현되는 수용체를 통해 작용하는 엔도크린의 기능을 제시한다. 만일 (FVB.Tg에서 관찰된 바와 같이) Ad5-Swir1이 에너지 소비를 현저하게 증가시키지만 체중에는 영향이 없다면, 음식물 섭취의 보상적 증가가 예상된다. Ad5-Swir1으로 처리된 OBOB 마우스에서 관찰된 바와 같이, 지방형성에 참여하는 유전자의 발현 감소도 예상된다(도 8A-8D).

실시예 15

Swir1 의 형질전환 발현은 비만 및 인슐린 내성을 예방한다.

렙틴(51, 52) 및 아디포넥틴(53, 54)을 과다발현하는 형질전환 마우스에서, 이들 단백질 중 하나의 과다발현의 항-당뇨병 작용이 확인되었다. Swir1의 과다발현은 아디포넥틴 및 렙틴의 과다발현으로 관찰된 결과와 맞먹는 결과를 보일 것이며, 즉 인슐린 감수성 및 글루코스 허용성 향상, 및 식이- 및 유전적으로 유발된 비만 상태에서의 공복 지질 감소가 예상된다. 또한, 간, 골격근 및/또는 갈색 지방 조직에서 산화 대사를 증가시킴으로써 Swir1이 에너지 소모를 증가시킬 것으로 예상된다. Swir1 생리 작용의 포괄적인 분석은, 이 펩티드가 에너지 대사 및 인슐린 시그널링을 조절하는 메카니즘(들)에 집중되는 이후의 실험들에서 중요하다.

형질전환체: 76 aa 단백질을 코딩하는 서열을 인간 베타-엑틴 프로모터에 의해 통제되는 합성 트랜스진에 연결한다(BAP)(도 9A). Swir1은 분비된 폴리펩티드(도 4)이며, 따라서 조직-선택성은 이들 형질전환 연구들에서 중요하지 않다. 조직 특이적인 프로모터는, 내인성 유전자가 다량 발현되는 경우에는 내인성 유전자의 억제가 과다발현의 효능을 제한할 수 있기 때문에 사용하지 않았다(53, 54). 포괄적인 mRNA 발현 분석을 기존에 언급된 바와 같이(31, 32, 46) 정량적 RT-PCR (qRT-PCR) 및 노던 블롯 분석으로 달성한다. 단백질 수준은 Swir ^34-76의 N- 및 C-말단에 대한 2종의 다클론 항체(pAB1(서열번호 8), pAB2(서열번호 9))를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 결정한다(도 5). 단백질을 검출하기 위해 면역침강이 필요할 수 있다. 대안적으로, 만약 수중에 있는 항체 또는 개발중인 항체가 민감하고 정량적인 분석법 개발에 유용하다면, 이를 사용한다. 트랜스진의 카피 수는 서든 블롯 분석에 의해 결정한다. 이러한 실험의 이차적인 목적은 마우스 조직들(간, 시상하부, 전뇌, 후뇌, 골격근, 심근, 두엽, 후복막 및 서혜부의 지방세포 축적부위, 위, 장, 췌장, 신장)에서의 보다 포괄적인 Swir1 mRNA 발현 분석이다. 주요 장기(심장, 신장, 소화기관, 간)의 무게를 달아 주요 형태 변화를 조직학적으로 관찰한다.

본 발명자들은, Swir1이 소형 분비된 폴리펩티드(렙틴, 아디포넥틴) 그룹 중 하나이고, 과다발현되었을 때 마우스의 비만 및 인슐린 내성 모델에서 대사 프로파일(즉, 인슐린 감수성 증가, 간의 지방형성 감소)을 향상시킨다는 것을 확인하였다. Swir1의 과다 발현은 에너지 대사에 있어 렙틴과 유사한 작용을 하여, 식이-유발성 비만 및 인슐린 내성을 방지한다. Swir1 투여로 식이- 및 유전적으로-유발된 비만과 관련된 인슐린 내성 및 이상지혈증을 반전시킬 수 있으며, 당뇨비만(diabesity)의 발병을 예방 또는 지연시킬 수 있다.

기타.

본원 및 청구항에서, 용어 "Swir1"은 단백질 Swir1(서열번호 2), 이의 기능적 펩티드(예, Swir1³⁴ ^-76), 유도체 및 유사체를 의미한다. 용어 "유도체" 및 "유사체는 Swir1과 구조적으로 유사하고 비변형된 Swir1과 질적으로 유사한 작용을 하는, 단백질인 것으로 이해된다. 용어 "기능적 펩티드"는 Swir1 수용체에 여전히 결합하거나, 또는 내부 신체 세포, 예컨대 지방세포 또는 간세포 변화를 활성화시킬 수 있는, Swir1 단백질의 일부를 의미한다.

본 발명에 따라, Swir1, 이의 기능적 펩티드, 이의 유사체 및 유도체의 투여를 이용하여, 인슐린 내성 및 이상지혈증을 반전시키고, 비만 발생을 방지 또는 지연시킬 수 있다. 또한, 이들 화합물은 고콜레스테롤혈증, 고트리글리세라이드혈증, 인슐린 내성, 비만 및 당뇨병에 대한 치료제 또는 진단제로서 사용할 수 있다.

본원에서, 용어 "치료적 유효량"은 통계학적으로 유의한 수준(p<0.05)으로의 신체 에너지 소비 증가, 혈청 트리글리세라이드 감소, 혈청 콜레스테롤 감소, 고지혈증 감소, 인슐린 내성 감소, 또는 비만 인슐린 내성 개체에서 2형 당뇨병 발병 지연 또는 감소 중 어느 하나에 충분한 Swir1 단백질, 단편, 유도체 또는 유사체의 함량을 의미한다. Swir1 단백질의 투여량 범위는 원하는 효과를 형성하는 범위이다. 일반적으로, 투여량은 환자의 나이, 체중, 조건, 성별에 따라 달라질 것이다. 당업자는, 본 발명의 내용을 고려하여 적합한 투여량 범위를 쉽게 결정할 수 있다. 투여량은 임의 금기 현상에 대해 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 임의 경우에서, 치료의 유효성은 신체 대사, 체중 또는 혈청 글루코스, 트리글리세라이드, 콜레스테롤 수치 중 어느 하나를 당업계에 잘 알려진 방법으로 모니터링함으로써 결정할 수 있다. 또한, Swir1은 당업계에 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체에 적용될 수 있다.

이러한 처리 방법은 일반적으로 인간 및 인간을 제외한 동물을 포함한 포유류에 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 경구, 정맥내, 비경구, 피하, 폐내 및 비강내 투여를 포함한 모든 적합한 방법에 의해 환자에 투여할 수 있다.

비경구 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내 또는 복막내 투여를 포함한다. 또한, 펩티드는 예컨대 서방형 피하 임플란트 형태로 경피로, 또는 캡슐, 분말 또는 과립 형태로 경구 투여할 수 있다. 또한, 흡입에 의해 투여할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체 조제물은 멸균, 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같 은 주사가능한 유기 에스테르류가 있다. 수성 담체로는 염수 및 완충화된 매질 등의 물, 알코올성/수성 용매, 에멀젼 또는 현탁액이 있다. 비경구 비히클로는 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트 처리된 링거 오일 또는 고정 오일을 포함한다. 펩티드는 약제학적으로 허용가능하며 활성 성분과 혼용가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 적합한 부형제로는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 혼합물이 있다. 정맥내 비히클로는 유체, 영양 보충제 및 링거 덱스트로스를 주성분으로 한 물질과 같은 전해질 보충제 등이 있다. 또한, 예컨대 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 보존제 및 그외 첨가제가 존재될 수 있다.

형태는 투여 경로에 따라 변경될 수 있다. 예컨대, 주사용 조성물은 각각 단위 투약 용량이 포함된 앰플 형태로 또는 다중 투여량이 포함된 용기 형태로, 제공될 수 있다.

화합물은 약제학적으로 허용가능한 염으로서 치료 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 염은 무기산, 예컨대 염산 또는 인산이나, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산 또는 주석산과 형성된 산 부가 염이 있다. 또한, 염은 예컨대 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘 또는 패릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 제조된 것이다. 조성물은 정맥내, 피하, 근육내로 투여될 수 있다.

펩티드를 적절한 거대분자, 예컨대 폴리에스테르, 폴리아미노 산, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌비닐아세테이트, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 프롤아민 설페이트 또는 락티드/글리콜라이드 공중합체와 혼합하여, 제어된 전달을 달성할 수 있다. 활성 화합물의 방출 속도는 거대 분자의 농도를 변경함으로써 제어할 수 있다.

작용 기간을 조절하는 다른 방법은, 펩티드를 폴리에스테르, 펩티드, 하이드로겔, 폴리락티드/글리콜라이드 공중합체 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체와 같은 폴리머성 물질의 입자에 병합하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 펩티드를 예컨대 액적 형성 기법, 또는 하이드록시메틸셀룰로스 사용에 의한 접촉면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에, 또는 콜로이드 약물 전달 시스템에 충진할 수 있다. 콜로이달 분산 시스템으로는 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 미세구, 비드 및 수중 오일(oil-in-water) 에멀젼, 마이셀, 혼성 마이셀 및 리포좀 등의 지질계 시스템이 있다.

또한, 핵산 서열(서열번호 1)(예, 도 4에 밑줄 친 오픈 리딩 프래임)의 전체 또는 일부를 사용하여, Swir1 단백질 생산을 증가시키기 위해 유기체에 Swir1 유전자를 삽입하기 위한 플라스미드 또는 벡터를 만들 수 있다. 당업자라면, 서열번호 1의 핵산 서열이 Swir1 단백질을 생산하는데 사용할 수 있는 서열에 불과하진 않다는 것을 알 것이다. 또한, 동일한 단백질을 코딩하지만 유전자 코드의 겹침으로 인해 다른 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 그러한 핵산 서열도 포함된다. 유전자 코드는 예컨대 B. Lewin, Genes VI (Oxford University Press, New York, 1997)의 214 페이지 도 9.1을 포함하여, 유전학 또는 생물학에 관한 수많은 참조문헌에서 확인할 수 있다. Lewin의 216 페이지 도 9.3에는, 유전자 코드의 겹침이 직접 예시되어 있다. 예컨대, 아스파라긴의 코드는 AAT 또는 AAC일 수 있다.

또한, 본 발명은 수용체 결합 또는 단백질 분비에 관여하지 않는 분자의 일부분에 하나 이상의 침묵 아미노산 변화가 있는 Swir1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예컨대, 해당 부위에 화학적으로 동등한 아미노산을 만드는 뉴클레오티드 서열 변형도 포함되며, 따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈을 글리신과 같은 다른 소수성 잔기를 코딩하는 코돈에 의해 치환할 수 있으며, 또는 발린, 루이신 또는 이소루신과 같은 더욱 소수성인 잔기로 치환할 수 있다. 이와 유사하게, 글루탐산에 대한 아스파르트산과 같이 음으로 하전된 잔기를 다른 잔기로 치환시키는 변화, 또는 아르기닌에 대한 라이신과 같이 양으로 하전된 잔기의 다른 잔기로 치환시키는 변화도, 생물학적으로 등가의 산물을 만들것으로 예상할 수 있다. 예로, Lewin(1997)의 10 페이지 도 1.8의, 유전자 코드에 의해 코딩된 "표준" 20개의 아미노산의 측쇄 성질을 나타낸 것을 참조한다. (또한, 공개된 도에 오타가 있으며, 즉 글루타민의 약자는 "Gln"이어야 함을 주지하여야 한다.).

본 명세서에 인용된 모든 참조문헌에 전체 내용은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 그러나, 모순되는 충돌이 있는 경우에 본 명세서의 내용을 표준으로 한다.

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SEQUENCE LISTING <110> Board of Supervisors of Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College <120> A Novel Lipid-Regulating Hormone <130> Butler 05P02W <140> PCT/US2006/______ <141> 2006-08-07 <150> 60/705,940 <151> 2005-08-05 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 868 <212> DNA <213> mus sp. <400> 1 cccgttgtcc cggaccctct cgcgggcgcg caccgggctc aactcaggcc caggactgca 60 ggtgggcatc ttccctgcca agaagtcgct gtgtgtggac aggacagcca ccttggatgg 120 ttggccaccc cagagttgtg cctcggcatg ggccttgccg ctgaggcagc tccactgtct 180 gcgctggcct gagggtgctg tctgtcatgg gggcagccat ctcccaaggg gctctcatcg 240 ccatcgtctg caatggcctc gtaggcttct tgctgctact gctctgggtc attctctgct 300 gggcctgcca ttctcgatct gctgacgtcg attctctctc ggaatccagt cccaactcca 360 gccctggccc ctgtcctgag aaggcgccac caccccagaa gcccagccat gaaggcagct 420 acctgctgca gccctgaagg gctctggcct agcctggagt cctggacctg agtatacctg 480 agtcagagcg tggaatcgga tccaagaagt cagtcggcct ggggtccagt cgatttgaca 540 ctggacccag cagcctagat tgtagccagc ctggctccaa gagaggcctg agtggcccta 600 gagagaaagg cctggagggg gggttaggag ttggtgctag ggccagggcc atctggactc 660 tgctccatcc caagggccaa gggctgagtc catgccttcc ctaggctcag cacatctggg 720 ctccctaggt tggggagcaa acgggaaccc catggcaata atgggagggt gtccaggctg 780 ggccccttct ctggtcctcc cactgtttgt tgggtaataa atggaactat ggcttgcaaa 840 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 868 <210> 2 <211> 76 <212> PRT <213> mus sp. <400> 2 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 3 cctgagggtg ctgtctgtca tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 4 cagtagcagc aagaagccta cg 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 5 ctctcatcgc catcgtctgc a 21 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 6 ggggcggccg caccatgggg gcagccatct cccaa 35 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 7 gggctcgagg gccagagccc ttcagggctg cag 33 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 8 Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> mus sp. <400> 9 Pro Pro Pro Gln Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 1 5 10 15 <210> 10 <211> 43 <212> PRT <213> mus sp. <400> 10 Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser Pro 1 5 10 15 Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln Lys 20 25 30 Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 35 40 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> mus sp. <400> 11 Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser Pro Asn Ser Ser Pro Gly 1 5 10 15 Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln Lys Pro Ser His Glu Gly 20 25 30 Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 35 <210> 12 <211> 76 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 12 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 13 <211> 76 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 13 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 14 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Val Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 15 <211> 76 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 15 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Val Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asp Ile Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 16 <211> 76 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 16 Met Gly Ala Ala Ile Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Ile Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asn Ile Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 17 <211> 76 <212> PRT <213> Bovidae <400> 17 Met Gly Ala Ala Leu Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Ile Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asn Ile Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75 <210> 18 <211> 76 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 18 Met Gly Ala Ala Leu Ser Gln Gly Ala Leu Ile Ala Ile Ile Cys Asn 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Trp Val Ile Leu Cys Trp 20 25 30 Ala Cys His Ser Arg Ser Ala Asn Ile Asp Ser Leu Ser Glu Ser Ser 35 40 45 Pro Asn Ser Ser Pro Gly Pro Cys Pro Glu Lys Ala Pro Pro Pro Gln 50 55 60 Lys Pro Ser His Glu Gly Ser Tyr Leu Leu Gln Pro 65 70 75

Claims

하기 특징을 가지는 정제된 Swir1 펩티드 및 이의 단편, 상동체, 유사체 및 유도체:

a. 실질적으로 균질물이며;

b. 서열번호 2, 10, 11, 12-18의 서열들 중 하나와 70% 이상의 상동성을 가진다.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 포유류 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 설치류 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 인간 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 합성 펩티드인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 서열번호 2, 10, 11, 12-18의 서열들 중 어느 하나와의 상동성은 85% 보다 높은 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 6항에 있어서, 상기 상동성은 95% 보다 높은 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한항에 따른 Swir1 펩티드 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
체중 항상성 관련 병태생리 상태를 치료하는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 Swir1 펩티드 또는 이의 단편, 상동성, 유사체 및 유도체를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
체중 항상성 관련 병태생리 상태를 예방하는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 Swir1 펩티드 또는 이의 단편, 상동성, 유사체 및 유도체를 포함하는 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 Swir1 펩티드는 서열번호 2 및 10-18의 서열들 중 어느 하나와 70% 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 병태생리 상태는 비만인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 개체에게 렙틴 및 아디포넥틴(adiponectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 병태생리 상태는 고혈당증, 고인슐린혈증, 인슐린 내성, 고지혈증 및 2형 당뇨병 중 어느 하나를 수반하는 비만과 관련된 병태생리 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 개체에게 투여하는 단계는 복막내 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터.
제 1항 또는 제 7항 중 어느 한항에 따른 Swir1 펩티드를 생산하는 배양된 세포.
제 17항에 있어서, 상기 세포는 박테리아, 효모, 포유류 세포, 식물 세포 및 곤충 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
Swir1 펩티드를 제조하는 방법으로서,

상기 방법은

a. 서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를, 펩티드의 발현을 제공하는 조건하에서 배양하는 단계; 및

b. 상기 발현된 펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
Swir1 펩티드를 코딩하고 서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 펩티드에 면역특이적으로 결합하는 항체, 및 이의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체.
제 21항에 있어서, 검출가능한 표지물로 표지된 것을 특징으로 하는 항체.
제 21항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2 및 8-18의 펩티드들 중 어느 하 나, 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 21항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 21항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
하나 이상의 용기에, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한항에 따른 Swir1 펩티드, 서열번호 1의 핵산 서열의 일부, 또는 제 21항 내지 제 25항 중 어느 한항에 따른 Swir1 단백질을 인지하는 항체를 포함하는, 키트.
핵산을 포함하는 인간을 제외한 재조합 동물로서,

상기 핵산은 서열번호 2 및 8-18의 Swir1 관련 펩티드들 중 어느 하나, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산인 것을 특징으로 하는 동물.
개체에서 인슐린 내성을 완화 또는 경감시키는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 당뇨병의 증상을 완화 또는 치료하는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 비만 발병을 예방 또는 지연시키는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 고지혈증을 완화 또는 경감시키는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 혈청내 총 콜레스테롤을 감소시키는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
개체에서 혈청 트리글리세라이드를 감소시키는 방법으로서,

상기 방법은 개체에게 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 28항 내지 제 33항 중 어느 한항에 있어서, 개체에게 렙틴 및 아디포넥틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 투여하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
외인성 프로모터와 서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산에 대응하는 cDNA를 가지고 있는 세포를 가진 인간을 제외한 형질전환 동물로서,

상기 세포는 서열번호 2 및 8-18로 제공되는 서열을 가진 Swir1 펩티드, 및 상기 펩티드의 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 구성적(constitutively)으로 과다발현하는 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
제 35항에 있어서, 상기 외인성 프로모터는 액틴 프로모터인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
제 35항에 있어서, 상기 인간을 제외한 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 형질전환 동물.
서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 벡터.
서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
서열번호 1의 오픈 리딩 프래임에 해당되는 적어도 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산을 포함하며, 상기 서열은 포유류에서 기능하는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 핵산 구조체.
제 40항에 있어서, 상기 프로모터는 액틴 프로모터인 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제 40항에 따른 핵산 구조체로 형질전환된 동물.