CN101505760A - 包含星形孢菌素类的组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用FLT－3激酶抑制剂和反义寡核苷酸或mcl－1特异性RNAi构建物的药物组合治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病以及实体瘤的方法。其还涉及组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和FLT－3激酶抑制剂的药物组合用于治疗上述疾病或恶性肿瘤的用途，以及此类药物组合物在制备用于治疗这些疾病或恶性肿瘤的药物中的用途。

Description

包含星形孢菌素类的组合

本发明涉及用FLT-3激酶抑制剂和MCL-1抑制剂(诸如mcl-1特异性核酸构建物)的药物组合治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，尤其是全身性肥大细胞增多症(SM)和急性骨髓性白血病(AML)，以及实体瘤的方法，所述实体瘤例如是结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)。mcl-1特异性核酸构建物包括但不限于反义mcl-1寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物。mcl-1特异性RNAi构建物包括但不限于短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或发夹RNA(shRNA)构建物。本发明还涉及反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi与FLT-3激酶抑制剂的药物组合用于治疗上述疾病或恶性肿瘤的用途，以及此类药物组合物在制备治疗这些疾病或恶性肿瘤的药物中的用途。

肥大细胞增多症是共同用于一组以肥大细胞(MC)在一个或多个器官系统中异常聚集为特征的疾病的术语。已经描述了该疾病的皮肤和全身变型(variant)。皮肤肥大细胞增多症(CM)一般出现于幼儿时期，并显示出经常自发消退的良性病程。全身性肥大细胞增多症(SM)可以出现于任何年龄，并且其特征在于涉及一个或多个内脏器官，同时有或没有皮肤涉及其中。与CM不同，SM是持续的MC克隆疾病。在很高比例的病例中，能够检测到转化的KIT突变D816V。在晚期SM中，在其它骨髓系或甚至在B淋巴细胞中都能检测到该突变。因此，SM是多谱系(multilineage)定向造血干细胞的疾病。SM产生自多谱系定向造血干细胞的观点也被这些患者能出现相关的血液非肥大细胞系疾病(AHNMD)的观念所支持。

WHO分类定义了四类SM：静止性全身性肥大细胞增多症(ISM)、伴有AHNMD的肥大细胞增多症(SM-AHNMD)、侵袭性SM(ASM)以及肥大细胞白血病(MCL)。SM变型在它们的临床表现和预后中彼此不同，并且通常需要不同的治疗。特别是，与ISM不同，患有ASM或MCL的患者是用细胞减少性或靶向药物治疗的候选者。

到目前为止，对于抑制ASM或MCL中的肿瘤MC的生长而言，仅仅描述了很少的药物，诸如干扰素-α(IFNα)或克拉屈滨(2CdA)，并且仅有少数患者显示出较大和持久的响应。一些新的酪氨酸激酶(TK)抑制剂，例如N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或尼洛替尼(4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)也可以阻碍肿瘤MC的生长。然而，再次说明，长期持久的响应还有待描述。其它研究显示伊马替尼在患有SM的患者中抑制肿瘤MC的生长。然而，仅仅在下述患者中观察到伊马替尼的效果：其肿瘤MC拥有野生型KIT、KIT突变F522C的患者，或者患有与FIP1L1/PDGFRα融合基因相关的共存的嗜酸粒细胞增多的患者。相比之下，伊马替尼对具有KIT D816V的肿瘤MC显示出很小的效果(如果有的话)。实际上，这一在多数患有SM的患者中能够检测到的KIT突变赋予了针对伊马替尼的抗性。

最近已经做了很多的尝试以鉴定在肿瘤MC中的新靶标，其目的在于开发更有效的治疗方法和更有效的药物组合。一个有前景的方法可能是研究高度恶性MC肿瘤(ASM，MCL)中的MC中表达的存活相关分子。

Mcl-1是已经被很好地鉴定了的Bcl-2家族成员，其被认为在很多肿瘤细胞中起着抗凋亡的作用。例如，参见“人类中的孟德尔遗传”(MendelianInheritance in Man)，MIM登录号159552。最初，Mcl-1被描述为存活增强分子，其在白血病ML-1细胞的TPA-诱导的分化期间表达。不断的研究表明Mcl-1在慢性骨髓性白血病的原发性肿瘤细胞中组成型表达。然而，目前关于在其它骨髓肿瘤中的Mcl-1的表达和功能几乎是未知的。

已经发现与反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物组合的FLT-3激酶抑制剂具有治疗特性。这些发现使得FLT-3激酶抑制剂和mcl-1抑制剂的组合尤其可用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，以及实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)。

特别是，已发现在包括ASM和MCL的所有SM变型的原发性肿瘤MC以及MCL细胞系HMC-1都以组成型方式表达Mcl-1。此外，在这些细胞中靶向Mcl-1与降低生长以及诱导凋亡相关，也与对TK抑制剂的敏感性增加相关，所述TK抑制剂包括N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺和伊马替尼。

在本发明的组合中应用的特别令人感兴趣的FLT-3激酶抑制剂是4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺、伊马替尼和下式的星形孢菌素衍生物或其盐(如果存在至少一个成盐基团的话)：

或

其中，(II)是化合物(I)的部分氢化衍生物，

或

或

或

或

其中，

R₁和R₂相互独立地为未取代或取代的烷基、氢、卤素、羟基、醚化或酯化的羟基、氨基、单或二取代的氨基、氰基、硝基、巯基、取代的巯基、羧基、酯化的羧基、氨基甲酰基、N-单-或N，N-二-取代的氨基甲酰基、磺基、取代的磺酰基、氨基磺酰基或者N-单-或N，N-二-取代的氨基磺酰基；

n和m相互独立地为从0至4且包括0和4的数；

n’和m’相互独立地为从0至4且包括0和4的数；

R₃、R₄、R₈和R₁₀相互独立地为氢；-O^-；最多含有30个碳原子的酰基；各自最多含有29个碳原子的脂肪族、碳环或碳环-脂肪族基团；各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基团或杂环-脂肪族基团；最多含有30个碳原子的酰基；其中R₄也可以不存在；

或者当R₃为最多含有30个碳原子的酰基时，则R₄不为酰基；

当R₄不存在时，则p为0，或者当R₃和R₄均存在且各自为上述基团之一时，则p为1；

R₅为氢；各自最多含有29个碳原子的脂肪族、碳环或碳环-脂肪族基团；各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基团或杂环-脂肪族基团；或者最多含有30个碳原子的酰基；

R₇、R₆和R₉为酰基或-(低级烷基)-酰基、未取代或取代的烷基、氢、卤素、羟基、醚化或酯化的羟基、氨基、单或二取代的氨基、氰基、硝基、巯基、取代的巯基、羧基、羰基、羰基二氧基、酯化的羧基、氨基甲酰基、N-单-或N，N-二-取代的氨基甲酰基、磺基、取代的磺酰基、氨基磺酰基或者N-单-或N，N-二-取代的氨基磺酰基；

X表示2个氢原子；1个氢原子和羟基；O；或者氢和低级烷氧基；

Z表示氢或低级烷基；并且

环A中以波浪线表示的两个键不存在并且被4个氢原子替换，且环B中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环B中以波浪线表示的两个键不存在并且被总共4个氢原子替换，且环A中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环A和环B中所有的4条波浪形键均不存在并且被总共8个氢原子替换。

对于该星形孢菌素衍生物而言，上下文所用的一般术语和定义优选具有以下含义：

前缀“低级”表示相关的基团优选最多具有7个碳原子且包括7个碳原子，特别是最多具有4个碳原子且包括4个碳原子。

低级烷基特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、以及戊基、己基或庚基。

未取代或取代的烷基优选为C₁-C₂₀烷基，特别是低级烷基，一般为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，其可以是未取代的或者尤其被下列基团取代：卤素，诸如氟、氯、溴或碘；C₆-C₁₄芳基，诸如苯基或萘基；羟基；醚化的羟基，例如低级烷氧基、苯基-低级烷氧基或苯氧基；酯化的羟基，诸如低级烷酰基氧基或苯甲酰氧基；氨基；单或二取代的氨基，诸如低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、苯基-低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、N，N-二-(苯基-低级烷基)氨基；氰基；巯基；取代的巯基，诸如低级烷硫基；羧基；酯化的羧基，诸如低级烷氧羰基；氨基甲酰基；N-单-或N，N-二取代的氨基甲酰基，诸如N-低级烷基氨基甲酰基或N，N-二-低级烷基氨基甲酰基；磺基；取代的磺基，诸如低级烷磺酰基或低级烷氧基磺酰基；氨基磺酰基或N-单-或N，N-二取代的氨基磺酰基，例如N-低级烷基氨基磺酰基或N，N-二-低级烷基氨基磺酰基。

卤素优选为氟、氯、溴或碘，特别是氟或氯。

醚化的羟基特别是低级烷氧基；C₆-C₁₄芳氧基，诸如苯氧基；或者C₆-C₁₄芳基-低级烷氧基，诸如苄氧基。

酯化的羟基优选为低级烷酰基氧基或C₆-C₁₄芳基羰基氧基，诸如苯甲酰基氧基。

单或二取代的氨基特别是被低级烷基、C₆-C₁₄芳基、C₆-C₁₄芳基-低级烷基、低级烷酰基或C₆-C₁₂芳基羰基单取代或二取代的氨基。

取代的巯基特别是低级烷硫基、C₆-C₁₄芳硫基、C₆-C₁₄芳基-低级烷硫基、低级烷酰基硫基或C₆-C₁₄芳基-低级烷酰基硫基。

酯化的羧基特别是低级烷氧基羰基、C₆-C₁₄芳基-低级烷氧基羰基或C₆-C₁₄芳氧基羰基。

N-单-或N，N-二取代的氨基甲酰基特别是被下列基团N-单取代或N，N-二取代的氨基甲酰基，所述基团为低级烷基、C₆-C₁₄芳基或C₆-C₁₄芳基-低级烷基。

取代的磺酰基特别是C₆-C₁₄芳基磺酰基，诸如甲苯磺酰基、C₆-C₁₄芳基-低级烷磺酰基或低级烷磺酰基。

N-单-或N，N-二取代的氨基磺酰基特别是被低级烷基、C₆-C₁₄芳基或C₆-C₁₄芳基-低级烷基N-单取代或N，N-二取代的氨基磺酰基。

C₆-C₁₄芳基为环系中具有6至14个碳原子的芳基，诸如苯基、萘基、芴基或茚基，其是未取代的或尤其被下列基团取代：卤素(诸如氟、氯、溴或碘)、苯基或萘基、羟基、低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、苯氧基、低级烷酰基氧基、苯甲酰氧基、氨基、低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、苯基-低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、N，N-二-(苯基-低级烷基)氨基、氰基、巯基、低级烷硫基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、磺基、低级烷磺酰基、低级烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、N-低级烷基氨基磺酰基或N，N-二-低级烷基氨基磺酰基。

下标n和m各自优选为1、2或特别是0。一般而言，特别优选其中n和m各自为0(零)的式I化合物。

最多含有29个碳原子的脂肪族烃基团R₃、R₄、R₈或R₁₀可以被非环状取代基取代且优选最多具有18个、尤其是最多12个、通常不超过7个碳原子，它们可以是饱和或不饱和的，并且特别是未取代或者被非环状取代基取代的直链或支链的低级烷基、低级链烯基、低级链二烯基或低级炔基。低级烷基例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，还有正戊基、异戊基、正己基、异己基和正庚基；低级链烯基例如为烯丙基、丙烯基、异丙烯基、2-或3-甲代烯丙基和2-或3-丁烯基；低级链二烯基例如为1-戊-2，4-二烯基；低级炔基例如为炔丙基或2-丁炔基。在相应的不饱和基团中，双键尤其是位于比相对于自由价的α-位置更高的位置。取代基特别是下文被定义为R^o的取代基的酰基，优选游离或酯化的羧基，诸如羧基或低级烷氧基羰基；氰基；或二-低级烷基氨基。

各自最多含有29个碳原子的碳环或碳环-脂肪族基团R₃、R₄、R₈或R₁₀特别是芳香族、脂环族、脂环族-脂肪族或芳香族-脂肪族基团，它们以未取代的形式存在或者被下文称为R^o的取代基的基团取代。芳香族基团(芳基)R₃或R₄最特别是苯基、萘基诸如1-或2-萘基、联苯基诸如特别是4-联苯基、蒽基、芴基和薁基以及它们的具有一个或多个饱和环的芳香族类似物，其以未取代的形式存在或被下文称为R^o的取代基的基团取代。优选的芳香族-脂肪族基团为芳基-低级烷基和芳基-低级链烯基，例如具有末端苯基的苯基-低级烷基或苯基-低级链烯基，例如苄基、苯乙基、1-、2-或3-苯丙基、二苯甲基、三苯甲基和肉桂基以及1-或2-萘甲基。对于带有非环基团(诸如低级烷基)的芳基，特别提及的是邻、间和对甲苯基以及甲基位于不同位置的二甲苯基。

最多含有29个碳原子的脂环族基团R₃、R₄、R₈或R₁₀特别是取代的或优选未取代的单、二或多环环烷基、环烯基或环二烯基。优选的是最多含有14个、特别是12个环碳原子和3至8、优选5至7，且最特别是6元环的基团，它们还可以带有作为取代基的一个或多个(例如两个)脂肪烃基团(例如上文定义的那些)、特别是低级烷基或其它脂环族基团。优选的取代基为下文R^o所定义的非环状取代基。

最多含有29个碳原子的脂环族-脂肪族基团R₃、R₄、R₈或R₁₀为其中非环状基团带有一个或多个如上文定义的脂环族基团的基团，所述非环状基团特别是最多含有7个、优选最多4个碳原子的非环状基团，例如特别是甲基、乙基和乙烯基。特别提及的是环烷基-低级烷基基团以及其类似物，所述类似物在环和/或链中不饱和但不是芳族基团，且其在链的末端碳原子上携带着环。优选的取代基为下文R^o所定义的非环状取代基。

各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基团R₃、R₄、R₈或R₁₀特别是单环的但也可以是二环或多环的、具有芳香族特征的氮杂、硫杂、氧杂、硫氮杂、氧氮杂、二氮杂、三氮杂或四氮杂环状基团，以及这些类型相应的部分饱和或最特别是全饱和的杂环基团，需要时这些基团还可以带有其它非环状、碳环或杂环基团，和/或可以被官能团单、二或多取代，所述官能团优选上文被称为脂肪烃基团的取代基的那些。它们最特别是未取代或取代的下列基团：含有氮、氧或硫原子的单环基团，诸如2-吖丙啶基；并且尤其是此类的芳香族基团，诸如吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，以及噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基；含有氧、硫或氮原子的类似二环基团，例如为吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，或苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基；优选的含有数个杂原子的单环和二环基团例如为咪唑基且通常为2-或4-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，或噻唑基且通常为2-噻唑基，以及苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，或喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基。还可以考虑合适的部分饱和或特别是完全饱和的类似基团，诸如2-四氢呋喃基；2-或3-吡咯烷基；2-、3-或4-哌啶基；以及2-或3-吗啉基；2-或3-硫代吗啉基；2-哌嗪基；和N-单-或N，N’-双-低级烷基-2-哌嗪基。这些基团还可以带有一个或多个非环状、碳环或杂环基团，特别是上文提到的那些基团。杂环基团R₃或R₄的自由价必须来自其碳原子之一。杂环基可以是未取代的或被一个或多个、优选一个或两个下文R^o所定义的取代基取代。杂环-脂肪族基团R₃、R₄、R₈或R₁₀特别是低级烷基基团，尤其是最多含有7个，优选最多4个碳原子，例如上文定义的那些，该低级烷基基团带有一个、两个或多个杂环基团，所述杂环基团例如是上一段所述的那些，其中杂环还可以通过其氮原子之一连接到脂肪链上。优选的杂环-脂肪族基团R₁例如为咪唑-1-基甲基、4-甲基哌嗪-1-基甲基、哌嗪-1-基甲基、2-(吗啉-4-基)乙基以及吡啶-3-基甲基。杂环基可以是未取代的或被一个或多个、优选一个或两个下文R^o所定义的取代基取代。

各自最多含有20个碳原子且各自最多含有10个杂原子的杂脂肪族基团R₃、R₄、R₈或R₁₀为其中一个、两个或多个碳原子被相同或不同的杂原子(诸如特别是氧、硫和氮)所代替的脂肪族基团。杂脂肪族基团R₁特别优选的排列采取氧杂-烷基的形式，其中在优选的直链的烷基中，一个或多个碳原子被优选被数个(特别是2个)碳原子相互隔开的氧原子替换，以使它们形成重复基团，需要的话，为多重复基团(O-CH₂-CH₂-)_q，其中q＝1-7。

除酰基外，R₃、R₄、R₈或R₁₀特别优选为低级烷基，尤其是甲基或乙基；低级烷氧基羰基-低级烷基，特别是甲氧基羰基甲基或2-(叔丁氧羰基)乙基；羧基-低级烷基，特别是羧甲基或2-羧基乙基；或氰基-低级烷基，特别是2-氰基乙基。

最多含有30个碳原子的酰基R₃、R₄、R₆、R₇、R₈、R₉或R₁₀衍生自羧酸(需要时进行官能团修饰)、有机磺酸或磷酸诸如焦磷酸或正磷酸(需要时被酯化)。

标为Ac¹且衍生自羧酸(需要时进行官能团修饰)的酰基特别是亚式Y-C(＝W)-之一，其中W为氧、硫或亚氨基，Y为氢、最多含有29个碳原子的烃基R^o、烃氧基R^o-O-、氨基或取代的氨基，且特别是式R^oHN-或R^oR^oN-(其中R^o基团可以彼此相同或不同)之一。

烃基R^o为各自最多含有29个碳原子、特别是最多18个碳原子、且优选最多12个碳原子的非环状(脂肪族)、碳环或碳环-非环状烃基团，并且是饱和或不饱和的、未取代或取代的。它可以在非环状和/或环状部分中含有相同或不同的杂原子(例如特别是氧、硫和氮)来代替一个、两个或多个碳原子；对于在环状部分含有杂原子的情况，它被描述为杂环基团或杂环-非环状基团。

不饱和基团是含有一个或多个、特别是共轭和/或孤立的多重键(双键或三键)的那些。术语环状基团还包括含有共轭双键的芳香族和非芳香族基团，例如其中至少一个6-元碳环或5-至8-元杂环含有最多数目的非累积双键的那些。其中至少一个环作为6-元芳香环(即苯环)存在的碳环基团被定义为芳基基团。

非环状未取代的烃基R^o特别是直链或支链的低级烷基、低级链烯基、低级链二烯基或低级炔基基团。低级烷基R^o例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基以及正戊基、异戊基、正己基、异己基和正庚基；低级链烯基例如为烯丙基、丙烯基、异丙烯基、2-或3-甲代烯丙基和2-或3-丁烯基；低级链二烯基例如为1-戊-2，4-二烯基；低级炔基例如为炔丙基或2-丁炔基。在相应的不饱和基团中，双键特别是位于比相对于自由价而言的α-位更高的位置。

碳环烃基团R^o特别是单、二或多环环烷基、环烯基或环二烯基或者相应的芳基。优选最多含有14个、特别是12个环碳原子和3-至8-、优选5-至7-且最特别是6-元环的基团，它们还可以带有一个或多个、例如两个非环状基团(例如上文所述的那些)、特别是低级烷基或其它碳环基团。碳环-非环状基团是其中非环状基团带有一个或多个上文定义的碳环(需要时为芳香族基团)的那些，所述非环状基团特别是最多含有7个、优选最多4个碳原子的非环状基团，特别是诸如甲基、乙基和乙烯基。特别提及的是环烷基-低级烷基和芳基-低级烷基及它们的在环和/或链中不饱和的且在链的末端碳原子处带有环的类似物。

环烷基R^o最特别地具有3至最多10个(且包括10个)碳原子，例如为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基以及二环[2，2，2]辛基、2-二环[2，2，1]庚基和金刚烷基，其还可以被1、2或多个例如低级烷基、特别是甲基取代；环烯基例如为在1-、2-或3位上带有双键的已经定义的单环环烷基之一。环烷基-低级烷基或环烷基-低级链烯基例如为被上面定义的环烷基之一取代的-甲基、-1-或-2-乙基、-1-或-2-乙烯基、1-、-2-或-3-丙基或-烯丙基，优选在直链末端被取代的那些。

芳基基团R^o最特别是苯基、萘基如1-或2-萘基、联苯基诸如特别是4-联苯基以及蒽基、芴基和薁基，以及它们的含有一个或多个饱和环的芳香族类似物。优选的芳基-低级烷基和芳基-低级链烯基例如为含有末端苯基的苯基-低级烷基或苯基-低级链烯基，例如苄基、苯乙基、1-、2-或3-苯丙基、二苯甲基、三苯甲基和肉桂基以及1-或2-萘甲基。芳基可以是未取代或取代的。

包括杂环-非环状基团的杂环基团特别是单环的还可以是二环或多环的具有芳香族特征的氮杂、硫杂、氧杂、硫氮杂、氧氮杂、二氮杂、三氮杂或四氮杂环状基团，以及这类相应的部分饱和或最特别是全部饱和的杂环基团；需要时，例如在上面提到的碳环或芳基的情况下，这些基团还可以带有非环状、碳环或杂环基团，和/或可以被官能团单、二或多取代。杂环-非环状基团中的非环状部分例如具有相应的碳环-非环状基团中所指明的含义。它们最特别是未取代或取代的：含有氮、氧或硫原子的单环基团，诸如2-吖丙啶基；以及尤其是此类的芳香族基团，诸如吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，以及噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基；含有氧、硫或氮原子的类似二环基团，例如为吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，或苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基；优选的含有数个杂原子的单环和二环基团例如为咪唑基且通常为2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，或噻唑基且通常为2-噻唑基，以及苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，或喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基。还可以考虑合适的部分饱和或特别是完全饱和的类似基团，诸如2-四氢呋喃基；4-四氢呋喃基；2-或3-吡咯烷基；2-、3-或4-哌啶基；以及2-或3-吗啉基；2-或3-硫代吗啉基；2-哌嗪基；和N，N’-双-低级烷基-2-哌嗪基。这些基团还可以带有一个或多个非环状、碳环或杂环基团，特别是上文提到的那些。杂环-非环状基团特别衍生自最多含有7个、优选最多4个碳原子的非环状基团，例如上文所述的那些，并且可以带有一个、两个或多个杂环基团，例如上文所述的那些，所述环还可以通过其氮原子之一连接到脂肪链上。

如已经提到的那样，烃基(包括杂环基)可以被一个、两个或更多个相同或不同的取代基(官能团)取代；可以考虑一个或多个以下取代基：低级烷基；游离、醚化和酯化的羟基；羧基和酯化的羧基；巯基-和低级烷硫基-，且需要时，取代的苯硫基；卤素原子，通常为氯和氟，但也可以是溴和碘；卤素-低级烷基；以甲酰基(即醛基)和酮基以及相应的缩醛或缩酮形式存在的氧代基团；叠氮基；硝基；氰基；伯、仲和优选的叔氨基，氨基-低级烷基，单-或二取代的氨基-低级烷基，被常规保护基团(特别是低级烷氧基羰基，通常为叔丁氧羰基)保护的伯或仲氨基，低级亚烷二氧基，以及游离或官能团修饰的磺基，通常为氨磺酰基或者以游离形式或作为盐存在的磺基。烃基还可以带有氨基甲酰基、脲基或胍基基团(其为游离的或带有一个或两个取代基的)以及氰基。以上使用词语“基(团)”还用于表示单独的基团。

卤素-低级烷基优选含有1至3个卤素原子；优选为三氟甲基或氯甲基。

作为取代基存在于烃基中的醚化羟基基团例如为低级烷氧基，通常为甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基和叔丁氧基，它们还可以被取代，特别是被如下基团取代：(i)杂环基，杂环基优选可以具有4至12个环原子，可以是不饱和的或者部分或全饱和的，是单环或二环的，并可以最多含有三个选自氮、氧和硫的杂原子，最特别是吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，以及噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基，吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基，咪唑基且通常为1-或2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，噻唑基且通常为2-噻唑基，苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，或喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基，2-四氢呋喃基，4-四氢呋喃基，2-或4-四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、3-或4-哌啶基，1-、2-或3-吗啉基，2-或3-硫代吗啉基，2-哌嗪基或N，N’-双-低级烷基-2-哌嗪基；以及(ii)卤素原子，例如特别是在2-位被单、二或多取代，如在2，2，2-三氯乙氧基、2-氯乙氧基或2-碘乙氧基中那样；或(iii)羟基；或(iv)低级烷氧基，各自优选特别是在2-位被单取代，如在2-甲氧基乙氧基中那样。此类醚化羟基还可以是未取代或取代的苯氧基和苯基-低级烷氧基，诸如特别是苄氧基、二苯甲氧基和三苯基甲氧基(三苯甲氧基)以及杂环基氧基，其中杂环基可以优选具有4至12个环原子，其可以是不饱和的或者部分饱和或全部饱和的，可以是单或二环的，且可以最多含有三个选自氮、氧和硫的杂原子，最特别是吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，以及噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基，吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基，咪唑基且通常为1-或2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，噻唑基且通常为2-噻唑基，苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基，2-四氢呋喃基，4-四氢呋喃基，2-或4-四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、3-或4-哌啶基，1-、2-或3-吗啉基，2-或3-硫代吗啉基，2-哌嗪基或N，N’-双-低级烷基-2-哌嗪基；例如特别是2-或4-四氢吡喃基氧基。

本文中的醚化羟基包括甲硅烷基化的羟基基团，例如通常为三-低级烷基甲硅烷基氧基，通常为三甲基甲硅烷基氧基和二甲基-叔丁基甲硅烷基氧基，或者是苯基二-低级烷基甲硅烷基氧基和低级烷基-二苯基甲硅烷基氧基。

作为取代基存在于烃基中的酯化羟基例如为低级烷酰基氧基。

作为取代基存在于烃基中的羧基是其中氢原子被上文描述的烃基之一(优选低级烷基-或苯基-低级烷基基团)替换的羧基；酯化羧基的示例是低级烷氧基羰基或苯基-低级烷氧基羰基(如有需要的话，在苯基部分被取代)，特别是甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基和苄氧基羰基以及内酯化的羧基。

作为烃基取代基的伯氨基基团-NH₂还可以以被常规保护基团保护的形式存在。仲氨基带有代替两个氢原子之一的烃基，其中所述的烃基优选是未取代的，通常为上文所述的烃基之一，特别是低级烷基，并且仲氨基也可以以被保护的形式存在。

作为取代基存在于烃基中的叔氨基带有2个不同或优选相同的烃基(包括杂环基)，诸如上文描述的未取代的烃基，特别是低级烷基。

优选的氨基是式R₁₁(R₁₂)N-的氨基，其中R₁₁和R₁₂各自独立地为氢、未取代的非环状C₁-C₇-烃基(诸如特别是C₁-C₄烷基或C₂-C₄链烯基)或者单环芳基、芳烷基或芳链烯基，需要的话被C₁-C₄-烷基、C₁-C₄-烷氧基、卤素和/或硝基取代，且最多具有10个碳原子，其中所述含碳基团可以通过碳-碳键或者氧原子、硫原子或氮原子相互连接，需要时可被烃基取代。在这种情况下，它们形成含有氨基氮原子的含氮杂环。以下为特别优选的二取代氨基的实例：二-低级烷基氨基，通常为二甲基氨基或二乙基氨基；吡咯烷子基；咪唑-1-基；哌啶子基；哌嗪子基；4-低级烷基哌嗪子基；吗啉代；硫代吗啉代；和哌嗪子基或4-甲基哌嗪子基；以及二苯基氨基和二苄基氨基，需要时特别在苯基部分可例如被低级-烷基、低级-烷氧基、卤素和/或硝基取代。以下是被保护的基团的实例：尤其是低级烷氧基羰基氨基，通常为叔丁氧羰基氨基；苯基-低级烷氧基羰基氨基，通常为4-甲氧基苄氧羰基氨基和9-芴基甲氧羰基氨基。

氨基-低级烷基最特别是在低级烷基链的1-位被氨基取代，并且特别是氨基甲基。

单或二取代的氨基-低级烷基是被一个或两个基团取代的氨基-低级烷基，其中氨基-低级烷基最特别是在低级烷基链的1-位被氨基取代，并且特别是氨基甲基；在此处氨基取代基优选(如果在各氨基中相互独立地存在2个取代基)选自：低级烷基，例如特别是甲基、乙基或正丙基；羟基-低级烷基，通常为2-羟基乙基；C₃-C₈环烷基，特别是环己基；氨基-低级烷基，通常为3-氨基丙基或4-氨基丁基；N-单-或N，N-二(低级烷基)-氨基-低级烷基，通常为3-(N，N-二甲基氨基)丙基；氨基；N-单-或N，N-二-低级烷基氨基；和N-单-或N，N-二-(羟基-低级烷基)氨基。

二取代的氨基-低级烷基还可以是5或6元的饱和或不饱和杂环基，该杂环基通过氮原子(优选在1-位)与低级烷基键合，并且具有0至2个、特别是0或1个选自氧、氮和硫的其它杂原子，其为未取代的或特别是被一个或两个选自低级烷基(通常为甲基)以及氧代的基团取代的。此处优选的是吡咯烷子基(1-吡咯烷基)、哌啶子基(1-哌啶基)、哌嗪子基(1-哌嗪基)、4-低级烷基哌嗪子基且通常为4-甲基哌嗪子基、咪唑子基(1-咪唑基)、吗啉代(4-吗啉基)或者硫代吗啉代、S-氧代-硫代吗啉代或S，S-二氧代硫代吗啉代。

低级亚烷二氧基特别是亚甲二氧基。

带有一个或两个取代基的氨基甲酰基特别是在氮上被一个或两个基团取代的氨基羰基(氨基甲酰基)；此处氨基取代基优选(如果2个取代基相互独立地存在于各氨基上)选自：低级烷基，例如特别是甲基、乙基或正丙基；羟基-低级烷基，通常为2-羟基乙基；C₃-C₈环烷基，特别是环己基；氨基-低级烷基，通常为3-氨基丙基或4-氨基丁基；N-单-或N，N-二(低级烷基)-氨基-低级烷基，通常为3-(N，N-二甲基氨基)丙基；氨基；N-单-或N，N-二-低级烷基氨基；和N-单-或N，N-二-(羟基-低级烷基)氨基；氨基氨基甲酰基中的二取代氨基还可以是5或6元的饱和或不饱和杂环基，该杂环基含有键合的氮原子及0至2个、特别是0或1个选自氧、氮和硫的其它杂原子，其是未取代的或被取代的，尤其是被一个或两个选自低级烷基(通常为甲基)以及氧代的基团取代。此处优选的是吡咯烷子基(1-吡咯烷基)、哌啶子基(1-哌啶基)、哌嗪子基(1-哌嗪基)、4-低级烷基哌嗪子基且通常为4-甲基哌嗪子基、咪唑子基(1-咪唑基)、吗啉代(4-吗啉基)或者硫代吗啉代、S-氧代-硫代吗啉代或S，S-二氧代硫代吗啉代。

被标明为Ac²的衍生自有机磺酸的酰基特别是具有亚式R^o-SO₂-的酰基，其中R^o为如上文定义的具有一般和具体含义的烃基，在此处通常优选后者。特别优选的是低级烷基苯基磺酰基，特别是4-甲苯磺酰基。

被标明为Ac³的衍生自磷酸(需要时可被酯化)的酰基特别是具有亚式R^oO(R^oO)P(＝O)-的酰基，其中基团R^o相互独立地如在上文描述的一般和具体含义中所定义。

上下文中给出的取代基的简缩数据被认为是优选的。

优选的本发明的化合物例如为其中R^o具有以下优选含义的那些：低级烷基，特别是甲基或乙基；氨基-低级烷基(其中氨基是未被保护的或被常规氨基保护基团保护，特别是被低级烷氧基羰基、一般为叔-低级烷氧基羰基如叔丁氧羰基保护)，例如氨基甲基、R，S-、R-或优选S-1-氨基乙基、叔丁氧羰基氨基甲基或者R，S-、R-或优选S-1-(叔丁氧羰基氨基)乙基；羧基-低级烷基，通常为2-羧基乙基；低级烷氧基羰基-低级烷基，通常为2-(叔丁氧羰基)乙基；氰基-低级烷基，通常为2-氰基乙基；四氢吡喃基氧基-低级烷基，通常为4-(四氢吡喃基)-氧基甲基；吗啉代-低级烷基，通常为2-(吗啉代)乙基；苯基；低级烷基苯基，通常为4-甲基苯基；低级烷氧基苯基，通常为4-甲氧基苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基，通常为4-[2-(咪唑-1-基)乙基]氧基苯基；羧基苯基，通常为4-羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基，通常为4-乙氧羰基苯基或4-甲氧基苯基；卤素-低级烷基苯基，通常为4-氯甲基苯基；吡咯烷子基苯基，通常为4-吡咯烷子基苯基；咪唑-1-基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基)苯基；哌嗪子基苯基，通常为4-哌嗪子基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基；吗啉代苯基，通常为4-吗啉代苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基，通常为4-吡咯烷子基甲基苯基；咪唑-1-基-低级烷基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基甲基)苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基，通常为4-哌嗪子基甲基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)-苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基，通常为4-吗啉代甲基苯基；哌嗪子基羰基苯基，通常为4-哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基-哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基。

优选的酰基Ac¹为由亚式R^o-CO-表示的羧酸的酰基，其中R^o具有上文烃基R^o的一般和优选含义之一。此处特别优选的R^o是：低级烷基，特别是甲基或乙基；氨基-低级烷基(其中氨基是未被保护的或被常规氨基保护基团保护，特别是被低级烷氧基羰基、一般为叔-低级烷氧基羰基如叔丁氧羰基保护)，例如氨基甲基、R，S-、R-或优选S-1-氨基乙基、叔丁氧羰基氨基甲基或者R，S-、R-或优选S-1-(叔丁氧羰基氨基)乙基；羧基-低级烷基，通常为2-羧基乙基；低级烷氧基羰基-低级烷基，通常为2-(叔丁氧羰基)乙基；四氢吡喃基氧基-低级烷基，通常为4-(四氢吡喃基)-氧基甲基；苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基，通常为4-[2-(咪唑-1-基)乙基]氧基苯基；羧基苯基，通常为4-羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基，通常为4-乙氧羰基苯基，卤素-低级烷基苯基，通常为4-氯甲基苯基；咪唑-1-基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基)苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基，通常为4-吡咯烷子基甲基苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基，通常为4-哌嗪子基甲基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)-苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基，通常为4-吗啉代甲基苯基；哌嗪子基羰基苯基，通常为4-哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基-哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基。

另一个优选的酰基Ac¹衍生自碳酸单酯并用亚式R^o-O-CO-表示。在这些衍生物中，低级烷基特别是叔丁基为特别优选的烃基R^o。

另一个优选的酰基Ac¹衍生自碳酸(或还有硫代碳酸)的酰胺，并用式R^oHN-C(＝W)-或R^oR^oN-C(＝W)-表示，其中基团R^o相互独立地如上文所定义，W为硫且特别是氧。具体而言，优选其中Ac¹为式R^oHN-C(＝W)-基团的化合物，其中W为氧且R^o具有以下优选的含义之一：吗啉代-低级烷基，通常为2-吗啉代乙基；苯基；低级烷氧基苯基，通常为4-甲氧基苯基或4-乙氧基苯基；羧基苯基，通常为常为4-羧基苯基；或低级烷氧基羰基苯基，通常为4-乙氧羰基苯基。

优选的亚式R^o-SO₂-的酰基Ac²(其中R^o为如上文一般和具体含义中所定义的烃基)为低级烷基苯基磺酰基，通常为4-甲苯磺酰基。

如果p为0，则结合有R₃的氮原子不带电荷。如果p为1，R₄也必须存在，则结合有R₃和R₄的氮原子(季氮)带正电荷。

各自最多含有29个碳原子的脂肪族、碳环或碳环-脂肪族基团的定义、或者各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基或杂环-脂肪族基团的定义、或者各自最多含有30个碳原子的酰基的定义优选匹配为相应基团R₃和R₄所给出的定义。特别优选的是R₅低级烷基，特别是甲基，或最特别是氢。

Z特别是低级烷基，最特别是甲基或氢。

如果环A中没有波浪线表示的两个键，则式I中由数字1、2、3和4表征的碳原子之间不存在双键(四氢化衍生物)而仅存在单键，而环B为芳香性的(式I中由8和9表征的碳原子之间以及由10和11表征的碳原子之间存在双键)。如果环B中没有波浪线表示的两个键，则式I中由数字8、9、10和11表征的碳原子之间不存在双键(四氢化衍生物)而仅存在单键，而环A为芳香性的(式I中由1和2表征的碳原子之间以及由3和4表征的碳原子之间存在双键)。如果环A和B中没有波浪线表示的全部四个键并且被总共8个氢原子替换，则式I中编号为1、2、3、4、8、9、10和11的碳原子之间不存在双键(八氢化衍生物)而仅存在单键。

根据本发明化合物的性质，它们还可以以药学上(即生理上)可接受的盐的形式存在，条件是它们含有成盐基团。为了分离和纯化，还可以使用药学上不可接受的盐。对于治疗的用途，仅可使用药学上可接受的盐且优选这些盐。

因此，具有游离酸基团例如游离磺基、磷酰基或羧基的式I化合物可以作为与成盐碱性组分形成的盐、优选生理上可接受的盐而存在。这些盐可以主要是金属或铵盐，诸如碱金属或碱土金属盐，例如钠、钾、镁或钙盐；或者与氨或合适的有机胺的铵盐，所述有机胺特别是三级单胺和杂环碱，例如三乙胺、三-(2-羟乙基)-胺、N-乙基哌啶或N，N′-二甲基哌嗪。

具有碱性性质的本发明化合物还可以作为加成盐、特别是作为与无机和有机酸的酸加成盐而存在，还可以作为季盐存在。因此，例如，具有碱性基团例如氨基作为取代基的化合物可以与普通酸形成酸加成盐。合适的酸例如为氢卤酸如盐酸和氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸或高氯酸；或者脂肪族、脂环族、芳香族或杂环羧酸或磺酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、羟基马来酸、草酸、丙酮酸、苯基乙酸、苯甲酸、对-氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、对-羟基苯甲酸、水杨酸、对-氨基水杨酸、双羟萘酸、甲磺酸、乙磺酸、羟基乙磺酸、乙二磺酸、卤代苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸或对氨基苯磺酸，还有甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸以及抗坏血酸。

由于游离形式及其盐(包括例如在新化合物的纯化或鉴定中可用作中间体的那些盐)和溶剂化物形式的化合物(特别是式I化合物)之间的密切关系，因此上下文中任何游离化合物的称谓在适宜和方便时应当理解为还指其相应的盐及溶剂化物，例如水合物。

式A、B、C、D、I、II、III、IV、V或VI化合物，特别是其中R₅为氢的那些，具有有价值的药理特性。

对于上下文提到的基团或化合物，在适宜和方便时，一般定义可以被上下文所述的更具体的定义所替换。

优选如下定义的式I、II、III、IV、V、VI化合物或其盐(如果存在至少一个成盐基团的话)，其中：

R₁和R₂相互独立地为低级烷基；被如下基团取代的低级烷基：卤素、C₆-C₁₄芳基、羟基、低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、苯氧基、低级烷酰基氧基、苯甲酰氧基、氨基、低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、苯基-低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、N，N-二-(苯基-低级烷基)氨基、氰基、巯基、低级烷硫基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、磺基、低级烷磺酰基、低级烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、N-低级烷基氨基磺酰基或N，N-二-低级烷基氨基磺酰基；卤素；低级烷氧基；C₆-C₁₄芳氧基；C₆-C₁₄芳基-低级烷氧基；低级烷酰基氧基；C₆-C₁₄芳基羰基氧基；被低级烷基、C₆-C₁₄芳基、C₆-C₁₄芳基-低级烷基、低级烷酰基或C₆-C₁₂芳基羰基单取代或二取代的氨基；氰基；硝基；巯基；低级烷硫基；C₆-C₁₄芳硫基；C₆-C₁₄芳基-低级烷硫基；低级烷酰基硫基；C₆-C₁₄芳基-低级烷酰基硫基；羧基；低级烷氧基羰基、C₆-C₁₄芳基-低级烷氧基羰基；C₆-C₁₄芳氧基羰基；氨基甲酰基；被低级烷基、C₆-C₁₄芳基或C₆-C₁₄芳基-低级烷基N-单-或N，N-二取代的氨基甲酰基；磺基；C₆-C₁₄芳基磺酰基；C₆-C₁₄芳基-低级烷磺酰基；低级烷磺酰基；或者被低级烷基、C₆-C₁₄芳基或C₆-C₁₄芳基-低级烷基N-单-或N，N-二取代的氨基磺酰基，其中C₆-C₁₄芳基为环系中含有6至12个碳原子的芳基基团，它可以是未取代的或被如下基团取代：卤素、苯基或萘基、羟基、低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、苯氧基、低级烷酰基氧基、苯甲酰氧基、氨基、低级烷基氨基、低级烷酰基氨基、苯基-低级烷基氨基、N，N-二-低级烷基氨基、N，N-二-(苯基-低级烷基)氨基、氰基、巯基、低级烷硫基、羧基、低级烷氧基羰基、氨基甲酰基、N-低级烷基氨基甲酰基、N，N-二-低级烷基氨基甲酰基、磺基、低级烷磺酰基、低级烷氧基磺酰基、氨基磺酰基、N-低级烷基氨基磺酰基或N，N-二-低级烷基氨基磺酰基；

n和m相互独立地为0或1或2，优选为0；

R₃、R₄、R₈、R₁₀相互独立地为氢、低级烷基、低级链烯基或低级链二烯基，它们各自为未取代的或者单取代的或多取代的，优选被独立地选自如下基团的取代基单取代或二取代：低级烷基；羟基；低级烷氧基，其可以是未取代的或者被如下基团单-、二-或三取代：(i)具有4至12个环原子的杂环基，它可以是不饱和的、全饱和的或部分饱和的，可以是单环或二环的，可以最多含有三个选自氮、氧和硫的杂原子，并且最特别是吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，或在更广泛意义上还有噻吩基如2-或3-噻吩基，或者呋喃基如2-呋喃基，吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基，咪唑基且通常为1-或2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，噻唑基且通常为2-噻唑基，苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基，2-四氢呋喃基，4-四氢呋喃基，4-四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、3-或4-哌啶基，1-、2-或3-吗啉基，2-或3-硫代吗啉基，2-哌嗪基或N，N′-双-低级烷基-2-哌嗪基，(ii)卤素，(iii)羟基或(iv)低级烷氧基；苯氧基；苯基-低级烷氧基；杂环基氧基，其中杂环基为吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，或在更广泛意义上还有噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基，吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基，咪唑基且通常为1-或2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，噻唑基且通常为2-噻唑基，苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基，2-四氢呋喃基，4-四氢呋喃基，2-或4-四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、3-或4-哌啶基，1-、2-或3-吗啉基，2-或3-硫代吗啉基，2-哌嗪基或N，N′-双-低级烷基-2-哌嗪基，诸如特别是2-或4-四氢吡喃基氧基；低级烷酰基氧基；羧基；低级烷氧基羰基；苯基-低级烷氧基羰基；巯基；低级烷硫基；苯硫基；卤素；卤素-低级烷基；氧代(1-位除外，因为否则则为酰基)；叠氮基；硝基；氰基；氨基；单-低级烷基氨基；二-低级烷基氨基；吡咯烷子基；咪唑-1-基；哌啶子基；哌嗪子基；4-低级烷基哌嗪子基；吗啉代；硫代吗啉代；未取代或在苯基部分被低级烷基、低级烷氧基、卤素和/或硝基取代的二苯基氨基或二苄基氨基；低级烷氧基羰基氨基；未取代或在苯基部分被低级烷基或低级烷氧基取代的苯基-低级烷氧基羰基氨基；芴基甲氧羰基氨基；氨基-低级烷基；单取代或二取代的氨基-低级烷基，其中氨基取代基选自低级烷基、羟基-低级烷基、C₃-C₈环烷基、氨基-低级烷基、N-单-或N，N-二-(低级烷基)氨基-低级烷基、氨基、N-单-或N，N-二-低级烷基氨基和N-单-或N，N-二-(羟基-低级烷基)氨基；吡咯烷子基-低级烷基；哌啶子基-低级烷基；哌嗪子基-低级烷基；4-低级烷基哌嗪子基-低级烷基；咪唑-1-基-低级烷基；吗啉代-低级烷基；硫代吗啉代-低级烷基；S-氧代-硫代吗啉代-低级烷基；S，S-二氧代硫代吗啉代-低级烷基；低级亚烷二氧基；氨磺酰基；磺基；氨基甲酰基；脲基；胍基；氰基；在氮上被一个或两个基团取代的氨基羰基(氨基甲酰基)和氨基羰基氧基，其中氨基取代基相互独立地选自低级烷基、羟基-低级烷基、C₃-C₈环烷基、氨基-低级烷基、N-单-或N，N-二-(低级烷基)氨基-低级烷基、氨基、N-单-或N，N-二-低级烷基氨基和N-单-或N，N-二-(羟基-低级烷基)氨基；吡咯烷子基羰基；哌啶子基羰基；哌嗪子基羰基；4-低级烷基哌嗪子基羰基；咪唑啉子基羰基；吗啉代羰基；硫代吗啉代羰基；S-氧代-硫代吗啉代羰基；和S，S-二氧代硫代吗啉代；

苯基、萘基、含有末端苯基的苯基-低级烷基或苯基-低级链烯基，其是未取代的或者被上文定义为低级烷基、低级链烯基或低级链二烯基的取代基的基团单取代或二取代；

或者杂环基-低级烷基，其中杂环基为吡咯基如2-吡咯基或3-吡咯基，吡啶基如2-、3-或4-吡啶基，或在更广泛意义上还有噻吩基如2-或3-噻吩基，或呋喃基如2-呋喃基，吲哚基且通常为2-或3-吲哚基，喹啉基且通常为2-或4-喹啉基，异喹啉基且通常为3-或5-异喹啉基，苯并呋喃基且通常为2-苯并呋喃基，色烯基且通常为3-色烯基，苯并噻吩基且通常为2-或3-苯并噻吩基，咪唑基且通常为1-或2-咪唑基，嘧啶基且通常为2-或4-嘧啶基，噁唑基且通常为2-噁唑基，异噁唑基且通常为3-异噁唑基，噻唑基且通常为2-噻唑基，苯并咪唑基且通常为2-苯并咪唑基，苯并噁唑基且通常为2-苯并噁唑基，喹唑啉基且通常为2-喹唑啉基，2-四氢呋喃基，4-四氢呋喃基，2-或4-四氢吡喃基，1-、2-或3-吡咯烷基，1-、2-、3-或4-哌啶基，1-、2-或3-吗啉基，2-或3-硫代吗啉基，2-哌嗪基或N，N′-双-低级烷基-2-哌嗪基，它们各自是未取代的或者被上文定义为低级烷基、低级链烯基或低级链二烯基的取代基的基团单取代或二取代；

或者亚式Y-C(＝W)-的酰基，其中W为氧且Y为氢、R^o、R^o-O-、R^oHN-或R^oR^oN-(其中基团R^o可以相同或不同)，

或者

亚式R^o-SO₂-的酰基，

对于式II化合物R₄还可以不存在；

或者

对于式II化合物R₄不存在，对于式I化合物R₄为氢或CH₃，

且

R₃为亚式Y-C(＝W)-的酰基，其中W为氧且Y为氢、R^o、R^o-O-、R^oHN-或R^oR^oN-(其中基团R^o可以相同或不同)，

或者

为亚式R^o-SO₂-的酰基，

其中所述基团中的R^o具有以下含义，即取代或未取代的下列基团：低级烷基，特别是甲基或乙基；氨基-低级烷基羟基-低级烷基(其中氨基是未被保护的或被常规氨基保护基团保护；特别是被低级烷氧基羰基、一般为叔-低级烷氧基羰基如叔丁氧羰基保护)，如氨基甲基、R，S-、R-或优选S-1-氨基乙基、叔丁氧羰基氨基甲基或者R，S-、R-或优选S-1-(叔丁氧羰基氨基)乙基；羧基-低级烷基，通常为2-羧基乙基；低级烷氧基羰基-低级烷基，通常为2-(叔丁氧羰基)乙基；氰基-低级烷基，通常为2-氰基乙基；四氢吡喃基氧基-低级烷基，通常为4-(四氢吡喃基)-氧基甲基；吗啉代-低级烷基，通常为2-(吗啉代)乙基；苯基；低级烷基苯基，通常为4-甲基苯基；低级烷氧基苯基，通常为4-甲氧基苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基，通常为4-[2-(咪唑-1-基)乙基]氧基苯基；羧基苯基，通常为4-羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基，通常为4-乙氧羰基苯基或4-甲氧基苯基；卤素-低级烷基苯基，通常为4-氯甲基苯基；吡咯烷子基苯基，通常为4-吡咯烷子基苯基；咪唑-1-基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基)苯基；哌嗪子基苯基，通常为4-哌嗪子基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基；吗啉代苯基，通常为4-吗啉代苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基，通常为4-吡咯烷子基甲基苯基；咪唑-1-基-低级烷基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基甲基)苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基，通常为4-哌嗪子基甲基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)-苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基，通常为4-吗啉代甲基苯基；哌嗪子基羰基苯基，通常为4-哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基；

如果R₄不存在，则p为0，或者如果R₃和R₄均存在且各自为上述基团之一，则p为1(对式II化合物而言)；

R₅为氢或低级烷基，特别是氢，

X表示2个氢原子；O；1个氢原子和羟基；或者1个氢原子和低级烷氧基；

Z为氢或特别是低级烷基，最特别是甲基；

并且对于式II化合物，环A中以波浪线表示的两个键优选不存在并且被4个氢原子替换，且环B中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环B中以波浪线表示的两个键不存在并且被总共4个氢原子替换，且环A中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环A和环B中所有的4条波形键均不存在并且被总共8个氢原子替换。

特别优选如下的式I化合物或其盐(如果存在至少一个成盐基团的话)，其中：

m和n各自为0；

R₃和R₄相互独立地为氢；未取代的或者被相互独立地选自羧基、低级烷氧基羰基和氰基的基团单或二取代、特别是单取代的低级烷基；

或者

R₄为氢或-CH₃，且

R₃如上定义，或者R₃优选为亚式R^o-CO的酰基，其中R^o为低级烷基；氨基-低级烷基，其中氨基以未被保护的形式存在或者被低级烷氧基羰基保护；四氢吡喃基氧基-低级烷基；苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基；羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基；卤素-低级烷基苯基；咪唑-1-基苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基；哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基哌嗪子基)苯基；

或者为亚式R^o-O-CO-的酰基，其中R^o为低级烷基；

或者为亚式R^oHN-C(＝W)-的酰基，其中W为氧且R^o具有以下含义：吗啉代-低级烷基、苯基、低级烷氧基苯基、羧基苯基或低级烷氧基羰基苯基；

或者R₃为低级烷基苯基磺酰基，通常为4-甲苯磺酰基；

对于优选的式II化合物，下面还描述了优选的R₃基团的其它具体实例，

R₅为氢或低级烷基，特别是氢，

X表示2个氢原子或表示O；

Z为甲基或氢。

特别优选如下的式II化合物或其盐(如果存在至少一个成盐基团的话)，其中：

m和n各自为0；

R₃和R₄相互独立地为氢；未取代的或者被相互独立地选自羧基、低级烷氧基羰基和氰基的基团单或二取代、特别是单取代的低级烷基；在此R₄还可以不存在；

或者

R₄不存在，且

R₃为亚式R^o-CO的酰基，其中R^o为低级烷基，特别是甲基或乙基；氨基-低级烷基，其中氨基是未被保护的或者被低级烷氧基羰基(通常为叔-低级烷氧基羰基如叔丁氧羰基)保护，例如氨基甲基、R，S-、R-或优选S-1-氨基乙基、叔丁氧羰基氨基甲基或者R，S-、R-或优选S-1-(叔丁氧羰基氨基)乙基；四氢吡喃基氧基-低级烷基，通常为4-(四氢吡喃基)氧基甲基；苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基，通常为4-[2-(咪唑-1-基)乙基]氧基苯基；羧基苯基，通常为4-羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基，通常为4-甲氧基-或4-乙氧基羰基苯基；卤素-低级烷基苯基，通常为4-氯甲基苯基；咪唑-1-基苯基，通常为4-(咪唑基-1-基)苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基，通常为4-吡咯烷子基甲基苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基，通常为4-哌嗪子基甲基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基，通常为4-吗啉代甲基苯基；哌嗪子基羰基苯基，通常为4-哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基哌嗪子基)苯基，通常为4-(4-甲基哌嗪子基)苯基；

或者为亚式R^o-O-CO-的酰基，其中R^o为低级烷基；

或者为亚式R^oHN-C(＝W)-的酰基，其中W为氧且R^o具有以下优选的含义：吗啉代-低级烷基，通常为2-吗啉代乙基；苯基；低级烷氧基苯基，通常为4-甲氧基苯基或4-乙氧基苯基；羧基苯基，通常为4-羧基苯基；或低级烷氧基羰基苯基，通常为4-乙氧羰基苯基；

或者为低级烷基苯基磺酰基，通常为4-甲苯磺酰基；

如果R₄不存在，则p为0，或者如果R₃和R₄均存在且各自为上述基团之一，则p为1；

R₅为氢或低级烷基，特别是氢，

X表示2个氢原子或表示O；

Z为甲基或氢；

并且环A中以波浪线表示的两个键优选不存在并且被4个氢原子替换，且环B中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环B中以波浪线表示的两个键不存在并且被总共4个氢原子替换，且环A中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环A和环B中所有的4个波浪状键均不存在并且被总共8个氢原子替换。

最特别优选的式II化合物选自：

8，9，10，11-四氢星形孢菌素；

N-[4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)苯甲酰基]-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-氯甲基苯甲酰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲酰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-(吗啉-4-基甲基)苯甲酰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯甲酰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-乙基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-甲苯磺酰基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-三氟乙酰基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-[4-(2-咪唑-1-基-乙氧基)苯甲酰基]-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-甲氧羰基甲基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-羧基甲基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-对苯二酰甲基酯-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-对苯二酰-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-乙基哌嗪基羰基苯甲酰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(2-氰基乙基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-苯甲酰基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

碘化N，N-二甲基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-BOC-甘氨酰-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-甘氨酰-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(3-(叔丁氧羰基)丙基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(3-羧基丙基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-咪唑-1-基)苯甲酰基]-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-[(四氢-2h-吡喃-4-基氧基)乙酰基]-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-BOC-1-丙氨酰基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-1-丙氨酰基-1，2，3，4-四氢星形孢菌素盐酸化物；

N-甲基-1，2，3，4-四氢-6-甲基星形孢菌素；

N-(4-羧基苯基氨基羰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(4-乙基苯基氨基羰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(N-苯基氨基羰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(N-[2-(1-吗啉代)乙基]氨基羰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-(N-[4-甲氧基苯基]氨基羰基)-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

1，2，3，4-四氢-6-甲基星形孢菌素；

N-BOC-1，2，3，4-四氢星形孢菌素；

N-BOC-1，2，3，4-四氢-6-甲基星形孢菌素；

N-BOC-1，2，3，4-四氢-6-甲基-7-氧代-星形孢菌素；

1，2，3，4，8，9，10，11-八氢星形孢菌素；

或其药学上可接受盐(如果存在至少一个成盐基团的话)。

最特别优选的为被称为1，2，3，4-四氢星形孢菌素的式I化合物或其盐(特别是药学上可接受盐)(此处，式I中的m和n为0，R₃为氢，盐不存在(p＝0)时R₄不存在，或者如果盐存在的话(p＝1)则R₄为氢，R₅为氢，环A中以波浪线表示的两个键不存在并且被总共4个氢原子替换，且环B中以波浪线表示的两条键各自与平行键一起表示双键，X表示2个氢原子，且Z为甲基)。

最特别优的是选如下式A化合物，其中：

A)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；Q＝-(CH₂)₂-O-CH(CH₂)OH-(CH₂)₂-

B)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；Q＝-(CH₂)₂-O-CH(CH₂N(CH₃)₂)-(CH₂)₂-

C)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅＝H；

最特别优选的是如下式I化合物，其中：

A)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₃、R₅＝H；R₄＝CH₃；Z＝CH₃(星形孢菌素)

B)X＝(R)或(S)异构体形式的1个氢原子和1个羟基；R₁、R₂、R₃、R₅＝H；R₄＝CH₃；Z＝CH₃(UCN-01和UCN-02)

C)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅＝H；R₄＝CH₃；R₃＝苯甲酰基；Z＝CH₃(CGP41251或PKC412或米哚妥林(MIDOSTAURIN))；

D)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₃＝CH₃；R₄＝乙氧基羰基；Z＝CH₃(NA 382；CAS＝143086-33-3)

E)X＝1个氢原子和1个羟基；R₁、R₂、R₅＝H；R₃＝CH₃；Z＝CH₃；且R₄选自：-(CH₂)₂OH；-CH₂CH(OH)CH₂OH；-CO(CH₂)₂CO₂Na；-(CH₂)₃CO₂H；-COCH₂N(CH₃)₂；

F)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅＝H；R₃＝CH₃；Z＝CH₃；且R₄选自：N-[0-(四氢吡喃-4-基)-D-乳酰基]；N-[2-甲基-2-(四氢吡喃-4-基氧基)-丙酰基；N-[0-(四氢吡喃-4-基)-L-乳酰基]；N-[0-(四氢吡喃-4-基)-D-乳酰基]；N-[2-(四氢吡喃-4-基氧基)-乙酰基)]

G)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₃＝CH₃；Z＝CH₃；且R₄选自：N-[0-(四氢吡喃-4-基)-D-乳酰基]；N-[2-(四氢吡喃-4-基氧基)-乙酰基)]

H)X＝1个氢原子和1个羟基；R₁、R₂、R₅＝H；R₃＝CH₃；Z＝CH₃；且R₄选自：N-[0-(四氢吡喃-4-基)-D-乳酰基]；N-[2-(四氢吡喃-4-基氧基)-乙酰基)]

缩写“CAS”的意思是化学文摘(CHEMICAL ABSTRACTS)登录号。

最优选的式I化合物、例如米哚妥林[国际非专有名称]被包括并且具体描述于1988年12月21日公开的欧洲专利号0 296 110以及1992年3月3日公开的美国专利号5,093,330和日本专利号2 708 047中。其它优选的化合物被包括并描述于1995年12月7日公开的专利申请WO 95/32974和WO 95/32976中。将这些文献中所述的所有化合物引入本申请作为参考。

最特别优选的为如下式III化合物，其中：

A)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅＝H；R₆＝CH₃；R₇＝甲氧基羰基；Z＝H(2-甲基K252a)

B)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅、R₆＝H；R₇＝甲氧基羰基；Z＝H(K-252a)

C)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅、R₆＝H；R₇＝甲氧基羰基；Z＝CH₃(KT-5720)

最特别优选的为如下式IV化合物，其中：

A)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₉＝CH₂-NMe₂；R₈＝CH₃；m’＝n’＝2

B)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₉＝CH₂-NH₂；R₈＝CH₃；m’＝2；n’＝1(Ro-31-8425；CAS＝151342-35-7)

最特别优选的为如下式V化合物，其中：

A)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₈＝CH₃；R₁₀＝-(CH₂)₃-NH₂；(Ro-31-7549；CAS＝138516-31)

B)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₈＝CH₃；R₁₀＝-(CH₂)₃-S-(C＝NH)-NH₂；(Ro-31-8220；CAS＝125314-64-9))

C)X＝O；R₁、R₂、R₅＝H；R₈＝CH₃；R₁₀＝-CH₃；

最特别优选的为如下式VI化合物，其中：

A)X＝2个氢原子；R₁、R₂、R₅＝H；R₄＝CH₃；Z＝CH₃；R₃选自甲基或(C₁-C₁₀)烷基、芳基烷基、C₆H₂CH₂-

星形孢菌素衍生物及其制备方法已经在许多现有技术文件中有具体叙述，且为本领域技术人员众所周知。

例如，在1995年6月14日公开的欧洲专利0 657 458、1994年11月17日公开的欧洲专利0 624 586、1992年2月12日公开的欧洲专利0470490、1989年8月16日公开的欧洲专利0 328 026、1990年8月29日公开的欧洲专利0 384 349以及多种出版物如“Barry M.Trost^＊和Weiping TangOrg.Lett.，3(21)，3409-3411”中描述了式A、B、C、D化合物及其制备方法。

在1988年12月21日公开的欧洲专利0 296 110以及1992年3月3日公开的美国专利5；093,330和日本专利2 708 047中已经具体描述了式I化合物及其制备方法。在1994年11月17日公开的欧洲专利0 624 590中已经描述了在R₄上具有(四氢吡喃-4-基)-乳酰基取代的式I化合物。在1993年12月29日公开的欧洲专利0575955、1987年9月23日公开的欧洲专利0 238 011(UCN-O1)、1998年7月3日以WO99/02532公开的国际专利申请EP98/04141中也对其它化合物进行了描述。

在1988年12月21日公开的欧洲专利0 296 110以及1992年3月3日公开的美国专利5；093,330和日本专利2 708 047中对式II化合物及其制备方法进行了具体描述。

在要求了于1992年7月24日提交的美国专利申请US 920102的优先权的专利申请(即1997年4月16日公开的欧洲专利0 768 312、2000年5月24日公开的1 002 534、1995年5月10日公开的0 651 754)中对式III化合物及其制备方法进行了具体叙述。

在要求了分别于1993年5月10日和1994年2月21日提交的英国专利申请GB 9309602和GB 9403249的优先权的专利申请(即1994年11月17日公开的欧洲专利0 624 586、2000年5月24日公开的1 002 534、1995年5月10日公开的0 651 754)中对式IV化合物及其制备方法进行了具体描述。

在要求了分别于1988年2月10日、1988年11月25日、1989年2月23日和1989年12月13日提交的英国专利申请GB 8803048、GB8827565、GB 8904161和GB 8928210的优先权的专利申请(即1989年8月16日公开的欧洲专利0 328 026和1990年8月29日公开的0 384 349)中对式V化合物及其制备方法进行了具体描述。

在要求了于1991年10月10日提交的美国专利申请07/777,395(Con)的优先权的专利申请(即1993年4月15日公开的国际专利申请WO93/07153)中对式VI化合物及其制备方法进行了具体描述。

在对于特别为星形孢菌素衍生物化合物而引用专利申请或科学出版物的每种情况下，将终产物、药物制剂和权利要求的主题在此处通过参考这些公开内容引入本申请中。

通过代码、通用名或商品名所确定的活性物质的结构可从标准目录“默克索引”(“The Merck Index”)的现行版本或从数据库、例如PatentsInternational(例如IMS全球出版物(IMS World Publications))中获得。其相应的内容在此处引入作为参考。

本发明优选的星形孢菌素衍生物为式(VII)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐(下文称为“式VII化合物或米哚妥林”)。

式VII化合物也称为米哚妥林[国际非专有名称]或PKC412。

米哚妥林为天然存在的生物碱星形孢菌素的衍生物，并且已经在1988年12月21日公开的欧洲专利0 296 110以及1992年3月3日公开的美国专利5；093,330和日本专利2708047中有具体描述。

核酸

抑制细胞凋亡或程序性细胞死亡的核酸分子包括但不限于对编码抗细胞凋亡MCL1蛋白的基因或这一基因的转录物特异的反义寡核苷酸和RNAi构建物。用于本发明组合的最优选的是Mcl-1特异性RNAi构建物，尤其包括mcl-1特异性siRNA。在实施例中描述了本发明的示例性mcl-1

RNAi构建物。

由骨髓细胞白血病序列1(“mcl-1”)(BCL2-相关)编码的蛋白属于Bcl-2家族。在这一基因座位上发生选择性剪接，导致了编码不同亚型的两个转录物变体。较长的基因产物(亚型1)通过抑制细胞凋亡提高细胞存活。选择性剪接的较短的基因产物(亚型2)促进细胞凋亡且是诱导死亡的。mcl-1基因的别名包括但不限于EAT、MCL1L、MCL1S、MGC104264、MGC1839和TM。MCL1多肽的其它名称包括但不限于：诱导的骨髓性白血病细胞分化蛋白Mcl-1；骨髓细胞白血病序列1；以及骨髓细胞白血病序列1，亚型1。

本文所使用的术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA或寡核苷酸)和RNA分子(例如，mRNA或RNAi构建物，诸如siRNA、shRNA)以及应用核苷类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链的或双链的。当核酸是单链时，其可以是有义链或反义链。该术语包括合成(例如化学合成)的DNA。核酸可以应用核苷类似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)合成。此类核苷例如可以用于制备具有改变了的碱基配对能力或增加了对核酸酶抗性的核酸。

本发明包括对mcl-1核苷酸序列(例如包括mcl-1 cDNA)特异的RNAi或反义核酸分子。较长的mcl-1亚型1的cDNA序列(GenBank登录号NM_021960)如SEQ ID NO：1所示。

GenBank登录号NM_021960，4020bp线性mRNA；PRI 2006年6月12日[人类(Homo sapiens)](SEQ ID NO：1)

  1     caccccgtag gactggccgc cctaaaaccg tgataaagga gctgctcgcc acttctcact

  61    tccgcttcct tccagtaagg agtcggggtc ttccccagtt ttctcagcca ggcggcggcg

 121    gcgactggca atgtttggcc tcaaaagaaa cgcggtaatc ggactcaacc tctactgtgg

 181    gggggccggc ttgggggccg gcagcggcgg cgccacccgc ccgggagggc gacttttggc

 241    tacggagaag gaggcctcgg cccggcgaga gataggggga ggggaggccg gcgcggtgat

 301    tggcggaagc gccggcgcaa gccccccgtc caccctcacg ccagactccc ggagggtcgc

 361    gcggccgccg cccattggcg ccgaggtccc cgacgtcacc gcgacccccg cgaggctgct

 421    tttcttcgcg cccacccgcc gcgcggcgcc gcttgaggag atggaagccc cggccgctga

 481    cgccatcatg tcgcccgaag aggagctgga cgggtacgag ccggagcctc tcgggaagcg

 541    gccggctgtc ctgccgctgc tggagttggt cggggaatct ggtaataaca ccagtacgga

 601    cgggtcacta ccctcgacgc cgccgccagc agaggaggag gaggacgagt tgtaccggca

 661    gtcgctggag attatctctc ggtaccttcg ggagcaggcc accggcgcca aggacacaaa

 721    gccaatgggc aggtctgggg ccaccagcag gaaggcgctg gagaccttac gacgggttgg

 781    ggatggcgtg cagcgcaacc acgagacggc cttccaaggc atgcttcgga aactggacat

 841    caaaaacgaa gacgatgtga aatcgttgtc tcgagtgatg atccatgttt tcagcgacgg

 901    cgtaacaaac tggggcagga ttgtgactct catttctttt ggtgcctttg tggctaaaca

 961    cttgaagacc ataaaccaag aaagctgcat cgaaccatta gcagaaagta tcacagacgt

1021    tctcgtaagg acaaaacggg actggctagt taaacaaaga ggctgggatg ggtttgtgga

1081    gttcttccat gtagaggacc tagaaggtgg catcaggaat gtgctgctgg cttttgcagg

1141    tgttgctgga gtaggagctg gtttggcata tctaataaga tagccttact gtaagtgcaa

1201    tagttgactt ttaaccaacc accaccacca ccaaaaccag tttatgcagt tggactccaa

1261    gctgtaactt cctagagttg caccctagca acctagccag aaaagcaagt ggcaagagga

1321    ttatggctaa caagaataaa tacatgggaa gagtgctccc cattgattga agagtcactg

1381    tctgaaagaa gcaaagttca gtttcagcaa caaacaaact ttgtttggga agctatggag

1441    gaggactttt agatttagtg aagatggtag ggtggaaaga cttaatttcc ttgttgagaa

1501    caggaaagtg gccagtagcc aggcaagtca tagaattgat tacccgccga attcattaat

1561    ttactgtagt gttaagagaa gcactaagaa tgccagtgac ctgtgtaaaa gttacaagta

1621    atagaactat gactgtaagc ctcagtactg tacaagggaa gcttttcctc tctctaatta

1681    gctttcccag tatacttctt agaaagtcca agtgttcagg acttttatac ctgttatact

1741    ttggcttggt ttccatqatt cttactttat tagcctagtt tatcaccaat aatacttgac

1801    ggaaggctca gtaattagtt atgaatatgg atatcctcaa ttcttaagac agcttgtaaa

1861    tgtatttgta aaaattgtat atatttttac agaaagtcta tttctttgaa acgaaggaag

1921    tatcgaattt acattagttt ttttcatacc cttttgaact ttgcaacttc cgtaattagg

1981    aacctgtttc ttacagcttt tctatgctaa actttgttct gttcagttct agagtgtata

2041    cagaacgaat tgatgtgtaa ctgtatgcag actggttgta gtggaacaaa tctgataact

2101    atgcaggttt aaattttctt atctgatttt ggtaagtatt ccttagatag gtttttcttt

2161    gaaaacctgg gattgagagg ttgatgaatg gaaattcttt cacttcatta tatgcaagtt

2221    ttcaataatt aggtctaagt ggagttttaa ggttactgat gacttacaaa taatgggctc

2281    tgattgggca atactcattt gagttccttc catttgacct aatttaactg gtgaaattta

2341    aagtgaattc atgggctcat ctttaaagct tttactaaaa gattttcagc tgaatggaac

2401    tcattagctg tgtgcatata aaaagatcac atcaggtgga tggagagaca tttgatccct

2461    tgtttgctta ataaattata aaatgatggc ttggaaaagc aggctagtct aaccatggtg

2521    ctattattag gcttgcttgt tacacacaca ggtctaagcc tagtatgtca ataaagcaaa

2581    tacttactgt tttgtttcta ttaatgattc ccaaaccttg ttgcaagttt ttgcattggc

2641    atctttggat ttcagtcttg atgtttgttc tatcagactt aaccttttat ttcctgtcct

2701    tccttgaaat tgctgattgt tctgctccct ctacagatat ttatatcaat tcctacagct

2761    ttcccctgcc atccctgaac tctttctagc ccttttagat tttggcactg tgaaacccct

2821    gctggaaacc tgagtgaccc tccctcccca ccaagagtcc acagaccttt catctttcac

2881    gaacttgatc ctgttagcag gtggtaatac catgggtgct gtgacactaa cagtcattga

2941    gaggtgggag gaagtccctt ttccttggac tggtatcttt tcaactattg ttttatcctg

3001    tctttggggg caatgtgtca aaagtcccct caggaatttt cagaggaaag aacattttat

3061    gaggctttct ctaaagtttc ctttgtatag gagtatgctc acttaaattt acagaaagag

3121    gtgagctgtg ttaaacctca gagtttaaaa gctactgata aactgaagaa agtgtctata

3181    ttggaactag ggtcatttga aagcttcagt ctcggaacat gacctttagt ctgtggactc

3241    catttaaaaa taggtatgaa taagatgact aagaatgtaa tggggaagaa ctgccctgcc

3301    tgcccatctc agagccataa ggtcatcttt gctagagcta tttttaccta tgtatttatc

3361    gttcttgatc ataagccgct tatttatatc atgtatctct aaggacctaa aagcacttta

3421    tgtagttttt aattaatctt aagatctggt tacggtaact aaaaaagcct gtctgccaaa

3481    tccagtggaa acaagtgcat agatgtgaat tggtttttag gggccccact tcccaattca

3541    ttaggtatga ctgtggaaat acagacaagg atcttagttg atattttggg cttggggcag

3601    tgagggctta ggacacccca agtggtttgg gaaaggagga ggggagtggt gggtttatag

3661    ggggaggagg aggcaggtgg tctaagtgct gactggctac gtagttcggg caaatcctcc

3721    aaaagggaaa gggaggattt gcttagaagg atggcgctcc cagtgactac tttttgactt

3781    ctgtttgtct tacgcttctc tcagggaaaa acatgcagtc ctctagtgtt tcatgtacat

3841    tctgtggggg gtgaacacct tggttctggt taaacagctg tacttttgat agctgtgcca

3901    ggaagggtta ggaccaacta caaattaatg ttggttgtca aatgtagtgt gtttccctaa

3961    ctttctgttt ttcctgagaa aaaaaaataa atcttttatt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa

本发明还包括由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1核苷酸序列不同、但编码和SEQ ID NO：1所编码的相同mcl-1蛋白的核酸分子。由SEQID NO：1的核苷酸编码的350aa MCL1多肽(GenPep登录号NP_068779)如SEQ ID NO：2所示。

GenPep登录号NP_068779350aa骨髓细胞白血病序列1亚型1，PRI2006年6月12日[人类](SEQ ID NO：2)

 1  mfglkrnavi glnlycggag lgagsggatr pggrllatek easarreigg geagaviggs

 61 agasppstlt pdsrrvarpp pigaevpdvt atparllffa ptrraaplee meapaadaim

121 speeeldgye peplgkrpav lpllelvges gnntstdgsl pstpppaeee edelyrqsle

181 iisrylreqa tgakdtkpmg rsgatsrkal etlrrvgdgv qrnhetafqg mlrkldikne

241 ddvkslsrvm ihvfsdgvtn wgrivtlisf gafvakhlkt inqesciepl aesitdvlvr

301 tkrdwlvkqr gwdgfveffh vedleggirn vllafagvag vgaglaylir

熟练的从业者可以理解，导致mcl-1氨基酸序列改变的DNA序列多态性可能存在于给定的群体(例如，人群)中。此类遗传多态性可以由于自然等位基因变异而存在于群体中。该自然等位基因变异一般可以导致mcl-1基因核苷酸序列中15％的变异。任意和所有的此类核苷酸变异，不管是“沉默的”还是导致作为自然等位基因变异结果的且不改变mcl-1功能活性的氨基酸多态性的，都包括在本发明的范围内。因此，mcl-1中例如1％、2％、3％、4％或5％的氨基酸可以例如通过保守替换而由其它氨基酸替代。

除了可能存在于群体中的天然存在的mcl-1序列等位基因变体外，熟练的从业者能够理解可以通过对SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行突变而引入改变，从而导致所编码的蛋白质氨基酸序列的改变，而不改变蛋白质的功能。例如，人们可以进行导致在“非重要”氨基酸残基上的氨基酸替换的核苷酸替换。“非重要”氨基酸残基是这样的残基，即可以从人类mcl-1蛋白野生型序列对其进行改变，而不会改变mcl-1蛋白的生物活性，而“重要”氨基酸残基对于生物活性是必需的。例如，预测在不同物种的mcl-1蛋白中保守的氨基酸残基是尤其不能被改变的。

因此，本发明包括编码在对活性不重要的氨基酸残基上含有改变的mcl-1蛋白的核酸分子。此类mcl-1蛋白在氨基酸序列上与SEQ ID NO：2不同，但仍然至少保留了部分野生型的生物活性。例如，在一个实施方案中，分离的核酸分子包括编码这样的蛋白质的序列，所述蛋白质包含在SEQ ID NO：2全长上与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约75％同一性，例如80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。

可以通过将一个或多个核苷酸的替换、添加或缺失引入SEQ ID NO：1来产生编码mcl-1蛋白的分离的核酸分子，其中所述mcl-1蛋白具有与SEQID NO：2不同的序列，从而将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失引入所编码的蛋白。可以通过标准技术，例如位点定向诱变和PCR介导的诱变来引入突变。可以在一个或多个所预测的非重要氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。因此，通过保守替换可以替换多达1％、2％、3％、5％或10％的氨基酸。“保守氨基酸替换”是这样的替换，即其中氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域是公知的。它们包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用另一个来自相同侧链家族的氨基酸残基来替换mcl-1中所预测的非重要氨基酸残基。或者，可以诸如通过饱和诱变在全部或部分mcl-1编码序列上随机引入突变，并且可以针对mcl-1生物活性对所得到的突变进行筛选来鉴定保留了活性的突变。诱变后，可以表达蛋白并确定其活性。

本发明还包括反义核酸分子，即与有义链互补的分子，例如，与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补的分子。反义核酸可以通过氢键连至相应的有义链。反义核酸可以与全部mcl-1编码序列互补，或仅仅与其部分互补。反义核酸分子可以与有义链的非编码区反义。非编码区(“5’和3’非翻译区”)是位于基因或mRNA编码区两侧且不被翻译的5’和3’序列。反义核酸分子可以与mcl-1 mRNA的全部编码区互补，或在某些情况下，仅仅与mcl-1 mRNA的编码或3’或5’非编码区的部分互补。反义寡核苷酸例如可以长度为约5，例如约10、15、18、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。对于关于反义核酸的一般指导，例如参见Goodchild，“通过寡核苷酸的基因表达的抑制”(“Inhibition of Gene Expression byOligonucleotides”)，分子和结构生物学论题(Topics in Molecular andStructural Biology)，第12卷：寡脱氧核苷酸(Oligodeoxynucleotides)(Cohen编辑)，MacMillan Press，伦敦，第53-77页(1989)。有用的示例性反义寡核苷酸包括但不限于，包括与SEQ ID NO：1的核苷酸131至1183之间区域互补的至少12个核苷酸的序列的反义寡核苷酸。还参见实施例中的SEQ ID NO：7-9。

可以应用化学合成、酶连接反应和其它本领域公知的方法构建本发明的反义核酸。例如，可以应用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸来合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，所述经修饰的核苷酸是经过设计以增加分子的生物学稳定性和/或反义和有义核酸间形成的双链体的物理稳定性的。例如，可以应用磷硫酰衍生物和吖啶取代的核苷酸。用于产生反义核酸的经修饰的核苷酸的示例包括5氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶、5氯尿嘧啶、5碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4乙酰胞嘧啶、5(羧基羟甲基)尿嘧啶、1甲基鸟嘌呤、5羧甲基氨甲基2硫尿苷、2，2二甲基鸟嘌呤、二氢尿嘧啶、βD半乳糖queosine、5羧甲基氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6异戊烯基腺嘌呤、1甲基肌苷、2甲基腺嘌呤、2甲基鸟嘌呤、4硫尿嘧啶、3甲基胞嘧啶、5甲基胞嘧啶、N6腺嘌呤、7甲基鸟嘌呤、5甲氧基尿嘧啶、5甲基氨基甲基腺嘌呤、5甲氧基氨基甲基2硫尿嘧啶、假尿嘧啶、queosine、βD甘露糖基queosine、5′甲氧基羧甲基尿嘧啶、5甲基2硫尿嘧啶、2甲硫基N6异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶5氧基乙酸(v)、wybutoxosine、2硫胞嘧啶、2硫尿嘧啶、5甲基尿嘧啶、尿嘧啶5氧基乙酸甲酯、5甲基2硫尿嘧啶、3(3氨基3N2羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2，6二氨基嘌呤。或者，可以应用表达载体产生反义核酸，其中往所述载体中以反义方向亚克隆了核酸(即，从所插入的核酸转录的RNA将与感兴趣的靶核酸互补，将在下面的段落中进一步描述)。

可将本发明的反义核酸分子施用至个体或在原位产生，因此它们与编码mcl-1蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与它们结合。以这种方式，反义核酸可以抑制蛋白质的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。杂交可以是通过常规核苷酸互补以形成稳定的双链体，或在与DNA双链体结合的反义核酸分子的情况下，通过在双螺旋大沟中的特异的相互作用。

可以通过本领域已知的任何方法施用反义核酸，例如，通过在组织位点直接注射。备选地或此外，可以使反义核酸分子适宜靶向选择细胞，因此它们可以全身性地施用。为了全身性施用，可以对反义分子进行修饰使得它们特异性地结合在所选择的细胞表面表达的受体或抗原，例如，通过将反义核酸分子连接至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。还可以应用本文描述的一些载体将反义核酸分子递送至细胞。可以使用其中将待转录的序列置于强pol II或pol III启动子控制之下的载体构建物，以达到反义转录物的足够的细胞内浓度。

本发明的反义核酸分子可以是α异头核酸分子。α异头核酸分子与互补RNA形成特定双链杂化物，其中与通常的β单位不同，所述链彼此平行(Gaultier等(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res)15：6625-6641)。反义核酸分子还可以包括2′o甲基核糖核苷(Inoue等(1987)核酸研究(NucleicAcids Res)15：6131-6148)或嵌合RNA DNA类似物(Inoue等(1987)FEBSLett 215：327-330)。

本发明还包括能够通过RNA干扰(RNAi)的方式抑制mcl-1表达的核酸。RNAi是这样的过程，由此过程双链RNA(dsDNA)诱导动物和植物细胞内的同源mRNA序列特异性地降解(Hutvagner和Zamore(2002)Cur.Opin Gene.Dev12：225-232；Sharp(2001)Genes Dev.15：485-490)。在哺乳动物细胞中，RNAi可以例如由21-核苷酸(nt)双链体RNA(也称为小抑制RNA(siRNA))触发(Chiu等(2001)分子细胞(Mol Cell)10：549-561；Elbashir等(2001)自然(Nature)411：494-498)；或由微小RNA(miRNA)、功能小发夹RNA(shRNA)或采用具有RNA聚合酶III启动子的DNA模板体内表达的dsRNA触发(Zeng等(2002)分子细胞(Mol Cell)9：1327-1333；Paddison等(2002)Genes Dev16：948-958；Lee等(2002)自然生物技术(NatureBiotechnol)20：500-505；Paul等(2002)自然生物技术(Nature Biotechnol)20：505-508；Tuschl(2002)自然生物技术(Nature Biotechnol)20：440-448；Yu等(2002)美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA)99：6047-6052；McManus等(2002)RNA8：842-850；Sui等(2002)美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA)99：5515-5520；还参见Hannon(2002)自然(Nature)418：244-251)。

抑制(也被称为“沉默”)主要是细胞质的、转录后事件，其为进化保守的(参见Hutvagner和Zamore(2002)Curr Opin Genet Dev 12：225-232)。当前的模型表明通过RNA酶III酶(Dicer)将dsRNA加工为siRNA。然后siRNA形成称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的复合物。该复合物与靶mRNA相互作用，然后将靶mRNA切割并降解(Martinez等(2002)细胞(Cell)110：563-574；Schwarz等(2002)分子细胞(Mol Cell)10：537-548)。已经在哺乳动物细胞中研究了shRNA(Paul等(2002)Genes & Dev 16：948-958)，并且shRNA可以在人类细胞中有效地表达(Sui等(2002)自然生物技术(Nature Biotechnol)20：505-508)。Yu和Turner((2002)美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA)99：5515-5520)描述了基于DNA载体的在哺乳动物细胞中抑制基因表达的RNAi技术。Yu等((2002)美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA)99：6047-6052)描述了通过在哺乳动物细胞中表达siRNA和shRNA的RNAi。

本发明包括siRNA、其双链体(即dsRNA)、shRNA和miRNA，其与mcl-1靶序列(例如，mcl-1 mRNA(例如，与人类mcl-1序列相应的mRNA，诸如本文所示的那些))相互作用(例如，结合)。此类核酸例如可以是化学合成的RNA寡核苷酸(参见Elbashir等，同上)。本发明所包括的和有用的示例性RNAi序列至少包括以下一种序列或其互补链序列：

5’TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG 3’(mcl1，SEQ ID NO：7)

5’AAG AAA CGC GGU AAU CGG ACU 3’(mcl1，SEQ ID NO：8)；

5’AGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU 3’(mcl1，SEQ ID NO：9)；

5’CUU ACG CUG AGU ACU UCG A 3’(萤光素酶，SEQ ID NO：10)；

可以应用质粒来转录能够以siRNA起作用的shRNA(参见Sui等(2002)美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci USA)99：5515-5520；Brummelkamp等(2002)科学(Science)296：550-553)。此类质粒可以例如含有RNA聚合酶III启动子，随后是转录为含有有义序列、环(loop)结构以及反义序列的RNA的序列。已经成功地应用了许多种环，由于其有若干种聚合酶III启动子(Brummelkamp等，科学(Science)296：550-553，2002；Miyagishi和Taira，核酸研究(Nucl.Acids Res.)2：113-114，2002)。可以应用本领域常规的方法制得载体(例如质粒)，所述载体含有可操作地连接至转录为RNA的序列的启动子(例如，RNA聚合酶III启动子)，其中所述RNA含有mcl-1“有义”序列、环结构以及相应的mcl-1“反义”序列。由于已经显示U6-启动子驱动的具有4个尿苷3’突出端的siRNA在哺乳动物细胞中抑制靶基因的表达(Paddison等(2002)自然生物技术(NatureBiotechnol)20：497-500)，本发明的载体可以包含U6启动子和转录为具有尿苷突出端(即在3’端的1-6个尿苷)的siRNA的序列。本发明所包含的和有用的示例性shRNA描述于实施例部分，其转录自分别作为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10在本文中阐述的序列(参见下表1)。

一般地，miRNA切割自约70个核苷酸的前体RNA茎环(shRNA)，切割可能是通过称为Dicer的RNA酶III-类型酶或其同系物进行的。通过用和靶mRNA(此处为mcl-1 mRNA)互补的miRNA序列替换miRNA前体的茎序列，可以应用表达miRNA的载体构建物来产生siRNA，以启动针对哺乳动物细胞中靶标的RNAi(Zeng，同上)。

本发明的核酸可以包括在病毒载体中并由其表达。因此，本发明描述了通过表达siRNA诱导mcl-1特异性沉默的病毒载体。例如，可以通过产生在RNA Pol II启动子转录控制之下表达siRNA的重组腺病毒来构建mcl-1特异腺病毒载体。

可以应用任何本领域公知的方法将siRNA或其它基于核酸的抑制剂施用至动物和人类。例如，可以应用“高压”递送技术，诸如将大体积的含有siRNA的溶液经过动脉或静脉快速注射(例如，在数秒中内完成的注射)至动物(例如，参见Lewis(2002)自然遗传(Nature Genetics)32：107-108)。还可以应用微粒、纳米颗粒和脂质体递送siRNA。靶向mcl-1 mRNA且与微粒、纳米颗粒或脂质体相关的或以其它方式配制用于递送至生物细胞的siRNA也在本发明的范围内。

本发明的dsRNA分子可以在每一条链中包含约15个或更多(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多)个核苷酸。dsRNA链可以与mcl-1 mRNA的靶区域基本上互补。例如，一条链可以与mcl-1 mRNA的靶区域约90％(例如，约90％、95％或100％)互补。靶区域可以是mcl-1核酸序列的任意区域，例如，对应于SEQ ID NO：1的核苷酸1至228的区域，例如，在编码SEQ ID NO：2的氨基酸1至76的多肽的区域内。

本发明的dsRNA分子例如可以如下产生：化学合成该分子、从DNA模板体外转录该分子、例如从shRNA体内制造该分子(上面进一步讨论了dsRNA和其它抑制性核酸的产生)或应用本领域已知的任何其它方法。例如，可以应用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸化学合成dsRNA的每一条链，所述经修饰的核苷酸是设计以增加分子的生物稳定性或增加dsRNA的反义和有义链之间形成的双链体的物理稳定性的(例如，可以应用磷硫酰衍生物和吖啶取代的核苷)。还可以应用表达载体产生dsRNA，其中已将在相同链上包含有义和反义序列的核酸克隆至该载体中(例如，从所插入的核酸转录的RNA可以形成发夹，所述发夹的茎形成包含与mcl-1RNA互补的反义链的dsRNA)。因此，可以通过产生(或设计)包含给定mcl-1mRNA序列的反向和互补序列的dsRNA而制得抑制mcl-1表达的dsRNA。

可以在表达mcl-1的细胞中测试dsRNA。抗mcl-1dsRNA将降低细胞内mcl-1的表达(即，将降低mcl-1蛋白和mcl-1 mRNA的水平)。可以通过本领域公知的方法测定mcl-1表达。例如，可以通过蛋白质印迹分析、免疫沉淀、ELISA或通过功能分析来测定mcl-1蛋白水平。可通过RNA印迹、原位分析或与聚合酶链式反应结合的逆转录(RT-PCR)来测定mcl-1mRNA的水平。

本发明还包括核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够切割与它们具有互补区域的单链核酸(例如，mRNA)。因此，可以应用核酶(例如，锤头状核酶(描述于Haselhoff和Gerlach(1988)自然(Nature)334：585591))催化地切割mcl-1 mRNA转录物，由此抑制mcl-1mRNA的翻译。可以基于本文公开的mcl-1 cDNA核苷酸序列设计具有对mcl-1编码核酸的特异性的核酶。例如，可以构建其中活性位置的核苷酸序列与mcl-1编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补的四膜虫属(Tetrahymena)L 19 IVS RNA的衍生物。例如，参见Cech等，美国专利4,987,071和Cech等，美国专利5,116,742。或者，可以用mcl-1 mRNA从RNA分子库中选择具有特定核糖核酸酶活性的催化RNA。例如参见Bartel和Szostak(1993)科学(Science)261：1411 1418。

本发明还包括形成三螺旋结构的核酸分子。例如，可以通过将互补的核苷酸序列靶向至mcl-1基因的调控区域(例如，mcl-1启动子和/或增强子)以形成在靶细胞内阻止mcl-1基因转录的三螺旋结构，从而抑制mcl-1基因表达。通常参见Helene(1991)抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.)6(6)：56984；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：2736；和Maher(1992)生物测定(Bioassays)14(12)：807 15。

在某些实施方案中，在碱基部分、糖部分或磷酸骨架对本发明的核酸分子进行修饰，例如以提高分子的稳定性、杂交或溶解度。例如，可对核酸的脱氧核糖磷酸骨架进行修饰以产生肽核酸(参见Hyrup等(1996)生物有机和药物化学(Bioorganic & Medicinal Chemistry)4(1)：523)。本文中所使用的术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物，例如DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架取代且仅仅保留了4种天然核碱基。已显示PNA的中性骨架允许在低离子强度的条件下特异杂交至DNA和RNA。可以应用如在Hyrup等(1996)同上；Perry O′Keefe等(1996)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：14670 675中描述的标准固相肽合成方案完成PNA寡聚物的合成。

在本发明中，mcl-1 PNA可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可以用作反义或反基因物质，其例如通过诱导转录或翻译停止或抑制基因的复制用于基因表达的序列特异性调控。mcl-1 PNA还可以：例如通过PNA指导的PCR钳位例如用于基因中单碱基对突变的分析；当与其它酶，例如S1核酸酶组合使用时，作为人工限制酶(Hyrup(1996)同上)；或作为探针或引物，用于DNA序列和杂交(Hyrup(1996)同上；Perry O′Keefe等(1996)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：14670 675)。

在另一个实施方案中，可以通过将亲脂性或其它辅助基团连接至PNA、通过形成PNA DNA嵌合体、或通过应用脂质体或其它本领域公知的药物递送技术，对mcl-1 PNA进行修饰，例如以提高它们的稳定性或细胞摄入。例如，可以产生能结合PNA和DNA的有利性质的mcl-1 PNA DNA嵌合体。此类嵌合体允许DNA识别酶(例如RNA酶H和DNA聚合物)与DNA部分相互作用，而PNA部分提供高的结合亲和力和特异性。可以应用依据碱基堆积、核碱基之间的键数和方向选择的适当长度的连接体连接PNA DNA嵌合体(Hyrup(1996)同上)。可以如Hyrup(1996)(同上)和Finn等((1996)核酸研究(Nucleic Acids Research)24(17)：3357 63)描述的那样完成PNA DNA嵌合体的合成。例如，可以应用标准亚磷酰胺连接化学在固体支持物上合成DNA链，并且经修饰的核苷类似物，例如5′(4甲氧基三苯甲基)氨基5′脱氧胸苷亚磷酰胺可以用作PNA和DNA 5’末端之间的连接体(Mag等(1989)核酸研究(Nucleic Acid Res.)17：5973 88)。然后以逐步的方式连接PNA单体以产生具有5’PNA片段和3’DNA片段的嵌合分子(Finn等(1996)核酸研究(Nucleic Acids Research)24(17)：3357 63)。或者，可以合成具有5’DNA片段和3’PNA片段的嵌合分子(Peterser等(1975)生物有机和药物化学快报(Bioorganic Med.Chem.Lett.)5：1119 11124)。

在其它实施方案中，寡核苷酸可以包含其它附加的基团，诸如肽(例如，用于在体内靶向宿主细胞受体)或促进跨细胞膜(例如，参见Letsinger等(1989)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86：6553 6556；Lemaitre等(1987)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：648 652；PCT公开号WO 88/09810)或血脑屏障(例如，参见PCT公开号WO 89/10134)运输的物质。此外，可以用杂交触发的断裂物质(例如，参见Krol等(1988)Bio/Techniques 6：958 976)或插入物质(例如，参见Zon(1988)药学研究(Pharm.Res.)5：539 549)修饰寡核苷酸。为此目的，可将寡核苷酸缀合至其它分子，例如，肽、杂交触发的交联剂、运载物质或杂交触发的断裂物质。

载体、宿主细胞和转基因动物

本发明还包括载体，例如表达载体，其含有mcl-1核酸(或其部分)。本文中所使用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是质粒，即附加的DNA片段可以连接至其中的环状双链DNA环。另一类型是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接至病毒基因组。某些载体能够在其进入的宿主细胞中自主复制。因此，本发明还包括含有载体的宿主细胞，所述载体含有mcl-1核酸。载体和宿主细胞的选择对本领域熟练从业者而言是常规的。

本发明提供了治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，和实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)的方法，该方法包括给需要此类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的FLT-3激酶抑制剂和mcl-1抑制剂(例如是反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物)的组合，其中FLT-3激酶抑制剂和mcl-1抑制剂分别为游离形式或药学上可接受盐或前药形式。

优选地，本发明提供了治疗患有骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，和实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)的哺乳动物(尤其是人类)的方法，该方法包括给需要此类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的式(VII)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其药学上可接受盐和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合。

在另一个实施方案中，本发明涉及FLT-3激酶抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，和实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)的用途。

在另一实施方案中，本发明涉及FLT-3激酶抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合在制备用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，和实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)的药物组合物中的用途。

根据本发明，式(VII)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其药学上可接受盐和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合是优选的FLT-3激酶抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合。

缩写

ASO                  反义寡核苷酸

ASM                  侵袭性全身性肥大细胞增多症

BM                   骨髓

BSA                  牛血清白蛋白

克拉屈滨             2-氯脱氧腺苷(＝2CdA)

FCS                  胎牛血清

ISM                  静止性全身性肥大细胞增多症

MC                   肥大细胞

MCL                  肥大细胞白血病

Mcl-1                骨髓细胞白血病-1

MCS                  肥大细胞肉瘤

miRNA              微小RNA

PB                 周围血

PBS                磷酸盐缓冲盐水

RNAi               RNA干扰

RT-PCR             逆转录聚合酶链式反应

shRNA              短发夹RNA

siRNA              短干扰RNA

SM                 全身性肥大细胞增多症

SSM                全身性郁积性肥大细胞增多症

TK                 酪氨酸激酶

用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病，特别是全身性肥大细胞增多症、以及急性骨髓性白血病(AML)，和实体瘤例如结肠直肠癌(CRC)和非小细胞性肺癌(NSCLC)的FLT-3激酶抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物(其中各自分别为游离形式或药学上可接受盐或前药形式)的组合可以是组合搭档的自由或固定组合。

一方面，本发明还涉及组合，诸如组合的制备物或药物组合物，其包含(a)FLT-3抑制剂，尤其是在上文中具体地提到的FLT-3抑制剂，尤其是作为优选的提到的那些；以及(b)反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物，其中活性成分(a)和(b)在每种情况下以游离形式或以药学上可接受盐形式或合适的生物药物制剂存在，用于同时、共同、分别或依次使用。合适的生物药物制剂是本领域技术人员公知的，其中依据治疗施用的是RNAi构建物还是反义寡核苷酸构建物最优化所述制剂。

术语“组合的制备物”特别地定义如下意义的“套装产品(kit of parts)”，即如上面定义的组合搭档(a)和(b)可以独立地给药或通过应用含有不同量的组合搭档(a)和(b)的不同的固定组合给药，即同时、共同、分别或依次给药。然后，套装产品的各部分例如可以同时施用或按时间先后交错施用，即对套装产品的任何部分在不同时间点且以相等或不同的时间间隔施用。在组合的制备物中待施用的组合搭档(a)的总量和组合搭档(b)的总量的比值可以改变，例如，以满足待治疗的患者亚群体的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可能是由于患者的特定疾病、疾病的严重程度、年龄、性别、体重等造成的。

如上面提到的那样，用于治疗上文所提到的疾病和病症的FLT-3抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的准确剂量取决于若干因素，包括宿主、所治疗病症的性质和严重程度、施用方式。然而，当FLT-3抑制剂以0.1至10mg/kg体重、优选1至5mg/kg体重的日剂量经肠胃外(例如腹膜内、静脉内、肌内、皮下、肿瘤内或直肠)或肠内(例如口服)、优选静脉内或优选口服、静脉内施用时，通常会取得满意的结果。在人试验中，225mg/日的总剂量最可能为最大耐受剂量(MTD)。优选的静脉内日剂量为0.1至10mg/kg体重，或者对于多数较大的灵长类动物，日剂量为200-300mg。典型的静脉内剂量为3至5mg/kg，一周3至5次。

FLT-3抑制剂、特别是米哚妥林最优选通过诸如微乳剂、软凝胶或固体分散体的剂型以最多约250mg/日、特别是225mg/日的剂量口服施用，每日施用一次、两次或三次。

通常，开始时施用小剂量，剂量逐渐增大直到确定对所治疗宿主的最佳剂量。剂量的上限受副作用影响并且可以通过对正在治疗的宿主进行的试验来确定。

FLT-3抑制剂、反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物可以和一种或多种药学上可接受载体及任选的一种或多种其它常规药物辅助剂组合，并且可以以片剂、胶囊剂、胶囊形片剂等形式肠内(例如口服)施用或者以无菌注射溶液或混悬液的形式经肠胃外(例如腹膜内或静脉内)施用。肠内和肠胃外组合物可以通过常规方法来制备。

本发明的输注溶液优选为无菌的。这可以例如通过经无菌滤膜过滤而容易地实现。液体形式的任何组合物的无菌形成、小瓶的无菌灌注和/或在无菌条件下混合本发明的药物组合物和合适稀释剂对于技术人员来说是众所周知的。

可将FLT-3抑制剂和反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物配制成含有治疗上文所述的疾病和病症的有效量的活性物质的肠内和胃肠外药物组合物，该组合物以单位剂量形式存在且此类组合物包含药学上可接受载体。

FLT-3抑制剂的有用组合物的示例描述于欧洲专利0 296 110、0 657164、0 296 110、0 733 372、0 711 556、0 711 557中。

FLT-3抑制剂的优选的组合物描述于在1995年6月14日公开的欧洲专利0 657 164中。所述的药物组合物包括式I化合物诸如米哚妥林在饱和聚亚烷基乙二醇甘油酯中的溶液或分散体，其中乙二醇甘油酯为一种或多种C8-C18饱和脂肪酸的甘油基和聚乙二醇酯的混合物。

FLT-3抑制剂的这些组合物的两种制备方法叙述如下。

组合物A：

通过加热至60℃使Gelucire 44/14(82份)熔化。向熔化的材料中加入粉状的米哚妥林(18份)。将所得混合物匀化并将所得分散物加入到不同大小的硬明胶胶囊中，以使得一些胶囊含有25mg剂量而其它含有75mg剂量的米哚妥林。所得胶囊适于口服施用。

组合物B：

通过加热至60℃使Gelucire 44/14(86份)熔化。向熔化的材料中加入粉状的米哚妥林(14份)。将混合物匀化并将所得分散物加入到不同大小的硬明胶胶囊中，以使得一些胶囊含有25mg剂量而其它含有75mg剂量的米哚妥林。所得胶囊适于口服施用。

Gelucire 44/14可从Gattefossé购得，其是C8-C18饱和脂肪酸和甘油以及具有约1500分子量的聚乙二醇的酯的混合物，脂肪酸组分的重量组成为：4-10％辛酸、3-9％癸酸、40-50％月桂酸、14-24％肉豆蔻酸、4-14％棕榈酸和5-15％硬脂酸。

Gelucire制剂的优选示例由如下组分组成：

Gelucire(44/14)：      47g

米哚妥林：             3.0g(装60mL旋盖瓶(Twist off flask)中)

软凝胶剂的优选示例含有以下微乳：

玉米油甘油酯               85.0mg

聚乙二醇400                128.25mg

Cremophor RH 40            213.75mg

米哚妥林                   25.0mg

DLα生育酚                  0.5mg

无水乙醇                   33.9mg

总计                       486.4mg

但是，应当清楚地理解这仅是为了进行解释说明。

通过以下描述的测试方法可以显示FLT-3抑制剂和mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合比其任一种物质单独治疗更有效。在这些确定由反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物和FLT-3激酶抑制剂(优选4-苄基星形孢菌素)诱导的细胞周期影响和细胞凋亡的研究中，证明了其对抗全身性肥大细胞增多症(SM)。

对在肿瘤人类MC中Mcl-1的表达和功能作用进行检查。显示在包括ASM和MCL的所有SM变型中的原发性肿瘤MC以及MCL细胞系HMC-1均以组成型方式表达Mcl-1。此外，本发明人表明在这些细胞中靶向Mcl-1与降低生长及诱导凋亡相关，并且与增加的对TK抑制剂的敏感性相关，所述TK抑制剂包括PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺和伊马替尼。

应用新开发的流式细胞术(FCM)分析，利用抗-FLT-3或磷光体(p)-FLT-3抗体证明当MV4-11(MV)细胞表达FLT-3和p-FLT-3时，RS4-11(RS)细胞仅在其细胞表面表达FLT-3。暴露于20至200nM优选的FLT-3抑制剂诱导细胞周期G1期积聚且，以剂量依赖的方式，MV的凋亡显著多于RS细胞。这与p-FLT-3、p-AKT和p-ERK1/2而不是FLT-3、AKT或ERK1/2水平的显著减少相关，如通过蛋白质印迹分析测定。优选的FLT-3抑制剂也抑制p-FLT-3而不是FLT-3(如可以通过FCM确定)在MV细胞上的表面表达。与优选的FLT-3抑制剂不同，用优选的HDAI化合物处理在MV和RS细胞中以剂量依赖方式减弱FLT-3和p-FLT-3两者的水平，如可以通过蛋白质印迹和FCM分析所确定。暴露于优选的HDAI化合物(20至100nM)也下调了p-FLT-3、p-AKT和p-ERK1/2的水平。用优选的FLT-3抑制剂和优选的HDAI化合物共同处理令人惊讶地显著诱导MV和RS细胞的细胞凋亡。这与MV细胞中p-FLT-3、p-AKT和p-ERK1/2的更多的减少相关联。

优选地，至少有一种有益效果，例如，第一种和第二种活性成分效果的相互提高，特别是协同作用，例如比相加的效果更有效；额外的有利效果；更少的副作用；非有效剂量的第一种和第二种活性成分之一或两者的的组合治疗效果；以及尤其是强协同活性成分。

在组合中FLT-3抑制剂/反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的摩尔比例通常是1/10至10/1，优选1/5至5/1，例如1/2、1/1、2/1或3/1。

实施例1

材料和方法

试剂

伊马替尼(STI571)、PKC41228和尼洛替尼(4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)29由诺华药业(Novartis Pharma AG)(Basel，Switzerland)提供。通过将其溶解于二甲亚砜(DMSO；默克(Merck)，Darmstadt，德国)而制备PKC412和4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺的储存溶液。白介素-4(IL-4)购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)；RPMI 1640培养基和胎牛血清(FCS)来自PAA实验室(Pasching，Austria)；L-谷氨酰胺和Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)来自Gibco生命技术公司(Gibco Life Technologies)(Gaithersburg，MD)，³H-胸腺嘧啶核苷来自安玛西亚(Amersham)(Aylesbury，UK)；以及克拉屈滨(2-氯脱氧腺苷，2CdA)来自杨森-齐拉格(Janssen-Cilag)(Beerse，比利时)。反义寡核苷酸(ASO；根据最近公开的序列设计)得自VBCGenomics(Vienna，奥地利)或ISIS Pharmaceuticals(Carlsbad，CA)，以及siRNA来自Dharmacon(Lafayette，CO)。

患者特性和肿瘤肥大细胞的纯化

检查了总共25例患有全身性肥大细胞增多症的患者(静止性全身性肥大细胞增多症，ISM，n＝17；侵袭性全身性肥大细胞增多症，ASM，n＝3；肥大细胞白血病，MCL，n＝2；郁积性肥大细胞增多症，SSM，n＝2；肥大细胞肉瘤，MCS，n＝1)。从后髂嵴获得骨髓(BM)细胞，并将其收集于含有无防腐剂的肝素的注射器中。在每种情况下，在活组织检查前获得知情同意。根据WHO标准进行诊断。在两例患有肥大细胞白血病(MCL)的患者和一例患有肥大细胞肉瘤(MCS)的患者中，如所描述的那样应用PE标记的mAb YB5.B8(Pharmingen，San Diego，CA)和FACS-Vantage细胞分类装置(Becton Dickinson，San Jose，CA)将原发肿瘤MC纯化至同质(纯度>98％)。所有的实验均有伦理审查委员会(institutional review board)的批准以及依照赫尔辛基宣言进行。

具有或缺乏KIT D816V的HMC-1细胞的培养

获得产生自患有MCL48的患者中的白血病细胞的人类肥大细胞系HMC-1(Mayo Clinic，Rochester，MN)。应用了HMC-1的两个亚克隆，即拥有KIT突变G560V但没有D816V的HMC-1.1、以及展示出KIT的G560V突变和D816V突变两者的HMC-1.2细胞。在37℃和5％ CO₂下，将32HMC-1细胞培养于补充有10％ FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的IMDM培养基中。每4-8周从原始储存再解冻HMC-1细胞，并每周传代。作为“表型稳定性”的对照，对HMC-1细胞定期检查KIT的表达和IL-4的下调效果(100U/ml，48小时)。

用抑制剂处理

在37℃和5％ CO₂下，用各种浓度的靶向KIT D816V的TK抑制剂PKC412(100pM至10μM)、不同浓度的4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(1nM至100μM)、伊马替尼(3nM至300μM)、2CdA(0.1-10,000ng/mL)或对照培养基孵育HMC-1细胞达48小时。在独立的实验组中，在暴露于抑制药物之前，用mcl-1特异性ASO转染HMC-1细胞(见下文)。在其它实验中，用不同浓度的Mcl-1特异性ASO(50nM-250nM)转染细胞达12小时，或用siRNA(200nM)转染12小时，而不进一步暴露于靶向药物。在暴露于药物和/或ASO之后，对细胞进行³H-胸腺嘧啶核苷摄入实验、细胞活力和细胞凋亡分析或蛋白质印迹。

RNA印迹分析和RT-PCR

根据生产商的说明用Trizol(英杰(Invitrogen)，Carlsbad，CA)从HMC-1细胞中分离总RNA。基本上如所描述的那样进行RNA制备和RNA印迹。简而言之，在1.0％甲醛-琼脂糖凝胶上将15μg总RNA进行大小分级，并如所描述的那样转移至尼龙膜上(Hybond N，Amersham，Aylesbury，U.K.)。用³²P-标记的对mcl-1或β-肌动蛋白特异的cDNA在快速杂交(rapid-hyb)缓冲液(Amersham)中进行杂交。如所描述的那样，通过用EcoRI和XbaI(New England Biolabs，Beverly，MA)切割来自pBSK-Mcl-1(获赠自Stanley J.Korsmeyer，Dana Farber Cancer Institute，Boston，MA)的全长mcl-1 cDNA产生mcl-1探针。用Megaprime试剂盒(Amersham)进行标记。在含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.2 x SSC(1 xSSC＝150mM NaCl和15mM柠檬酸钠，pH7.0)中洗涤印迹，历时1小时在42℃洗涤2 x 30分钟，并在62℃再洗涤30分钟。应用增感屏(柯达(Kodak))通过在-80℃暴露于Biomax MS胶片(柯达，Rochester，NY)显现结合放射性。通过应用E.A.S.Y.Win32软件(Herolab，Wiesloch，德国)的放射自显影图的光密度法量化mRNA表达水平。应用Protoscript First StrandcDNA合成试剂盒(New England Biolabs，Beverly，MA)，采用1μgRNA在50μL反应体积中进行RT-PCR反应。PCR条件如下：在94℃最初变性60秒，在55℃退火60秒，在72℃聚合60秒(35个循环)，以及在72℃末端延伸10分钟。使用了以下的引物对：mcl-1：5′-TGC TGG AGT TGGTCG GGG AA-3′(正向)(SEQ ID NO：3)和5′-TCG TAA GGT CTC CAGCGC CT-3′(反向)(SEQ ID NO：4)。β-肌动蛋白：5′-ATG GAT GAT GATATC GCC GCG-3′(正向)(SEQ ID NO：5)和5′-CTA GAA GCA TTTGCG GTG GAC GAT GGA GGG GCC-3′(反向)(SEQ ID NO：6)。在含有0.5μg/mL溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分辨PCR产物。

蛋白质印迹分析

应用HMC-1细胞裂解物和多克隆兔抗人Mcl-1抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)如之前描述的那样进行蛋白质印迹分析。简而言之，将细胞裂解于含有1％ Triton-X-100(Sigma，St.Louis，MO)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在还原条件下分离蛋白质，并在转移缓冲液中转移至硝化纤维膜(Protran，Schleicher &Schuell，Dassel，德国)上。然后将膜暴露于抗小鼠/抗兔IgG(BM化学发光蛋白质印迹试剂盒，罗氏(Roche))。为证实相等的上样，用抗β-肌动蛋白抗体(西格玛(Sigma))再探测(re-probed)膜。通过暴露于Biomax MS胶片(柯达(Kodak))检测化学发光。

免疫组织化学和免疫细胞化学

在所有患有SM的患者中，应用间接免疫过氧化物酶染色技术在从石蜡包埋的、福尔马林固定的BM样本制备的连续切片(2μm)上检查了肿瘤BM MC中Mcl-1的表达。用CH₃OH/H₂O₂阻断内源过氧化物酶。在用多克隆抗Mcl-1抗体(Santa Cruz)(工作稀释：1:50)染色之前，用微波炉预处理BM切片。用抗Mcl-1抗体(过夜)和抗类胰蛋白酶抗体G3(工作稀释：1:5,000，在室温下1小时)(Chemicon，Temecula，CA)孵育连续BM切片。将抗体稀释于0.05M Tris缓冲盐水(TBS，pH 7.5)和1％牛血清白蛋白BSA(西格玛(Sigma))中。洗涤后，用生物素化的山羊抗兔或马抗小鼠IgG孵育载玻片30分钟，洗涤，并暴露于链霉抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物30分钟。应用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC)作为色原。将载玻片在迈尔氏苏木精明矾染剂(Mayer’s Hemalaun)中复染色。应用抗Mcl-1抗体(工作稀释1:200)和生物素化的山羊抗兔IgG(Biocarta，San Diego，CA)，如所描述的那样在HMC-1细胞的细胞离心涂片器制备物上进行免疫细胞化学。在选择实验中，应用了Mcl-1封闭肽(Santa Cruz)(工作稀释1∶40)。应用了作为色原的碱性磷酸酶复合物(Biocarta)。应用Neofuchsin(Nichirei，东京，日本)使抗体反应可视化。

用mcl-1反义寡核苷酸(ASO)和siRNA转染

用mcl-1特异性2′-O-甲氧基乙基/2′-脱氧核苷酸嵌合的磷硫酰ASO(5′-TTG GCT TTG TGT CCT TGG CG-3′)(SEQ ID NO：7)或用混合对照(Scramble control)寡核苷酸库转染HMC-1.1和HMC-1.2细胞。混合对照代表A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、T(胸腺嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基的混合物，所得到的制备物含有等摩尔的寡核苷酸混合物。在独立的实验组中，应用了退火、纯化并脱盐的双链mcl-1siRNA(AAG AAA CGC GGU AAU CGGACU)(SEQ ID NO：8)和AGU CCG AUU ACC GCG UUU CUU 3’(mcl1，SEQ ID NO：9))以及针对萤光素酶的对照siRNA(CUU ACG CUG AGUACU UCG A)(SEQ ID NO：10)，两者都获自Dharmacon(Lafayette，CO)。为了进行转染，在37℃在75cm²培养板皿中接种800,000个细胞(24小时)。基本上如所描述的那样在RPMI 1640培养基中用Lipofectin-试剂(英杰(Invitrogen))复合Mcl-1-ASO和Mcl-1siRNA。简而言之，在37℃用各种浓度的mcl-1 ASO(50-250nM)或200nM mcl-1特异性siRNA孵育HMC-1.1或HMC-1.2细胞4小时。在暴露于ASO之后，洗涤细胞，并在有或没有各种浓度的TK抑制剂存在的情况下将其在含有10％ FCS的RPMI 1640培养基中再培养12小时，然后进行分析。在进行凋亡细胞百分比检查和蛋白质印迹分析之前，将siRNA处理的细胞保持于对照培养基中12小时(没有TK抑制剂)。

³H-胸腺嘧啶核苷插入分析和细胞活力测定

为研究Mcl-1 ASO、PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺、伊马替尼和2CdA的抗增殖效果，应用HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞进行了³H-胸腺嘧啶核苷插入实验。将TK抑制剂和2CdA应用于未处理的细胞或用ASO或通用(混合)对照转染的细胞。具体而言，在用Mcl-1 ASO或对照寡核苷酸转染4小时后，在有或没有各种浓度的PKC412(100pM至10μM)、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(1nM至100μM)、伊马替尼(3nM至300μM)或克拉屈滨(2CdA；HMC-1.1:0.1-10,000ng/mL；HMC-1.2:0.5-500ng/mL)存在的情况下，将细胞培养于96孔微量滴定板(每孔5 x 10⁴个细胞)中，培养24小时。之后，将1μCi ³H-胸腺嘧啶核苷加入到每一孔中。十六小时后，将细胞收集在Filtermate 196收集装置(Packard Bioscience)中的滤膜(Packard Bioscience，Meriden，CT)上。然后风干滤器，并且在β-计数器(Top-Count NXT，Packard Bioscience)中测量结合放射性。所有的实验均以一式三份进行。通过台盼蓝不相容试验测定细胞活性。应用常规的细胞形态学标准，在Wright-Giemsa染色的细胞离心涂片器载玻片上确定凋亡细胞百分比。

统计分析

为确定在数据评估中所发现的差异的显著水平，应用了配对t-检验。p<0.05时，认为结果是显著差异的。为确定mcl-1 ASO和靶向药物的协同效果，应用商业可获得的软件(CalcuSyn；Biosoft，Ferguson，MO)根据公开的指导计算了组合指数值。

结果

在肿瘤肥大细胞中检测Mcl-1蛋白

方法：正如通过免疫组织化学和连续切片染色所评估，在所有被检查的SM患者(n＝25)中均发现肿瘤MC与针对Mcl-1的抗体反应。通过在患有静止性SM(ISM)的患者的肿瘤MC中免疫组织化学检测类胰蛋白酶和Mcl-1，分析了Mcl-1在肿瘤人类肥大细胞中的表达。用针对类胰蛋白酶或Mcl-1的抗体孵育相邻的骨髓切片。如所描述的那样进行免疫组织化学。

在具有KIT突变D816V的HMC-1.2细胞中进一步分析了Mcl-1表达的免疫细胞化学检测。应用多克隆抗Mcl-1抗体进行免疫细胞化学。用特异性封闭肽预孵育抗体得到了负染色。用缺乏KIT D816V的HMC-1.1细胞也得到了相同的染色结果。用mcl-1特异性cDNA探针和β-肌动蛋白上样对照进行HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的RNA印迹分析。在K562细胞、HMC-1.1细胞、HMC-1.2细胞和纯化的(纯度>98％)肿瘤人类肥大细胞中进行了mcl-1 mRNA表达的RT-PCR分析，所述纯化的肿瘤人类肥大细胞获自一例患有肥大细胞肉瘤(MCS)的患者(#1)和两例患有肥大细胞白血病(MCL)的患者(#2和#3)。通过省略RT步骤(-RT)对PCR反应进行对照。

结果：在患有ISM的患者的梭状肿瘤BM MC中观察到类胰蛋白酶和Mcl-1的共表达。实际上，发现这些浸润物中的所有的肿瘤MC对Mcl-1都是染色阳性的。当比较各种类型的SM患者时，通过免疫组织化学在MC中也没有Mcl-1表达(关于在浸润物中染色MC的百分比或染色的强度)的差异。具体而言，在患有ISM和SSM的患者，以及高度恶性肿瘤诸如ASM和MCL的肿瘤MC中均发现Mcl-1表达。发现人类MCL衍生的白血病细胞系HMC-1(HMC-1.1和HMC-1.2)也表达Mcl-1蛋白，如通过免疫细胞化学确定的那样。进行了抗Mcl-1抗体和用对照培养基或Mcl-1特异性封闭肽预孵育后的HMC-1.1细胞的反应，且用MC-1.2细胞也得到了相同的结果。

在肿瘤肥大细胞中检测mcl-1 mRNA

在接下来的步骤，我们检查了在原发性肿瘤MC和HMC-1细胞中mcl-1 mRNA的表达。如通过RNA印迹评估的那样，发现HMC-1.1和HMC-1.2均表达mcl-1 mRNA。通过RT-PCR分析证实了在HMC-1细胞中的mcl-1 mRNA的表达。此外，通过RT-PCR分析，我们能够证明在患有MCL或MCS的患者的高度纯化的原发性肿瘤MC中的mcl-1 mRNA的表达。

Mcl-1表达的下调对抗肿瘤MC的活力

方法：分析了在HMC-1.1和HMC-1.2细胞中mcl-1反义寡核苷酸对Mcl-1蛋白表达和细胞活力的影响。在分析之前，用250nM的mcl-1反义寡核苷酸或混合对照转染HMC-1.1细胞和拥有KIT D816V的HMC-1.2细胞，或使其保持未转染12小时。用抗Mcl-1抗体进行Mcl-1表达的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白作为上样对照。将无活力(台盼蓝阳性)细胞的估值表达为所有有核细胞的百分数。凋亡细胞的数值(％)。结果代表来自3次独立实验的平均值±S.D.。

在暴露于各种浓度的mcl-1反义寡核苷酸(50-250nM)或对照培养基12小时后，通过用蛋白质印迹分析HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中Mcl-1表达，分析了mcl-1反义寡核苷酸对肿瘤肥大细胞的剂量和时间依赖性作用。β-肌动蛋白作为上样对照。观察了mcl-1反义寡核苷酸(250nM)和混合对照(250nM)对HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中Mcl-1蛋白表达的时间依赖性作用。通过用β-肌动蛋白作为上样对照的蛋白质印迹确定Mcl-1的表达。得到了mcl-1反义寡核苷酸(250nM)和混合对照(250nM)对细胞活力(即凋亡的HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的百分比)的时间依赖性作用。结果代表来自3次独立实验的平均值±S.D.。

结果：为研究Mcl-1作为存活分子和SM中潜在靶标的作用，通过反义寡核苷酸(ASO)方法在HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中降低了Mcl-1。如通过蛋白质印迹确定的那样，当与混合对照转染或未转染的细胞相比较时，用mcl-1 ASO(250nM)对两个细胞系的转染几乎消除了Mcl-1蛋白的表达。如期望的那样，在所测试的两种HMC-1亚克隆(即HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞)中，用mcl-1 ASO转染导致台盼蓝阳性细胞的大量增加(对照为约1-5％；混合对照约5-8％；ASO约35-50％)并且导致凋亡细胞百分比类似地大量增加。发现mcl-1 ASO对肿瘤MC(HMC-1)生长和存活的影响是剂量和时间依赖性的。这些数据显示通过ASO方法靶向肿瘤MC的mcl-1与细胞活力的丧失以及细胞凋亡的诱导相关。

mcl-1siRNA对肿瘤肥大细胞的影响

方法：[001]在肿瘤肥大细胞中分析了mcl-1-siRNA对HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中Mcl-1蛋白表达及细胞活力的影响。使细胞保持未转染(对照)，或如本文所描述的那样用mcl-1特异性siRNA(mcl-1-siRNA；200nM)或萤光素酶特异的(对照)siRNA(luc-siRNA；200nM)转染。应用多克隆抗Mcl-1抗体通过蛋白质印迹确定Mcl-1蛋白表达。通过检测β-肌动蛋白证实相等的上样。通过记录凋亡细胞百分比(％)分析细胞活力。结果以来自每一组实验中3次独立实验的平均值±S.D.表示。

结果：接下来的步骤中，我们应用mcl-1特异性siRNA进一步证实mcl-1作为存活相关分子和肿瘤MC中潜在靶标的作用。在这些实验中，发现mcl-1siRNA下调HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中Mcl-1蛋白的表达。在HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中，发现siRNA诱导的Mcl-1的下调与凋亡细胞的增加相关。这些数据提供了mcl-1是肿瘤MC中重要存活因子的进一步证据。

抗肿瘤剂和靶向药物对肿瘤肥大细胞中Mcl-1表达的影响

方法：观察了在缺乏KIT D816V的HMC-1.1细胞和展现有KITD816V的HMC-1.2细胞中PKC412、尼洛替尼(即，4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)、伊马替尼(即，GLIVEC或GLEEVEC)或2CdA对Mcl-1蛋白表达和对细胞活力的影响。应用多克隆抗Mcl-1抗体通过蛋白质印迹确定Mcl-1蛋白的表达。通过检测β-肌动蛋白证实相等的上样。通过记录凋亡细胞百分比(％)分析细胞活力。证明药物对细胞活力作用的结果以来自3次独立实验的平均值±S.D.表示。

结果：在接下来的步骤中，我们研究了各种靶向药物对HMC-1细胞中Mcl-1表达的影响。在这些实验中，我们发现PKC412(0.3-10μM)、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(10-300nM)和伊马替尼(30-300nM)，而不是2CdA(高达1,000ng/ml)，下调缺乏KIT D816V的HMC-1.1细胞中Mcl-1的表达。当将相同的药物(以相同的浓度)应用于具有KIT D816V的HMC-1.2细胞时，我们发现与对照相比较，PKC412(1-10μM)和2CdA(10-100ng/ml)降低了Mcl-1的表达，而对于在所测试的剂量范围内的4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或伊马替尼，均没有观察到显著效果。在两个细胞系中，均发现药物诱导的Mcl-1蛋白表达的降低伴随着凋亡细胞的增加。

在肿瘤MC中产生生长抑制作用方面，Mcl-1 ASO与PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(尼洛替尼)以及伊马替尼协作。

基于靶向药物和mcl-1特异性ASO的引人注目的效果，我们很感兴趣地研究药物和ASO的组合是否将产生对HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的协同抗增殖(或凋亡诱导)效果。在第一个步骤中，在³H-胸腺嘧啶核苷摄入实验和暴露于药物后确定凋亡细胞数目的实验中确定每一单独药物的IC50值。各自的结果(IC50值)概述于表1中。对于靶向药物，该数据大部分与我们之前的观察一致。阻止增殖所需的靶向药物的浓度通常比诱导凋亡所需的浓度要低。与我们之前的数据一致，发现PKC412和2CdA、以及更小程度上的4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺在药理学合适浓度上阻碍HMC-1.2细胞的生长。相反，在HMC-1.1细胞中，发现PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺和伊马替尼降低细胞生长并诱导凋亡，而没有观察到2CdA的显著效果。发现mcl-1 ASO在HMC-1.1和HMC-1.2亚克隆中均抑制增殖且诱导凋亡，而在HMC-1.2细胞中观察到稍微更高的IC50值。

表1

在HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞中各种靶向药物对³H-胸腺嘧啶核苷摄入(IC₅₀)和凋亡诱导(EC₅₀)的影响

^＊在用药物孵育或用ASO转染24小时后分析³H-胸腺嘧啶核苷摄入，并且在细胞用药物孵育24小时后在细胞离心涂片器制备物中确定凋亡细胞百分比。为了评估细胞凋亡，在用ASO转染12小时后检查细胞，因为在24小时后，在所有的实例中凋亡细胞的数目均>50％。

^＊＊尼洛替尼是4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺

分析了mcl-1反义寡核苷酸和靶向药物对缺乏(HMC-1.1)或展示有(HMC-1.2)KIT D816V的肿瘤肥大细胞生长和活力的影响。

方法：研究了各种浓度的PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺(尼洛替尼)、STI571(伊马替尼)或2CdA对HMC-1.1细胞的³H-胸腺嘧啶核苷摄入的影响，所述HMC-1.1细胞用混合对照或mcl-1反义寡核苷酸(50nM)进行转染。将结果表达为没有靶向药物的对照(＝混合对照)的百分比，且其表示为3次所分析的独立实验的平均值±SD。分析了与PKC412、尼洛替尼、STI571(伊马替尼)或2CdA一起应用或者不含上述各个药物的mcl-1反义寡核苷酸或混合对照(各自100nM)对细胞活力(即凋亡细胞百分比(％))的影响。结果代表3次独立实验的平均值±SD。应用CalcuSyn软件，根据Chou和Talalay的中值效果方法(median effect method)计算PKC412、尼洛替尼、STI571(伊马替尼)或2CdA和mcl-1反义诱导的HMC-1.1细胞凋亡的剂量-效应关系分析。小于1的组合指数(CI)表明协同作用。

分析了各种浓度的PKC412、尼洛替尼、STI571(伊马替尼)或2CdA对HMC-1.2细胞的³H-胸腺嘧啶核苷摄入的影响，所述HMC-1.2细胞用混合对照或mcl-1反义寡核苷酸(80nM)进行转染。将结果表示为没有靶向药物的对照(即，混合对照)的百分比，且其表示3次独立实验的平均值±SD。分析了与PKC412、尼洛替尼、STI571(伊马替尼)或2CdA一起应用的或者不含上述各个药物的mcl-1反义寡核苷酸或混合对照(各自100nM)对细胞活力(即凋亡细胞百分比(％))的影响。结果代表3次独立实验的平均值±SD。应用CalcuSyn软件，根据Chou和Talalay的中值效果方法计算PKC412、尼洛替尼、STI571(伊马替尼)或2CdA和mcl-1反义诱导的HMC-1.2细胞凋亡的剂量-效应关系分析。小于1的组合指数(CI)表明协同作用。

结果：当将经mcl-1-ASO转染的HMC-1细胞的药物诱导的反应与用混合对照转染的HMC-1细胞的药物诱导的反应比较时，发现了显著不同。实际上，在多数情况下，发现用mcl-1 ASO转染能使HMC-1细胞对TK抑制剂以及对2CdA变得敏感。有趣的是，在HMC-1.1细胞中，发现多数组合实质上均是协同的。相反，在HMC-1.2细胞中，仅在ASO和PKC412、以及ASO和2CdA的组合中观测到协同作用，但在ASO和4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或ASO和伊马替尼的组合中没有观察到协同作用。总之，这些数据显示Mcl-1可以用作肿瘤MC中的新药物靶标，并且mcl-1特异性ASO能够使HMC-1细胞对2CdA和新的TK抑制剂变得敏感。

讨论

Mcl-1是被很好地鉴定了的Bcl-2家族成员，近来表明其与各种骨髓肿瘤的发病机理相关。全身性肥大细胞增多症(SM)是特征在于MC在内脏中异常生长和蓄集的骨髓肿瘤。我们提供证据表明患有SM的患者中的肿瘤MC以及人类肥大细胞白血病细胞系HMC-1以组成型方式表达Mcl-1。此外，我们的数据显示Mcl-1是肿瘤MC中的关键存活分子，并且通过ASO或siRNA靶向Mcl-1与降低的肿瘤MC存活、以及增加的对KIT酪氨酸激酶抑制剂的响应相关，所述KIT酪氨酸激酶抑制剂包括PKC412或4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺。

与多数其它骨髓谱系包括嗜碱细胞相比，正常的和肿瘤MC是极其长寿的细胞，但是与它们长期存活相关的机制和存活因子大部分仍然还是未知的。尽管已表明Bcl-2家族成员是粒单核(granulomonocytic)细胞中的重要存活因子，但是关于这些分子在MC中的表达和功能几乎是未知的。目前为止，已报道肿瘤MC以及HMC-1细胞表达Bcl-2。此外，描述了SM中的肿瘤MC展示Bcl-xL。在本研究中，我们能够在mRNA和蛋白质水平，并通过应用了特异性ASO和siRNA的功能分析证实了Mcl-1在肿瘤MC中的表达。因此，基于我们的数据，应当将Mcl-1认为是在肿瘤MC中表达的重要存活因子。

SM的临床过程是多变的，且可从具有低MC增殖能力和正常生命预期的无症状至具有肿瘤MC快速增殖和短生存的高度侵袭性病例。因此我们很感兴趣地研究Mcl-1的水平是否会在患有SM的患者的各个群体间不同。然而，当比较低度和高度恶性MC恶性肿瘤时，在MC的Mcl-1表达中没有检测到明显不同。这一观察现象可以由Mcl-1表达与MC的存活相关，而不是与它们的增殖能力相关这一事实来解释。实际上，甚至在静止性SM中，MC也表现出极其长的存活。另一方面，应用高度敏感的流式细胞术技术，Cervero等报道了与ISM相比，患有MCL的患者的BM MC中增加的Bcl-2表达。因此，我们不能排除与正常MC或ISM中的MC相比，MCL中的MC表达稍微更高水平的Mcl-1，因为在我们的研究中应用的技术不如比流式细胞术灵敏。

在肿瘤骨髓细胞中Mcl-1的表达的调控几乎是未知的。在慢性髓细胞性白血病(CML)中，发现疾病相关的癌蛋白BCR/ABL促进Mcl-1.46的表达。在SM中，KIT的D816V突变的变体以与CML中BCR/ABL相类似的方式作为疾病相关的癌蛋白。为研究这一癌蛋白是否参与肿瘤MC中Mcl-1的表达调控，我们利用了KIT的TK活性抑制剂。在这些实验中，发现PKC412、4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺和伊马替尼在HMC-1.1(缺乏KITD816V但表达KIT G560V)中下调Mcl-1表达，而在表达KIT D816V的HMC-1.2细胞中，仅有PKC412和更低程度上的4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺降低Mcl-1蛋白的表达。由于PKC412有效地抑制KIT D816V的TK活性，且由于这一突变带来了针对伊马替尼的抗性，可将这些观察结果解释为支持KIT D816V有助于肿瘤MC中Mcl-1的异常表达的假说。另一方面，我们的数据还表明在缺乏KIT D816V的HMC-1细胞中Mcl-1表达是可检测的且是KIT依赖的，因为KIT TK抑制剂下调了HMC-1.1细胞中Mcl-1的表达。这一观察结果是特别有趣的，因为高度恶性肿瘤(ASM或MCL)中的MC通常缺乏KIT D816V，或具有导致复发的可以在TK靶向治疗过程中被选择的KIT D816V阴性亚克隆。

Mcl-1是很好地确定的存活分子，其在骨髓细胞中抵抗细胞凋亡。为了对在肿瘤MC中Mcl-1表达的功能重要性提供证据，用mcl-1特异性ASO或mcl-1特异性siRNA转染HMC-1细胞。在两个HMC-1亚克隆中，通过蛋白质印迹证实了特异性ASO和siRNA诱导的Mcl-1蛋白的降低，且这伴随着凋亡细胞的显著增加。此外，与用混合对照转染的细胞相比较，用Mcl-1 ASO转染后HMC-1细胞的增殖降低了。这些数据提供了Mcl-1是HMC-1细胞中重要存活因子的实证。

我们接下来比较了mcl-1 ASO和各种靶向药物的增殖抑制和细胞凋亡诱导作用，所述靶向药物包括2CdA和新的KIT TK抑制剂。在这些实验中有趣的一个方面是，与细胞凋亡诱导相比较，在TK抑制剂的更低浓度抑制了通过³H-胸腺嘧啶核苷摄入测得的增殖。当比较各种抑制药物的作用时，这一差异可能具有显著的含义，并且可能被以下事实最好地解释：即³H-胸腺嘧啶核苷摄入是更敏感的生长参数，并且可以在细胞凋亡征兆发生之前即受到影响。

ASM和MCL是具有不良预后和短生存的高度恶性MC恶性肿瘤。在这些患者中，许多不同的因子可能促进MC的异常生长和存活，并且在这些患者中鉴定对抗肿瘤细胞生长的药物是很困难的。然而，在过去的几年中，鉴定了许多克服高度恶性MC肿瘤中药物抗性的新的治疗观念和靶向药物。这些药物之一是PKC412，其为对抗Flt3突变体、野生型KIT以及KIT D816V的TK活性的新TK抑制剂。相应地，在本研究中，发现PKC412在表达KIT D816V的HMC-1.2细胞中阻碍生长和Mcl-1表达。关于生长抑制，这些数据证实了我们和其他人之前的观察。然而，甚至PKC412作为单个药物也可能不能在患有ASM或MCL的患者中诱导长久完全的缓解。

在TK驱动的、耐药的骨髓肿瘤中的最有吸引力的方法是将靶向药物相互组合或与常规药物组合。在ASM或MCL的情况下，考虑应用PKC412、其它TK抑制剂和其它靶向药物的组合可能是合理的。我们的研究结果表明，mcl-1 ASO和PKC412、以及mcl-1 ASO和4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺在产生HMC-1.1细胞和HMC-1.2细胞的生长抑制作用方面相互协作。此外，当在HMC-1.1细胞中应用伊马替尼和mcl-1 ASO时，也观察到了协作作用。一个有趣的现象是mcl-1 ASO和PKC412之间的协作药物作用在两个HMC-1亚克隆中都是协同的，而mcl-1 ASO和4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺之间的相互作用仅在HMC-1.1细胞中是协同的，但在HCM-1.2细胞中则不是。这些差异可以如下最好地解释：由与PKC412的作用相比，伊马替尼和4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺对展示KIT D816V的HMC-1.2细胞具有显著更小的抗增殖作用。

2CdA是最近引入的作为用于治疗晚期SM的新的有效的细胞减少性物质的药物。在本研究中，我们发现与HMC-1.1细胞相比，2CdA更强有力地抑制HMC-1.2细胞中的生长和Mcl-1表达，这可能具有很大的临床重要性，因为多数患有SM的患者(包括患有ASM和MCL的那些)都展示有这一KIT突变。因此，2CdA是所描述的在表达KIT D816V的MC中比在缺乏这一KIT突变的MC中表现更好的第一个药物。然而，尽管有这些作用，2CdA在所分析的两个HMC-1亚克隆中均没有与mcl-1 ASO产生协同抗增殖作用。

许多临床I/II期试验试图应用ASO类型药物。然而，尽管有最先的鼓舞人心的结果，但是在过去有了一些关于在癌症患者中应用此类药物的可能性的异议。对于mcl-1和SM，需要进一步的临床前和临床研究以确定mcl-1靶向治疗观念是否能够发展得足够远以进入ASM和MCL的临床试验。

总之，我们的数据显示肿瘤MC表达mcl-1，并且靶向Mcl-1与降低的存活以及增加的针对TK抑制剂诸如PKC412的响应相关。这些数据表明Mcl-1是肿瘤MC中的新的有意义的靶标，其可能有助于克服针对TK抑制剂的抗性。

序列表

<110>诺瓦提斯公司

     彼得·瓦伦特

<120>包含星形孢菌素类的组合

<130>50270A

<160>10

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>4020

<212>DNA

<213>人类

<400>1

<210>2

<211>350

<212>PRT

<213>人类

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人类

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人类

<400>4

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人类

<400>5

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人类

<400>6

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人类

<400>7

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>人类

<400>8

<210>9

<211>21

<212>RNA

<213>人类

<400>9

<210>10

<211>19

<212>RNA

<213>人类

<400>10

Claims (21)

1.在哺乳动物中治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病、以及实体瘤的方法，该方法包括同时、共同、分别或依次用药学有效量的(a)FLT-3抑制剂或其药学上可接受盐或前药、和(b)mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物治疗需要此类治疗的哺乳动物。

2.权利要求1的方法，其用于治疗急性骨髓性白血病(AML)。

3.权利要求1的方法，其中FLT-3抑制剂是星形孢菌素衍生物或4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]-N-[5-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺或伊马替尼。

4.权利要求3的方法，其中星形孢菌素衍生物选自下式的化合物或，当存在至少一个成盐基团时，它们的盐：

或

或或

或

或

其中，

R₁和R₂相互独立地为未取代或取代的烷基、氢、卤素、羟基、醚化或酯化的羟基、氨基、单或二取代的氨基、氰基、硝基、巯基、取代的巯基、羧基、酯化的羧基、氨基甲酰基、N-单-或N，N-二-取代的氨基甲酰基、磺基、取代的磺酰基、氨基磺酰基或者N-单-或N，N-二-取代的氨基磺酰基；

n和m相互独立地为从0至4且包括0和4的数；

n’和m’相互独立地为从1至4且包括1和4的数；

R₃、R₄、R₈和R₁₀相互独立地为氢；各自最多含有29个碳原子的脂肪族、碳环或碳环-脂肪族基团；各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基团或杂环-脂肪族基团；最多含有30个碳原子的酰基；其中R₄也可以不存在；

或者R₃为最多含有30个碳原子的酰基，且R₄不为酰基；

当R₄不存在时，则p为0，或者当R₃和R₄均存在且各自为上述基团之一时，则p为1；

R₅为氢；各自最多含有29个碳原子的脂肪族、碳环或碳环-脂肪族基团；各自最多含有20个碳原子且各自最多含有9个杂原子的杂环基团或杂环-脂肪族基团；或者最多含有30个碳原子的酰基；

R₇、R₆和R₉为酰基或-(低级烷基)-酰基、未取代或取代的烷基、氢、卤素、羟基、醚化或酯化的羟基、氨基、单或二取代的氨基、氰基、硝基、巯基、取代的巯基、羧基、羰基、羰基二氧基、酯化的羧基、氨基甲酰基、N-单-或N，N-二-取代的氨基甲酰基、磺基、取代的磺酰基、氨基磺酰基或者N-单-或N，N-二-取代的氨基磺酰基；

X表示2个氢原子；1个氢原子和羟基；O；或者氢和低级烷氧基；

Z表示氢或低级烷基；

并且环A中以波浪线表示的两个键不存在并且被4个氢原子替换，且环B中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环B中以波浪线表示的两个键不存在并且被总共4个氢原子替换，且环A中的两条波浪线分别与各自的平行键一起表示双键；

或者，环A和环B中所有的4条波浪形键均不存在并且被总共8个氢原子替换。

5.权利要求3的方法，其中星形孢菌素衍生物是式I的星形孢菌素衍生物或，当存在至少一个成盐基团时，它们的盐：

其中，

m和n各自为0；

R₃和R₄相互独立地为氢，未取代的或者被相互独立地选自羧基、低级烷氧基羰基和氰基的基团单或二取代、特别是单取代的低级烷基；

或者

R₄为氢或-CH₃，且

R₃为亚式R^o-CO的酰基，其中R^o为低级烷基；氨基-低级烷基，其中氨基以未被保护的形式存在或者被低级烷氧基羰基保护；四氢吡喃基氧基-低级烷基；苯基；咪唑基-低级烷氧基苯基；羧基苯基；低级烷氧基羰基苯基；卤素-低级烷基苯基；咪唑-1-基苯基；吡咯烷子基-低级烷基苯基；哌嗪子基-低级烷基苯基；(4-低级烷基哌嗪子基甲基)苯基；吗啉代-低级烷基苯基；哌嗪子基羰基苯基；或(4-低级烷基哌嗪子基)苯基；

或者为亚式R^o-O-CO-的酰基，其中R^o为低级烷基；

或者为亚式R^oHN-C(＝W)-的酰基，其中W为氧且R^o具有以下含义：吗啉代-低级烷基、苯基、低级烷氧基苯基、羧基苯基或低级烷氧基羰基苯基；

或者R₃为低级烷基苯基磺酰基，通常为4-甲苯磺酰基；

R⁵为氢或低级烷基；

X代表2个氢原子或O；

Z为甲基或氢。

6.权利要求3的方法，其中星形孢菌素衍生物是式(VII)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐：

7.(a)FLT-3抑制剂和(b)mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合在治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病以及实体瘤中的用途。

8.用于治疗急性骨髓性白血病(AML)、结肠直肠癌(CRC)或非小细胞性肺癌(NSCLC)的权利要求7的用途。

9.权利要求7的用途，其中FLT-3抑制剂是式(VII)的N-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐

以及mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物。

10.(a)FLT-3抑制剂和(b)mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的组合在制备用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病以及实体瘤的药物中的用途。

11.用于治疗急性骨髓性白血病(AML)、结肠直肠癌(CRC)或非小细胞性肺癌(NSCLC)的权利要求10的用途。

12.权利要求10的用途，其中FLT-3抑制剂是式(VII)的-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐

以及mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物。

13.包含(a)FLT-3抑制剂和(b)mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物的药物组合物，其用于治疗骨髓增生异常综合征、淋巴瘤和白血病以及实体瘤。

14.权利要求13的药物组合物，其用于治疗急性骨髓性白血病(AML)、结肠直肠癌(CRC)或非小细胞性肺癌(NSCLC)。

15.权利要求13的药物组合物，其中FLT-3抑制剂是式(VII)的-[(9S，10R，11R，13R)-2，3，10，11，12，13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-1-氧代-9，13-环氧-1H，9H-二吲哚并[1，2，3-gh：3′，2′，1′-lm]吡咯并[3，4-j][1，7]苯并二氮杂环壬四烯-11-基]-N-甲基苯甲酰胺或其盐

以及mcl-1反义寡核苷酸或mcl-1特异性RNAi构建物。

16.分离的核酸，其包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列或其互补链序列。

17.包含权利要求16的分离的核酸的载体。

18.权利要求17的载体，其中载体是表达载体。

19.包含权利要求16的分离的核酸的宿主细胞。

20.短发夹RNA(shRNA)，其包含选自SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9的序列或其互补链序列。

21.反义寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的序列或其互补链序列。