CN101505598A - 用于神经元再生和功能恢复之σ配体 - Google Patents

Abstract

本发明揭示可用于在神经变性疾病中促进神经元再生和功能恢复的方法和组合物。所述方法和组合物使用σ受体的配体，其中所述配体优选为AGY－94806或其盐或溶合物。这些分子可单独递送或与治疗或预防神经变性疾病的药剂组合递送，所述疾病例如为：由缺血性中风引起的神经变性疾病、糖尿病性周围神经病变、癌症治疗诱导之神经病变、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)、或帕金森氏病(Parkinson′s disease)。在其他方法中，在中风后投与σ受体配体以促进功能恢复。σ受体配体的投与可实现较快功能恢复。

Description

用于神经元再生和功能恢复之σ配体

参考相关申请案

此申请案是2004年6月14日提出申请的美国序号第10/868,423号案件的部分接续申请案且主张所述美国案件的优先权，所述美国案件主张以下利益：在2003年6月12日申请的美国临时专利申请案第60/478,735号、在2003年6月12日申请的第60/478,329号、在2003年8月26日申请的第60/498,132号、和在2004年3月12日申请的第60/552,613号，并为2004年6月14日提出申请的国际申请案第PCT/US2004/019139号的接续申请案，所述国际申请案的公开号为WO2004/110387A2，以上所述专利案件的全部内容皆被本文列为参考。

技术领域

本发明涉及在患有神经变性病症的个体中达成神经元再生的治疗方法。具体来说，本发明涉及σ受体配体在发生神经变性疾病后的个体中促进神经元再生和功能恢复的用途。

背景技术

马丁(Martin)等人(1976)在药理学实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)197：517-532中提出σ受体的存在以解释苯并吗啡烷的拟精神病效应。最初，认为σ受体是新颖阿片样物质受体。然而，纳洛酮(naloxone)(传统阿片样物质受体拮抗剂)并不拮抗苯并吗啡烷与σ受体的结合。而且，在N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体复合物上苯并吗啡烷结合至与苯环利定(phencyclidine)受体不同的位点。因此，σ受体被确定为独特受体。

σ受体包括两种亚型，即σ-1和σ-2。赫勒韦尔(Hellewell)和鲍文(Bowen)(1990)在大脑研究(Brain Res.)，527：224-253首先界定两种假定σ受体亚型的特性。这两种位点间的主要药理学差异是苯并吗啡烷麻醉剂的(+)同分异构体对结合位点的亲和力。对于与σ-2位点相比的σ-1位点，这些化合物(例如(+)SKF 10,047(NANM)和(+)喷他佐辛(pentazocine))显示接近两个数量级的更高亲和力强度。苯并吗啡烷的(-)同分异构体显示对这两种位点具有极少的选择性。两种位点之间的其他明显差异是σ-2位点在诸如NCB-20、PC12和NG108-15细胞等细胞系中的优势(赫勒韦尔和鲍文；奎利恩(Quirion)等人，(1992)药理学的发展动态(Trends in Pharmacological Sciences)，13：85-86)。σ-1受体已被鉴别和克隆，但σ-2受体仍未被鉴别和克隆(兰格(Langa)等人，(2003)欧洲神经学杂志(European Journal of Neuroscience)，18：2188-2196)。σ受体的内源性配体是未知的。

σ-1受体在大脑中的亚细胞分布包括海马、皮质层和嗅球。σ-1是26kDa蛋白质，并且编码受体的基因已被克隆。嗜水性分析表明σ-1受体具有两个跨膜区段。而且，σ-1受体与任何其他已知哺乳动物蛋白没有同源性。

两种σ受体类型在中枢神经系统以及外周组织中表达。因此，受体配体可用于治疗和预防神经变性疾病。因而，大脑σ受体已经成为积极研究的主题(桑德斯(Sonders)等人，(1988)神经学动态(Trends Neurosci.)，1：37-40)。一般来说，σ受体表现出可与众多种配体不加选择地结合，例如精神病药物、抗抑郁药和神经甾体。在健忘症动物模型以及抑郁行为模型中那些配体已显现出在学习和记忆中具有重要作用。众多研究证实了σ受体配体在脑缺血动物模型中的健康神经保护特性。一些所述σ配体的神经保护机制是有争论的，因为已经报导σ受体和NMDA受体通道复合物的苯环利定(PCP)结合位点都有助于这些效应。

神经变性疾病的特征在于神经元的功能障碍和死亡，这会导致由大脑、脊髓和外周神经系统介导的功能的丧失。这些病症对社会具有重大影响。例如，约4至5百万美国人受到称作阿兹海默氏症(Alzheimer′s disease)的慢性神经变性疾病的折磨。其他慢性神经变性疾病的实例包括糖尿病性周围神经病变、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和帕金森氏病(Parkinson′s disease)。正常大脑衰老也与正常神经元功能的丧失有关并且可使某些神经元必然衰竭。

在美国中风是死亡的第三大原因并且占住院神经病患者的一半。根据受损大脑面积，中风可引起昏迷、瘫痪、语言障碍和痴呆。大脑梗塞的主要原因是血管血栓形成、大脑栓塞、低血压、高血压出血、和缺氧(anoxia/hypoxia)。然而，即使在中风或大脑缺血后，成人大脑仍在整个生存期内保持可塑性和功能重组的能力。神经元连接不断改变。大脑补偿大脑受损部分的潜在能力与中风康复有关。中风患者的神经影像表现了某些功能重组。因此，大脑可塑性一方面在于，在中风患者中，神经元连接可通过感觉输入、体验和学习来改变，并且大脑可通过功能和结构重组、针对事件的神经反应的上调或下调、和通过侧支出芽和补偿性突触发生以及神经发生建立新功能和结构连接来反应。

然而，除了环境因素对大脑可塑性的影响外，药物和药物与环境因素之间的交互反应是应考虑的另一方面。因此，仍需要治疗中枢神经系统病症和其他病况的新药物和新方法，其利用大脑可塑性辅助神经元再生和功能恢复。本发明可满足这些和其它需要。

已发现若干σ受体配体在用于检验药物的神经保护活性的预测模型中具有神经保护性(即防止神经元细胞死亡和相应的功能丧失)。例如，发现σ受体配体奥匹哌醇(opipramol)可在沙鼠中防止缺血且发现其可调节谷氨酸受体的NMDA类型。此外，其他σ配体(包括BMY-14802、卡拉美芬(caramiphen)和氟哌啶醇(haloperidol))在体内模型中表现与针对NMDA诱导的毒性和癫痫发作提供保护性效应一致的特性(M.彭特寇沃(M.Pontecorvo)等人，(1991)大脑研究简报(Brain Res.Bull.)，26：461-465)，并且发现若干σ配体可抑制缺血诱导的从体外海马切片制品释放谷氨酸(D.劳伯纳(D.Lobner)等人，(1990)神经科学通讯(Neuroscience Lett.)，117：169-174)。

美国专利第5,736,546号揭示某些1，4-(二苯基烷基)六氢吡嗪衍生物，其是σ受体的配体。这些化合物之一，1-(3，4-二甲氧基苯乙基)-4-(3-苯丙基)六氢吡嗪，现在也称为SA-4503或AGY-94806。中泽(Nakazawa)等人，(1998)国际神经化学(Neurochem.Int.)，32：337-343报导了AGY-94806是选择性σ-1激动剂，并且发现在大鼠原代神经元培养中其可显著抑制缺氧/低血糖诱导的神经毒性。此神经保护性作用引导作者表明σ-1受体可用于治疗神经变性(参见第342页)。森达(Senda)等人，(1998)欧洲药理学杂志(European Journal of Pharmacology)，342：105-111另外报导，在经培养大鼠视网膜神经元中AGY-94806被发现具有针对谷氨酸神经毒性的活性。作者表明σ-1受体激动剂可用于抵抗具有由于缺血导致的神经元细胞死亡的视网膜疾病，例如视网膜中央动脉阻塞和视网膜分支动脉阻塞、糖尿病、年龄相关性黄斑变性、血红蛋白病和各种类型的青光眼。目前正在对AGY-94806实施关于抑郁治疗的临床研发，并且也已经注意到其在痴呆和药物依赖性治疗中具有潜在用途。

美国专利第5,665,725号揭示特定六氢吡啶衍生物，其为σ受体的配体。据说这些化合物可用于治疗焦虑症、精神病、癫痫、惊厥、运动失调、运动障碍、健忘症、脑血管疾病、阿兹海默型老年性痴呆和帕金森氏病。这些化合物之一，1′-[4-[1-(4-氟苯基)-1H-吲哚-3-基]-1-丁基]螺旋基[异苯并呋喃-1(3H)，4′-六氢吡啶]也被称为Lu28-179或西拉美新(siramesine)。其为选择性σ-2激动剂并且也表现针对σ1受体的活性(伯瑞戈雅德(PerregaardJ.)等人，(1995)医学化学杂志(J.Med.Chem.)，38：1998-2008)。国际专利申请公开号WO 99/24436另外揭示所述化合物的氢卤化物盐(尤其盐酸盐)具有良好的生物利用度。

因此，业内建议，在患有神经变性疾病的个体的治疗中，σ配体可用作神经保护药剂。

意外的是，现在发现在患有神经变性疾病的个体中，某些σ配体能促进功能恢复。因此，在神经元损伤后的神经变性疾病治疗中，σ配体可用作神经再生药剂。

发明内容

本发明提供治疗神经变性疾病的方法和组合物。本发明的σ受体配体可增强功能恢复和神经元再生。这些分子可单独递送或与其他药剂组合递送，并且可用作治疗神经变性疾病的神经元再生药剂，例如因缺血性中风或其他伤害神经元的损伤导致的神经变性疾病。

因此，本发明一方面是关于在有需要的个体中治疗或预防神经变性疾病的方法。所述方法包括向个体投与医药有效量的σ受体配体。

本发明由此提供在有需要的哺乳动物个体中治疗神经变性疾病的方法，以促进在神经变性疾病后使功能恢复的神经元再生，所述方法包括将医药有效量的σ受体配体投与个体。

另一方面，本发明提供σ配体在制造药物中的用途，在哺乳动物个体中所述药物可促进在神经变性疾病后导致功能恢复的神经元再生。

另一方面，本发明提供医药组合物，其包括治疗哺乳动物个体以促进在神经变性疾病后导致功能恢复的神经元再生的σ配体。

神经变性疾病可为缺血性中风、阿兹海默氏症、糖尿病性周围神经病变、癌症治疗诱导之神经病变、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化、外伤性脑损伤、脊髓损伤、亨廷顿氏病或帕金森氏病，但优选地为缺血性中风、外伤性脑损伤、或脊髓损伤。而且，本发明提供投与额外活性药剂的方法。可将包含医药上可接受赋形剂的医药组合物形式投与本发明配体。所述赋形剂可适用于经口投与。因此，所述组合物可呈片剂形式、胶囊形式或软胶囊形式。

或者，所述赋形剂可为适合静脉内、肌内、或皮下投与的液体。或者，所述赋形剂可适于经皮投与或经口腔投与。所述σ受体配体优选为1-(3，4-二甲氧基苯乙基)-4-(3-苯丙基)六氢吡嗪(AGY-94806)或其医药上可接受之盐或溶合物。

本发明提供用于患有中枢神经系统病症(例如中风、脊髓缺血、脊髓损伤和外伤性脑损伤)的患者康复的方法和组合物。本发明是基于下述发现：如果在中风后约48小时内以及在1到3个月期间投与患者，优选地在至多一年内投与，或更优选地连续投与，σ受体配体(优选为AGY-94806)可使患者从功能障碍状态恢复。所述配体可单独递送或与其他药剂组合递送。例如，可在治疗期间每天投与AGY-94806。

因此，本发明一方面是关于在个体中治疗中风的方法，其包括在中风发作后立即向个体投与医药有效量的σ受体配体以及在1到3个月期间投与所述配体。所述σ受体配体优选为1-(3，4-二甲氧基苯乙基)-4-(3-苯丙基)六氢吡嗪(AGY-94806)或其医药上可接受的盐或溶合物，例如HCl盐或AGY-94806的二盐酸盐。

本发明另一方面，在神经变性疾病后(尤其在缺血性中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤后)不少于24小时(例如不少于48小时、1周、1个月或3个月)开始向个体投与所述σ配体。从治疗开始，可重复投与所述σ配体，例如每天、在(例如)一周、两周、一个月、三个月、一年或更长的期间投与。例如，治疗可在缺血性中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤后至少24小时、或至少48小时、至少一周时开始，并且持续一个月、三个月、六个月或一年。

可在医师指导下对个体实施治疗。在治疗过程中，医师可评价个体的神经元再生的证据。证据可为功能恢复或脑或脊髓中结构改变的证据。因此，例如，医师可在治疗前或在治疗开始时立即测量个体的一或多种功能性反应，并且在治疗后再次测量。因此，可连续治疗直至获得神经元再生(或功能恢复)的证据。

如下文中更详细的描述，功能恢复的证据可为(例如)运动技能、认知技能、语言或感觉的知觉和功能的恢复。具体提及可为运动技能的恢复和认知技能的恢复。神经元再生的证据也可为大脑或脊髓中结构改变的证据。

本发明的另一方面，系为患者提供用于治疗神经变性疾病的包装试剂盒以促进神经元再生(或功能恢复)。所述试剂盒包括AGY-94806或其盐或溶合物的医药调配物、在储存期间和投与前贮存医药调配物的容器、和关于以有效治疗神经变性疾病以促进神经元再生(或功能恢复)的方式实施药物投与的说明书(例如在包装说明书或标签上的书面说明)。医药调配物可为本文所述的任一调配物，例如包含单位剂量σ受体配体的口服剂型，所述单位剂量是治疗疾病的治疗有效量。

参照下文具体说明，本发明所述和其他方面将显而易见。此外，本文所述的各参考文献更详细地阐述某些程序或组合物，其全部内容被本文列为参考。

附图说明

图1阐述在永久和瞬时MCA阻塞后以及在大脑外伤后，AGY-94806可在大脑损伤后增强功能恢复。在28天内每天用盐水(Vh)(n＝7)、0.3(n＝9)或1mg/kg s.c.(n＝10)治疗患有永久性阻塞的MCA的SHR大鼠，此治疗是在阻塞后2天开始的。(图1A)：各组间位于皮质区(左图，星号)的阻塞没有显著差异(右图)。(图1B和1C)：在MCA瞬时阻塞后于90分钟内通过足错误测试评价恢复。成绩表现为跨越水平悬挂的梯子时所得足错误次数(图1B)和所需时间(图1C)。在MCAO后恢复两天后开始用盐水(n＝13)、0.3(n＝15)或1.0mg/kg(n＝11)AGY94806s.c.治疗，并在28天内连续每天治疗。值为平均值±SEM。统计学差异(^**和^*表示p<0.01和p<0.05，二因子ANOVA，之后实施包法隆尼测试(Bonferroni test))。用AGY 94806(1.0mg/kg)治疗改良了此测试中在所有测量时间点的成绩。(图1D和E)：在外伤性脑损伤后，AGY 94806可分别增强功能恢复(转杆)和复合神经得分。分别用1mg/kg s.c.AGY 94806(n＝10)或盐水(n＝9)治疗动物。中值表示为(圆点)，第25和第75百分点表示为(框)，并且最高和最低值表示为(条形)。(p<0.05，曼-惠特尼(Mann-Whitney))。

图2阐述AGY-94806可促进神经突生长和分支、以及树突棘头变形。在AGY94806存在下(AGY 94806)或不存在下(对照)用培养基倒平板后处理离散皮质神经元。(图2A)：皮质细胞的显微照片，所述皮质细胞是用针对以不具有或具有3μM AGY94806的培养基处理的神经元微管蛋白的抗体来染色。(图2B)：在培养和处理2和3天后，与对照培养物相比，3μM AGY 94806可显著促进神经突生长。数据是来自三个单独实验(包括在不同天数对4-8孔实施的实验)的平均值±SD(^**p<0.001，塔奇后测试(Tukey′s post test))。(图2C)：不论是在对照培养物中还是在经3μM AGY94806处理的培养物中，与用错义序列(scr)处理相比，在原代皮质神经元中用siRNA敲低Sig1R蛋白都可降低第2天的神经突生长。数据是平均值±SD(***表示p<0.001，司徒登氏t测试(Students t-test))。AGY 94806可改变树突棘头形态。插图：敲低Sig1R可降低西方点渍分析中的受体蛋白浓度(所显示三点中的一点)。(图2D)：不论是在对照培养物中还是在经3μM AGY-94806处理的培养物中，与用错义序列(scr)处理相比，在原代皮质神经元中用siRNA敲低Sig1R蛋白都可降低第2天的神经突生长。数据是平均值±SD(***表示p<0.001，司徒登氏t测试)。

图3阐述不同蛋白激酶抑制剂对神经突生长和对cJun磷酸化的效应。(A)：用3μM AGY 94806处理皮质神经元培养物，并且在平板接种时添加或不添加10μM Jun-激酶(INK)抑制剂SP600125、10μM p38抑制剂SB203580、10μM ERK抑制剂U0128和10μM PI-3激酶抑制剂LY294002。在处理第2天后评价神经突长度。数据是来自三至六个独立实验的4-8孔的平均值±SD。NS表示不显著并且**表示与经AGY 94806处理的对照组的差异显著(p<0.01单因子ANOVA，之后实施包法隆尼/杜恩(Dunn′s)测试)。(B)用3μM AGY-94806和以针对cJun和磷光体c-Jun(p-cJun)的抗体探测的细胞裂解物将皮质神经元培养物处理15分钟。显示代表性西方点渍分析。在原代皮质神经元中AGY-94806将c-jun磷酸化程度提高约两倍(P<0.05；非成对t测试)。

具体实施方式

I.定义

除非另有说明，否则本申请案(包括说明书和权利要求书)中所用下列术语都具有下文给出的定义。必须注意，除非上下文另外明确说明，否则说明书及随附权利要求书中所用的单数形式“一”和“所述”都包括复数个指示物。标准化学术语的定义可参见参考著作，包括凯利(Carey)和桑德伯格(Sundberg)(1992)“高等有机化学(Advanced Organic Chemistry)第三版”卷A和B，普雷纳姆出版社(Plenum Press)，纽约。除非另外指明，本发明的实施将采用所属领域的技术人员所精通的习用质谱分析方法、蛋白质化学方法、生物化学方法、重组DNA技术方法和药理学方法。

术语“激动剂”意指诸如化合物、药物、酶、活化剂或激素等分子，其可增强另一分子的活性或σ受体位点的活性。

术语“拮抗剂”意指诸如化合物、药物、酶、抑制剂、或激素等分子，其可降低或妨碍另一分子的作用或σ受体位点的活性。

术语“中风”广泛地指与可由任何原因引起的流向大脑的血流量减少相关的神经缺陷的发生。可能的原因包括(但不限于)血栓形成、出血和栓塞。大脑缺血性发作的最常见原因包括血栓、栓塞物、和全身性低血压。以下原因可造成其他损伤：高血压、高血压性脑血管疾病、动脉瘤破裂、血管瘤、血恶液质、心力衰竭、心动停止、心源性休克、败血症性休克、头部外伤、脊髓创伤、癫痫发作、肿瘤出血、或其他血液损失。

本文所用的“缺血性发作”意指可导致血液向组织供应不足的任一情况。当缺血伴随中风时，其可为整体性缺血或局灶性脑缺血，如下文所定义。更具体来说，术语“缺血性中风”是指程度有限并且是由血流堵塞引起的中风类型。术语“缺血性中风”包括心动停止后的大脑缺血、中风、和多发梗塞性痴呆，其包括由外科手术引起的中风。大脑缺血性发作是由流至大脑的血液供应不足引起的。同为中枢神经系统一部分的脊髓同样容易受由血流量减少引起的缺血的影响。

本文所用关于中枢神经系统的“局灶性缺血”意指由向大脑或脊髓供应血液的单一动脉堵塞引起的病况，其导致所述动脉所供应范围内的细胞损伤。

本文所用关于中枢神经系统的“整体性缺血”意指由流至全脑、前脑或脊髓的血流量的全面减少引起的病况，其在所有这些组织的选择性易损区中导致神经元死亡。每个所述病例的病理差别很大，其在临床上相关。局灶性缺血模型适用于患有局灶性大脑梗塞的患者，而整体性缺血模型与心动停止和其他全身性低血压的病因类似。

本文所用“神经保护药剂”意指可有效降低神经元细胞死亡的化合物，其包括抑制神经元损伤从损伤起始位点扩散的能力。

术语“微阵列”是指在基板上合成或连接或沉积的独特多核苷酸或寡核苷酸的阵列，所述基板为(例如)纸、尼龙或其他类型的膜、滤膜、芯片、载玻片、小珠或任何其他具有期望密度的适宜固体支持物。

术语“有效量”或“医药有效量”是指提供期望生物学结果的药剂的无毒但有效的量。所述结果可为降低和/或缓解疾病的体征、症状或病因，或生物系统的任何其他期望变化。例如，对于治疗应用，“有效量”是使神经变性疾病(例如由缺血性中风所引起的神经变性疾病)在临床上显著降低所需的包含本文所揭示σ受体配体的组合物的量。可由一个所属领域的技术人员使用常规实验来确定在任一个体病例中的适宜“有效”量。

本文所用术语“治疗”(“treat”或“treatment”)可互换使用并且意欲表示神经变性疾病发生的延缓和/或将发生或预期要发生的所述症状严重度的降低。所述术语另外包括改善已存在神经变性病症症状、预防其他症状、和改善或预防症状的潜在代谢性病因。

“医药上可接受”或“药理上可接受”意指材料在生物学上或其他方面不是不期望的，即可将材料投与个体而不会引起任何不期望生物学效应或以有害方式与包含其的组合物的任一组份交互作用。

“生理pH”或“生理上可接受范围内的pH”意指pH在约7.2至8.0(含)范围内，更通常在约7.2至7.6(含范围内。)

本文所用术语“个体”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括(但不限于)任何哺乳动物纲成员：人类、非人灵长类，例如黑猩猩和其他猿和猴类；农业动物，例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家畜，例如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如大鼠、小鼠和天竺鼠及诸如此类。非哺乳动物的实例包括(但不限于)鸟、鱼及诸如此类。所述术语并不表示具体年龄或性别。

术语化合物的“医药上可接受的盐”意指医药上可接受并且具有母体化合物的期望药理活性的盐。所述盐包括(例如)：

(1)酸加成盐，其是以无机酸形成的，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸和类似物；或是以有机酸形成的，例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲基二环-[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、4，4′-亚甲基双-(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸和类似物；

(2)当存于母体化合物中的酸性质子被金属离子(例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)取代时；或与有机碱配位时所形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺和类似物。可接受的无机碱包括氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钠和类似物。应理解所提及的医药上可接受的盐包括其溶剂加成形式或晶体形式，具体来说包括溶合物或多晶型体。溶合物包含化学计量量或非化学计量量的溶剂，并且经常在结晶过程中形成。当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇合物。多晶型体包括化合物的相同元素组合物的不同晶体堆积排列。多晶型体通常具有不同X射线衍射模式、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状、光学和电学特性、稳定性和溶解度。诸如重结晶溶剂、结晶速率、和储存温度等各种因素可使某单晶形占主导地位。

术语“可选”或“视需要”意指随后所述的事件或情况可能发生或可能不发生，而且说明书包括其中发生事件或情况的实例和其中不发生事件或情况的实例。例如，短语“视需要另一药物”意指可给予或不给予患者除σ受体配体外的另一药物。本文所用“另一药物”意指适用于投与哺乳动物(优选为人类)并诱导期望的局部或全身效应的任一化学材料或化合物。一般来说，其包括：减食欲剂；抗感染剂，例如抗生素和抗病毒剂，包括许多青霉素(penicillin)和头孢菌素(cephalosporin)；止痛剂和止痛剂组合物；抗心律不齐药；抗关节炎药；止喘药；抗胆碱能药；抗惊厥剂；抗糖尿病药；止泻药；抗蠕虫药；抗组胺剂；消炎药；抗偏头痛药制剂；止恶心药；抗瘤剂；抗帕金森病药；止痒剂；抗精神病药物；退热药；反义药物；镇痉剂；心血管制剂，包括钙通道阻断剂和β-封阻剂，例如吲哚洛尔(pindolol)；抗高血压药；中枢神经系统兴奋剂；咳嗽和感冒制剂，包括减充血剂；利尿剂；胃肠药，包括H₂受体拮抗剂；拟交感神经药；激素，例如雌二醇和其他类固醇，包括皮质类固醇；安眠药；免疫抑制剂；肌肉弛缓剂；抗副交感神经药；精神兴奋剂；镇静剂；镇定剂；血栓溶解剂；神经保护剂；自由基清除剂和血管舒张剂。

本文所用术语“功能性康复”意指物理治疗、职业疗法和诸如此类。预计药物治疗可在康复开始前或开始后开始，或与康复同时开始。

II.σ受体

使用丰富环境实验的微阵列分析鉴定σ受体。本发明另外提供鉴定化合物的方法，所述化合物在患有神经变性病症的个体中可调节σ受体的表达以治疗中枢神经系统病症以及刺激神经细胞存活和再生。本文鉴定并描述微阵列分析鉴定的基因，所述基因在皮质缺血后和缺血后环境丰富化大脑组织中的表达相对于其在正常或非丰富环境中的表达有所不同。

而且，本发明提供在上述基因表达中表现出变化的个体的治疗方法，其中治疗性干预可导致大脑中细胞发生和随后增强的功能恢复。发明者发现易损区的σ受体表达在标准条件下于中脑动脉阻塞(MCAO)后降低，并且在MCAO后当使个体暴露于丰富环境条件中时升高。在MCAO后于大脑耐受区也检测到升高。因此，对于患有局灶性或整体性大脑缺血的个体，在损伤后投与σ受体配体，并且持续充足时间以促进功能恢复。医药干预可导致加快功能恢复。

一方面，阵列或微阵列可用于获得目标基因表达。通常，将探针寡核苷酸固定在固体支持物上，然后在杂交条件下使其与包含经标记靶寡核苷酸接触以产生杂交模式。杂交后，分析荧光或放射性(例如用于原位杂交的³³P)测量以测定靶与探针的杂交程度。信息可用于确定基因功能、基因剪接、了解疾病的遗传基础、诊断疾病；用于显现和监测治疗药剂的活性、检测是否存在多晶型，以及诸如此类(海勒(Heller R.)等人，(1997)国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)，94：2150-55)。可从生物样品的RNA或DNA获得探针和靶寡核苷酸。寡核苷酸一般可为用通常得自天然存在的来源的RNA逆转录的DNA，其中RNA可为总RNA、聚A+mRNA、经扩增RNA和类似物。起始mRNA样品可得自生理来源，包括诸如酵母等单细胞生物；得自真核生物来源或多细胞生物，包括植物和动物，尤其是哺乳动物和得自哺乳动物的器官、组织和细胞，例如得自任何体液(例如血液、尿液、唾液、痰液、胃液等)、经培养细胞、活检样品或其他组织制剂。从细胞、组织、器官或完整生物体分离RNA的方法是所属领域的技术人员已知的，并且阐述于萨布鲁克(Sambrook)、福里茨(Fritsch)和马尼亚提斯(Maniatis)(1989)分子克隆(Molecular Cloning)：实验室指南(A Laboratory Manual)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))中。具体来说，将来自个体大脑(例如来自内侧区、脑喙区、额区、海马区和纹状体区)的RNA纯化并克隆用于微阵列实验中。

杂交模式可用于测定在与阵列接触以生成杂交模式的样品中，以及在自其获得经标记样品-核酸的生理来源中，关于核酸遗传状况的定量信息。数据特别以定量形式提供关于自其获得样品核酸的生理来源的信息，例如在作为生理来源的组织或细胞中所表达基因的类型，以及每种基因的表达程度。

人们发现经历MCAO然后暴露于丰富环境下的大鼠在纹状体和额皮质中表现第1类σ受体mRNA的上调并且在内侧皮质中表现受体的下调。额皮质与感觉-运动功能的控制有关。因此医药干预可在缺血后康复阶段发挥作用。因此，σ受体配体(例如σ受体激动剂)的投与可在中风后改良个体的功能恢复。而且，药物与环境因素(例如丰富环境)之间的交互作用可用于改良功能恢复。

不期望受限于理论，据信σ配体可通过模拟丰富或刺激环境的效应来促进神经元再生和功能恢复。

III.σ受体配体

σ受体配体可用于治疗神经变性疾病以及改良自神经变性疾病功能恢复的方法和组合物。

已知若干σ受体配体，经发现其可用于本发明方法中。例如，玛诺莱克D.T.(Manallack，D.T.)等人，(1987)欧洲药理学杂志，144：231-235揭示对σ结合位点具有亲和力的苯环利定化合物，并且显示可通过大型N-烷基取代基(例如苄基或苯乙基)来增强σ位点亲和力。拉根特B.L.(Largent，B.L.)等人，(1987)分子药理学(Mol.Pharmacol.)，32：772-784教示若干六氢吡啶和六氢吡嗪衍生物具有σ受体活性，并且表明包含更具亲脂性的取代基的化合物可获得对σ受体结合位点的更强亲和力。夏奇J.(Sharkey，J.)等人，(1988)，欧洲药理学杂志，149：171-174显示可卡因(cocaine)相关化合物具有σ受体结合活性。欧洲专利申请案第362,001号阐述α，α-二取代N-环烷基烷基胺对σ受体具有特异性亲和力，并且欧洲专利申请案第445,013号阐述N-环烷基烷基胺对σ受体具有特异性亲和力。在这两个欧洲专利申请案中所述的σ受体配体可用于治疗精神病和胃肠疾病。PCT公开案WO 91/03243包括1-环烷基六氢吡啶的阐述，其对σ受体具有拮抗剂活性并且其可用于治疗精神病和运动障碍。PCT公开案WO 93/09094包括衍生自烷基六氢吡啶或吡咯烷的醚的阐述，其为抗精神病药物。其他为σ受体配体的经取代六氢吡啶和六氢吡嗪揭示于PCT公开案WO 94/24116中。1，4-(二苯基烷基)六氢吡嗪衍生物的σ受体亲和力和其用于大脑功能障碍(例如痴呆、抑郁和精神分裂症)的用途阐述于美国专利第5,736,546号中。美国专利第6,087,346号揭示某些苯基烷基胺、氨基四氢萘、六氢吡嗪、六氢吡啶和相关化合物与σ受体结合，并且可用于治疗中枢神经系统病症、神经障碍、胃肠道病症、药物滥用、心绞痛(angina)、偏头痛、高血压和抑郁。其他σ受体配体包括BMY-14802卡拉美芬和氟哌啶醇，发现其具有针对NMDA诱导毒性和癫痫发作的体内保护效应(M.彭特寇沃等人，(1991)大脑研究简报，26：461-465)。其他σ受体配体包括(例如)3PP-HCl、氟哌啶醇、烯丙基-去甲美他佐辛(normetazocine)(也称为SKF 10047)、去甲美他佐辛、U-50488酒石酸盐、咳必清(carbetapentane)、环唑辛(cyclazocine)、苄哌酚醇(ifenprodil)、DTG(1，3-二-2-甲苯基胍)、L693，409、PTPP、4PPBP(4-苯基-1-(4-苯基丁基)六氢吡啶马来酸盐)、BD 1063、IPAB碘代苯甲酰胺、SM-21、BD1008。

IV.鉴定σ受体配体的方法

鉴定为σ受体配体的化合物的方法是业内已知的。一种用于鉴定为σ受体配体的化合物的方法涉及将细胞、组织或优选地细胞提取物或其它包含σ受体的制剂置于与受体活性相容的缓冲液中并与若干已知浓度的测试化合物接触，以及分析配体结合和/或受体活性。可以连续方式或以多级形式实施所述方法。如兰格F.(2003)，欧洲神经学杂志，18：2188-2196中所述，以已知特异性配体应用体外结合分析使得可测定对σ1或σ2受体的配体亲和力。可使用其他测定为σ受体配体的化合物的方法，基于本文揭示内容其对所属领域的技术人员是显而易见的。

σ配体优选为AGY-94806(下文的化合物IV)或其盐或溶合物。然而，所有下列化合物都是σ受体配体：

                 (I)氟伏沙明

            V)西拉美新

                   (VI)伊格美新

在另一方法中，基于上文所鉴定σ受体配体和已知配体或类似物的分子形状的结构研究的合理药物设计可用于鉴定其三维结构与σ受体活性位点的三维结构互补的化合物。可通过各种技术来确定这些化合物，包括分子力学计算、分子动力学计算、限制性分子动力学计算(其中通过NMR光谱来测定限制)、距离几何(其中通过NMR光谱来部分地测定距离矩阵)、x射线衍射、或中子衍射技术。对于所有这些技术，可在存在或不存在已知可与σ受体交互作用的任何配体的情况下测定结构。

继而可针对其治疗和/或预防神经变性疾病的能力来测试由此鉴定或设计的σ受体配体。在一方法中，针对其调节σ受体(例如σ-1(登录号NM_005866、NM_147157、NM_147158、NM_147159和NM147160)、σ-2或重组σ受体)的能力来测试化合物。在这些筛选期间所鉴定的先导化合物可用作合成更多活性类似物的基础。可将由此生成的先导化合物和/或活性类似物调配为在治疗诸如中风、癫痫和神经变性病症等神经障碍中有效的医药组合物。

V.σ受体配体的合成

某些σ受体配体可在市场上购得。制备多种配体的方法阐述于专利和科学文献中，例如氟伏沙明(fluvoxamine)(美国专利第4,085,225号)、4-IBP(约翰(John)等人(1999)，核医学和核生物学(Nuclear Medicine & Biology)26：377-382)、Pre-084(美国专利第5,223,530号)、AGY-94806(美国专利第5,736,546号)、西拉美新(美国专利第5,665,725号)、OPC-14523(美国专利第5,556,857号)、BD-737(美国专利第5,130,330号和美国专利第5,739,158号)、伊格美新(Igmesine)美国专利第5,034,419号)。

VI.神经元再生和功能恢复

本发明一方面提供治疗个体的方法，其中在中风后投与σ受体配体I-IX或其盐或溶合物并且持续治疗所需的充足时间，例如约1周至约1个月或至约12个月，或连续投与直至观察到期望治疗效应。优选地，σ受体配体是AGY-94806或其盐或溶合物。在本发明另一方面中提供治疗个体的方法，其中在中风后投与σ受体配体AGY-94806或其盐或溶合物并且持续治疗所需的充足时间，例如约1周至约1个月或至约12个月，或连续投与直至观察到期望治疗效应，并且其中也使个体暴露于丰富刺激环境(例如丰富环境)和功能性康复中，以改良患者从中枢神经系统损伤的有害结果中功能恢复。

当神经组织受损区的功能由先前通常对所述具体功能没有影响的其他区域接收时发生功能恢复，并且神经功能的变化导致行为或行为能力的变化。功能恢复也称作神经可塑性。因此大脑功能恢复是指功能和结构重组、对事件的神经反应的上调或下调、以及通过侧支出芽和补偿性突触发生和神经发生的方式达成的新功能和结构连接的建立。

可评价患者功能恢复的改良，例如通过使用功能/行为测试来评价患者运动技能的感觉运动功能和反射功能(例如姿势、平衡、抓握、或步态)、认知技能、语言和/或感觉知觉和功能(包括视觉能力、味觉、嗅觉和本体感受)由投与本发明σ受体配体引起的改良。另一方面，可通过组织学分析来测定患者的功能恢复，其包括测定轴突束的长度、损伤位点神经元再生程度的提高，评估树枝状形态和树突棘数，和诸如此类。另一方面，可通过使用非侵入性技术测定患者功能恢复的改良，其测定大脑中导致神经功能变化的结构改变。因此，可使用以下测量方法来测量患者的功能恢复：电生理学测量(脑电描记器(EEG)或诱发反应电位(ERP))、肌电描记测量(EMG)、神经化学物质测量(CSF代谢产物)、外周测量(循环β-内啡肽浓度)、放射性测量(CT扫描，MRI)和临床测量(瞳孔光反射、姿势、味觉)。此外，上述技术可用于选择可能会对本发明治疗有成功反应的患者。

投与σ受体配体AGY-94806以模拟丰富或刺激环境的效应。已知使大鼠在缺血后居住在丰富或刺激环境中可改良其大脑缺血后的功能结果。在实验性脑梗塞后，居住在具有与其他大鼠进行各种活动和交互作用的机会的丰富环境中的大鼠比居住在标准实验室环境中的大鼠表现更好。在不改变梗塞体积的情况下，容许自由身体活动以及社会交互作用的丰富环境获得最佳表现。在局灶性脑缺血后丰富环境可刺激增强大脑可塑性的机制。已显示使大鼠居住于刺激环境中可显著增加梗塞和受损大脑中皮质浅层树突棘的密度。

本发明一方面刺激环境包括社会交互作用、运动活动、大脑的电刺激、居住地改变、和诸如此类。例如，可鼓励个体使用受损肢臂以改良感觉运动功能；可对个体实施每天的身体程序，例如步行、伸展、举重和诸如此类；或鼓励个体玩游戏，例如篮球、曲棍球、足球或桌面游戏。此外，可改变个体住所以刺激大脑活动，例如可通过改变房间颜色、提供纹理化材料、提供由不同材料制造的物品(例如木材、钢和诸如此类)来达成。为具体患者定制刺激环境的知识是物理疗法和职业疗法领域工作人员已知的。

在另一方面，刺激环境包括对大脑或大脑区域的直接刺激。例如，如美国专利第6,339,725号和第5,611,350号所述，可将电脉冲施加至大脑，并且可施用业内已知的其他方法。或者，可通过局部投与药物刺激大脑或大脑区域，例如乙酰胆碱、神经生长因子，例如神经刺激剂、神经元或神经胶质生长因子和其他神经元调节药物。

所属领域的技术人员可了解，投与包含σ配体的剂量的时限可改变。本发明一方面在中风后投与σ受体配体。可在症状开始一周内、优选在症状开始至少24小时内、或至少48小时内起始配体的投与。本发明另一方面在使患者暴露于刺激环境的同时将σ受体配体投与患者。优选地，在中风后当将患者置于刺激环境中时投与σ受体配体，并且在约1个月至约3个月内投与配体以促进功能恢复。优选地，在至多约12个月或更长时间内投与配体或包含配体的组合物，或甚至更优选地将其连续投与。

VII.医药调配物和投与模式

本文所述方法使用医药组合物，其包含上述分子和一或多种医药上可接受的赋形剂或媒剂，以及(视需要)其他治疗性和/或预防性成份，其中所述分子优选为AGY-94806。所述赋形剂包括液体，例如水、盐水、甘油、聚乙烯二醇、玻璃酸、乙醇等。用于非液体调配物的适宜赋形剂也是所属领域的技术人员已知的。医药上可接受的盐可用于本发明组合物中并且包括(例如)无机酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐和类似物；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐和类似物。关于医药上可接受的赋形剂和盐的全面论述可参见雷明顿氏药学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(Pennsylvania)：麦克出版公司(Mack Publishing Company)，1990)。

此外，辅助物质(例如润湿剂或乳化剂，生物缓冲物质、表面活性剂和类似物)可存于所述媒剂中。生物缓冲液实际上可为药理上可接受并且可提供具有期望pH(即在生理上可接受范围内的pH)的调配物的任何溶液。缓冲溶液的实例包括盐水、磷酸缓冲盐水、Tris缓冲盐水、Hank′s缓冲盐水和类似物。

根据既定投与模式，医药组合物可呈固体、半固体或液体剂型形式，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉剂、液体、悬浮液、乳剂、软膏剂、洗剂或类似物，优选地呈适合单次投与精确剂量的单位剂型。组合物可包括与医药上可接受载剂组合的有效量的所选药物，并且另外可包括其他医药药剂、佐剂、稀释剂、缓冲液等。

本发明包括医药组合物，其包含本发明化合物，包括其同分异构体、同分异构体的消旋或非消旋混合物、或医药上可接受的盐或溶合物，以及一或多种医药上可接受的载剂，和(视需要)其他治疗性和/或预防性成份。

一般来说，可通过任一被接受的投与模式以治疗有效量投与本发明化合物。适宜剂量范围取决于多种因素，例如待治疗疾病的严重度、个体的年龄和相关健康状况、所用化合物的效能、投与途径和形式、投与所针对的适应症、和有关从业医师的偏好和经验。对于给定疾病来说，熟习治疗所述疾病的技术的人员无需进行过多实验，仅根据个人知识和本申请案的揭示内容就可确定本发明化合物的治疗有效量。

一般来说，可以医药调配物形式投与本发明化合物，所述医药调配物包括适合口服(包括经口腔和舌下)、经直肠、经鼻、局部、经肺、经阴道或非经肠(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮下和静脉内)投与的调配物或呈适合通过吸入或吹入投与的形式。优选投与方式是使用可根据患病程度调节的适宜日剂量的静脉内或口服方式。

对于固体组合物，习用无毒固体载剂包括(例如)医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似物。可通过(例如)以下方式制备医药上可投与的液体组合物：使本文所述活性化合物和可选医药佐剂溶解或分散(等)于赋形剂(例如水、盐水、水性右旋糖、甘油、乙醇和类似物)中以由此形成溶液或悬浮液。如果需要，待投与医药组合物也可包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和类似物，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸盐等。对于所属领域的技术人员制备所述剂型的实际方法是已知的或可显而易见；例如参见上文所引用的雷明顿氏药学。

对于口服投与，一般组合物可采用片剂、胶囊、软胶囊形式或可为水性或非水性溶液、悬浮液或糖浆剂。片剂和胶囊是优选的口服投与形式。用于口服应用的片剂和胶囊一般可包括一或多种常用载剂，例如乳糖和玉米淀粉。通常也可加入润滑剂，例如硬脂酸镁。通常本发明化合物可与口服、无毒、医药上可接受的惰性载剂组合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇和类似物。此外，当期望或需要时，也可将适宜结合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂纳入混合物中。适宜结合剂包括淀粉、明胶、天然糖类例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶(例如阿拉伯胶、磺蓍胶、或藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡和诸如此类。所述剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠和类似物。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶和类似物。

因此，例如，可通过习用程序制备胶囊以使剂量单位为100mg本发明化合物、100mg纤维素和10mg硬脂酸镁。大量胶囊单位也可通过用100mg粉末状活性成份、150mg乳糖、50mg纤维素和10mg硬脂酸镁填充标准两片式硬明胶胶囊来制备。或者，可通过习用程序制备片剂以使剂量单位为100mg本发明化合物、150mg乳糖、50mg纤维素和10mg硬脂酸镁。也可通过习用程序制备大量片剂以使剂量单位为100mg本发明化合物，并且其他成份可为0.2mg二氧化硅胶体、5mg硬脂酸镁、250mg微晶纤维素、10mg淀粉和100mg乳糖。可施加适宜包衣以增强适口性或延迟吸收。

当使用液体悬浮液时，活性药剂可与任何口服、无毒、医药上可接受的惰性载剂(例如乙醇、甘油、水和类似物)组合并且与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可添加矫味剂、着色剂和/或甜味剂。其他可纳入本文口服调配物的可选组份包括(但不限于)防腐剂、悬浮剂、增稠剂和类似物。

可以习用形式制备非经肠调配物，可为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、或乳液形式。优选地，根据业内已知技术使用适宜载剂、分散或润湿剂和悬浮剂调配调配无菌可注射悬浮液。无菌可注射调配物也可为存于无毒非经肠可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受媒剂和溶剂包括水、林格氏(Ringer′s)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌不挥发油、脂肪酸酯或多元醇作为溶剂或悬浮介质。此外，非经肠投与可涉及缓慢释放或持续释放系统的使用以维持恒定剂量水平。

非经肠投与包括关节内、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径，并且包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使调配物与既定接受者的血液等渗的溶质，以及水性及非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。通过某些非经肠途径投与可涉及通过由无菌唧筒或某些其他机械装置(例如连续输注系统)推进的针或导管将本发明调配物引入患者身体中。可使用唧筒、注射器、泵或任何业内公认可用于非经肠投与的其他装置投与本发明所提供的调配物。

优选地，根据业内已知技术使用适宜载剂、分散或润湿剂和悬浮剂调配无菌可注射悬浮液。无菌可注射调配物也可为存于无毒非经肠可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受的媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常使用无菌不挥发油、脂肪酸酯或多元醇作为溶剂或悬浮介质。此外，非经肠投与可涉及缓慢释放或持续释放系统的使用以维持恒定剂量水平。

用于非经肠投与的本发明制剂包括无菌水性或非水溶液、悬浮液或乳液。非水性溶剂或媒剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射有机酯(例如油酸乙酯)。所述剂型也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。其可通过(例如)以下来灭菌：通过细菌阻留过滤器过滤，将灭菌剂纳入组合物中，辐照组合物，或加热组合物。其也可在即将使用前用无菌水或某些其他无菌可注射介质来制造。

调配物视需要可包含等渗剂。调配物优选地包含等渗剂，并且甘油是最优选的等渗剂。当使用甘油时，其浓度在业内已知范围内，例如约1mg/mL至约20mg/mL。

非经肠调配物的pH可通过缓冲剂来控制，例如磷酸盐、乙酸盐、TRIS或L-精氨酸。缓冲剂的浓度优选地足以在储存期间提供pH缓冲以将pH维持在目标pH±0.2pH单位。在室温下测量时，优选pH为约7至约8。

视需要可将其他添加剂添加至调配物中，例如医药上可接受的增溶剂，如吐温(Tween)20

(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、吐温40

(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕榈酸酯)、吐温80

(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单油酸酯)、普流尼克(Pluronic)F68

(聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)、和PEG(聚乙二醇)，并且如果调配物将接触塑料材料所述添加剂可能是有用的。此外，非经肠调配物可包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞和类似物。

无菌可注射溶液可通过将所需量的一或多种本发明化合物纳入具有各种上文所列举其他成份的适宜溶剂中且需要时随后进行过滤灭菌来制备。一般来说，分散液是通过将各种经灭菌活性成份纳入含有基本分散介质和来自上文所列举成份的所需其它成份的无菌媒剂中而制备。对于使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情况，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其可产生由活性成份加上任何所需附加成份(来自先前经无菌过滤的所述成份的溶液)构成的粉末。因此，例如，适用于注射投与的非经肠组合物是通过在10体积％丙二醇和水中搅拌1.5重量％活性成份来制备。用氯化钠使溶液等渗并将其灭菌。

或者，可以用于直肠投与的栓剂形式投与本发明医药组合物。所述组合物可通过将药剂与适宜非刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，并且因此可在直肠中熔化而释放药物。所述材料包括可可油、蜂蜡和聚乙二醇。

也可通过经鼻气溶胶或吸入剂投与本发明医药组合物。可根据医药调配领域熟知的技术来制备所述组合物，并且可以盐水溶液形式来制备，其使用苯甲醇或其他适宜防腐剂、吸收促进剂(以增强生物利用度)、推进剂(例如碳氟化合物或氮)和/或其他习用增溶剂或分散剂。

用于局部药物递送的优选调配物是软膏剂和乳剂。软膏剂是半固体制剂，其通常以凡士林或其他石油衍生物为基础。如业内已知，包含所选活性药剂的乳剂是粘稠液体或半固体乳液，如水包油或油包水。乳剂基础是水可洗的并且包含油相、乳化剂和水相。有时油相也称为“内”相，其一般包括凡士林和脂肪醇，例如鲸蜡基或硬酯酰醇；尽管不是必然的，但水相通常在体积上超过油相，并且一般包含保湿剂。乳剂调配物中的乳化剂一般是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。正如所属领域的技术人员可了解的，所用具体软膏剂或乳剂的基础是可提供最适药物递送的基础。对于其他载剂或媒剂，软膏剂基础应为惰性、稳定、非刺激性和非敏化性的。

用于经口腔投与的调配物包括片剂、锭剂、凝胶和类似物。或者，可使用所属领域的技术人员已知的经粘膜递送系统来实现经口腔投与。也可使用习用经皮药物递送系统(即经皮“贴剂”)通过皮肤或粘膜组织递送本发明化合物，其中药剂通常包含在用作药物递送装置的层状结构中以固定在身体表面。在此类结构中，药物组合物通常包含于在上衬片层之下的层或“储蓄层”中。层状装置可包含单一储蓄层，或其可包含多个储蓄层。在一实施例中，储蓄层包含医药上可接受接触型粘合材料的聚合基质，其用于在药物递送期间将系统固定在皮肤上。适宜皮肤接触型粘合材料的实例包括(但不限于)聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯和类似物。或者，包含药物的储蓄层和皮肤接触型粘合剂以不相连的分离层形式存在，并且粘合剂在储蓄层之下，在此情况中，储蓄层可为如上所述的聚合基质，或其可为液体或凝胶储蓄层，或可采用某些其他形式。这些层状物中的衬片层可用作装置上表面，用作层状结构主要结构元件并且向装置提供其大量弹性。选择用于衬片层的材料应对活性药剂和存在的任何其他材料是非渗透性的。

可将医药有效量或治疗有效量的组合物递送至个体。精确有效量可随个体不同而变化，并且可取决于物种、年龄、个体体形和健康情况、所治疗病况的性质和程度、治疗医师的建议、和所选择投与的治疗方法或治疗方法的组合。因此，可通过常规实验来确定给定情况下的有效量。出于本发明目的，在至少一次剂量中，一般治疗量可在约0.01mg/kg至约40mg/kg体重范围内，更优选为0.1mg/kg至约10mg/kg。在大型哺乳动物中指定日剂量可为约1mg至300mg，每天投与一或多次，更优选在约10mg至200mg范围内。可向个体投与所需剂量以降低和/或缓解所述病症的体征、症状或病因，或引起生物系统的任何其他期望变化。

本发明化合物可经调配用于气溶胶投与，具体来说投与至呼吸道并且包括鼻内投与。化合物粒径一般较小，例如约5微米或更小。所述粒径可通过业内已知的方式(例如通过微粉化)获得。活性成份可与适宜推进剂(例如，含氯氟烃(CFC)(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)、二氧化碳或其它适宜气体)一起提供于加压包装件中。气溶胶也可方便地含有表面活性剂，例如卵磷脂。可通过计量阀控制药物剂量。或者，活性成份可以干燥粉末形式提供，例如化合物存于适宜粉末基础(例如，乳醣、淀粉、淀粉衍生物(例如羟基丙基甲基纤维素)和聚乙烯基吡咯烷(PVP))中的粉末混合物。粉末载剂可在鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以单位剂型存在，例如以(例如)明胶或泡壳包装的胶囊或药筒形式存在，藉助吸入器可自其投与粉末。

若需要，可使用适于持续或受控释放投与活性成份的肠包衣来制备调配物。

医药制剂优选为单位剂型。在所述形式中，可将制剂细分为包含适量活性组份的单位剂量。单位剂型可为经包装制剂，所述包装包含离散量的制剂，例如小包片剂、胶囊和小瓶或安瓿瓶中的粉末。同样，单位剂型可为胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂自身，或其可为适宜量的任何所述包装形式。

VIII.试剂盒

本发明另一方面涉及呈试剂盒形式的医药组合物。试剂盒包含含有组合物的容器构件，例如瓶、箔包、或其它类型容器。通常试剂盒另外包含投与组合物的说明书。

在另一方面，提供包装试剂盒，其包含待投与的医药调配物(即包含治疗神经变性疾病以促进神经元再生或功能恢复的σ受体配体的医药调配物)、在储存期间和使用前容纳调配物的容器(优选地经密封)、和以可有效治疗疾病的方式实施药物投与的说明书。说明书通常可为在包装说明书和/或标签上的书面说明。调配物可为本文所述任一适宜调配物。例如，调配物可为包含单位剂量σ受体配体的口服剂型。试剂盒可包含具有不同剂量的相同药剂的多种调配物。试剂盒也可包含具有不同活性药剂的多种调配物。

例如，非经肠投与的试剂盒可包含a)医药组合物，其包含上述AGY-94806和医药上可接受的载剂、媒剂或稀释剂；和(视需要)b)阐述使用治疗或预防疾病的医药组合物的方法的说明书。试剂盒可另外包括投与调配物的装置(例如唧筒、导管和类似物)。口服投与的试剂盒可包括容器(例如纸或纸板盒、玻璃或塑料瓶或罐、可重复密封的袋、或具有单独剂量的泡壳包装)内所包含的剂量调配物。泡壳包装通常由一片覆盖有优选透明塑性材料箔的相对坚硬的材料组成。在包装过程期间，在塑料箔中形成具有片剂或胶囊尺寸和形状的凹陷。之后，将锭剂或胶囊置于凹陷中并使相对坚硬的材料片在与凹陷形成方向相对的箔表面上紧贴塑性箔密封。由此，片剂或胶囊被单独密封。优选地，材料片的强度使得通过用手在凹陷上施加压力并借此在凹陷处的材料片上形成开口而可将片剂或胶囊从泡壳包装移出。然后可经由开口移出片剂或胶囊。

可期望在试剂盒上提供记忆辅助物，例如所述记忆辅助物可呈毗连片剂或胶囊的数字的形式，其中所述数字对应于应投与所规定剂型的治疗方案中的天数。此一记忆辅助物的另一实例是印刷于卡片上的日历，例如，遵循“第一周，星期一、星期二、...等...第二周，星期一、星期二、...等“的顺序等等。可容易地看出记忆辅助物的其他变化形式，例如机械计数器(其指示已施予日剂量数)、与液晶读数器偶联的微芯片记忆器、或可听信号提醒装置(其(例如)读出最后一次服用日剂量的日期和/或在下次该服用剂量时提醒人们)、和诸如此类。

实例

下文是实施本发明的具体实施例的实例。仅出于说明目的提供实例，而不欲以任何形式限制本发明的范围。尽管已努力确保所用数字(例如数量、温度等)的精确性，但当然应容许某些实验性误差和偏差。

在蔡司(Zeiss)LSM5 10麦塔(Meta)或帕斯卡(Pascal)5系统上使用488和543激光以每个通道具有四次叠加的多通道模式生成共焦图像。用63X物镜生成Z-堆叠，将光学薄片设定为0.8微米且步长为0.5微米。

实例1

神经元再生(功能恢复)的动物模型

将雄性3月龄SHR(自发性高血压)大鼠用于通过MCA阻塞诱导中风。因为大多数中风患者也患有高血压，所以这种大鼠是优选品系。用美索比妥(Methohexital)将动物麻醉并且在颧弓上实施小型颅骨切除术以暴露中脑动脉，在纹状体起点的远端用10-0单丝尼龙线将其阻塞。未对大鼠实施插管治疗并且未插入导管。在MCA阻塞后形成大型可重现梗塞，其导致健康感觉运动缺陷。将动物保持在6hr光/18h暗循环中，并且其可自由获得食物和水。在MCAO后第二天，在2-8周内用化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX(0.03-10mg/kg)s.c.或p.o.治疗大鼠，并且给予对照组盐水。在第2、4、6和8周时在转杆或圆筒测试中测试动物。

转杆：此测试可通过大鼠横越转杆的能力快速评价运动动作的协调性和整体性，如先前文献中所述(约翰逊(Johansson)和欧森(Ohlsson)(1995)，中风(Stroke)，26：644-649)。杆长1500mm，将其升高至地面上750mm处并且以10rpm分别向右或向左旋转。

对每个方向给予6-0的分值：

6，动物跨越杆，没有脚步滑脱；

5，动物跨越杆，少数脚步滑脱；

4，动物跨越杆，50％的脚步滑脱；

3，动物跨越杆，50％以上的脚步滑脱；

2，动物走了一小段，然后绕着杆旋转；

1，动物没有跨越杆，绕着杆旋转；

0，动物从杆上掉落。

用于在自发站立中测试前肢使用的不对称应用的圆筒测试

使用圆筒测试(斯嘉丽(Schallert)和蒂勒森(Tillerson)，CNS疾病的创新模型：从分子到治疗。(Innovative models of CNS disease：from molecule to therapy.)克里夫顿(Clifton)、NJ、胡马纳(Humana)、1999的修改形式)来量化在圆筒壁上站立的前肢使用。当大鼠在20cm宽的干净玻璃圆筒中自由移动时对其实施监测。当大鼠站立时由不知情观察者对每个前爪与圆筒壁的接触评分。对每只动物总共记录20次接触，并且以总接触数百分比计算受损前肢(左)、两个前肢和未受损前肢的接触数。通过在MCAO前测量每个前爪所做的接触来获得大鼠的基线。

当使用转杆测试或圆筒测试时，给予化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX的动物组比第1组对照动物表现更好。因此，当投与σ受体配体时，患有中枢神经系统病症的动物显示增强的功能恢复。

实例2

AGY-94806增强功能恢复

AGY-94806(也称为SA4503)，即1-(3，4-二甲氧基苯乙基)-4-(3-苯丙基)-六氢吡嗪二盐酸盐是具有有效脑吸收的水溶性选择性σ-1受体激动剂。在两种实验性中风模型中研究化合物对运动功能恢复的效应。在第一种模型中，对自发性高血压大鼠实施pMCAO，其导致大型皮质梗塞和严重运动缺陷(图1A)。

在用AGY-94806治疗的大鼠中神经元再生的证据

使35只自发性高血压大鼠暴露于永久性中脑动脉阻塞(MCAO)，然后将其分至三个治疗组中。在阻塞后两天时开始以0.3mg/kg(12只大鼠)或1.0mg/kg(12只大鼠)的剂量s.c.投与AGY-94806并且连续每天投与直至阻塞后28天时。在对照组(11只大鼠)中，仅投与媒剂。在治疗开始时，以及在测試期间的若干时间点，针对大鼠在转杆模型中的表现评价大鼠。此模型阐述于实例1中。其需要大鼠跨越水平悬挂的1m长的转杆。此任务测量动物的感觉运动表现。使用摄像机记录动物的行为并且之后由经训练技术人员对其分析并评分。评分范围是从0到6，其中0表示极差表现而6反映健康动物的表现(无MCAO)。结果示于表1中。

表1.

 

剂量	在第30天得分的平均增加(SEM)
		媒剂	1.8(SEM0.5)(p<0.05)
0.3mg/kg	3.5(SEM0.4)(p<0.05)
		1.0mg/kg	3.67(SEM0.48)(p<0.05)

用0.3mg/kg AGY-94806治疗的组在第30天显示为5.2的总平均分，其接近健康动物的预期值。

因此，此测试显示，当在中风后2天直至中风后28天的28天内每天投与缺血性中风模型中的大鼠时，σ-1选择性激动剂AGY-94806可促进功能恢复，尤其促进运动技能的恢复。梗塞大小未受影响，并且在媒剂组、0.3和1.0mg/kg AGY-94806治疗组中其经测量分别为完整同侧半球的24、23和25.5％(图1A)。

在模拟再灌注损伤的另一实验性中风模型中，施用90min的tMCAO，并且在tMCAO后第2-28天期间使用足错误测试测试大鼠的运动功能(图1B、1C)。在tMCAO后两天用AGY-94806治疗动物。在测试期间经假手术的动物出现少量错误，并且在2-3秒内快速跨越网格。在tMCAO后，足错误次数和跨越网格的时间增加显示严重运动缺陷。在所研究的所有恢复时间，与经媒剂治疗的大鼠相比，在经AGY-94806(1mg/kg)治疗的动物中足错误次数显著较低(p<0.01；二因子ANOVA，之后实施包法隆尼测试)(图1D)。同样，在所研究所有时间点，与经媒剂治疗的大鼠相比，经AGY-94806(1mg/kg)治疗的动物以约两倍速度跨越网格(图1C)。在经媒剂治疗的动物中穿越时间为20±4，并且在经AGY-94806治疗的大鼠中为10±3(p<0.05；二因子ANOVA，之后实施包法隆尼测试)。

在由液压冲击引发的实验性外伤性脑损伤(TBI)(其导致皮质和皮质下组织损伤和运动功能障碍)中测试AGY-94806的用途。在冲击后2天用1mg/kg AGY-94806s.c.治疗经历TBI的威斯塔(Wistar)大鼠，之后在三周内每天治疗并在第14和21天测试感觉运动功能。经AGY-94806治疗的动物中值功能得分为4.5，在正常范围内，而经媒剂治疗组得分显著较低，在恢复的第14和21天分别为3和2(p<0.05，曼-惠特尼)(图1D)。在经媒剂治疗的动物中合成得分也从中值18显著提高至中值21.5，最高分为24(图1E)。

总之，这些数据显示在三种不同实验性脑损伤模型中，当在损伤后两天开始治疗并持续2到4周时，用σ-1受体配体AGY-94806治疗可显著改良感觉运动功能。

实例3

在经AGY-94806治疗的大鼠中神经元再生的其他证据

圆筒测试

使43只自發性高血壓大鼠暴露于永久性中腦勤胍阻塞(MCAO)，然後將其分至三個治療組中。在阻塞后两天时开始以0.1mg/kg(14只大鼠)或0.3mg/kg(14只大鼠)的剂量p.o.投与AGY-94806并且连续每天投与14天。在对照组(15只大鼠)中，仅投与媒剂。在治疗开始时，以及在测试期间的若干时间点，针对大鼠在圆筒测试中的表现评价大鼠。此测试阐述于实例1中。其测量动物的感觉运动表现。在永久性MCAO前一天评价大鼠在测试中的表现，然后在永久性MCAO后第14天、第28天和第59天评价。当大鼠在20cm宽的干净玻璃圆筒中自由移动时对其实施监测。当大鼠站立时由不知情观察者对每个前爪与圆筒壁的接触记分。对每只动物总共记录20次接触，并且以总接触数百分比计算受损前肢(左)、两只前肢和未受损前肢的接触数。结果示于表2中。

表2

永久性MCAO的后果是爪使用的不对称性(左/右爪的％差异)。动物在MCAO之前不显示任何不对称行为。经媒剂治疗的动物在整个观察期间保持不对称性。在所测量的所有时间点，经0.3mg/kg AGY-94806治疗的动物其爪使用的不对称性都降低至MCAO之前的水平。

因此，此测试显示，当从中风后第2天开始在14天内每天投与缺血性中风模型中的大鼠时，σ-1选择性激动剂AGY-94806可促进功能恢复，尤其可促进运动技能的恢复。

实例4

σ-1受体活化增强神经突生长并改变树突棘形态

中风后感觉运动功能的改良取决于存活组织中可塑性的增强。在用AGY-94806治疗后分别在体外测定皮质和海马神经元中的神经突生长和树枝状形态。

神经突生长.制备原代神经元培养物并以0.8 X 10⁴细胞/孔的密度将其平板接种于96孔板中包含B27的神经基础培养基中，且使其在5％ CO₂中达到37℃并保持三小时。通过在期望培养时间内使神经元与不同浓度的AGY-94806一起培养诱导神经突生长。在实验最后将神经元培养物固定并染色并且使用光学成像系统(阵列扫描HCS系统)量化神经突形成。使用赫斯特(Hoechst)33342鉴定群中的所有细胞并且通过间接免疫荧光法使用针对微管蛋白的神经元形式的初级抗体和与荧光团阿莱克撒(Alexa)荧光素588偶合的二级抗体标记神经元，获得发出绿色荧光的细胞体并导致神经炎。然后使用图像分析算法(神经突生长生物应用；阵列扫描HCS系统)量化神经突生长。

原代海马培养物制备.制备海马原代培养物并且将20细胞/mm²平板接种于经聚溶素涂布的盖玻片上并且使其在神经基础培养基A(补加B27 0.5mML-谷氨酰胺和100U青霉素/streptravicin/ml、20mmol/L HEPES和10ng/ml FGF2和5μM阿糖胞苷，英杰(Invitrogen)，卡尔斯贝(Carlsbad)，CA，美国)中生长。在实验前使培养物在体外生长7-10天。将培养物置于来自华纳(Warner)仪器公司(哈姆登(Hamden)，CT，美国)的温度受控灌注系统中后，在原代细胞培养物中根据吉赛尔森(Gisselsson)等人，2005实施IVI。使用灌注泵MS-Reglo(艾斯玛提克(Ismatec)SA，格莱特布鲁格(Glattbrugg)，瑞士)以260μl/min的灌注速率将生长培养基变为缺氧iCSF灌注培养基。使用克拉克(Clark)电极(康索尔特(Consort)z921，杜荷特(Tumhout)，比利时)监测灌注培养基的氧浓度。用碘化丙啶(PI)(10μg/ml)评价细胞死亡的评估。

延时显微术和树突棘分类.使用延时成像检验树突形态中的变化。使用来自软件成像系统SIS(安诺来西斯奥林巴斯(AnalySIS Olympus)公司，德国)的软件实施获取和分析，其控制安装在奥林巴斯IX-81荧光显微镜上的冷却式数码相机(前取景器(Fview))。使用专用GFP滤光片和中型滤光片(克鲁玛(Chroma)技术公司，罗肯汉姆(Rockingham)，美国)来使光毒性最小化并漂白。

用通过电穿孔(核转染技术(Nucleofector technology)，安玛科萨(Amaxa))转染至原代皮质神经元中的siRNA寡核苷酸敲低σ-1受体表达。使新分裂的原代皮质神经元(4.8 X 10⁶细胞)再悬浮于核转染缓冲液中。添加σ-1受体特异性(GGCUUGAGCUCACCACCUA)或错义(UAGCGACUAAACACAUC AAUU)siRNA寡核苷酸并且使用核因子程序G-13对再悬浮的神经元实施电穿孔。为测量在σ1受体敲低背景下由AGY-94806诱导的神经突生长，添加化合物以获得3μM的终浓度并在所述化合物存在下将细胞培养三天。对于受体敲低程度的评价，使细胞溶解于100μl溶解缓冲液中，对其实施超声处理并在4-20％Tris甘氨酸凝胶上运行。通过西方点渍分析使用可识别肽“EVYYPGETWHGPGEATDV”的选择性多克隆抗体来检测σ1受体蛋白浓度，所述肽涵盖大鼠σ1受体序列中的氨基酸144-162。

在用3μM AGY-94806处理皮质神经元的第2和3天，3μM AGY-94806将平均神经突长度显著增加(图2A)2倍以上(p<0.01；塔奇测试)(图2B)。在培养物中海马神经元的神经突的生长和分支也可通过1μM AGY-94806来增强(数据未显示)。与错义si-RNA序列(si(scr))相比，用σ-1受体(si(Sig1R))处理可显著降低σ-1受体蛋白浓度(图2C，插图)。在经媒剂体外处理以及经AGY-94806(3μM)体外处理的第2天培养物中，与si(scr)相比，在用si(Sig1R)敲低原代皮质神经元中的σ-1受体mRNA导致神经突生长显著降低(图2C)。此外，si(Sig1R)消除AGY-94806对神经突生长的刺激效应(图2D)。

因此，通过刺激σ-1受体，AGY-94806可增强神经突生长和分支并诱发培养物中皮质和海马神经元的树突棘形态中的可塑性。

实例5

基因表达研究

在隆德大学(Lund University)的已批准所述实验方案。2个月前自摩利嘉德(Mollegard)饲养中心(伊拜(Ejby)，丹麦)获得的六个月大的雄性SHR(自发性高血压大鼠)在手术前居住在标准笼子(550 x 350 x 200mm，每笼3至4只大鼠)里，用50mg/kg甲己炔巴比妥钠(Brietal，37℃)以腹膜内方式将其麻醉。经由小型颅骨切除术到达右侧MCA，并且将纹状体远端动脉结扎，其导致新皮质梗塞。平均手术时间约为20分钟并且使体温维持在接近37℃。手术后，使大鼠在单独笼中保持24小时。使经历MCA阻塞(MCAO)的大鼠返回标准环境(SE)，或将其置于大型、垂直、丰富环境(EE)笼(815 x 610 x 1,280mm)中，所述笼子装配有水平和垂直板、链、秋千、木块、和具有不同大小与材料的物体。板与可移动物体间的距离每周改变两次。对假手术组实施不具有MCAO的假手术并且将其置于标准环境中。在所有实验组中，选择恢复的第12和60天作为基因表达的终点分析。使用6个实验组实施研究，每组由6-8只动物组成。

在12和60天后将来自每个实验组的动物处死并且分离大脑内侧区、角吻区和额皮质区以及海马区和纹状体区的组织以供RNA纯化和靶制备。使由来自大鼠皮质cDNA文库的50,000个克隆组成的cDNA阵列与从对照标准MCAO和丰富环境动物获得的经标记靶核酸杂交。在所得基因发现阵列数据的生物信息学分析后选择约3400个经上调的基因。通过每个各自阵列滤膜的中位空孔值对原始克隆数据标准化。然后将这些数值转化(log2+1)为近似正态性。然后汇集所有复制体以供之后的统计分析。对于各大脑区域(额、内侧、角吻、海马和纹状体)，通过主成份分析(PCA)来分析三种实验条件(丰富环境、中风和对照)的时间点。从数据组中移除无关数据点。然后实施关于在给定大脑区域内和时间点的实验条件间的克隆行为的ANOVA。针对p值小于0.05的克隆过滤ANOVA的结果。然后用塔奇HSD测试分析此经过滤ANOVA列表以确定克隆的表达模式。

选择是基于≥1.8倍的表达上调和<0.2的变异系数(cv)。挑出所选择克隆，通过PCR扩增，并且将其翻印在尼龙膜上用于表达谱阵列。用来自第12天与第60天恢复时间的不同皮质和皮质下区域的探针探测表达谱阵列。选择经上调的克隆用于进一步分析。

来自发现和表达谱阵列的数据的分析使得可鉴定缺血性中风的病理生理学中可能的机制路径和丰富环境后功能恢复的细胞内机制。此分析包括经调节克隆的主成份分析，以及具有相似表达谱的经调节基因的聚类。主成份分析获得各组基因簇之间的因果关系。选择可作为中枢神经系统(CNS)病症的潜在干预靶的经调节基因时可依据一系列标准，包括(但不限于)序列注解、表达谱、基因在CNS病症病理学中生物相关性机制路径内的地位、研发关于调节特异性基因的药物的技术可行性(即成药性)、在CNS或其他器官病理学中基因的已知生物学作用。

EE阵列数据的分析显示当将动物置于相对于标准环境的丰富环境中时，在纹状体和额皮质中，第1类σ受体mRNA被上调，而在内侧皮质中，第1类σ受体mRNA被下调。因此，通过使用丰富环境刺激大脑可在对控制感觉运动功能有重要作用的大脑区域中诱导第1类σ受体的表达。

实例6

σ-1受体活化神经元中的JNK和p38信号

以0.8 x 10⁴细胞的密度将原代神经元培养物平板接种于96板中的神经基础培养基中。将细胞与10μM选择性激酶抑制剂(JNK的SP600125、p38的SB203580、ERK的U0126和PI3激酶的LY294002，其都来自Tocris)一起预培养1小时，之后添加3μM AGY 94806或媒剂(0.03％ DMSO)。在培养两天后根据所述测定神经突生长。对于c-jun磷酸化研究，将原代皮质神经元平板接种并在培养3小时后用3μM AGY-94806处理。在AGY 94806投与后5、15和30分钟时测量对c-jun磷酸化的效应。在冰上收集细胞并将其溶解并且使其在4℃下于匀浆缓冲液中旋转，所述匀浆缓冲液是由以下组成的：10mM Tris、pH7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM NaF、20mM Na₄P₂O₇、2mM Na₃VO₄、1％ Triton X-100、10％甘油、0.1％SDS、0.5％脱氧胆酸盐1mM PMSF、和1:200的蛋白酶抑制剂混合液(σ第P2714号)。使用根据制造商建议各自以1:1000稀释的抗c-jun抗体(细胞信号第9162号)或抗磷酸化c-jun抗体(细胞信号第9261号)在包含20μg总蛋白/病况的样品中检测到c-jun和磷酸化c-jun二者。然后将细胞裂解物与以1:2000稀释的与辣根过氧化物酶偶合的山羊抗大鼠抗体一起培养。通过增强的化学发光使用ECL检测试剂盒(安玛西亚药业(Amersham-Pharmacia)第RPN2132号)使免疫反应性具体化。

与未经处理培养物相比，在对照培养物中，3μM AGY-94806将神经突长度增加2倍以上(p<0.01；包法隆尼/杜恩测试)(图3A)。与经AGY-94806处理的对照培养物相比，JNK抑制剂SP600125(10μM)和p38抑制剂SB203580(10μM)分别将神经突长度降低至62±1μm和63±9μM(降低约80％)。在这两个组中神经突生长程度与其各自的对照组没有显著差异。ERK抑制剂U0126(10μM)和PI3激酶抑制剂LY294002(10μM)没有影响。此外，AGY-94806将原代皮质神经元中的c-jun磷酸化程度提高约两倍(P<0.05；非成对t测试；图3B)。因此，在AGY-94806介导的神经突生长中，σ-1受体的活化位于JNK/p38活化的上游。

实例7

片剂的制备

使式IV化合物(10.0g)与乳糖(85.5g)、羟丙基纤维素HPC-SL(2.0g)、羟丙基纤维素L-HPC、LH-22(2.0g)和净化水(9.0g)混合，对所得混合物实施粒化、干燥和分级，并且使由此获得的颗粒与硬脂酸镁(0.5g)混合并对其实施片剂制备，由此获得包含10mg式IV化合物/片剂的片剂。

实例8

向个体投与

在0时刻向个体提供实例7中所制备的片剂。在一周时间内提供1片剂/24h。在投与第三次片剂后，使个体暴露于神经变性病症事件中。与未经治疗的个体相比，经治疗个体表现的神经障碍症状的严重性较低。

本申请案中所提及的所有出版的专利和公开案的全部内容都是以引用方式并入本文中。

尽管已阐释并描述了本发明的优选实施例，但应了解在不背离本发明精神和范围的条件下，可对其作出各种改变。

Claims (18)

1、一种活化JNK/p38路径的方法，所述方法包括使AGY-94806与细胞接触，其中JNK/p38路径被活化。

2、如权利要求1所述的方法，其中AGY-94806的浓度为约0.01μM至约100μM。

3、如权利要求2所述的方法，其中AGY-94806的浓度为约0.1μM至约10μM。

4、如权利要求1所述的方法，其中活化可促进神经突生长。

5、一种在神经变性疾病发病后治疗哺乳动物个体以促进神经元再生的方法，所述方法包括向所述个体投与医药有效量的AGY-94806或其盐或溶合物。

6、如权利要求5所述的方法，其另外包括针对神经元再生的证据评价所述个体。

7、如权利要求6所述的方法，其中所述神经元再生的证据是所述个体的功能恢复。

8、如权利要求7所述的方法，其中所述功能恢复是运动技能、认知技能、语言、感觉知觉或感觉功能的恢复。

9、如权利要求8所述的方法，其中所述功能恢复是运动技能的恢复。

10、如权利要求9所述的方法，其中所述功能恢复是认知技能的恢复。

11、如权利要求6所述的方法，其中所述神经元再生的证据是所述个体的大脑或脊髓的结构变化。

12、如权利要求6所述的方法，其中将AGY-94806重复投与所述个体直至发现神经元再生的证据。

13、如权利要求12所述的方法，其中每天投与AGY-94806。

14、如权利要求5所述的方法，其中所述神经变性疾病选自缺血性中风、外伤性脑损伤和脊髓损伤。

15、如权利要求14所述的方法，其中在所述缺血性中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤后至少24小时开始所述治疗。

16、如权利要求14所述的方法，其中在所述缺血性中风、外伤性脑损伤或脊髓损伤后至少48小时开始所述治疗。

17、如权利要求5所述的方法，其另外包括使所述个体暴露于刺激环境中。

18、如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物个体是人类。

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