CN101504413A - 一种鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片制备及定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鼠疫耶尔森菌蛋白质悬浮芯片的制备方法、检测方法及定量方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以鼠疫菌为代表的细菌抗原的开放性检测模式化平台。

Description

一种鼠疫耶尔森菌的蛋白质悬浮芯片制备及定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白质悬浮芯片的制备方法及其定量检测方法。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Y.pestis，简称鼠疫菌)是鼠疫的病原菌，为革兰氏阴性球杆菌、不运动、不形成芽孢，吉母萨、瑞特氏或威森染色呈双极浓染，能在4-40℃范围内生长，最适生长温度为28-30℃，最适生长pH值为7.2-7.6，pH的耐受上下极限分别为pH5.0和pH9.6。鼠疫菌主要宿主为啮齿动物，主要通过蚤的叮咬在动物间传播，也可传播到人，引起病人发烧、寒颤、头痛，有少数患者会由败血型鼠疫发展为肺鼠疫。

鼠疫在历史上曾经引起三次世界范围的大流行，使人类遭受了深重的灾难。2000年世界卫生组织(WHO)将鼠疫列为重新抬头的传染病。同时，鼠疫菌传染性强、发病迅速，是生物战剂和生物恐怖的重要病原之一。出于公共卫生和国家安全的目的，研究和开发快速、定性、定量检测传染病病原体是所属技术领域中长期致力追求的目标。尤其对于鼠疫菌来说，作为一种烈性传染病的病原体，能否实现定量检测至关重要。目前用于鼠疫菌的实验室常规检测方法有细菌学检测方法、血清学检测方法及检测核酸的分子生物学方法。但是，细菌学检测方法、血清学检测方法(例如间接血凝方法)及核酸检测法等现有检测技术存在许多缺陷。对于细菌学检测法，细菌培养耗时较长，不适合对鼠疫菌的快速检测。荚膜抗原(F1抗原)是目前公认的鼠疫菌种特异性抗原之一，检测鼠疫菌F1抗原及其抗体是鼠疫诊断的重要依据。检测鼠疫菌特异性抗体(F1抗体)的间接血凝方法(IHA)，灵敏度低，特异性差。对于核酸检测法，尽管采用了PCR技术对鼠疫菌进行检测和分析，尤其是实时荧光定量PCR技术，特异性高，不容易被污染，但是现有PCR技术的方法繁琐，特别是此类方法包括DNA/RNA的提取和复杂的操作步骤，而且不能用于非核酸物质如蛋白质的检测，因此核酸检测法具有局限性且不方便。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquidchip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。

目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测鼠疫菌，是否适合从粉末、液体等样品中快速直接检测，其定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。

发明内容

本发明涉及一种鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)的蛋白质悬浮芯片的制备及定量检测方法。

本发明提供一种检测鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，所述悬浮芯片包括：编码微球(如028号)包被鼠疫菌的捕获抗体(如兔抗F1 Ag抗体)、生物素标记的鼠疫菌检测抗体(如兔抗F1Ag单抗2F6)、链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)及相关缓冲溶液。

本发明提供一种鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片检测方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板上进行也可在微量离心管中进行。包括下列步骤：(1)每孔加入含已包被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入检测样品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化检测抗体，孵育后清洗；(4)加入链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(5)加入检测缓冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取FMI数值(平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。

本发明还提供一种鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片的定量检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(1)加入的鼠疫菌菌悬液经10倍梯度倍比系列稀释，(2)制作样品浓度对应FMI值的剂量-反应标准曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断样品检测浓度，可判定方法检测限和动态检测范围。

本发明人经过大量和深入的研究，对鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的优化，其具有下列优点：

1、抗体包被量的改进

抗体的包被量需要以检测效果进行优化，悬浮芯片所需的抗体包被量很低，优化结果为10μg/1.25×10⁶个微球，即20-40ng/2500-5000个微球/测试，而传统免疫学ELISA方法的包被量为200ng/测试。

2、生物素标记的改进

标记抗体所用的生物素是过量的，过量的值试剂盒中有参考的计算公式。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能降低的现象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。

3、检测的灵敏度及动态范围

本发明鼠疫菌蛋白质悬浮芯片定量检测方法与经典的免疫学ELISA检测方法相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R²＝0.9721)。同时，悬浮芯片方法灵敏度(67.5cfu/mL)高于ELISA方法(10⁴cfu/mL)灵敏度3个数量级；并且悬浮芯片方法动态检测范围(67.5-10⁸cfu/mL)高于ELISA方法动态检测范围(10⁴-10⁸cfu/mL)3个数量级。

4、方法的特异性

本发明通过选用鼠疫菌为检测标的抗原，分别以兔抗F1 Ag抗体为捕获抗体，以兔抗F1 Ag单抗2F6为检测抗体。本研究试验证明，在存在假结核菌、小肠结肠炎菌、炭疽芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等干扰背静条件下本方法具有良好的特异性。

5、样品的检测能力

本发明评价了悬浮芯片方法对“白色粉末”等环境和食品样品的检测能力。通过对奶粉、小麦面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等模拟添加样品的检测，初步证实了该方法在检测可疑污染鼠疫菌的“白色粉末”样品中的实用性。

附图说明：

图1：鼠疫菌检测用028号微球包被兔抗F1Ag抗体检测示意图；

图2：蛋白质悬浮芯片方法检测鼠疫菌标准曲线图；

图3：ELISA方法检测鼠疫菌标准曲线图；

图4：蛋白质悬浮芯片与ELISA方法检测鼠疫菌的相关性。

具体实施方式

本发明涉及的鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片制备方法、检测及定量方法通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限定。

一、材料

1.蛋白质悬浮芯片的相关缓冲液：

(1)0.03M PB缓冲液(pH7.2)：2.83g Na₂HPO₄，1.36g KH₂PO₄定容至1L。

(2)0.01M PB缓冲液(pH7.2)：由0.03M PB缓冲液稀释而成。

(3)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄ 2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm²)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(4)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％ TWEEN-20。

(5)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH 6.2。

(6)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH 0.15mL，定容于250mL。

(7)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN，0.05％叠氮化物，pH 7.4。

(8)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(9)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)抗体稀释液：0.01mmol/L PB(pH7.2)。

(11)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(12)样品稀释液：0.01M PB，pH7.2。

(13)生物素化抗体稀释液：PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％ TWEEN-20，0.05％NaN₃，pH7.4)。

(14)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

2.菌株

本发明所使用鼠疫菌为国产疫苗株EV76菌株。

3.抗原与抗体

本发明所使用捕获抗体为兔抗F1 Ag抗体由青海省地方病预防控制所提供，检测抗体为生物素化兔抗F1 Ag单抗2F6，为本研究室以正辛酸-饱和硫酸铵提纯法纯化制备获得。

二、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为鼠疫菌，但涉及烈性传染病生物安全问题，以鼠疫菌疫苗株EV76作为目标分析物样品。鼠疫菌接种于赫氏培养基上，37℃培养2-3天，肉眼观察菌苔的均一性，刮取菌落，用显微镜观察菌落形态，并确保培养物中无杂菌污染，同时以鼠疫噬菌体鉴定，确保细菌为纯种鼠疫菌。用PB缓冲液制成菌悬液，在标准比浊管的对照下将其调整到一定麦氏比浊标准相当于菌浓度10⁷-10⁸cfu/mL，然后对调整好浓度的菌悬液用无菌的PB进行一系列的10倍稀释，稀释后的菌悬液浓度范围为10^1-10⁸cfu/mL。同时采用平板菌落计数法测定稀释样本中活菌的数量(cfu/mL)，从10^-5，10^-6和10^-7稀释管中分别取100μl的稀释液接种到营养琼脂平板，每稀释度培养三块平板。计数培养出的菌落数取其均值，换算出菌悬液中的活菌数(cfu/mL)。

干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它细菌，包括假结核菌、小肠结肠炎菌、炭疽芽孢杆菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌等接种于营养琼脂培养基，37℃ 24小时，肉眼观察菌苔的均一性，刮取菌落，以无菌PB缓冲液稀释菌液，麦氏标准比浊法初步计数，4℃保存备检。菌悬液浓度约为10^5-10⁷cfu/mL。

比较实验中，相同鼠疫菌样品用于ELISA和悬浮芯片的检测。

2、模拟污染样品

分别将0.5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL样品稀释液中，将不同浓度的鼠疫菌掺入到粉末样品中，经充分振摇混匀，静置2h以上，使目标分析物与待测模拟白色粉末充分吸附。再用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜滤纸过滤或低速离心(2000rpm，1min)后，上清液作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

实施例1、检测鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片的制备

1、捕获抗体包被编码微球

本发明采用的028号编码微球购自美国BIO-RAD公司，编码微球用于标记可以捕获鼠疫菌的抗体，即利用兔抗F1Ag抗体包被微球。

A、编码微球的活化

取100μL(1.25×10⁶个)编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，再加入10μL新鲜配置的50mg/mL的氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)或羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡后，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。

B、用抗体包被编码微球

取捕获抗体兔抗F1Ag抗体4-50μg加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数×10⁴×稀释倍数×体积(mL))计算微球数量。

2、检测抗体标记生物素

A、生物素的标记

分别配制好浓度为10mM生物素(biotin)溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

B、抗体用量计算

以标记2mg/mL的IgG(免疫球蛋白，分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μl。

计算过程如下：

$1\mathrm{ml\; lgG}\×\frac{2\mathrm{mg\; lgG}}{1\mathrm{ml\; lgG}}\×\frac{1\mathrm{mmol\; lgG}}{\mathrm{150,000}\mathrm{mg\; lgG}}\×\frac{20\mathrm{mmol\; Biotin}}{1\mathrm{mmol\; lgG}}=0.000266\mathrm{mmol\; Biotin}$

$0.000266\mathrm{mmol\; Biotin}\×\frac{\mathrm{1,000,000}\mathrm{\μl}}{L}\×\frac{L}{10\mathrm{mmol}}=26.6\mathrm{\μl\; Biotin\; Reagent}$

C、生物素化抗体的优化选择

用ELISA方法对生物素化抗体进行质量控制，方法如下：

1)用抗原包被ELISA 96孔板每孔加入50μL，4℃静止过夜；

2)加入封闭液(含5％ BSA的PBS溶液)在37℃封闭1h；

3)洗液(含0.5％ Tween20的PBS)洗3次，拍干；

4)加入生物素化的抗体，每孔50μL，室温放置30min；

5)洗液洗3次，拍干；

6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50μL/孔，室温放置30min；

7)洗液洗3次，拍干；

8)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50μL/孔，室温放置10min；

9)最后用2M H₂SO4终止反应。应用酶标仪测读A450nm数值。

结果判定：若阴性对照孔出现很淡蓝色，阳性孔颜色很深，则生物素化抗体可使用；否则，需重新进行新一轮抗体的生物素化标记。

实施例2、悬浮芯片制备法条件的优化

1、微球包被抗体及抗体包被量的选择

分别以4μg、8μg、10μg、16μg、24μg、40μg、48μg的量包被100μL编码为028号的微球。经检测效果比较，以10μg/1.25×10⁶个微球即20-40ng/2500-5000个微球/测试包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。如图1所示，包被羊抗Sterne抗体的025号微球均落在其正确检测区域内，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)，说明优化的悬浮芯片检测系统可成功用于鼠疫菌检测。

2、生物素化抗体的优化

本发明分别用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)标记检测抗体，经质控过程检测效果比较，本实验中SH-活性的生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。

本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体以1:1000稀释作为检测抗体进行检测，检测结果显示生物素化检测抗体兔抗F1 Ag单抗2F6抗体可获得高检测值和低背景值的检测效果。

实施例3、悬浮芯片样品制备、检测及结果判定

1、待测样品制备

用样品稀释液将待测样本配置为不同浓度样本进行蛋白质悬浮芯片检测。

2、样品的检测及结果判定

检测过程全部反应均在96孔滤板上进行，检测过程如下：

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

3、检测结果判定

根据试验研究结果与相关研究报道，本发明定义蛋白质悬浮芯片方法检测鼠疫菌的最低检出限(LOD值)为检测荧光强度临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为＝MFI_Blank+3×SD。若检测结果高于LOD对应荧光强度值则判定为鼠疫菌检测结果阳性；若检测结果低于LOD对应荧光强度值则判定为鼠疫菌检测结果阴性。

实施例4、悬浮芯片对鼠疫菌的特异性检测

应用悬浮芯片检测方法分别对菌液浓度10⁵-10⁷cfu/mL假结核菌、小肠结肠炎菌、鼠疫菌杆菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、覃状芽孢杆菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆等进行检测，根据实施例3中检测结果判定标准，仅鼠疫菌抗原为阳性，其余干扰抗原均为阴性。说明本发明所建立的鼠疫菌悬浮芯片检测方法与其它测试细菌均不发生交叉反应或非特异反应。

实施例5、悬浮芯片定量检测模型的建立

1、鼠疫菌抗原标准曲线样品制备

用样品稀释液将鼠疫菌菌悬液由1.6×10⁸cfu/mL以10倍倍比梯度稀释至1.6×10¹cfu/mL成系列浓度样品。同时，相同样品用于ELISA方法检测。

2、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表鼠疫菌的浓度(cfu/mL)，Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定。

悬浮芯片系统根据检测结果拟合鼠疫菌剂量-反应标准曲线方程：

FI＝3.18126+(2051.72-3.18126)/[1+(Conc/2605.91)^-0.294629]^3.78595

3、悬浮芯片检测鼠疫菌的灵敏度和动态范围

根据最低检出限定义和剂量-反应标准曲线方程，本发明即蛋白质悬浮芯片方法检测鼠疫菌的灵敏度为：67.5cfu/mL(Cutoff＝14.63，Blank＝12.5，SD＝0.71)。

本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着鼠疫菌浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当鼠疫菌浓度超过10⁸cfu/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。

因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量检测鼠疫菌的动态范围为67.5～10⁸cfu/mL。

实施例6、蛋白质悬浮芯片方法与ELISA方法检测鼠疫菌的比较

1、蛋白质悬浮芯片检测方法

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤2次；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤3次；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

2、ELISA检测方法

作为对照，采用包括下列步骤的ELISA检测：

1)向普通ELISA微孔板每孔加入50μL用PB缓冲液稀释的捕获抗体5-50μg，4℃静止过夜；

2)加入封闭液，在37℃封闭2小时；

3)洗液洗3次，拍干；

4)加入检测样品，每孔50μL，室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；

5)加入适量生物素化检测抗体，每孔50μL，室温放置30分钟；洗液洗3次，拍干；

6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50μL/孔，室温放置3分钟；洗液洗3次，拍干；

7)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50μL/孔，室温放置10分钟；

8)用2M H₂SO₄终止反应；

9)应用酶标仪测读A_450nm数值。

3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较

实施例5中制备的相同一组鼠疫菌样品同时应用悬浮芯片和经典ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测鼠疫菌的标准曲线(图2和3中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与实施例5中悬浮芯片方法结果进行比较。

根据两种方法标准曲线：悬浮芯片方法(如图2所示)灵敏度为10³cfu/mL，动态检测范围67.5～10⁸cfu/mL；ELISA方法(如图3所示)灵敏度为10⁴cfu/mL，线性检测范围10⁴-10⁸cfu/mL。可以得出结论：检测相同鼠疫菌样品，蛋白质悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即即高3个数量级；并且具有更宽的动态检测范围，即高3个数量级。

另外，将两种方法检测结果在10⁴～10⁸cfu/mL范围内进行比较(如图4所示)可以判定蛋白质悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0.9721。

实施例7、人工污染“白色粉末”样品的检测

1、人工污染“白色粉末”样品的制备

将一定含量的鼠疫菌或空白(样品稀释液)依照不同浓度分别掺入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末样品制备人工污染样品。将0.5g粉末加入到5mL样品稀释缓冲液中，充分混匀，静置2小时，让待测样品与白色粉末充分吸附。

2、人工污染“白色粉末”样品的检测

对上述被污染的“白色粉末”样品进行处理，选用棉花、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜、0.22μm滤膜过滤，以及2000rpm、5分钟和1000rpm、4分钟低速离心等方法处理人工添加样品后的粉末溶液，收集滤液或上清液后按照实施例进行悬浮芯片分析检测。

表1：悬浮芯片对人工污染“白色粉末”样品的检测结果

根据所检测的18个样品中，检测结果(如表1所示)全部正确，初步证明了蛋白质悬浮芯片方法可以快速、准确、高效地应用于鼠疫菌污染的“白色粉末”样品的实际检测工作。

Claims (12)

1、一种采用蛋白质悬浮芯片技术检测鼠疫耶尔森菌的方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：

(1)向孔加入含已包被捕获抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(2)加入待测样品，孵育后清洗；

(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；

(4)加入SA-PE，孵育后清洗；

(5)加入检测缓冲液后混匀；

(6)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(FMI)数值并分析数据判定检测结果。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为抗鼠疫菌抗体或抗鼠疫菌F1抗原抗体(如兔抗F1Ag抗体)，采用生物素标记的检测抗体为抗鼠疫菌抗体或抗鼠疫菌F1抗原抗体(如兔抗F1Ag单抗2F6)，并且其组合组成目标检测物检测体系。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗体兔抗F1Ag抗体用量为10μg/1.25×10⁶个编码微球或20-40ng/2500-5000个微球/测试。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体兔抗F1Ag单抗2F6的生物素为羧基活性的生物素。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体兔抗F1Ag单抗2F6以1:1000稀释作为检测抗体进行检测。

6、一种定量检测鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为10倍；

(2)将系列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI)；

(3)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线；

(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

(5)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断未知样本中鼠疫菌浓度。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为兔抗F1Ag抗体，采用生物素标记的兔抗F1Ag单抗2F6作为检测抗体，并且其组合组成目标检测物检测体系。

8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定量检测鼠疫菌方法中的包被微球的捕获抗体兔抗F1Ag抗体用量为10μg/1.25×10⁶个编码微球或20-40ng/2500-5000个微球/测试。

9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定量检测鼠疫菌方法中的标记检测抗体兔抗F1Ag单抗2F6的生物素为羧基活性的生物素。

10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述定量检测鼠疫菌方法中2mg/mL生物素化的检测抗体兔抗F1Ag单抗2F6以1:1000稀释作为检测抗体进行检测。

11、一种检测鼠疫菌的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，所述悬浮芯片包括：编码微球，包被微球的所述鼠疫菌的捕获抗体、生物素标记的鼠疫菌检测抗体、链亲和素-藻红蛋白及所述缓冲溶液。

12、如权利要求11的蛋白质悬浮芯片，其特征在于：用于包被微球的捕获抗体为兔抗F1Ag抗体，采用生物素标记的兔抗F1Ag单抗2F6作为检测抗体，并且其组合组成目标检测物检测体系。

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