CN101503704A - 家蚕滞育品种的转基因方法 - Google Patents

Abstract

一种家蚕滞育种的转基因蚕的制作方法利用亲代所处环境条件与子代蚕卵的滞育性的关系，利用在转基因操作的前一个世代对滞育性家蚕品种进行环境条件的控制以改变该品种在转基因操作当代的滞育性，随后对所得的非滞育性的蚕卵进行蚕卵胚胎显微注射并利用荧光蛋白标记进行筛选，制作转基因家蚕该方法巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍，并有效地克服了现有转基因方法的缺陷，将为家蚕转基因技术在功能基因研究和生物反应器开发等实用研究中的大规模应用奠定坚实的技术基础。

Description

家蚕滞育品种的转基因方法

技术领域

本发明涉及生物技术、生物工程领域，特别是涉及一种家蚕滞育品种的转基因方法。

背景技术

转基因技术是现代生物学研究中的一项重要的技术，它能将人工分离或修饰过的基因有效的导入生物体基因组中，是实现异源或异位表达最为有力的遗传工具。在后基因组时代，转基因技术在功能基因研究、生物素材创新与新产品开发，以及现代遗传育种等方面具有不可替代的优势。

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。家蚕基因组框架图(2004)和精细图谱(2008)绘制工作的相继完成，标志着人类对家蚕的研究和认识正式进入后基因组时代。利用高效稳定的技术大规模地研究重要基因的功能成为后基因组时代家蚕研究的重要课题。同时，家蚕是理想的“昆虫工厂”，利用现代基因工程技术开发丝腺生物反应器具有巨大的市场前景。在功能基因研究和家蚕生物工厂并驾齐驱的道路上，家蚕转基因技术无疑是探索解析家蚕生长发育奥秘、奠定家蚕作为鳞翅目模式昆虫的理论基础，开发家蚕生物反应器、拓展蚕业产业链、促进科技成果实用化进程中最为有力的武器。

自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。但是迄今为止的报道中，绝大多数转基因实验都是利用多化性家蚕品系，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为非滞育卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制和转基因后的进一步实验研究。但这些多化性家蚕品系与生产上普遍使用的实用家蚕品种比较，具有丝量少，丝质差等经济性状差的特点。故利用多化性家蚕品种作为转基因的材料具有以下两个方面的明显缺陷：①多化性家蚕品种经济性状差，利用转基因所创造的附加性状在产量和质量上都无法达到直接推广应用的标准，以多化性蚕种为原始材料的转基因品系只能作为育种原始材料，作为某一相关优良性状的原始载体的角色运用于漫长而艰辛的传统育种之中。②多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要浪费大量的人力和物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。因此，利用多化性家蚕品种不但不利于进行大规模的转基因实验，而且很难使研究成果快速转化到生产实际中去。家蚕滞育品种为一化或二化性品系，在产卵以后便进入一个比较漫长的滞育期，这样极有利于它们维持和继代。另外生产上的实用家蚕品系几乎都是滞育品系，多为一化或二化性品系。如利用普通的家蚕滞育品系进行转基因研究可以克服多化性家蚕品种转基因研究中所述的第二个缺陷，而利用生产上的实用家蚕滞育品系原种进行转基因研究则可以克服多化性家蚕品种转基因研究中所述的所有缺陷。

此外，在长达五千年的人工驯化和改造过程中，人类积累了丰富的表型突变和生理突变家蚕遗传资源，这些遗传资源对于重要基因功能的解析无疑是一笔宝贵的财富。对这些突变资源进行转基因挽救操作是研究和利用相关基因必不可少的一个环节，而目前保存的突变遗传资源中，绝大多数都是滞育品种。因此，不论是在功能基因研究等基础研究领域，还是在生物工厂开发等应用研究领域，家蚕滞育品种的转基因研究都具有重要意义。

生产实际中，滞育卵一般在产卵后约16-20小时左右利用常规的即时浸酸法或者经过长期的低温冷藏能有效解除它们的滞育。而目前最有效的家蚕转基因显微注射时间是在产卵后3-6小时，因为转基因操作后卵上会上留下注射小孔，如果在注射后利用常规的即时浸酸法会导致盐酸渗入蚕卵内，从而致死，根本无法实现家蚕滞育品种的转基因研究，转基因注射留下的小孔也使得蚕卵不能长期放置。因此，家蚕滞育品种卵的滞育，给转基因操作带来很大的限制。到目前为止，在国内外众多的家蚕转基因文献报道中，仅有日本学者Satoshi Inoue等(2004)采用在产卵后4小时浸酸之后再注射的方法成功实现了滞育种的转基因。但是重复实验发现在产卵后4小时浸酸延误了注射时间导致转化率明显偏低，于是我们探索了在蚕卵受精后立即进行浸酸的方法并成功的获得相应的转基因方法[家蚕滞育种的早期浸酸转基因方法，本发明申请人已于2007年12月21日申请专利(申请号：200710303904.1)，现已公开]。同时，我们还利用特殊的催青条件改变家蚕滞育品种下一代蚕卵的化性，并结合常规的家蚕转基因技术，巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍并有效制作转基因蚕[家蚕滞育种的低温催青转基因方法，本发明申请人已于2007年12月21日申请专利(申请号：200710303903.7)，现已公开]。虽然上述两个专利已分别提供了相应的滞育种转基因方法，据此也可以实现大多数滞育种的转基因，但是其提供的方法都有各自的局限和缺点：家蚕滞育种的早期浸酸转基因方法(申请号：200710303904.1)由于需要浸酸，显微注射后孵化率较低，而且早期浸酸的效果在品种间的差异比较大；家蚕滞育种的低温催青转基因方法(申请号：200710303903.7)虽然在注射后孵化率和多化性蚕卵不相上下，但是低温催青的效果在品种间的差异非常大，对一化性和日系二化性蚕品种基本上不适用。这些缺点极大的限制了家蚕转基因技术在功能基因研究和生物反应器开发等实用研究中的大规模应用。

因此，克服和解决上述专利中所提供方法的局限性，探索出一种更为简便有效的、适合于绝大多数蚕品种的家蚕滞育种转基因方法就显得尤为必要。简便有效的家蚕滞育种转基因方法，也是建立稳定高效的家蚕转基因技术体系、推进规模化功能基因研究、实现家蚕转基因成果快速产业化的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便有效、适合于绝大多数家蚕品种的家蚕滞育种转基因方法。该路线方法利用亲代所处环境条件与子代蚕卵的滞育性的关系，使亲代家蚕在经严格控制的特殊环境条件下进行催青、饲养和种茧保护，并采用适当的交配方式以获得非滞育的子代蚕卵，得到的非滞育性蚕卵参照非滞育家蚕卵胚胎显微注射的转基因方法进行转基因，从而巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的障碍并有效制作转基因蚕。

本发明首次系统地调查了亲代所处的环境条件对家蚕滞育品种的子代蚕卵化性的影响，获得了通过严格控制亲代催青、饲养和种茧保护的环境条件使家蚕滞育品种产下非滞育的蚕卵的条件，并将这项技术与家蚕胚胎显微注射技术，荧光检测与分子生物学操作技术相结合，巧妙地突破了家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈，建立了一种家蚕滞育品种的转基因技术路线方法。本发明提供的滞育种转基因方法简便有效、适合于绝大多数家蚕品种。

本发明家蚕滞育品种的转基因方法，依次通过以下步骤实现：

(1)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15℃恒温、相对湿度75％、黑暗的环境中催青至孵化；

(2)逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束；

(3)将四龄起蚕转移至27℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟；

(4)将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中，待其化蛹完毕后削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中进行种茧保护；

(5)待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；

(6)以收集蚕卵时间开始记时，于收集后2h-4h用显微注射仪将10-15nL、总浓度400ng/uL的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔；

(7)将注射完成的蚕卵在35-37％的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25℃、相对湿度85％以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的G1代蚕卵，G1代蚕卵经即时浸酸处理后于胚胎发育第六天在荧光显微镜下扫描获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。

上述步骤中，h表示小时，min表示分钟。

本发明的优点是：

本发明关于家蚕滞育品种的转基因蚕的制作方法，首次利用亲代所处环境条件与子代蚕卵的滞育性的关系，使亲代家蚕在经严格控制的特殊环境条件下进行催青、饲养和种茧保护，并采用适当的交配方式以获得非滞育的子代蚕卵，并参照和结合非滞育家蚕卵胚胎显微注射的转基因方法进行转基因，巧妙地突破家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈，克服了之前有关滞育种转基因方法的缺陷。本发明的优点是，利用上述技术路线，可以简便有效地实现绝大多数家蚕滞育品种的转基因操作。而利用家蚕滞育品种创造的转基因蚕品系，可以克服多化性品系转基因家蚕的所有缺点，其具有以下的明显优势：①家蚕滞育品种，尤其是生产上采用的实用性品种，各种经济性状都比较良好，外源或内源的转基因目标性状也非常优良，在利用这些家蚕品种作为生物反应器时，其目的产物的产量与质量远远超过多化性品系的转基因家蚕；②现今蚕业生产中所采用的蚕品种多为滞育性的一化或二化性品种，在利用转基因技术创造新的遗传素材或品种资源时，直接采用生产中普遍使用的实用性家蚕滞育品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利用转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊家蚕品种，大大的缩短了育种的周期，也节约了大量的人力和物力；③滞育性家蚕在自然条件下一年繁殖一个或两个世代以后便自动进入一个漫长的滞育期，要保存其品种资源只需要在一年内进行一次或两次的饲养和简单的蚕种管理即可，对其生产和管理可以根据计划的需要人为地进行调节，而且实用性家蚕品种的各项性状通过长期育种的选择，都比较稳定，所以利用这些家蚕滞育品种作为家蚕转基因研究的材料，可以简化资源保存的工作，降低品种资源丢失的风险，增强转基因工作的计划性，使转基因工作与实际生产更加紧密地结合。④家蚕滞育品种，特别是生产上的实用滞育品种一般个体较大，其蚕卵也远大于一般的多化性家蚕品种，抗逆性强，具有耐注射的特性。此外，家蚕滞育品种的蚕卵一般具有一层着色的浆膜，可以降低荧光检测时激发光对胚胎的伤害，这些特点都降低了家蚕转基因操作的难度，有助于转基因的成功。其次，目前保存的表型突变和生理突变家蚕遗传资源绝大多数都是滞育种，本发明为研究和利用这些宝贵的遗传资源奠定了坚实的技术基础。最后，转基因技术已经在果蝇、伊蚊、蜜蜂等20余种昆虫中建立，但是报道比较多的蝇、蚊、蜂等昆虫多属于多化性，所以本发明也将为其他昆虫特别是卵滞育性的鳞翅目昆虫转基因技术的建立提供有用借鉴和参考。

具体实施方式：

实施例1：

利用家蚕滞育品种“大造”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化处理后置于15℃恒温、相对湿度75％、绝对黑暗的环境中催青至孵化。逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、绝对黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束。将四龄起蚕迅速转移至27℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟。将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中，待其化蛹完毕后立即削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中进行种茧保护。待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。于产卵后3h用Eppendorf显微注射仪，将10-15nL、总浓度400ng/uL的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入325粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经35％的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25℃、相对湿度85％的高湿度环境中催青孵化，将孵化的169头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的152头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得81蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察筛选了81蛾圈G1代蚕卵并获得30个阳性蛾圈，共获得254头家蚕滞育品种“大造”的转基因蚕，转化效率为37.04％。

实施例2：

利用家蚕滞育品种“碧·波”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化处理后置于15℃恒温、相对湿度75％、绝对黑暗的环境中催青至孵化。逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、绝对黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束。将四龄起蚕迅速转移至27℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟。将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中，待其化蛹完毕后立即削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中进行种茧保护。待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。于产卵后2h用Eppendorf显微注射仪，将10-15nL、总浓度400ng/uL的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入506粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经36％的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25℃、相对湿度85％的高湿度环境中催青孵化，将孵化的295头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的237头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得113蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察筛选了50蛾圈G1代蚕卵并获得14个阳性蛾圈，共获得263头家蚕滞育品种“碧·波”的转基因蚕，转化效率为28.00％。

实施例3：

利用家蚕滞育品种“872”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化处理后置于15℃恒温、相对湿度75％、绝对黑暗的环境中催青至孵化。逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、绝对黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束。将四龄起蚕迅速转移至27℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟。将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中，待其化蛹完毕后立即削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中进行种茧保护。待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。于产卵后4h用Eppendorf显微注射仪，将10-15nL、总浓度400ng/uL的带有神经和眼睛特异启动子启动的绿色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入813粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经37％的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25℃、相对湿度85％的高湿度环境中催青孵化，将孵化的349头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，获得的301头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得184蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察筛选了64蛾圈G1代蚕卵并获得9个阳性蛾圈，共获得128头家蚕滞育品种“872”的转基因蚕，转化效率为14.06％。

实施例4：

利用家蚕滞育品种“秋丰”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化处理后置于15℃恒温、相对湿度75％、绝对黑暗的环境中催青至孵化。逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、绝对黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束。将四龄起蚕迅速转移至27℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟。将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中，待其化蛹完毕后立即削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中进行种茧保护。待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。于产卵后4h用Eppendorf显微注射仪，将10-15nL、总浓度400ng/uL的带有神经和眼睛特异启动子启动的绿色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入339粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经35％的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25℃、相对湿度85％的高湿度环境中催青孵化，将孵化的103头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，获得的75头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得41蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察筛选了41蛾圈G1代蚕卵并获得11个阳性蛾圈，共获得380头家蚕滞育品种“秋丰”的转基因蚕，转化效率为26.83％。

实施例5：

利用家蚕滞育品种“871”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在常规的人工孵化处理后置于15℃恒温、相对湿度75％、绝对黑暗的环境中催青至孵化。逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、绝对黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束。将四龄起蚕迅速转移至27℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟。将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中，待其化蛹完毕后立即削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、绝对光照的环境中进行种茧保护。待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。于产卵后3h用Eppendorf显微注射仪，将10-15nL、总浓度400ng/uL的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入447粒蚕卵中，用无毒胶水封住注射口，并经36％的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25℃、相对湿度85％的高湿度环境中催青孵化，将孵化的176头G0代蚁蚕用桑叶收集饲养至化蛾，获得的141头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得68蛾圈G1代蚕卵，用

电动宏观荧光显微镜观察筛选了68蛾圈G1代蚕卵并获得15个阳性蛾圈，共获得128头家蚕滞育品种“871”的转基因蚕，转化效率为22.06％。

Claims (1)

1、一种家蚕滞育品种的转基因方法，其特征在于依次通过下列步骤实现：

(1)将家蚕滞育品种的蚕卵通过人工孵化处理后，置于15℃恒温、相对湿度75％、黑暗的环境中催青至孵化；

(2)逐天收集孵化的蚁蚕，置于23℃恒温、相对湿度85％、黑暗的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至三眠结束；

(3)将四龄起蚕转移至27℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中用桑叶或者人工饲料饲养至上蔟；

(4)将上蔟后的家蚕转移至25℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中，待其化蛹完毕后削开茧壳，将裸露的蛹体转移至26℃恒温、相对湿度75％、光照的环境中进行种茧保护；

(5)待羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在25℃、弱光的条件下交配4h后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上，在黑暗的环境中产卵，每间隔0.5h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；

(6)以收集蚕卵时间开始记时，于收集后2h-4h用显微注射仪将10-15nL、总浓度400ng/uL的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔；

(7)将注射完成的蚕卵在35-37％的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25℃、相对湿度85％以上的湿度条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(G0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的G1代蚕卵，G1代蚕卵经即时浸酸处理后于胚胎发育第六天在荧光显微镜下扫描获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成家蚕滞育品种的转基因蚕的制作。

上述步骤中，h表示小时，min表示分钟。