CN101501494A - 用于侧流分析的测试条 - Google Patents

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CN101501494A CNA2007800297957A CN200780029795A CN101501494A CN 101501494 A CN101501494 A CN 101501494A CN A2007800297957 A CNA2007800297957 A CN A2007800297957A CN 200780029795 A CN200780029795 A CN 200780029795A CN 101501494 A CN101501494 A CN 101501494A
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Abstract

本发明提供了用于检测流体样品中分析物而构造的测试条，以及用于制造和使用测试条的方法。测试条包含顺序排列以在其间形成界面的第一流动基质和第二流动基质。第一流动基质包含可移动地结合至其上的检测组合物，其中当暴露于分析物时，检测组合物产生至少一种可检测的产物，并且其中选择第一和第二固体基质使得当流体样品从第一流动基质行进到第二流动基质时，至少一种可检测的产物聚集在两基质间的界面处。

Description

用于侧流分析的测试条
发明背景
发明领域
本发明主要涉及用于快速分析的测试装置，更具体地涉及用于新型侧流分析的装置和方法。
背景技术
对于包括医疗诊断、环境监测、法医毒理学和食物病原体测试的各种应用，用于检测生物化合物存在的快速诊断体外分析已经变为常规手段。近年来，该领域中对于新的、廉价的和敏感的快速分析的不断增长的需要已经产生了许多新的发展。然而，仍然不断需要新的和改进的检测方法以及更高灵敏度和更低成本的装置。特别是，对于可由未经训练的人使用的低成本即时临床诊断试剂盒，存在巨大的需求。
进行一步法快速分析的一种通用形式是侧流分析技术，其中将样品应用于用分析特效试剂预处理过的测试条的一端。通过毛细管作用沿所述测试条引导样品，穿过指示剂区域，其中出现可见的或另外可检测到的信号表明样品中存在被分析物。所述指示剂区域通常包括许多在规定区域内固定至所述测试条的特定结合对，其通常是线。所述测试条还可以包括标记区域，位于样品应用区域的下游，具有标记物质。这样进行侧流分析：通过将疑似包含分析物的样品应用于样品接受端，并使得它能通过毛细管作用沿着所述条前进，以当其存在时获得标记化合物，并进一步在下游待被捕获和在检测/捕获区域集中。有许多这种基本结构的变化形式，关于位于沿所述条的固定、标记和其他物质的数量和性质以及它们与被分析物的相互作用，以及可检测信号的性质和形成。例如，可检测信号不一定由固定物质与分析物之间的直接相互作用产生，而是取决于特定的分析和条结构，可能由与二次产物的间接相互作用产生，该二次产物在固定物质的上游形成并且它的产生需要分析物的存在。根据其他的变化形式，当检测区域位于捕获区域下游时，固定试剂可以用于捕获未反应的上游试剂，例如未结合的标记试剂。然而，大多数情况下，现有技术的侧流条包括至少一种预固定试剂。
本发明提供一种用于侧流分析的新型条，其中所有的检测反应物可移动地结合到所述条，并且其中捕获区域形成在两个顺序排序的不同特征的流动基质间的界面上。
特别是，本发明的条适用但不限于体液中酶或者酶底物的检测。
发明内容
本发明的一个方面是用于流体样品中分析物检测的测试条，其没有预固定的试剂。所述条包含顺序排列以在其间形成接合点的第一和第二流动基质，其中第一流动基质包含可移动地结合至其上的检测组合物，并且其中所述检测组合物的至少一种组分可以干燥形式预先沉积在第一基质上。选择所述检测组合物，使得当其接触分析物时产生至少一种可检测的产物。选择第一和第二固体基质，使得当流体样品从第一基质行进至第二基质时，所述至少一种可检测的产物在基质之间的接合点处聚集。第一基质与第二基质相比具有更高的孔隙率，以使得所述可检测的产物能以更高的渗透速率通过第一基质。优选地，当所述至少一种可检测的产物不溶于样品流体中时，所述检测组合物的组分可溶于样品流体中。优选地，第一和第二基质被夹在背衬和上部非渗透性的层压材料之间，其中所述背衬和上部层压材料的至少一个是透明的或者半透明的。
根据本发明的具体实施方式，使所述条成形以用于检测流体样品中的酶活性。根据该实施方式，所述检测组合物包含在分析中对酶具有特异性的显色底物试剂体系。所述显色底物试剂体系可以包括显色的酶底物，诸如含吲哚酚的底物，其在接触酶时得到有色的产物。或者，所述显色底物试剂体系可以包含酶底物和显色试剂的混合物，其中在酶与酶底物之间的酶促反应存在下，所述显色试剂产生可检测到的有色产物。优选地，当所述有色产物在样品流体中不可溶时，所述显色底物试剂体系的组分可溶于样品流体中。
本发明的第二个方面是用于测定流体样品中的分析物的方法，其包含以下步骤：提供如上定义的本发明的新型测试条；使所述测试条接触流体样品；并且在两种基质之间的界面处观察到出现了明显的变化，优选颜色变化，其中出现的明显变化表明流体样品中所述分析物的存在。
本发明的第三个方面是适用于流体样品中分析物检测的条的制造方法，所述方法包含以下步骤：选择用于检测所述分析物的检测组合物，选择所述检测组合物以便在与所述分析物接触时产生至少一种可检测的产物；选择特征不同的第一和第二流动基质，使得当样品从第一基质行进到第二基质时，至少一种可检测的产物保留在所述第一和第二基质之间的界面处；将第一和第二基质以顺序排序的方式排列在非吸收性的载体上，以便在其间形成界面；以及将预定量的检测组合物提供给第一基质。
附图说明
结合附图，从以下详细说明中将更充分地理解和领会本发明：
图1和2分别是根据本发明优选实施方案构造的侧流条的分解侧视图和俯视图；
图3是在本发明的侧流条上获得的阳性信号的示意图。
图4是说明书实施例1～3所用条的构造图的分解视图，说明了不同条层的尺寸和相对位置。
图5显示了用本发明构造用于唾液酸酶检测的侧流条得到的示例性结果；左边的条显示了用脆弱类杆菌(B.fragilis)的样品得到的结果；右边的条显示了用运行缓冲液的对照实验；条在培育10分钟后扫描。
图6显示了用本发明构造用于检测碱性磷酸酶(AP)的侧流条得到的示例性结果；
图7显示了用本发明构造用于检测过氧化物酶(POD)的侧流条得到的示例性结果。
优选实施方式的详细说明
本发明提供一种用于测定流体样品(包括人类、动物或者人造的样品)中分析物的新型的侧流分析条。本发明的条能被用于定性的、半定量的或者定量的检测。本发明还提供用于制造和使用所述条的方法。
本发明的条适用于样品流体中，更特别是体液中酶活性的检测，但不限于此。在生物或化学样品(诸如完整的有机体、细胞或者细胞提取物、生物流体或者化学混合物)的分析中，酶活性的检测是有用的。特别是，体液中的酶水平表示健康状况。某些酶的活性评价可以提供关于新陈代谢、疾病状态和病毒和细菌病原体身份的信息。
本发明的条包含至少两个顺序排序的、不同特征的固态流动基质，其中所有的检测反应物可移动地结合到第一基质，并且其中在两个流动基质间的界面上形成捕获区域。在第一或者第二基质上不提供固定试剂。本申请通篇中使用的术语“流动基质”是指任何液体可渗透的运输固体材料，其使得液体能通过其流动，该材料包括诸如硝化纤维、尼龙、人造丝、纤维素、纸、玻璃纤维和硅石或者任何其他多孔的、纤维的、吸水的或非吸水的材料。优选所述流动基质被成形为基本平坦的细长条。所述流动基质材料可按需要预先处理或者改变。
参考图1和2，其中表示本发明的条，通常标示为10。条10包含两种流动基质，样品接收固体基质2和反应固体基质4顺序排列在背衬层15上，以形成约1～5mm长的界面区域8，其中在界面区域8处基质2和4重叠。界面重叠区域8是信号区，其中可检测到的变化，通常是颜色变化在阳性测定时出现。选择基质2和4以具有不同的孔隙率，并因此具有不同的渗透速率。特别是，选择基质使得通过基质2的渗透速率高于通过基质4的渗透速率。基质2可以是玻璃纤维(GF)、滤纸或者任何其他本领域已知的具有相对大的孔径的过滤或网状介质，优选纤维材料。基质4优选但不限于硝化纤维(NC)或尼龙膜。优选地，膜4的孔径在约0.22μm～约15μm的范围内。根据特定的分析(设计条用于该分析)及其可检测的产物选择特定的膜4，使得可检测的产物保留在界面8。所述条还包括吸收垫6以确保样品的连续流动，以及上部层压材料25。使上部层压材料25成形以充分地覆盖膜4以及部分地覆盖膜2和吸收垫6，留出未覆盖的膜2的部分20(样品将要应用于此)和暴露的衬垫6的大部分。吸收垫6由吸水材料制得，诸如纤维素或滤纸，使得液体被吸引通过基质2和4并且聚集在吸收垫6中。根据将要用于分析的液体体积，选择衬垫6的尺寸和形状。通常用于衬垫6的材料包括但不限于纤维素和滤纸。背部和上部层压材料15和25是非吸收性的膜。优选地，膜15和25是透明的或半透明的膜，使得从条的两侧能观察信号。然而，在某些应用中，在一侧使用白色膜并在另一侧使用透明膜能够增加信号区的对比度。为了便于制造，层压材料15和25优选是由隔离衬里保护的一侧有粘性的塑料膜。在实践中，通过将层压材料15以粘性侧向上的方式放置，剥落隔离衬里并如图1所示在衬里15上放置基质2、4和6，从而组装条10。为了完成组装，将层压材料25以有粘性的侧面向下放置的方式置于上面。
分析物特定检测组合物可移动地放置在样品接收基质2上。检测组合物包含这样的试剂，其在分析物存在下会产生至少一种聚集在基质2和4之间的界面8处的可检测的产物。为了提高信号强度，检测组合物还可以包含表面活性剂。在酶的分析中，例如唾液酸酶分析中，检测组合物可以包含显色酶底物，比如5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸(BCIN)，其在唾液酸酶存在下产生吲哚酚，以及显色试剂，诸如四唑鎓盐，其与吲哚酚反应产生强烈着色的不溶性靛蓝和甲腊染料。在酶分析的其他实例中，检测组合物可以包含酶底物和显色试剂的混合物，所述显色试剂参与酶促反应以产生可检测的产物。这样的显色试剂可以是例如参与酶的电子传递链的电子受体或电子供体。例如，使用包含脱氢酶底物和显色电子受体(诸如四唑鎓盐)的检测组合物，可以检测脱氢酶。使用包含过氧化物酶底物和显色电子供体(诸如四甲基联苯胺(TMB))的检测组合物，可以检测过氧化物酶。通常，可以这样在现有装置中完成酶分析的实现：通过选择相当于用于酶组织化学中的那些检测组合物，即包括用于所关心的酶的底物以及试剂的组合物，其在酶促反应存在下得到不可溶有色的、或否则得到可检测到的沉淀物。
通过正确选择基质2和4，有色的沉淀物粒子保留并集中在两种基质间的界面处，以产生明显的信号。
各种检测组分在流动基质2上的位置可以充分地或部分地彼此重叠，或者可以包含分离的区域。类似地，样品应用区域可以与用检测组分浸渍的一个或多个区域重叠，或者可以是分离的区域。应该了解，可以改变在基质2上各种区域的特定位置，只要当沿着基质2行进并在到达基质4之前，所有样品组分和所有检测组分充分混合并溶解在样品流体内即可，以使得能有足够的相互作用时间。为了制造的简化和方便，用所有检测组分充分浸渍基质2是便利的。因而，如果所有检测组分的混合物在溶液中是稳定的，则基质2可以被浸泡在这样的溶液内一段预定时间，并使其干燥。或者，如果溶液是不稳定的，则基质2可以完全地或部分地浸泡在仅包含在一起稳定的那些组分的溶液内。保留的组分可以加载在干燥的基质上，或者在用溶液组分的干燥形式预浸渍的区域上，或者在自由的非浸渍区域上。还有另一个选择是基本上在样品加载的同时，或者之前或之后，立即将一种或多种组分加载在基质2上。
应该注意到根据本发明，检测组合物不含预先形成的标记粒子，诸如乳液或者胶体金粒子。这种惰性粒子，结合至生物特性对的一员，通过与生物特性对的第二部分形成络合物而作为用于产生信号的标记手段是本领域公知的。根据本发明，通过形成具有可检测性质的新产物而产生阳性信号，例如明显的颜色，其之前在条上不存在，并且其形成需要分析物的存在。因而，与基于捕获预沉积的有色粒子检测的情况不同，本发明的信号基于具有新的明显可检测性质的新产品的形成。该可检测的产物，通过检测组分与分析物间的化学反应形成，即在化学键形成和分裂时形成，集中在两种基质之间的界面处，因而增强了信号。优选地，可检测的产物在样品流体中是不可溶的，以便形成被第二、渗透性较低的基质保留的沉淀物粒子，而检测组合物仅包含完全溶解在洗脱流体中的试剂。
为了进行测试，样品和洗脱试剂(通常是运行缓冲液)加载于衬垫2的暴露端20。通常，样品是水溶液或者生物流体。样品可以被作为一种溶液预先加入将要加载的运行缓冲液，或者可以在样品点样后加载运行缓冲液。当样品溶液沿条移动时，随样品液体沿着条行进，所述预沉积的检测组分被再次溶解于所述待与样品组分混合并反应的溶液内。因而，在上面给定的酶实例中，如果酶存在于样品中，显色的底物裂开以得到显色的中间体，该中间体进一步与显色试剂反应以得到强烈着色的产物。有色产物聚集在两种基质间的重叠界面8处，以产生清楚突出的信号线。参考图3，由在信号区8处出现的明显的线30表示阳性结果，而信号区处不存在这种线则表示阴性结果。
对应于测试样品中分析物的存在或不存在，本发明的侧流条可用于以定性的方式以给出阳性/阴性响应。根据该实施方式，所述条可以被引入侧流装置中，该装置具有用于加载样品的接收口以及在信号区的至少一个透明窗，因而提供了无需附加设备的简单自容式检测装置。可以用校准色彩强度等级增加参考，以通过将信号强度匹配至校准等级而得到半定量的测量。或者可以通过仪器读条，所述仪器例如但不限于分光光度计、扫描仪、光密度计、读出器、照相机，以给出定量的结果。如前面所述，因为可以从条的两侧观察信号，这使得能测量信号的吸收以及反射。
以下给出的详细实施例仅为了说明目的，而非意欲将本发明限制为其所描述的内容。
实施例1：唾液酸酶测试条
根据本发明，如下所述构造用于检测流体样品中唾液酸酶活性的唾液酸酶测试条。所述分析基于显色的唾液酸酶底物5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸(BCIN)在唾液酸酶存在下的水解以得到吲哚酚，和所产生的吲哚酚与硝基四氮唑蓝(NBT)进一步反应，以产生聚集在两基质间的界面处的靛蓝和甲腊。BCIN和NBT的化学结构以及分析反应的详细反应示意图在标题为“干燥形式唾液酸酶分析”的共同未决申请中出现，该申请与本发明提交日期相同并转让给相同的受让人，其全部内容此处并入作为参考。用包括阴道拭子样品的所述条测试各种样品，用于检测细菌性阴道病(BV)。
A.制备NBT浸渍的样品垫
在暗处于室温下，将玻璃纤维滤材(微孔，GFCP0010000，10mm×10cm)浸泡于NBT溶液中30分钟。将浸透的玻璃纤维滤材放置在吸水纸上以除去过量的流体，然后转移至干燥箱在50℃下15分钟。将干燥的NBT浸渍玻璃纤维滤材(样品垫)在室温下储存在干燥且黑暗的干燥房间(相对湿度5～10％)中。
B.卡的组装
根据以下步骤并根据图4组装测试卡，图4详细说明了每个卡组件精确的纵向尺寸和位置。在制备之后，修整该卡以获得多个用于唾液酸酶分析的条。
1.用带有隔离衬里保护粘合剂的、43×250mm的清洁塑料膜片作为背部层压材料，在图2中用15标示，(ARcare8876，AdhesivesResearch，Limerick，爱尔兰)置于工作台的顶部。剥落隔离衬里以暴露出该带的粘合剂侧。
2.将反应膜(硝化纤维HF18004，微孔，SA3J154101，25×300mm，或者Biodyne B，PALL，BNBZF3RT，25×300mm，或者BiodynePLUS，PALL，ZNXG3R，25×300mm)附着在背部覆盖物的粘合剂侧上，距下端8mm。
3.将NBT浸渍的样品垫(如A部分所述制备)附着在背部覆盖物下侧上，与反应膜的顶部重叠2mm。
4.将吸收垫(凝胶吸水纸，S&S，GB003，21×300mm)放置于背部覆盖物上侧的顶部，与反应膜在顶部重叠12mm。
5.将顶部层压材料膜(ARcare7759，Adhesives Research，Limerick，爱尔兰)的隔离衬里剥落，以暴露出粘合剂侧，并将该膜用粘合剂面面向反应膜的顶部附着，与样品垫和吸收垫的顶部重叠。
在室温下于暗处在干燥室内(相对湿度5～10％)固化所述都卡过夜。固化之后，使用自动模具切割机修整所述卡得到4mm宽的条。
C.在条样品垫上浸渍BCIN
将1μl的BCIN(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸)溶液加至样品垫的顶部，并使其在37℃干燥15分钟。
D.用唾液酸酶测试条进行测试
D1.细菌的和纯化的唾液酸酶样品
使用产生唾液酸酶的细菌样品，将如以上部分B所述构造的条用于唾液酸酶活性的测试：脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)、唾液酸酶阴性细菌：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和纯化的唾液酸酶。
将25μl的样品加载在条的样品垫上开始测试。阳性唾液酸酶反应的信号，褐紫色，聚集在两不同的基质(样品垫和反应膜)之间的界面处，即信号区处。阴性对照(其中没有唾液酸酶存在)在信号区显示出黄色背景。记录每个测试信号的出现时间。观察条直到30分钟。图5表示用脆弱类杆菌的样品(左边的条)和用运行缓冲液(右边的条)作为阴性对照得到的示例性结果。
肉眼可观察到信号区的颜色变化，并对应于通过眼睛估测的强度指定“+”值(见表1)。作为选择或者此外，能够通过电子光学仪器检测和测量颜色。从将样品加载到测试条的信号出现时间，和10分钟时的信号强度总结在随后的表1中。
表1：通过唾液酸酶测试条获得的结果
 
样品(25μl) 信号出现的时间(分钟) 10分钟后的信号强度*
脆弱类杆菌5×104个细胞 2 ++++
脆弱类杆菌2.5×104个细胞 3 +++
脆弱类杆菌104个细胞 6 ++
脆弱类杆菌5×103个细胞 8 +
脆弱类杆菌2.5×103个细胞 - -
脆弱类杆菌103个细胞 - -
植物乳杆菌5×105个细胞 - -
纯化的唾液酸酶5单位 1 ++++
纯化的唾液酸酶1单位 1 ++++
缓冲液
*相对信号强度：非常强(++++)，强(+++)，中等(++)，弱(+)和无信号(-)。
D2.临床的样品(阴道拭子)
测试47例临床样品以测试唾液酸酶测试条用于诊断细菌性阴道病BV的临床意义。从以色列，Holon，Wolfson医疗中心的泌尿生殖感染单位的志愿者处获得阴道排出物样品。由医师使用无菌拭子(552C，Copan，意大利)收集阴道排出物。拭子头(尖端)放置在2ml的螺旋帽管内，并保持在4℃直到使用。通过将300μl的运行缓冲液加入管中，并通过涡流从拭子洗脱分泌物1分钟，从而清洗阴道拭子并获得同质的样品。对于每个阴道拭子，使用革兰氏染色法和Nugent评分(RPNugent等人，Reliability of Diagnosing Bacterial Vaginosis Is Improved bya Standardized Method of Gram Stain Interpretation(J.Clin.Microbiol.，29：297～301(1999)))进行BV的诊断。从300μl拭子洗液，取出25μl用于测试。如上所述进行对于培养样品的测试。
表2总结了47例用于BV诊断和用唾液酸酶测试条测试的阴道拭子洗液的结果。
表2：通过Nugent评分用于BV诊断的47例阴道拭子由唾液酸酶测试条获得的结果
Figure A200780029795D00151
唾液酸酶测试条的灵敏度和专一性是100％。总结在表1和2中的结果清楚地证明了提到的唾液酸酶测试条能被使用于BV的诊断。
唾液酸酶分析用溶液的材料和制备：
NBT溶液：2mg/ml的NBT(氯化硝基四氮唑蓝，N-8100BiosynthAG，瑞士)，5％的蔗糖(5553810，Frutarom，Haifa，以色列)，0.1％的MgCl2(1200310，Merck，Darmstadt，德国)在50mM的MES(M-8250，Sigma-Aldrich，Rehovoth，以色列)缓冲液中，pH6.0；具有Surfynol-440的NBT溶液：2mg/ml的NBT(氯化硝基四氮唑蓝，N-8100Biosynth AG，瑞士)，5％的蔗糖(5553810，Frutarom，Haifa，以色列)，0.1％的MgCl2(1200310，Merck，Darmstadt，德国)，0.5％的surfynol-440(2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7-二醇乙氧基化物，1.75EO/OH，Aldrich，461180)在50mM的MES(M-8250，Sigma-Aldrich，Rehovoth，以色列)缓冲液中，pH6.0；BCIN溶液：35.3mg的BCIN(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-α-D-N-乙酰神经氨酸钠盐，B4666，Sigma)在1ml的重蒸馏水中；运行缓冲液：0.5％的PEG(PolyEthyleneGlycol-15000，Merck，819003)，0.5％的BSA(01200050，Seracare，CA，美国)，0.1％的吐温20(Sigma，P-5927)，0.1％的MgCl2(Merck1200310)在TBS(Tris缓冲盐水)中，pH7.8。
细菌培养
产生唾液酸酶的细菌：脆弱类杆菌(ATCC#23745)的培养，107菌落形成单位/ml。通过在运行缓冲液中稀释培养物至以下细胞数制备25μl的样品：5×104，2.5×104，104和5×103。唾液酸酶阴性的细菌：植物乳杆菌(ATCC#14917)的培养，108菌落形成单位/ml。通过在运行缓冲液中稀释培养物制备具有5×105个细胞的25μl样品。纯化的唾液酸酶：得自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(P0720L，神经氨酸酶)的纯化重组细菌唾液酸酶，得自New England Biolabs，MA，美国。通过在运行缓冲液中稀释纯化的唾液酸酶至以下水平制备25μl的样品：每个样品5单位和1单位。
实施例2：碱性磷酸酶测试条
类似上述实施例1的方式，构造用于检测流体样品中碱性磷酸酶(AP)活性的测试条。分析基于显色的磷酸酶底物5-溴代-4-氯代-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)在AP存在下的水解以得到吲哚酚，以及所产生的吲哚酚与氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的进一步反应，以产生聚集在两基质间的界面处的靛蓝和甲腊。本实施例与上面实施例所述条之间的主要区别在于，本实施例中样品接收基质被浸在同时包含显色的底物BCIP和显色试剂NBT的溶液中。
A.制备BCIP-NBT浸渍的样品垫
在暗处于室温下，将玻璃纤维滤材(微孔，GFCP0010000，10mm×10cm)浸在BCIP-NBT溶液(0.2mg/ml的BCIP+0.3mg/ml的NBT，在0.1M的Tris缓冲液中，pH9.6)30分钟。将玻璃纤维滤材转移至干燥箱中，并在50℃干燥15分钟。
将BCIP-NBT浸渍的玻璃纤维滤材(样品垫)在室温下储存在干燥且黑暗的干燥房间(相对湿度5～10％)中。
B.卡的组装和条的修整
根据以下步骤并根据图4组装测试卡，图4说明了每个卡组件精确的纵向尺寸和位置。在制备之后，修整该卡以形成多个用于AP分析的条。
1.将带有隔离衬里保护的粘合剂的清洁塑料膜，即背面覆盖物，43×250mm的片(ARcare8876，Adhesives Research，Limerick，爱尔兰)放置在工作台的顶部。剥落隔离衬里以暴露出该带的粘合剂侧。
2.将反应膜(硝化纤维HF18004，微孔，SA3J154101，25×300mm)附着于背部覆盖物的粘合剂侧上，距下端8mm。
3.将BCIP-NBT浸渍的样品垫附着于背部覆盖物下侧上，并与反应膜的顶部重叠2mm。
4.将吸收垫(凝胶吸水纸，S&S，GB003，21×300mm)置于背部覆盖物上侧的顶部，与反应膜在顶部重叠12mm。
5.将顶部层压材料膜(ARcare7759，Adhesives Research，Limerick，爱尔兰)的隔离衬里剥落，以暴露出粘合剂侧，并将该膜以粘合剂面向反应膜的顶部附着，与样品垫和吸收垫的顶部重叠。
C.用抗地高辛AP测试碱性磷酸酶(AP)的活性
a.通过在pH7.8的TBS(Tris缓冲盐水)中稀释抗地高辛AP(Roche 10932740.75单位/μl)至以下水平制备25μl的样品：0.0375单位/测试，0.00375单位/测试和0.000375单位/测试。
b.将25μl的样品加载在条的样品垫上。
结果：
测试结果显示在图6中。阳性反应的信号，褐紫色，聚集在两个不同的基质(样品垫和反应膜)之间的界面处，即信号区处。阴性对照(其中没有抗地高辛AP存在)未显示任何信号。
所有的阳性信号在3分钟之内出现。
实施例3：过氧化物酶测试条
类似上述实施例1和2的方式，构造用于检测流体样品中过氧化物酶(POD)活性的测试条。然而在该实施例中，样品接收基质不用检测试剂浸渍，而是以它清洁未处理的形式组装入条。在即将加载样品之前，以四甲基联苯胺(TMB)作为显色物，将显色的过氧化物酶底物混合物的可商购获得溶液加载在条上。在过氧化物酶存在下，TMB底物混合物产生有色的产物。测试两个不同的TMB过氧化物酶底物混合物，Sigma T0565和Pierce#34028。Sigma底物报告得到不可溶的产品并推荐用于膜应用。Pierce底物得到可溶性产物底物并将用于ELISA。
A.运行缓冲液
0.5％的PEG(PolyEthyleneGlycol-15000，Merck，819003)，0.5％的BSA(01200050，Seracare，CA，美国)，0.1％的吐温20(Sigma，P-5927)，0.1％的MgCl2(Merck 1200310)在TBS(Tris缓冲液盐水)中，pH7.8。
B.卡组装和条修整
根据以下步骤并根据图4组装测试卡，图4说明了每个卡组件精确的纵向尺寸和位置。在制备之后，修整该卡以形成多个用于POD分析的条。
1.将带有隔离衬里保护的粘合剂的清洁的塑料膜，即背面覆盖物，43×250mm的片(ARcare 8876，Adhesives Research，Limerick，爱尔兰)放置在工作台的顶部。剥落隔离衬里以暴露所述带的粘合剂侧。
2.将反应膜(硝化纤维HF18004，微孔，SA3J154101，25×300mm)附着于背部覆盖物粘合剂侧上，距下端8mm。
3.将样品垫(玻璃纤维滤材，微孔GFCP0010000，10mm×10cm)附着于背部覆盖物下侧上，与反应膜顶部重叠2mm。
4.将吸收垫(凝胶吸水纸，S&S，GB003，21×300mm)放置于背部覆盖物上侧的顶部，与反应膜在顶部重叠12mm。
5.将顶部层压材料膜(ARcare 7759，Adhesives Research，Limerick，爱尔兰)的隔离衬里剥落，以暴露出粘合剂侧，并将该膜以粘合剂面向反应膜的顶部附着，与样品垫和吸收垫的顶部重叠。
C.用抗地高辛POD测试过氧化物酶(POD)的活性
a.通过在运行缓冲液中稀释抗地高辛POD(Roche 1207733，0.15单位/μl)至以下水平制备25μl样品：7.5单位/测试，0.75单位/测试和0.075单位/测试。
b.将5μl的四甲基联苯胺(TMB)底物混合物(Sigma T0565或Pierce#34028)放置在条的样品垫上。
c.将25μl的样品加载在样品垫的顶部。
结果：
图7显示了用Sigma底物和Pierce底物获得的结果。阳性反应的信号，蓝紫色，聚集在样品垫和两个不同的基质(样品垫和反应膜)之间的界面处，即信号区处。阴性对照(其中没有抗地高辛POD存在)未显示任何信号。
所有的阳性信号在3分钟之内出现。
本领域普通技术人员将领会本发明并不限于在上文中特别给出和描述的那些内容。相反，本发明的范围有附随的权利要求所限定。

Claims (20)

1.一种为检测流体样品中被分析物而构造的测试条，所述条包括顺序排列以在其间形成界面的第一流动基质和第二流动基质，所述第一流动基质包括可移动地结合至其上的检测组合物，其中所述检测组合物在所述被分析物存在下产生至少一种可检测的产物，并且其中选择所述第一和第二固体基质，使得当流体样品从所述第一流动基质行进到所述第二流动基质时，所述至少一种可检测的产物聚集在所述界面处。
2.如权利要求1所述的条，其中将所述检测组合物的至少一种组份以可再次溶解的干燥形式沉积在所述第一基质上。
3.如权利要求1所述的条，其中所述第一基质的孔隙率比所述第二基质的孔隙率高。
4.如权利要求1所述的条，其中所述至少一种可检测的产物通过第一基质的传送速率高于所述至少一种可检测的产物通过第二基质的传送速率。
5.如权利要求1所述的条，其中所述第一基质是玻璃纤维或者滤纸，以及其中所述第二基质是硝化纤维或者尼龙膜。
6.如权利要求1所述的条，其中所述至少一种产物在样品流体中是不溶的。
7.如权利要求1所述的条，其中所述检测组合物在样品流体中是能溶的。
8.如权利要求1所述的条，其中所述第一和第二基质被夹在背衬和上部非渗透性层压材料之间。
9.如权利要求8所述的条，其中所述背衬和上部层压材料的至少一个是透明的或者半透明的。
10.如权利要求1所述的条，其中所述被分析物是酶，并且其中所述检测组合物包括对所述酶具有特异性的显色底物试剂体系。
11.一种用于检测流体样品中酶的条，所述条包括顺序排列在非吸收性固体载体上的第一基质和第二基质，其间形成接合点，其中
所述第一基质具有可移动结合的酶检测组合物，所述组合物包括在暴露于所述酶时会产生至少一种可检测产物的组份的组合；并且
其中选择所述第一和第二基质，使得当流体样品从所述第一流动基质行进到所述第二流动基质时，所述至少一种可检测的产物在所述接合点处聚集。
12.如权利要求11所述的条，其中所述可检测的产物在样品流体中是不溶的。
13.如权利要求11所述的条，其中所述酶检测组合物包括所述酶的显色底物。
14.如权利要求13所述的条，其中所述酶检测组合物还包括增色剂。
15.如权利要求13所述的条，其中所述底物包括吲哚酚基团。
16.如权利要求15所述的条，其中所述酶检测组合物还包括四唑嗡盐。
17.如权利要求11所述的条，其中所述酶检测组合物包括所述酶的底物和显色试剂，其中在酶与酶底物之间的酶促反应存在下，所述显色试剂产生可检测到的有色产物。
18.如权利要求17所述的条，其中所述显色试剂是电子供体或者电子受体。
19.用于检测流体样品中被分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
提供如权利要求1～10任一项所限定的测试装置；
将所述测试装置暴露于所述流体样品；并且
观察颜色变化的出现；
其中出现显著颜色变化表明在所述流体样品中存在被分析物。
20.用于制造适于检测流体样品中被分析物的测试装置的方法，所述方法包括以下步骤：
选择用于检测所述被分析物的检测组合物，选择所述检测组合物使其在暴露于所述被分析物时产生至少一种能检测到的产物；
选择特征不同的第一和第二流动基质，选择所述第一和第二流动基质以使得当所述样品从第一基质行进到第二基质时，所述至少一种能检测到的产物保留在所述第一和第二基质间的界面处；
以顺序方式在非吸收性载体上排列第一和第二基质，使得在其间形成界面；并且
使所述第一基质具有预定量的所述检测组合物。
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