CN101496528A - 一种木霉属生防胶囊菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种木霉属生防胶囊菌剂及其制备方法，该菌剂由木霉真菌纯培养和颗粒固体培养基以及空心胶囊组成；经过菌种分离纯化，颗粒固体培养基的制备和干燥，以及空心胶囊的填充。该胶囊制剂保值期可以长达3年左右，制备过程简单，抗病效果大大提高，对蔬菜，果树，花卉等作物的菌核病、枯萎病、立枯病有较好的防治作用。

Description

一种木霉属生防胶囊菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物农药，尤其是涉及一种木霉属生防胶囊菌剂及其制备方法。

背景技术

微生物活性菌试剂是微生物农药的主要内容之一。当前国内外木霉属真菌中应用最多的哈茨木霉属菌，常用剂型为麸皮制剂。在中国发明专利2003101241219中揭示了一种颗粒包衣制剂，虽然提高了木霉真菌孢子的保质时间，但是制备过程比较复杂，而且容易受外界环境影响。另外，采用该申请公开的技术制备的木霉孢子的产量低。这就需要一种制备方法简单，保值期更长但并不影响其防病效果，受外界环境影响小的新型制剂。

发明内容

为了解决以上问题，一方面，本发明提供一种木霉属生防菌剂，它包括：木霉真菌纯培养活菌和固体状颗粒培养基。

在一个较优的实施方式中，颗粒培养基选自粒径为0.2-0.8mm之间的碎米，稻米，玉米，大小麦或高粱中的一种或几种。较优的，颗粒固体培养基为碎米。更优的，颗粒培养基的粒径为0.2-0.4mm。

在另一个更优的实施例子中，固体颗粒培养基含有，其中水与固体颗粒的重量比例为3：10～5：10。较优的，固体颗粒培养基种还包括(重量百分比)0.2％硝酸铵。最优的，固体颗粒与水的重量比例为10：4。

另一方面，本发明提供一种制备一种木霉属生防胶囊菌剂的方法，包括：

(1)木霉属真菌菌种分离、纯化与培养，至含菌量达到100％的纯度且无其它杂菌；

(2)颗粒状固体培养基的制备：选用粒径为0.2-0.8mm之间的固体颗粒，加水，然后灭菌；

(3)在固体培养基上接种纯化的木霉真菌；

(4)在温度为20—30℃，湿度65—90％条件下，发酵培养；

在一个优选的实施方式中，颗粒培养基选自粒径为0.2-0.8mm之间的碎米，稻米、玉米、大小麦或高梁中的一种或几种。更优的，选自粒径为0.2-0.4mm之间的碎米。在另一个优选的实施方式中，加入的水与固体颗粒重量比例为3：10～5：10；更优的，固体颗粒为碎米，加入的水与碎米颗粒重量比例为4：10。

另一个实施方式中，把经过步骤(4)制备的固体颗粒培养物于常温下干燥，然后装入能够被水解的空心胶囊中。在另一个优选的方式中，空心胶囊为植物胶囊。

另一方面，本发明还提供一种木霉属生防胶囊菌剂，包括：木霉真菌纯培养活菌和固体状颗粒培养基，其中，所述的木霉真菌纯培养活菌和固体状颗粒培养基被填充于空心胶囊中。在一个优选的实施方式中，固体颗粒培养基的粒径为0.2-0.8mm。在一个优选的实施方式中，固体培养基与水的重量比例为：10：3～10：5。在一个更优选的方式中，固体颗粒培养基为碎米。在另一个优选的实施方式中，胶囊为能够被水解的空心胶囊。较优的，胶囊为植物胶囊。最优的，胶囊为海藻多糖胶囊。较优的，固体颗粒培养基种还包括(重量百分比)0.2％硝酸铵。最优的，固体颗粒与水的重量比例为10：4。

空心胶囊

本发明可以采用的胶囊可以是以明胶为主要材料制备的明胶空心胶囊。明胶为主要原料，具有一些天然的优势：首先是原料来源广泛，动物皮、骨等都可作为其原料；其次是成膜性能优秀，明胶膜的机械性能、溶胶与凝胶可逆转的物理性能等都有很好的表现。另外，明胶是用动物皮、骨、筋腱中的胶原质经部分水解后，提纯而获得的蛋白质制品，可以为木霉真菌提供营养供后期孢子萌发和生长；它含多种氨基酸，富有营养。在一个优选的方式中，空心胶囊可以选自主要材料为鱼明胶和一些聚合物制备的空心胶囊。李正达介绍说，鱼明胶来源于深海鱼类的皮，无臭无味，没有携带疯牛病病毒的风险。市场上用鱼明胶做空心胶囊的产品有天然鱼油、螺旋藻、天然鱼油、纤维素等。聚合物主要包括羟丙甲纤维素和普鲁兰多糖。明胶、羟丙甲纤维素、普鲁兰多糖空心胶囊比较起来，在外观、含水量、脆碎度、透氧率、上机表现、化学稳定性等方面各有特点。羟丙甲纤维素无臭无味，为白色或乳白色纤维状或颗粒状粉末，来源于棉绒或木浆，溶于冷水，几乎不溶于无水乙醇等有机溶剂。

本发明所采用的胶囊还可以是植物性胶囊，例如以羟丙甲纤维素为主要材料制备的空心胶囊，它来源植物，无携带疯牛病病毒风险，囊壳含水量低且无脆碎，对储运环境要求较低；更重要的是化学性质稳定，无交联反应，膜附着性好，更适合于包衣。现在市场上有很多成功的应用实例，如天然草本植物胶囊、浓缩草本植物胶囊、金力宝植物胶囊等。普鲁兰多糖是无色、无味无臭的高分子物质，其由淀粉或糖类发酵制成，它易溶于水，不溶于有机溶剂，2006年中国卫生部批准其为食品添加剂，欧盟以及澳大利亚、加拿大也先后批准其为食品添加剂。普鲁兰多糖空心胶囊的某些性质与明胶胶囊相近，它属于植物源性，透氧率极低，可有效保护易氧化的充填物，而且化学性质稳定，无交联反应。明专利申请公开200510044141.4中所揭示的一种海藻多糖胶制造胃溶空心胶囊也可以作为本发明填充含木霉真菌固体颗粒培养基。

在以上所有的实施例子中，木霉属真菌可以为绿色木霉、哈茨木霉、康氏木霉、钩状木霉和多孢木霉之中的一种或多种按任意比例复合的真菌菌种。

有益效果

目前生产上常用的木霉菌剂多为它的孢子制剂，其主要的缺点是保质期短，通过现有方法产孢能力低；田间定殖能力差，一般保质期在半年左右，而本发明所公开的生防菌剂可以大大延长保质期，可以达到3年以上；另外，本发明所公开的木霉真菌制剂含孢量高，制作成本低；究其原因，主要有以下几方面原因：一是采用本发明公开的方法制作的胶囊制剂中不仅含有孢子，而且还含有菌丝、厚垣孢子等，而菌丝、厚垣孢子等存活明显较孢子长。特别地，当把含有孢子的培养基填充到空心胶囊中去，这样减少了制备包衣试剂的步骤，同时延长了该制剂的保质期。是因为空心胶囊可以自身形成一个木霉菌生存的小环境，该小环境更加不容易受外界环境影响，延长了木霉存活时间。本胶囊制剂中固体培养基的原料都来源于食品加工的副产品，木霉菌也分离自土壤，因此该颗粒剂能在土壤中迅速分解，不会对土壤造成污染，从而达到无残留、无公害、不污染环境的要求。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，现给予试验说明，这些试验仅仅是一些具体实施例子的体现，并不能对本发明的保护范围做出任何限定。

试验1  木霉菌分析纯化培养

木霉属绿色木霉菌种分离，纯化与培养：按《植物研究方法》(农业出版社，1979年出版)种所述的方法进行，从田间作物或土壤种，进行定向分离，随后纯化与培养，至含菌量达到100％的纯度且无其它杂菌。

试验2：固体培养基的筛选

根据其营养学特点和研制颗粒剂型的需要，选用直径为0.2-0.4mm碎米，大麦，小麦，麸皮配制培养基，固料为30g，初设料水(固体颗粒与水的重量比例)比10：5，接种量(质量百分比)4％，温度28℃，湿度80，恒温培养5d，在显微镜下计算产孢量。

从培养基对木霉菌生长的影响看(表1)，碎米、小麦、麸皮做为培养基均比较合适。其中碎米产孢子量较高，生长较缓慢。小麦产孢子快，菌丝生长较慢；麸皮长菌丝非常快，但对产孢子不利。综合孢子量和颗粒成型要求，选用直径0.2-0.4mm的碎米作为木霉固体培养载体。

表1  不同培养基对木霉菌丝生长和产孢量的影响

试验3：培养基的含水量对产孢量和固体颗粒成型的影响(0.2-0.4mm碎米)

培养基的含水量直接影响固体培养基的颗粒成型和产孢量，试验表明，料水比在10：2～10：5的情况下固体培养基的颗粒成型，10：2～10：4成型较佳，大于10：6则颗粒不成型，料水在10：4～10：7情况下产孢量最大，因此，选择培养基的含水量10：4为固体培养基颗粒成型和产孢的最佳含水量。

表2  培养基含水量对碎米固体培养基颗粒成型和产孢量的影响

碎米是大米加工的主要副产品，因为我国米的产量非常大，每一百公斤大米中可以生产8公斤碎米，而碎米除了作饲料外，基本没有其他用处，碎米的价格也非常低，具有来源丰富、价格低廉，营养丰富的特点，碎米除富含有淀粉、蛋白质、糖类等提供微生物生长的物质外，其中的b族维生素和生物素以及镁、磷、铁、钙等金属离子是微生物必需的生长因子，因此利用直径0.2-0.4mm的碎米作为木霉固体培养载体，料水比为10：2-10：5的情况下，灭菌后既能保持固体培养载体的成型性，又能保证木霉菌有效快速生长，这成为本木霉胶囊菌剂剂研制的关键。

碎米中已经有一定的碳氮源、外加碳源和氮源等为能加速木霉菌的固体培养和产孢量，在固体发酵过程中，菌株萌发、生长及繁殖需消耗水分，菌株代谢产生大量生物热，温度升高，水分蒸发，水活度(aw)下降，水量的变化必然会对微生物的生长及繁殖产生主要影响，因此在发酵过程中需要提供合适的水分，满足菌体正常代谢活动和降低发酵温度。

试验4：碎米(直径0.2-0.4mm)固体培养基固体发酵条件的研究

试验4—1：外加碳源对产孢量影响

在碎米培养基中分别添加葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，试验结果表明(图1)，在培养基中添加蔗糖时产孢量最高，葡萄糖次之。因此选用蔗糖作为外加碳源。不同浓度的蔗糖对产孢量的影响也不同(图2)，其中以添加0.2％蔗糖的效果最好。

试验4—2：外加氮源对产孢量影响：

试验结果表明，不同的无机氮源对产孢量的影响差异显著，以硝酸铵为氮源效果较好，分生孢子数达9.55×10⁹个/g^-1(图3)：有机氮源以1％蛋白胨浓度效果较好。进一步考察不同浓度硝酸铵对产孢量的影响，结果表明(图4)添加0.2％硝酸铵的效果最好，故确定以0.2％硝酸铵为最佳氮源。

试验4—3：磷酸盐对产孢量影响：分别考察了1％的KH₂PO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、对产孢的影响，每个处理设3个重复。

从图5可以看出磷酸盐对产孢量的影响试验中，KH₂PO₄对产孢有一定促进作用。不同KH₂PO₄浓度对产孢量的影响不同，其中以0.1％KH₂PO₄产孢效果最好(图6)。KH₂PO₄不仅提供磷元素，同时也提供钾元素因此KH₂PO₄是木霉的优良底物。

试验4—4：最佳接种量：

试验过程中发现菌株生长与接种量有很大的关系，接种量过低会使生长缓慢，发酵周期延长，同时增大了染菌机率，而且产孢量低；接种量大时，发酵周期缩短，而过高接种量则会造成生长过快，曲温升高，不利木霉的产孢量。试验结果表明接种量4％时产孢效果都较好(图7)。从生产成本考虑选用4％的接种量较合适。

试验4—5：最佳温度

分别选取22℃、24℃、26℃、28℃及变温(28℃～24℃～26℃)5个梯度。恒温处理以28℃产孢子效果最好，变温发酵时产孢量最高(图8)。这是因为发酵前期为菌株生长的适应期，温度较高有利于孢子萌发，使适应期缩短；对数生长期菌株生长速度较快，放出大量生物热，因而培养基内部温度升温较快，消耗水分较多，应适当降低温度，加强通气，促进散热；后期大量孢子成熟，培养基营养降低，升高温度能加快产孢，缩短培养周期。

试验4—6：装料量对木霉产孢量的影响：

木霉菌是一种好气性真菌，发酵中通气既可以提供菌体生长所需的氧，又可移走反应热和二氧化碳，提高传质、传热效率，但通气量由多种因素决定，其中包括微生物的特性、发酵过程产生的热量、固料厚度、固料间的空隙大小等。因此，在固体发酵中，固料层厚度及搅拌次数极为重要。从试验结果看(图9)，厚度在1.5—3.0cm范围内产孢子效果较理想，其中厚度为2cm时最佳，既有利于保持水分，又不影响散热效果。实验过程中还发现适量搅拌一次，有利于孢子产量的提高。

试验4—7：培养时间对木霉菌丝生长和产孢量的影响：

采用上述最佳的发酵条件，1d后，培养基中开始出现少量白色菌落；2—3d，大部分颗粒培养基中表面有白色菌丝；培养4d的颗粒培养基表面布满白色绒状菌丝，并出现浅绿色孢子；培养5d大部分颗表面出现浅绿色孢子；6—7d整个培养基呈现深绿色；7—8d颗粒培养基表面布满深绿色孢子，对1—10d孢子进行检测，在1～6d菌株一直处于生长阶段，其中7—8d菌株生长繁殖速度最快；8—10d生长速度基本保持不变，处于静止阶段，说明8天时孢子已成熟，而且8天后颗粒易粘连，因此，固体发酵适宜周期为8d。

表3  培养时间对木霉菌丝生长和产孢量的影响

试验5  木霉属生防胶囊菌剂的制备。

1，木霉属绿色木霉菌种的分离，纯化于培养：按照方中达“植物研究方法”(农业出版社，1979年出版)所述的方法，从田间作物或土壤中，进行定向分离，随后纯化和培养，至含菌量达到100％的纯度且无其它杂菌。

2，颗粒固体培养基的制备：以碎米为原料，从破碎的碎米中筛选出粒径为0.2-0.4mm的颗粒，料水比(碎米与加入的水的重量比)为10：4，并添加(重量百分比)0.2％蔗糖，0.2％(重量百分比)硝酸铵，0.1％(重量百分比)KH₂PO₄，放入高压灭菌锅中，按15磅的压力，120℃左右，灭菌30分钟，室温下冷却；

3，颗粒固体培养基的菌种接种和发酵培养：让冷却的固体培养基于经过步骤1纯化的木霉菌按照重量比例为

100的比例混合于接种，并固体培养基的厚度为2厘米，在温度为28℃下培养8天。

4，填装胶囊：把培养好的固体颗粒采用机械自动装囊机器自动的装入到海藻多糖空心 胶囊中，该胶囊购自浙江昂利康胶囊有限公司(浙江省嵊州市嵊州大道北1000号)。

试验6  本发明的胶囊制剂对一些病害的影响。

把试验5所制备的胶囊制剂在下列植物的苗期，按照每株3粒的标准定植于植物的根部，观察对下列病害的防止效果。

表4  培养时间对木霉菌丝生长和产孢量的影响

试验6  木霉生防菌胶囊的保质期测定分析

经过对试验5所制备的胶囊制剂存活期的测定表明，胶囊制剂在干燥、避光的室内自然常温下贮存16个月其存活率还达100％，贮存24个月其存活率达97.5％，贮存30个月其存活率达92.3％。因此，胶囊制剂存活期在干燥、避光的室内自然常温下贮存能存活30个月以上。

本文中用来描述装置的术语和表达方式并不是唯一不变的，并且我们没有任何意图使用这些术语和表达方式来排除描述本装置的结构或者特征的任何相同意义的表达方式，我们认同在本发明声明的范围内的各种不同的表达方式。因此，我们认为尽管在本文中本发明已经用各种具体方案和任意的特征描述清楚地展示出来，但是改变本文中揭示的设计的表达方式还要求助于那些有经验的专业技术人士，并且这些改变要与本发明附带的声明一致。

文章、专利、专利应用和所有其它文档的内容以及本文中提到的和引证的有用的电子化信息是结合在一起的，必须作为一个完整的内容来参考，发表其中任何一个部分都要特别指明这一点。申请者具有将任何和全部的这些文章、专利、专利应用或其它文档的信息和材料合并入该申请书作为本专利说明书揭示的一部分的权利。

Claims (10)

1.一种木霉属生防胶囊菌剂，其特征在于，它包括：能够被水解的空心胶囊以及位于该胶囊内的木霉真菌纯培养活菌和固体状颗粒培养基。

2.根据权利要求1所述的胶囊菌剂，其特征在于：所述的空心胶囊为植物胶囊。

3.根据权利要求1任一所述的胶囊菌剂，其特征在于：所述的固体颗粒培养基选自粒径为0.2-0.4mm之间的碎米、稻米、玉米、大小麦或高梁中的一种或几种。

4.根据权利要求1任一所述的胶囊菌剂，其特征在于：所述的活菌包括木霉孢子，木霉菌丝或厚垣孢子。

5.根据权利要求1—4任一所述的胶囊菌剂，其特征在于：所述的固体颗粒培养基中还含有水，水与固体培养基的重量比例为3：10～5：10。

6.根据权利要求1—4任一所述的胶囊菌剂，所述的固体颗粒培养基种还包括(重量百分比)0.2％硝酸铵。

7.根据权利要求1所述胶囊菌剂的制备方法，其特征是经过如下的工艺制备而成：

(1)木霉属真菌菌种分离，纯化与培养，至含菌量达到100％的纯度且无其它杂菌；

(2)颗粒状固体培养基的制备：选用粒径为0.2-0.8mm之间的固体颗粒，加水，并灭菌；

(3)在固体培养基上接种纯化的木霉真菌；

(4)在温度为20—30℃，湿度65—90％条件下，发酵培养；

(5)把经过步骤(4)制备的固体颗粒培养物于常温下干燥，然后装入空心胶囊中。

其中，固体颗粒选自碎米、稻米、玉米、大小麦或高梁中的一种或几种；加的水与固体颗粒重量比例为3：10～5：10。

8.根据权利要求7所述胶囊菌剂的制备方法，其特征是，在所述的固体培养基中还添加尿素、硝酸铵、硝酸钠和硫酸铵中的一种或几种。

9.一种木霉属生防菌剂，包括：木霉真菌纯培养活菌和固体状颗粒培养基，其特征在于：所述的固体颗粒培养基的粒径为0.2-0.8mm。

10.根据权利要求9所述的生防菌剂，其特征在于：所述的固体颗粒培养基中还含有水，水与固体培养基的重量比例为3：10～5：10，所述的固体颗粒选自碎米、稻米、玉米、大小麦或高梁中的一种或几种。

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