CN101493461A - 一种定量检测重症急性呼吸道综合症冠状病毒的蛋白质悬浮芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种定量检测重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SAS－CoV)的蛋白质悬浮芯片及其制备方法。本发明的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了新的检测模式化平台。

Description

一种定量检测重症急性呼吸道综合症冠状病毒的蛋白质悬浮芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和定量检测方法。

背景技术

重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)引起本世纪第一种在全球暴发的烈性传染病，SARS引起的恐慌至今人们仍记忆犹新。SARS-CoV为单股正链RNA病毒，属巢状病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属。根据血清型，冠状病毒属主要分为3个型，包括多种哺乳动物冠状病毒和鸟感染性支气管炎病毒。SARS-CoV是引起人类严重疾病的第一个冠状病毒。SARS-CoV主要结构蛋白有：S蛋白(刺突糖蛋白)、M蛋白(跨膜蛋白)、E蛋白(包膜蛋白)、N蛋白(核壳体蛋白)。N蛋白是其中最稳定的一个结构蛋白，也是感染过程中最丰富的病毒蛋白，证实是理想的诊断抗原。N蛋白是一长度从377-455个氨基酸不等，含有大量丝氨酸的碱性蛋白。SARS-CoV的N蛋白与其它冠状病毒的N蛋白差异较大。临床诊断SARS的实验室检测方法包括3类，即病毒分离、病毒核酸检测和免疫学检测，其中免疫学检测方法以抗体检测报道较多，抗原检测的报道较少。

目前，基于微生物学、化学、分子生物学和免疫学理论发展起来的病原体快速检验方法可以分别对环境样本中的生物威胁因子进行定性和定量检测。定性检测技术有常规的分离培养、血清学方法等，鉴定结果虽然准确可靠，但存在耗时长的缺陷，并且每次只能确定或排除一种病原微生物，往往延误紧急突发公共卫生事件的处置。快速检测技术主要是以病原体遗传物质核酸为基础的检测方法如核酸分子杂交、PCR、多重PCR等以及基于病原体核酸或抗原检测的生物传感器技术，如光纤传感器、电化学传感器、上转换磷光生物传感器、纳米传感器等。其中，利用多重PCR方法进行单一或多种致病菌的试验屡有报道。微生物定量检测方法包括细胞培养法法、半数致死量法、细胞计数法和阻抗计法等，但存在耗时长的缺陷；微生物定量检测的新技术主要是实时定量PCR，近年来在多种病原微生物的定量检测中得到广泛应用，但缺陷是只能检测病原菌的核酸，不能检测蛋白。

悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(liquid array，liquid chip)，是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。最早的报道是1977年Horan将该技术用于免疫学检测，至今，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应，克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重复性好等特点。目前利用悬浮芯片技术，国外已经开发了抗体检测、肿瘤标志、过敏原筛查、自身免疫病、细胞因子等微球悬浮芯片检测技术。

发明内容

本发明涉及一种重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)的蛋白质悬浮芯片的制备及定量检测方法。

本发明提供一种检测SARS-CoV的方法，该方法采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应可在96孔滤板上进行也可在微量离心管中进行。包括下列步骤：(1)每孔加入含已包被抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；(2)加入检测样品，孵育后清洗；(3)加入用生物素化检测抗体，孵育后清洗；(4)加入SA-PE，孵育后清洗，(5)加入检测缓冲液后混匀，(6)用悬浮芯片系统读取(平均荧光强度)FMI数值并分析数据。

本发明还提供一种SARS-CoV的蛋白质悬浮芯片的定量检测方法，该方法包括下列步骤：(1)加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比稀释，(2)制作样品浓度对应FMI值的剂量-反应曲线，(3)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(4)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断样品检测浓度，可判定方法检测限和动态检测范围。

本发明人经过大量和深入的研究，对SARS-CoV的蛋白质悬浮芯片制备及其检测条件作了实质性的优化，其具有下列优点：

1、抗体包被量的改进

抗体的包被量需要以检测效果进行优化，悬浮芯片所需的抗体包被量很低，每孔20-40ng/2500-5000个微球/测试，而传统免疫学方法-ELISA的包被量为200ng/孔/测试。

2、生物素标记的改进

标记抗体所用的生物素是过量的，过量的值试剂盒中有参考的计算公式。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能降低的现象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。

3、检测的灵敏度及动态范围

本发明SARS-CoV蛋白质悬浮芯片方法与经典的免疫学检测方法——ELISA相比，结果有着很好的吻合性(相关系数R²＝0.9874)。同时，悬浮芯片方法灵敏度(4.86ng/mL)高于ELISA方法(25ng/mL)灵敏度高5倍以上；并且悬浮芯片方法动态检测范围(3.91-25600ng/mL)高于ELISA方法动态检测范围(25-6400ng/mL)二个数量级。

4、方法的特异性

本发明通过选用SARS-CoV病毒主要结构蛋白之一的N蛋白为检测标的抗原，分别以SARS-CoV N32蛋白制备捕获抗体，以SARS-CoV N13蛋白制备检测抗体。本研究试验证明，在存在重组HIV P24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、NH蛋白等干扰抗原存在条件下本方法具有良好的特异性。

同时根据资料显示，N蛋白是该病毒结构蛋白中最稳定的一种蛋白，也是感染过程中最丰富的病毒蛋白，由于SARS-CoV的N蛋白与其它冠状病毒的N蛋白存在较大差异，因此能够有效去除免疫学检测中常出现的非特异现象。相关研究试验也证实N蛋白是理想的诊断抗原(Che，X.Y.，Qiu，L W.&Pan，Y.X.Sensitive and specific monoclonal antibody-basedcapture enzyme immunoassay for detection of nucleocapsid antigen in serafrom patients with severe acute respiratory syndrome.J.Clin.Microbiol.2004，42(6)，2629-2635.)。

5、样品的检测能力

本发明评价了悬浮芯片方法对“白色粉末”等环境和食品样品的检测能力。通过对奶粉、小麦面粉、玉米淀粉、混合型果珍粉末等模拟添加样品的检测，初步证实了该方法在检测可疑污染鼠疫菌等生物威胁因子的“白色粉末”样品中的实用性。

附图说明：

图1：SARS-CoV检测用044号微球包被SARS-CoV N蛋白抗体检测示意图；

图2：蛋白质悬浮芯片方法检测SARS-CoV N蛋白标准曲线图；

图3：ELISA方法检测SARS-CoV N蛋白标准曲线图；

图4：蛋白质悬浮芯片与ELISA方法检测SARS-CoV的相关性。

具体实施方式

本发明涉及的定量检测SARS-CoV病毒的蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法通过下面的具体实施方式作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限定。

一、材料

本发明采用下列缓冲液来制备悬浮芯片并进行目标物的检测：

(1)0.03M PB缓冲液(pH7.2)：2.83g Na₂HPO₄，1.36g KH₂PO₄定容至1L。

(2)0.01M PB缓冲液(pH7.2)：由0.03M PB缓冲液稀释而成。

(3)PBS缓冲液(pH7.4)：NaCl 137mmol/L；KCl 2.7mmol/L；Na₂HPO₄10mmol/L；KH₂PO₄2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄。用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在15psi(1.05kg/cm²)高压蒸汽20分钟，或过滤除菌，保存于室温。

(4)微球清洗液：PBS(pH7.4)，0.05％TWEEN-20。

(5)微球活化缓冲液100mM NaH₂PO₄：3g NaH₂PO₄，5N NaOH 1.5mL，定容于250mL，pH 6.2。

(6)微球包被缓冲液0.05M MES，pH 5.0：2.44g MES，5N NaOH 0.15mL，定容于250mL。

(7)微球保存液PBS-TBN：PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN，0.05％叠氮化物，pH 7.4。

(8)微球封闭液PBS-BN：PBS，1％BSA，0.05％叠氮化物，pH7.4。

(9)检测缓冲液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(10)抗体稀释液：0.01mmol/L PB(pH7.2)。

(11)微球稀释液：PBS，1％BSA，pH7.4。

(12)样品稀释液：0.01M PB，pH7.2。

(13)生物素化抗体稀释液：PBS-TBN(PBS，0.1％BSA，0.02％TWEEN-20，0.05％NaN₃，pH7.4)。

(14)SA-PE稀释液：PBS(pH7.4)，1％BSA。

二、抗原抗体

本发明所使用SARS-CoV N蛋白抗原为重组SARS-CoV全长核蛋白-N32(aa1-422)和重组SARS-CoV核蛋白片段N13(aa221-422)，均经镍亲和柱纯化。

本发明所使用捕获抗体为兔抗SARS-CoV N32IgG，检测抗体为生物素化兔抗SARS-CoV N13IgG。

三、待测样品的制备

1、目标分析物样品的制备

目标分析物为SARS-CoV，但涉及烈性传染病生物安全问题，以SARS-CoV N蛋白作为目标分析物样品。干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它病毒或其它蛋白质，包括重组HIV P24抗原、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等。将上述待分析样品均溶于样品稀释液液中，4℃保存。SARS-CoV N蛋白的储备液浓度均为1mg/mL。比较实验中，同样的样品用于ELISA和悬浮芯片的检测。

将待分析的SARS-CoV N蛋白用样品稀释液以4倍倍比稀释为不同浓度样品，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱和状态。

2、模拟污染样品

分别将0.5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL样品稀释液中，将不同浓度的SARS-CoV N蛋白掺入到粉末样品中，经充分振摇混匀，静置2h以上，使目标分析物与待测模拟白色粉末充分吸附。再用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜滤纸过滤或低速离心(2000rpm，1min)后，上清液作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。

实施例1、检测SARS-CoV病毒的蛋白质悬浮芯片的制备

1、捕获抗体包被编码微球

本发明采用的编码微球可以购自LUMINEX、BIO-RAD等公司，所用的编码微球用于标记可以捕获SARS-CoV病毒N蛋白的抗体，即利用兔抗SARS-CoV N32IgG包被微球。

A、编码微球的活化

取100μL(1.25×10⁶个)编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球清洗缓冲液悬浮，震荡并超声后14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的微球活化缓冲液，接着先加入10μL新鲜配置的EDC(50mg/mL)，紧接着加入10μL新鲜配置的Sulfo-NHS(50mg/mL)，在室温震摇20分钟。加入150μL的PBS(pH7.4)，震荡后，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100μL的PBS(pH7.4)悬浮编码微球。

B、用抗体包被编码微球

取捕获抗体兔抗SARS-CoV N32IgG 4-50μg加入到活化后的编码微球中，用PBS缓冲液定容至500μL，室温震摇2小时。14000g离心，小心吸出并弃去上清液。用500μL的PBS缓冲液洗一次，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入250μL的封闭缓冲液悬浮编码微球，在室温震摇30分钟，14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500μL的微球保存液洗涤编码微球，16000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150μL的微球保存液悬浮编码微球，于4℃避光保存备用。

C、包被微球的计数

吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(0.10mm；1/400mm²)在普通显微镜下计数。根据公式(每个大格数×10⁴×稀释倍数×体积(mL))计算微球数量。

2、检测抗体标记的生物素

A、生物素的标记

分别配制好浓度为10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30分钟(或冰上2小时)，过柱脱盐后分装，-20℃冻存备用。

B、抗体用量计算

以标记2mg/mL的IgG(分子量150,000)1mL溶液为例，需加入10mM生物素溶液约27μl。

计算过程如下：

$1\mathrm{mllgG}\×\frac{2\mathrm{mglgG}}{1\mathrm{mllgG}}\×\frac{1\mathrm{mmollgG}}{\mathrm{150,000}\mathrm{mglgG}}\×\frac{20\mathrm{mmolBiotin}}{1\mathrm{mmollgG}}=0.000266\mathrm{mmolBiotin}$

$0.000266\mathrm{mmolBiotin}\×\frac{\mathrm{1,000,000}\mathrm{\μl}}{L}\×\frac{L}{10\mathrm{mmol}}=26.6\mathrm{\μlBiotinReagent}$

结果判定：若阴性对照孔出现很淡蓝色，阳性孔颜色很深，则生物素化抗体可使用；否则，需重新进行新一轮抗体的生物素化标记。

实施例2、悬浮芯片制备条件的优化

1、微球包被不同抗体及包被量的选择

分别以4μg、8μg、10μg、16μg、24μg、40μg、48μg的量包被100μL编码为044号的微球。经质控过程检测，以10μg/1.25×10⁶个微球即20-40ng/2500-5000个微球/测试包被效果最好，显微镜下计数后避光冷藏保存待用。优化的悬浮芯片检测系统可成功用于SARS-CoV检测。包被SARS-CoV蛋白N抗体的044号微球均落在其正确检测区域内(如图1所示)，并且获得高信噪比结果(MFI值远大于2000)。

2、生物素化抗体的优化

本发明分别用氨基活性的生物素(生物素-LC-hydrazide)和羧基活性的生物素(即Sulfo-NHS-生物素，SH-活性的生物素)标记检测抗体，经检测效果比较，本实验中SH-活性的生物素标记检测抗体检测效果较好，检测效果的方法采用本领域的常规方法或安装制造商的产品说明书所述的方法。

本发明人经过试验验证，发现2mg/mL生物素化的抗体以1∶1000稀释作为检测抗体进行检测，检测结果显示生物素化检测抗体Bio-兔抗SARS-CoV NI3可获得高检测值和低背景值的检测效果。

实施例3、悬浮芯片检测样品的制备和检测

1、待测样品制备

用样品稀释液将SARS-CoV N蛋白抗原配置为不同浓度待测样品进行蛋白悬浮芯片检测。

2、样品的检测

采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，用清洗液洗涤并用真空泵抽滤；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。洗液洗涤并真空泵抽滤；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

实施例4、悬浮芯片对SARS-CoV N蛋白抗原的特异性检测

应用悬浮芯片检测方法分别对重组HIV P24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH蛋白等进行检测，仅SARS-CoV N蛋白抗原为阳性，其余干扰抗原均为阴性。说明本发明所建立的SARS-CoV N蛋白抗原悬浮芯片检测方法与其它测试抗原均不发生交叉反应或非特异反应。

实施例5、悬浮芯片定量检测模型的建立

1、SARS-CoV N蛋白抗原标准曲线样品制备

用样品稀释液将SARS-CoV N蛋白抗原标准品由25.6μg/mL以4倍倍比梯度稀释至0.391ng/mL成系列浓度样品。同时，相同样品用于ELISA方法检测。

2、剂量-反应标准曲线的绘制

按照实施例3中的检测方法检测上述系列浓度样品，并根据悬浮芯片系统检测结果绘制对数-对数剂量-反应标准曲线(如图2所示)。其中，X轴代表抗原的浓度(ng/mL)，Y轴代表悬浮芯片仪检测的荧光值(MFI)。每个数据代表3次的检测结果平均值，坐标轴以对数-对数关系设定。

悬浮芯片系统根据检测结果拟合剂量-反应标准曲线方程：

FI＝0.921362+(9400.93-0.921362)/[1+(Conc/1140.28)^-0604039]²¹⁹⁹⁹⁵

3、悬浮芯片检测SARS-CoV N蛋白抗原的灵敏度和动态范围

本发明定义最低检出限(LOD值)为临界值(Cutoff)对应的检测物浓度。其中，Cutoff的定义是采用空白对照样品(Blank)荧光检测信号MFI均值加3倍标准差(SD)，即Cutoff值为＝MFI_Blank+3×SD。根据最低检出限定义和标准曲线方程，判定悬浮芯片检测SARS-CoV N蛋白抗原的灵敏度为：4.86ng/mL，其Cutoff＝104.68(Blank＝87.5，SD＝5.66)。

本发明定义最高检出限为使编码微球的结合位点处于饱和状态的检测物浓度。根据标准曲线随着SARS-CoV N蛋白抗原浓度的升高，其对应的MFI值也随之递增，当SARS-CoV N蛋白抗原浓度超过25600ng/mL时，抗原抗体的免疫反应达到饱和状态，MFI值开始进入平台期，说明样品中的待检物浓度过高，需要将样品稀释后再检测。

因此，根据最低检出限与最高检出限可以判定本发明即悬浮芯片定量检测SARS-CoV N蛋白抗原的动态范围为4.86～25600ng/mL。

实施例6、蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法检测SARS-CoV N蛋白抗原的比较

1、双抗体夹心ELISA检测方法

作为对这，采用包括下列步骤的双抗体夹心ELISA检测：

1)向普通ELISA微孔板每孔加入50μL用PB缓冲液稀释的捕获抗体5-50μg，4℃静止过夜；

2)加入封闭液，在37℃封闭2小时；

3)洗液洗3次，拍干；

4)加入检测样品，每孔50μL，室温放置40分钟；洗液洗3次，拍干；

5)加入适量生物素化检测抗体，每孔50μL，室温放置30分钟；洗液洗3次，拍干；

6)加入适量SA/HRP(辣根酶标记链霉亲和素)，50μL/孔，室温放置3分钟；洗液洗3次，拍干；

7)加入TMB显色液(可溶型单组分TMB底物溶液)显色，50μL/孔，室温放置10分钟；

8)用2M H₂SO₄终止反应；

9)应用酶标仪测读A_450nm数值。

2、样品的悬浮芯片检测方法

采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤板上进行。

1)每孔加入50μL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空泵抽滤2次；

2)加入50μL检测样品，混匀后室温避光震摇30分钟，用清洗液洗涤并抽滤3次；

3)加入50μL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇30分钟，洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

4)加入50μL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10分钟。用清洗液洗涤并真空泵抽滤3次；

5)加入125μL的检测缓冲液，经蜗旋重悬混匀；

6)用Bio-Plex悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

3、两种检测方法的灵敏度和动态范围及相关性的比较

实施例5中制备的相同一组SARS-CoV N蛋白抗原样品同时应用悬浮芯片和ELISA方法进行检测。绘制ELISA方法检测SARS-CoV N蛋白抗原的标准曲线(图2和图3中横坐标为样品浓度，纵坐标为吸光度值，坐标轴取对数-对数关系)，并与实施例5中悬浮芯片方法结果进行比较。

根据两种方法标准曲线：悬浮芯片方法(如图2所示)灵敏度为4.86ng/mL，线性检测范围4.86～25600ng/mL；ELISA方法(如图3所示)灵敏度为25ng/mL，线性检测范围25-6400ng/mL。可以得出结论：检测相同SARS-CoV N蛋白抗原样品，蛋白悬浮芯片方法比ELISA方法具有更高的检测灵敏度，即高5倍；并且具有更宽的动态检测范围，即高2个数量级。

另外，将两种方法检测结果在25-6400ng/mL范围内进行比较，如图4所示，可以判定蛋白悬浮芯片方法与ELISA方法有良好的相关性，相关系数为0.9874。

实施例7、人工污染“白色粉末”样品的检测

1、人工污染“白色粉末”样品的制备

将一定含量的SARS-CoV N蛋白或空白(样品稀释液)依照不同浓度分别掺入奶粉、淀粉、面粉、速溶果珍等粉末样品制备人工污染样品。将0.5g粉末加入到5mL样品稀释缓冲液中，充分混匀，静置2小时，让待测样品与白色粉末充分吸附。

2、人工污染“白色粉末”样品的检测

对上述被污染的“白色粉末”样品进行处理，选用棉花、薄滤纸、厚滤纸、0.45μm滤膜、0.22μm滤膜过滤，以及2000rpm、5分钟和1000rpm、4分钟低速离心等方法处理人工添加样品后的粉末溶液，收集滤液或上清液后按照实施例进行悬浮芯片分析检测。

表1悬浮芯片对人工污染“白色粉末”样品的检测结果

根据所检测的18个样品中，检测结果如表1所示全部正确，初步证明了蛋白悬浮芯片方法可以快速、准确、高效地应用于SARS-CoV病毒污染的“白色粉末”样品的实际检测工作。

Claims (11)

1、一种采用双抗体夹心免疫学检测模式检测重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SAS-CoV)的方法，其特征在于，检测过程中全部反应可在96孔滤板或者微量离心管中进行，该方法包括下列步骤：

(1)向孔加入含已包被抗体编码微球的工作溶液，用清洗液清洗；

(2)加入待测样品，孵育后清洗；

(3)加入用生物素化的检测抗体，孵育后清洗；

(4)加入SA-PE，孵育后清洗；

(5)加入检测缓冲液后混匀；

(6)用悬浮芯片系统读取平均荧光强度(FMI)数值并分析数据。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为兔抗SARS-CoV N32 IgG，采用生物素标记的兔抗SARS-CoV N13作为检测抗体，并且其组合组成双抗夹心检测体系。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗体兔抗SARS-CoV N32 IgG用量为10μg/1.25×10⁶个编码微球或20-40ng/2500-5000个微球/测试。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体兔抗SARS-CoV N13的生物素为羧基活性的生物素。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-兔抗SARS-CoV N13以1∶1000稀释作为检测抗体进行检测。

6、一种定量检测重症急性呼吸道综合症冠状病毒(SAS-CoV)的蛋白质悬浮芯片方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)加入的阳性检测样品或标准品经梯度倍比稀释，所述梯度倍比稀释为4倍；

(2)将系列稀释样品在悬浮芯片中检测读取对应荧光值(MFI)；

(3)制作样品浓度对应MFI值的剂量-反应曲线；

(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程；

(5)未知浓度样品可根据剂量-反应曲线和方程判断样品检测浓度，可判定方法检测限。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，在测定待测样品的FMI数值时包括以下的步骤：

(1)加入含相应编码微球的工作溶液，洗涤；

(2)加入待测样品，混匀后室温避光震摇，洗涤；

(3)加入适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混匀后室温避光震摇，洗涤；

(4)加入SA-PE，室温避光震摇，洗涤；

(5)加入的检测缓冲液，经振摇重悬混匀，用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。

8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，用于包被微球的捕获抗体为兔抗SARS-CoV N32 IgG，采用生物素标记的兔抗SARS-CoV N13作为检测抗体。

9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的包被微球的捕获抗体兔抗SARS-CoV N32 IgG用量为10μg/1.25×10⁶个编码微球或20-40ng/2500-5000个微球/测试。

10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中的标记检测抗体兔抗SARS-CoV N13的生物素为羧基活性的生物素。

11、如权利要求6所述的方法，其特征在于，2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-兔抗SARS-CoV N13以1∶1000稀释作为检测抗体进行检测。

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