CN101486969B - 一种堆肥发酵复合菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种适宜在堆肥早期接入的微生物复合菌剂的制备方法，分别使用产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌，经过单体菌种固体斜面培养、种子液扩大培养、复合发酵液培养制得。其活体微生物数量可达到1×109个/ml以上。应用于城市垃圾的堆肥处理或畜禽粪便高温堆肥处理。在堆肥初期接入，通过加强早期酸化，增强底物真菌活动，实现快速腐熟，从而提升堆肥品质，提高堆肥生产效率。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂的生产方法，具体为一种用于堆肥发酵的复合型微生物菌剂的制备方法。
二、背景技术
高温好氧堆肥工艺是固体废弃物资源化处理常用的技术，是集无害化处理和资源再生利用于一体的生物学处理方法，具有较强的物质转化能力及易被人为控制等优点。其过程从初始堆肥的原料阶段，先后经历升温阶段、高温阶段、降温阶段、熟化稳定阶段，最后达到腐熟。由于堆肥化是一种生物学工艺过程，在堆肥过程的不同阶段对有机物的降解起关键作用的微生物种群不同。在工艺过程中所要控制的各种参数就是那些对微生物有影响的因素，因为它们决定微生物活动的程度，进而影响堆肥的速度与质量。传统堆肥法一般都是采用增加营养和改善环境条件的方法，利用堆制原料中的土著微生物来降解有机污染物，但传统堆肥法存在发酵时间长、产生臭味且肥效低等问题。目前人们广泛采用向堆肥中接入微生物菌剂来加速腐熟和改善堆肥产品质量。
堆肥物料包括城市污泥、垃圾、作物秸杆、畜禽粪便等固体废弃物。它的成分均由单糖、蛋白质、脂类、纤维素和半纤维素以及木质素等，其中纤维素和半纤维素以及木质素占的比重较大。因而木质纤维素转化为腐殖质是堆肥充分腐熟的关键问题，而降解纤维素的微生物主要是杆状细菌和真菌。不同的底物成份对菌种的选择有不同的要求。目前已被应用或有应用报道的菌种有：乳酸菌、酵母菌、绿色木霉、放线菌、光合细菌、高温芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、灰藤黄链霉菌W1、蜡状芽孢杆菌、白腐菌等。
如申请号为200510031158.6的中国专利申请说明书公开了一种固定化白腐菌剂及其在垃圾堆肥化中的应用方法，其采用植物材料玉米芯作固定化载体，将游离白腐菌制成固定化菌剂，再将固定化白腐菌接入增活培养基中富集培养4～6天，滤去培养液，制成固定化菌剂；在垃圾堆肥物料的温度降至40℃左右时接种固定化菌剂，并调整堆料含水率，控制通风，及时翻堆至腐熟。该方法用白腐菌较强的产木质素降解酶的能力和对重金属的强吸附固定能力，又采用固定化技术降低了堆肥成品中Pb、Cd等有毒金属的迁移性及其总量。但该方法由于接入菌种单一，在不同的底物中降解腐熟效果差距较大，对物料适应性不强，影响腐熟效果。又如申请号为200610031262.X的中国专利说明书公开了一种在堆肥的不同堆制阶段两次添加不同促腐发酵剂的垃圾堆肥法及其促腐发酵剂，其两种促腐发酵剂都是将不同菌种的单一发酵液按一定比例混合而制成的复合酶液体系。在堆肥开始时添加促腐发酵剂A，以加速果胶、脂类、蛋白质等易降解物的分解，并初步破坏木质纤维结构、促成部分木质纤维素类难降解物的降解。在堆肥降温阶段的中后期添加促腐发酵剂B，进一步加强对木质纤维素等难降解有机物的降解作用，促进堆料的深度腐熟。通过两次添加促腐发酵剂，加快了堆料的降解，加快堆肥腐熟进程，提高了堆肥品质。但此方法需要两次添加，需要掌握两次添加的时机，并且要每天翻垛一次，操作复杂作业量较大，而且除臭效果不尽理想。
在堆肥的生物降解和发酵过程中，开始时pH值在7左右，为好氧发酵，两三天内pH值上升到8.5左右，发酵方式改为半厌氧发酵，pH值逐步下降。土著微生物中真菌在pH5.5-8.0的环境中大量生长繁殖，促进底物中纤维成份的降解。如何在堆肥发酵早期接入外源微生物，促进快速升温，并迅速降低堆肥的pH值，缩短前期发酵的时间和进程，以促进底物中土著微生物特别是真菌的生长，从而提高纤维降解的效率，并缩短堆肥发酵时间，是目前堆肥发酵领域人们不断探索的新课题。
三、发明内容
本发明是要提供一种适宜在堆肥早期接入的微生物复合菌剂，通过加强早期酸化，增强底物真菌活动，以实现快速腐熟，从而提升堆肥品质，提高堆肥生产效率。
本发明提出的一种堆肥发酵复合菌剂的制备方法，该方法分别使用产朊假丝酵母(Candida utilis)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，经过以下的培养过程：
单体菌种固体斜面培养-种子液扩大培养-复合发酵液培养；
并且所述复合发酵液培养是将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.2-0.5∶0.5-1∶0.5-0.8混合后，按5％-10％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在25-30℃静置培养7-10d；当发酵液pH值达到3.5-4.0，活体微生物数量达到1×109个/ml以上，制备完成。
上述的发酵培养基液为：
蔗糖10-20g，蛋白胨0.5-5g，酵母粉1-2g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，硫酸铵0.5-1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.3-0.6g，乙酸钠1-3g，碳酸氢钠2-4g，硫酸亚铁0.01-0.02g，水1000ml，pH值7。
产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌三种菌种相互之间没有拮抗和抑制作用。堆体发酵进行时，先是好氧状态，再到半好氧或厌氧状态。由于枯草芽孢杆菌具有很强的淀粉糖化酶、纤维素酶活性以及蛋白酶活性，可先将淀粉水解产生糖类。植物乳杆菌和产朊假丝酵母菌能够利用堆肥中原有的单糖和水解糖，产生乳酸和其他有机酸小分子。并且乳酸具有抑制其他细菌生长的功能，造成堆体pH值下降。在半好氧或厌氧状态下，当pH在5.5-8.0，真菌适合生长，而细菌受到抑制，真菌能够利用这些厌氧状态下产生的有机酸，大量繁殖。本发明由于外源微生物的接入使得堆体中的微生物活动加剧，产生大量的热，使堆体温度快速升高。不仅三种外源菌参与并加剧了堆肥物料的降解，而且为底物中真菌的生长繁殖提供了良好的环境，促进真菌的活动。由于真菌是以纤维素为底物并具有较高的降解效率，使得堆体的发酵过程加快。又由于植物乳杆菌和产朊假丝酵母发酵能够产生小分子有机酸，可以中和堆肥中氨气等碱性气体，从而消除臭味。
本发明的复合菌剂，选择功能不同的三种菌相配伍，在堆肥早期接入，在外源微生物的促进下，能快速提升堆体温度和降低堆体pH值，缩短堆体发酵的前期时间，并为底物中真菌的繁殖创造条件，引发土著微生物的活动，强化纤维素的降解，从而使堆肥发酵的周期缩短，降解质量提升。并且能够消除堆肥臭味，改善环境质量。
四、附图说明
图1为本发明堆肥复合发酵菌剂的工艺流程图。
图2为复合发酵菌剂在堆肥中使用时堆体温度变化图。
图3为复合发酵菌剂在堆肥中使用时堆体pH值变化图。
五、具体实施方式
本发明所采用的产朊假丝酵母(Candida utilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，三种菌种的标准株均来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，三种菌编号分别为：枯草芽孢杆菌10035，植物乳杆菌6009，产朊假丝酵母31395。
结合附图1所示，本发明实施的具体步骤为：
1、单体菌种固体斜面培养。
(1)固体斜面的制备。
植物乳杆菌斜面培养基配方：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，乳糖5g，氯化钠5g，琼脂15g，pH值5.5-6.5，蒸馏水1000ml。
产朊假丝酵母采用马铃薯糖琼脂培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，pH值7.2-7.4，蒸馏水1000ml。
枯草芽孢杆菌斜面培养基配方：葡萄糖20g，蛋白胨15g，氯化钠5g，牛肉膏0.5g，琼脂15g，自然pH值，蒸馏水1000ml。
(2)固体斜面培养。
分别将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌菌种接入固体斜面，其中枯草芽孢杆菌培养温度为30-35℃，培养时间16-24h；产朊假丝酵母和植物乳杆菌培养温度为25-28℃，培养时间24-36h。
2、种子液扩大培养。
(1)种子培养液制备。
产朊假丝酵母液体培养基配方为固体培养基去除琼脂。
枯草芽孢杆菌液体培养基配方为固体培养基去除琼脂。
植物乳杆菌液体培养基配方(MRS液体培养基)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，CH3COONa·3H2O 5g，吐温80ml，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.25g，蒸馏水1000ml，pH6.9±0.1。
(2)扩大培养。
将纯化培养的产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌，分别从保藏的斜面培养基上接种至上述的种子液扩大培养基。每个250ml的发酵瓶中装100ml，培养温度28-32℃，摇床上培养，转速180rpm，培养24-36h，菌数含量达到1×109/ml。
3、复合发酵液培养。
实施例一：
在1000ml水中加入蔗糖10g，蛋白胨0.5g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.5，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.36g，硫酸亚铁0.02g，乙酸钠1.0g，碳酸氢钠0.5g，pH值7.0。培养基115℃灭菌30min。将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.2∶0.5∶0.5混合后，按10％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在25℃静置培养10d；当发酵液不再产生气泡时，发酵终止。此时pH值为4.0，味酸，有白色膜状物漂浮在发酵液表层，活体微生物数量达到1×109个/ml以上，培养完成。
实施例二：
在1000ml水中加入蔗糖15g蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，乙酸钠1.0g，碳酸氢钠0.5g，pH值7.0。培养基115℃灭菌30min。将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.5∶1∶0.8混合后，按5％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在30℃静置培养7d；当发酵液不再产生气泡时，发酵终止。此时pH值为3.8，味酸，有白色膜状物漂浮在发酵液表层。摇匀后显微计数能够达到1×109个/ml，培养完成。
实施例三：
在1000ml水中加入蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.02g，乙酸钠1.0g，碳酸氢钠1.5g，pH值7.0。培养基115℃灭菌30min，分别将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.5∶0.5∶0.8混合后，按10％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在28℃静置培养7d。当发酵液不再产生气泡时，发酵已经终止。此时pH值为3.5，味酸，有白色膜状物漂浮在发酵液表层。摇匀后显微计数能够达到1×109个/ml以上，培养完成。
此实施例为最佳实施例。
实施例四：
在1000ml水中加入蔗糖10g蛋白胨5g，酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.36g，硫酸亚铁0.02g，乙酸钠1.0g，碳酸氢钠2.5g，pH值7.0。培养基115℃灭菌30min，分别将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.4∶0.8∶0.6混合后，按8％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在30℃静置培养7d。当发酵液不再产生气泡时，发酵已经终止。此时pH值为4，味酸，有白色膜状物漂浮在发酵液表层。摇匀后显微计数能够达到1×109个/ml以上，培养完成。
实施例五：
在1000ml水中加入蔗糖15g蛋白胨2g，酵母粉1g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.36g，硫酸亚铁0.02g，乙酸钠2.0g，碳酸氢钠0.5g，pH值7.0。培养基115℃灭菌30min，分别将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.2∶1∶0.5混合后，按10％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在28℃静置培养8d。当发酵液不在产生气泡时，发酵已经终止。此时pH值为3.8，味酸，有白色膜状物漂浮在发酵液表层。摇匀后显微计数能够达到1×109个/ml以上，培养完成。
4、复合发酵菌剂在堆肥中的使用。
按以上步骤及实施例1-5制成的复合菌剂，使用时按1∶20-100接入堆肥底物，将底物水分调节到50-60％，并混匀，堆肥按长宽高2m×1.2m×1.0m，堆成条垛状，每周翻堆一次，六周后堆肥底物完全腐熟。
经对比实验测量，堆体温度比不接入的对照组升温提前(如附图2)，pH值下降期提前(如附图3)，发酵周期可缩短10d左右。
Claims (2)
1.一种堆肥发酵复合菌剂的制备方法，其特征是该方法分别使用产朊假丝酵母(Candida utilis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，经过以下的培养过程：
单体菌种固体斜面培养-种子液扩大培养-复合发酵液培养；
所述复合发酵液培养是将产朊假丝酵母、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌的种子液以体积比0.2-0.5∶0.5-1∶0.5-0.8混合后，按5％-10％的量接入高温灭菌后的发酵培养基液中，在25-30℃静置培养7-10天；当发酵液pH值达到3.5-4.0，活体微生物数量达到1×109个/ml以上，制备完成；
上述的发酵培养基液的配方为：
蔗糖10-20g，蛋白胨0.5-5g，酵母粉1-2g，磷酸二氢钾0.5-1.0g，硫酸铵0.5-1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.3-0.6g，乙酸钠1-3g，碳酸氢钠2-4g，硫酸亚铁0.01-0.02g，水1000ml。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基液的配方为：
蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵1.0g，氯化钙0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.02g，乙酸钠1.0g，碳酸氢钠1.5g，水1000ml，pH值7.0。
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