CN101484618A - 支架 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用作引导性组织再生和修复的医疗器械的支架，尤其是本发明涉及包含平均纤维直径为约1.2－4.0微米的纤维的支架，其中纤维包含乙交酯。本发明还涉及选择性捕获细胞源材料的细胞群体的支架的应用。

Description

支架
发明领域
本申请要求2006年5月12日提交的题为“细胞接种装置和方法”的英国临时申请号0609455.1和2007年2月14日提交的题为“支架”的英国临时申请号0702846.7的权益，上述两个申请的全部内容通过引用结合于本文。
本发明涉及可用作引导组织再生和修复的医疗器械和从细胞源材料中选择性捕获细胞群体的支架。
发明背景
支架技术已知用于慢性和急性创伤中的皮肤再生。许多这样的技术开拓了相关的纯天然聚合物，诸如由动物或植物组织中提取的胶原、丝、藻酸盐、壳聚糖和透明质酸盐的生物学特性。其它的是基于含多种天然巨分子的加工的细胞外基质(脱细胞的(decellularized))物质。这样的支架的实例是
Figure A200780025215D0005100609QIETU
(Healthpoint Limited)，一种生物衍生的基于细胞外基质的创伤用产品，其包含源于含I型胶原、糖胺聚糖和某些生长因子的猪的非细胞小肠粘膜下层。
然而，由于潜在的病原体传播、免疫反应、操作失当、机械特性和较少受控制的生物可降解性(biodegradability)1，对于天然聚合物的应用感到忧虑。
在二十世纪30年代2早期，静电纺技术被首次引入织造业(fabricate)或家用非织造织物产品中。近年，该技术已经被利用形成用于组织工程学的聚合物纤维的支架。该项技术包括将天然或合成的聚合物溶液挤压通过毛细管，在末梢形成聚合物溶液滴并且在末梢和收集标靶之间施加大的电位差。当电场克服小滴的表面张力，启动聚合物溶液喷射并加速喷射至收集标靶。在喷射物通过空气时，溶剂蒸发并在标靶上形成非织造聚合物织物。这样的平均纤维直径在微米或纳米范围的含纤维的织物已经被用于制造用于组织工程学应用的复杂的三维支架。
在科学界广为接受的是，具有小直径纤维的支架导致最大的生物学反应，此为检测细胞粘附和增殖3所证实。这被认为是纤维提供细胞可粘附并随后在其上增殖的大的表面积的结果。由于在纤维直径和孔径之间存在强的相关关系，具有小直径纤维的任何支架也将以小的孔径为特征。然而，此将对细胞迁移进入支架具有负面作用，可能导致围绕支架外周的替代组织的再生受限，而支架的核心实质上是非细胞的(acellular)。
与许多已知的静电纺支架相关的不曾预料到的问题是，当如在表1描述中的体温下的水溶液中孵育时，它们在空间上变得不稳定。这种不稳定性在宏观和微观上都是可测定的，前者通过支架收缩测定，而后者通过最初的纤维构造的损失和最初的孔径的减小来测定。空间上不稳定的支架由于它们的收缩可潜在地对支架的行为产生显著影响和其与细胞环境的相互作用而将使应用范围最小。
令人惊讶地，我们已经确定支架具有使细胞粘附、增殖和迁移达最优化的构造，同时还证明在对于这些最初的细胞过程所需要的时间内在空间上是稳定的。
血液包含多种被分类为红细胞、白细胞和血小板的特殊细胞类型。血小板，也称为凝血细胞的主要功能是凝血。血小板释放许多因子进入血液，包括ECM蛋白和细胞因子，诸如生长因子和其它促炎症因子如5-羟色胺、缓激肽、前列腺素、前列环素、血栓烷和组胺，从而增强细胞增殖和迁移至作用部位并引起血管扩张和渗漏。
局部给予某些细胞类型已经显示比局部给予外源性因子更有效。因此，在某些情况下，可能需要选择性地恢复来自血液样本中的治疗上有益的特殊的细胞亚集。例如，可能需要选择地从血液样本中分离和重新获得血小板群体，以便在创伤部位可立即提供外源性血小板以增强机体固有的修复机制。
还有，不带细胞的植入的支架不表现出如细胞-接种装置的相同的结构完整性。此导致延长的时期直至该装置真正具功能性的，在此时期其可失效。
支架在某些医疗和/或手术应用的同时，可为满意的是细胞迁移发生在植入后，在其它情况下，可能需要植入已经含有细胞的支架。
接种支架的已知方法是将支架在生物反应器中与细胞群体一起培养，从而，使细胞逐渐渗透入支架。然而，使用生物反应器是昂贵的，在技术上有难度并且生产最终产品需要花费数周。
将细胞直接注射入预-植入支架的尝试不导致适宜的贯穿支架的分布，造成功能丧失。
发明人已经发现，本发明支架除了证明植入后对于细胞粘附、增殖和迁移的最佳几何学特性外，还可被用于细胞捕获装置中以从样本中优先捕获特殊的细胞群体。
本发明支架从具有血小板密度约200000-300000/mm3的血液样本中选择性地捕获血小板群体。红细胞不被选择性地捕获。该选择特别令人惊讶的是，血小板的直径为约2-3μm和红细胞的直径为约6-8μm。可将该接种了血小板的支架植入医疗和/或手术部位。
本发明支架也从具有白细胞密度约5000-7000/mm的血液样本中选择性地捕获白细胞群体。红细胞不被选择性地捕获。
发明简述
依据本发明的一个方面，其提供包含平均纤维直径为约1.2-4.0微米的纤维并且其中所述纤维包含乙交酯(glycolide)的支架。
在本发明的实施方案中，平均纤维直径为约1.3-2.9微米。在本发明的再一个实施方案中，平均纤维直径为约1.5-3.5微米并且更特别为约1.9-2.6微米。
在本发明的实施方案中，纤维包含超过90％的聚合物，超过95％的聚合物或由100％的聚合物组成。
用于本发明的聚合物可为天然、合成、生物相容性的和/或可生物降解的。
术语“天然聚合物”指天然存在的任何聚合物，例如，丝、胶原-基物质、壳聚糖、透明质酸和藻酸盐。
术语“合成聚合物”意为不是天然存在的任何聚合物，尽管该聚合物由天然存在的生物材料制备。实例包括，但不限于脂族聚酯类、聚(氨基酸)类、共聚(醚酯)类、聚烯类、草酸酯类、聚酰胺类、酪氨酸衍生的聚碳酸酯类、聚(亚氨基碳酸酯类)、聚原酸酯类、聚草酸酯类(polyoxaesters)、聚酰氨基酯类、含氨基的草酸酯类(polyoxaesters)、聚(酐)、含磷氮链聚合物及其组合。
术语“生物相容性聚合物”指在与有机体的细胞、组织或体液接触时而不引起副作用，诸如免疫反应和/或排斥等的任何聚合物。
术语“可生物降解的聚合物”指在生理环境中，诸如通过蛋白酶可降解的任何聚合物。可生物降解的聚合物的实例包括胶原、纤维蛋白、透明质酸、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚对二氧环己酮(PDO)、聚三亚甲基碳酸酯(TMC)、聚乙二醇(PEG)、藻酸盐、壳聚糖或其混合物。
在本发明的实施方案中，纤维的聚合物含量包含超过85％的乙交酯，超过90％的乙交酯，超过95％的乙交酯，或由100％的乙交酯组成。
聚乙醇酸(PGA)，也称为聚乙交酯，是可生物降解的、热塑性的聚合物并且是最简单的直链脂族聚酯。其可从乙醇酸起始通过乙交酯的聚缩聚作用或开环聚合的方式制备。PGA特征是水解不稳定性，这是由于在其主链上存在酯联接并且从而当其暴露于生理条件时，PGA被通过随机水解而降解。降解产物，乙醇酸，是无毒性的并且其可进入三羧酸循环，随后其被作为水和二氧化碳排泄。聚合物已经显示在在4-6个月的时间期内被有机物完全再吸收4。
在本发明特别的实施方案中，乙交酯是PGA。
在本发明的实施方案中，纤维包含乙交酯和/或丙交酯和/或其它适宜的羟基酸的共聚物。适宜的共聚物的实例包括聚(乳-乙醇)酸共聚物(PLGA)，与乳酸的共聚物；聚(乙交酯-己内酯共聚物)(PGACL)，与ε-己内酯的共聚物和聚(乙交酯-聚三亚甲基碳酸酯共聚物)(PGATMC)，与三亚甲基碳酸酯的共聚物。
在本发明的实施方案中，共聚物是聚(丙交酯-乙交酯共聚物)(PLGA)，其中PGA:PLA的比率是约85:15，或约85.25:14.75，或约85.50:14.50，或约85.75:14.25；或约90:10，或约90.25:9.75；或约90.50:9.5；或约90.75:9.25；或约91:9；或约92:8；或约93:7；或约94:6；或约95:5；或约96:4；或约97:3；或约98:2；或约99:1。
本发明进一步覆盖PGA和聚酯的混合物。适宜的混合物的实例包括与聚乳酸混合的聚乙醇酸(PGA/PLA)以及也有与聚乙醇酸混合的聚对二氧环己酮(PDO/PGA)。已构思该混合物可由至少一种共聚物组成。
已构思聚合物的所有立体异构形式。
已经有利地发现，支架或依据本发明的支架当其暴露于生理条件时在空间上是稳定的，并且因此当其被植入体内时，它们如在表1中阐明的那样表现出小于10％，更特别地小于5％的最小限度的收缩。
表1：聚合物支架的空间稳定性
 
材料 在37℃的PBS中24小时后的％收缩      
PDLA 72±2
PLGA(75/25) 74±4
PGA(0.29和2.19μm纤维) 4±4
PLGA(10/90)0.9μm纤维 18±3
PLGA(10/90)2.7μm纤维 10±2
PCL 0±0
PDLA+5％ PGA 73±3
PDLA+10％ PGA 75±3
PDLA+25％ PGA 34±1
PDLA+50％ PGA 35±3
PDLA+75％ PGA 48±1
PDLA+25％ PLLA 36±4
PDLA+50％ PLLA 34±3
PDLA+75％ PLLA 32±1
PLGA+5％ PGA 53±2
PLGA+10％ PGA 35±3
PLGA+25％ PGA 47±1
PLGA+50％ PGA 49±4
PLGA+75％ PGA 55±1
PLGA+25％ PLLA 41±2
PLGA+50％ PLLA 43±7
PLGA+75％ PLLA 37±1
PDLA+5％ PCL 85±1
PDLA+10％ PCL 85±2
PDLA+20％ PCL 83±0
·聚(D，L-乳酸)＝PDLA            聚乙醇酸＝PGA
·聚(丙交酯-乙交酯共聚物)＝PLGA  聚(L-丙交酯)＝PLLA
·聚(ε-己内酯)＝PCL
在细胞与支架相互作用的最初阶段，该最初的空间稳定性导致表面积和孔径保持相对稳定。例如，该稳定的孔隙率在能使细胞向支架的中心迁移方面是重要的。
在本发明的实施方案中，支架是非织造物。非织造织物是那些既不是机织织物又不是编织物(knit)的东西，并且典型地由将小纤维拼在一起形成片或网，然后将其或用粘合剂机械地粘连在一起(如毡制品的情况，通过将它们用锯齿状的针连锁一起，这样纤维间摩擦力导致更强的织物)或用热(通过应用粘连剂(以粉剂、糊剂或聚合物熔化剂的形式)和通过渐增的温度将粘连剂熔化在网上)制备。
在本发明的又一个实施方案中，通过静电纺(或者溶解或熔化静电纺物)、相分离、熔喷、纺纱或自组装制备支架。静电纺是制备的优选方法，因为其易于使按比例放大至产业化水平，特别在用于医学应用的适宜尺寸的支架方面。
为了增加细胞增殖和/或迁移通过支架的生物亲和力和识别和/或为了增加支架的治疗效力，已发现用于促进细胞克隆、分化、渗出和/或迁移的至少一种试剂与支架的纤维相关联。该至少一种试剂可为生物的、化学的或矿物的试剂，其可附着、植入或渗入纤维中。
适宜的试剂的实例是抗微生物剂，诸如银、碘或氯己定。
可在形成纤维之前在聚合物溶液中提供试剂。此外，或作为选择，至少一种试剂可与形成后的纤维相关联。
本文也提供支架对药物传递应用上的用途。药用化合物可与支架的纤维相关联。
依据本发明的又一方面，提供医用敷料，例如，包含依据本发明支架的创伤用敷料。
覆盖大的体表面积的烧伤需要在损伤后尽可能快地恢复表皮样功能的特殊治疗。这些敷料的主要的目的是恢复身体能力以保持水分并对抗环境危害。此可通过使用由在许多商业上可获得的产品中用作表皮类似物的硅胶片提供的、常常被称为合成表皮的密闭性敷料覆盖伤口得以实现。然而，在这些密闭性敷料下的愈合速度保持次优化并且可通过整合适当响应的细胞的其它的层大大地改善愈合速度。
由Woodroof于1979年开发的
Figure A200780025215D00121
(Dow HickamPharmaceuticals Inc)由机械地连接至超薄的硅树脂膜的、按常规编织的尼龙织物组成。完整的敷料上均匀地涂上通过共价和独立地结合至敷料和作为类真皮的猪I型胶原肽。
Figure A200780025215D00122
(Smith & Nephew，PIc)由聚合物膜和新生的人成纤维细胞组成。新生人成纤维细胞是在体外尼龙网上有防腐剂的条件下培养的。
Figure A200780025215D00123
和
Figure A200780025215D00124
两者均以紧贴创面床的尼龙网侧和最上面的硅树脂层一起应用于烧伤创面。作用的主要模式是硅树脂层用作合成表皮并防止患者过多的水分通过易受损的表皮丢失并且也防止环境侵扰而受伤。作用的次要模式是存在于硅树脂层之下的蛋白质发挥生物学作用和促进烧伤表面的再生上皮形成，导致更快闭合。
本文所关注的是天然聚合物由于其在病原体传播和免疫反应中有效性而在这些合成中的应用。
当将本发明支架，例如，通过静电纺沉积在适当的底物上时，已经被看成是提供解决与存在于在先技术的敷料中源于生物材料相关问题的理想的烧伤敷料。
在本发明的实施方案中，该底物层由生物学、合成的或混合材料组成。适宜的材料包括聚合物，例如聚纤维素、聚氨酯、聚苯乙烯、聚酰亚胺、聚酰胺、树脂、尼龙、硅树脂、聚酯、聚烯烃，例如，聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯、共聚物及其混合物。
可依据它们对于蒸汽和空气的渗透性，将硅树脂底物分类。闭合的硅树脂底物对于蒸汽和空气不通透。有孔的硅树脂底物允许蒸汽和空气经穿孔交换同时可渗透的硅树脂底物是蒸汽和空气可渗透的。
在本发明具体的实施方案中，硅树脂底物是硅树脂基薄膜，例如，
Figure A200780025215D00125
(T J Smith & Nephew Limited)。
可用适宜的粘合剂将底物层以可拆卸地附着于支架。或者，可将支架直接静电纺在底物层上。此提供相对低成本的方法以制备敷料。
在这样的敷料中，底物层将防止过多的水分丢失和环境侵扰烧伤创面。纤维性支架将促进上皮细胞迁移和增殖并且将促进再生上皮形成和创面闭合。当完成再生上皮形成时，半透性屏障层从支架剥离开，而可再吸收的纤维保留在创面床中，随着时间推移降解成无害的降解产物。
还构思可将具有不同构造的支架各层，例如，通过静电纺沉积在底物，诸如硅树脂基薄膜上。例如，最靠近硅树脂基薄膜的层可由小直径和孔径的纤维组成，以促进角化细胞迁移越过纤维的表面，挨在硅树脂基薄膜下。在使用中位于创面床更深处的支架的各层可由较大直径和孔径的纤维组成，以允许其它细胞类型，诸如成纤维细胞和内皮细胞渗透。
也构思可将活性药物与支架缔结，例如，改善疤痕分解和预防疤痕形成的药物，例如：胰岛素、维生素B、透明质酸、丝裂霉素C、生长因子(TGFβ)、细胞因子、皮质甾类和/或促进再生上皮形成的药物。
依据本发明的又一方面，本文提供医用敷料，例如，包含沉积在底物，诸如硅树脂基薄膜上的支架的烧伤敷料。
依据本发明的还一方面，本文提供制备包含静电纺纤维支架的方法，所述纤维包含在标靶之上的乙交酯和其中平均纤维直径为约1.2-4.0微米。
在本发明的实施方案中，乙交酯是PGA。
支架的制备可在实验室中或在制造厂中进行。可将支架纺在适当的标靶之上、进行包装和消毒。或者，可在原位，例如，在创面位置实施该方法，这样静电纺支架被直接纺入创面床。此可通过采用手提式静电纺装置实现。然后可将顶层，诸如硅树脂基薄膜应用于支架的上表面。
在本发明的实施方案中，支架形成烧伤敷料的部分，而将纤维通过静电纺至半透性屏障层，诸如硅树脂基薄膜的一侧。当烧伤已经愈合时，该半渗透屏障层从保留的支架剥离开来，而支架在创面中被生物再吸收。
依据本发明的再一方面，本文提供促进伤口组织再生的方法，该方法包括将创伤用敷料应用于伤口的步骤，该敷料包含含有纤维的支架组成，该纤维包含聚乙醇酸，其中的平均纤维直径为约1.2-4.0微米。
还提供包含沉积在半渗透屏障层之上的本发明支架的医用敷料在治疗动物，包括人和非人动物两者的皮肤病症的应用。该皮肤病症可为动物皮肤上的烧伤。可使用医用敷料以治疗延伸至至少动物皮肤表皮的烧伤。也可将该医用敷料用于治疗延伸至动物皮肤的真皮或皮下脂肪区域的烧伤。
对能够将细胞快速接种至适宜用于修复组织缺失的支架上的装置和方法存在需求。这对于使用患者自己的细胞的自体过程是特别重要的并且合意的是收集细胞、将细胞接种至支架上和在一个医疗程序中将接种了细胞的支架植入组织中缺损处。有利地，收集组织和植入接种的装置之间的时间应该为30分钟或更少。有利地，该程序应该是单步骤程序。
因而，依据本发明再一方面，本文提供依据本发明的支架用于从细胞源材料中选择性捕获细胞群体的应用。
可将该支架描述为被用捕获的细胞“接种”。有利地，在本发明的实施方案中，用有核细胞，例如，血小板和/或白细胞接种该支架。
在创伤愈合中血小板和白细胞起关键作用。
血小板或凝血细胞是在血液中循环的细胞碎片，其涉及导致血液凝结形成的初步止血的细胞机制。
血液白细胞或白细胞是防御身体对抗感染性疾病和外来异物的免疫系统的细胞。创面部位的血小板释放生长因子，诸如吸引血液白细胞和刺激释放对于创面愈合是必须的其它化学介质(诸如细胞因子)的血小板衍生的生长因子。炎症期对后续的愈合过程的阶段是关键刺激物，并且可在感染的、慢性的或坏死的伤口被延长，导致慢性炎症。单核细胞(一种白细胞的亚类)分化为巨噬细胞，其分泌吸引和激活局部细胞，诸如内皮细胞和成纤维细胞的生长因子，以启动肉芽组织形成。延长的炎症导致巨噬细胞活性增殖，导致细胞因子释放增加，其进一步刺激炎症过程。
在本发明的实施方案中，支架包含静电纺纤维，典型地该纤维直径为约50纳米至5微米，特别是约1.2-4.0微米，更特别是约1.5-3.5微米和进一步更特别是约1.9-2.6微米。
在本发明的实施方案中，支架孔径为1-25微米，和更优选为8-12微米。
细胞源材料可源于，例如，骨髓、血液(诸如脐带血或外周血)、血浆、血清、尿、羊水、精液、脑脊液、淋巴或唾液。可将细胞源材料未经稀释地导入装置中。或者，可用磷酸缓冲盐水、组织培养基或本领域已知的其它稀释剂将其稀释或将其制备悬浮液。或者，可将分离的细胞用作细胞源材料。适宜的细胞包括干细胞、祖细胞、骨细胞、软骨细胞或成纤维细胞，但可为任何可被分离的并且适于被修复的缺损组织的细胞。典型地，如本文之前所提及的，细胞将为在适宜的稀释剂中的悬浮液。
可使细胞源材料在进入支架前通过预滤器过滤。可在将细胞源材料导入装置之前实施该预滤步骤。或者可使细胞源材料在进入支架之前的任何时点，通过装置中提供的预滤器。预滤器可为粗滤器(约70微米滤器)。
在本发明的实施方案中，提供在细胞捕获装置中的支架，其中将该支架排列在装置中，使细胞源材料能够更易于通过支架过滤。
可或者经由被动或者加压过滤使细胞源材料通过支架过滤。加压过滤特别具有优势，因为此增加细胞源材料过滤的速度，如果在手术室正在使用该装置，以从患者自己的体液获得自体同源细胞，其是特别有益的，至关紧要的是其使患者在手术台上的时间最少。再有，加压过滤导致捕获的细胞充分遍布整个支架。
产生压力的装置可向装置提供或者负压或者正压，以使加压过滤成为可能。
适宜的产生负压的装置是真空泵。可用该泵向装置传送至少低于大气压5mb的真空。在本发明的实施方案中，如果需要，真空泵可传送至多低于大气压900mb的真空。可在将细胞源材料导入预过滤室之前、期间或之后使用真空。
或者，使用产生正压的装置以向含细胞液体施加正压，使之通过支架。该正压可替代或补充负压来源。适宜的产生正压的装置是注射器。
在向装置施用正压或负压期间，支架所受到的力可潜在地损害支架的结构。因此，有利地，用支持结构支持支架。该结构在支持支架抵抗压力的同时使细胞源材料通过。适宜的支持结构包括Hollander丝网、聚酯或尼龙支持物。
在应用中，将细胞源材料导入细胞捕获装置中的预过滤室并施用正压或负压，以将细胞源材料抽吸通过支架。包含在材料中的第一细胞群体被支架捕获，同时第二细胞群体通过支架进入预过滤室。
在本发明的实施方案中，第一细胞群体包含血小板和/或白细胞或由血小板和/或白细胞组成。
在本发明的实施方案中，第二细胞群体包含红细胞或由红细胞组成。该第二细胞群体在某些境况下可被认为是“废物”并且被立即除掉。或者可任选将该第二细胞群体返回预过滤室至少第二个过滤周期。
在本发明的实施方案中，将包含捕获的细胞群体的支架直接植入某部位。在这样的实施方案中，支架优选为生物相容性的和可生物再吸收的。这样的支架由在植入时具有治疗益处的细胞群体，诸如血小板和/或白细胞组成。此外，支架具有最佳的构造以促进内源性细胞粘附、增殖和迁移，同时也证明在这些初始细胞过程(cellular processes)所需的时间中其空间的稳定性。
可将支架植入人体或动物(即非-人动物)体内的任何部位，在那里支架将具有治疗益处。例如，可将支架植入软组织缺损处。术语软组织指连接、支持或环绕身体的其它结构和器官的组织。软组织包括肌肉、肌腱、纤维性组织、脂肪、血管、神经和滑液组织以及皮肤。
在本发明的其它实施方案中，捕获的细胞群体被清洗出支架并用作单独的细胞源。
细胞捕获装置优选是一次性使用的，尽管其可用适宜消毒的物质制备。这样的消毒方法可包括高压灭菌、电子束、环氧乙烷或本领域已知的其它方法。
依据本发明，本文提供适于将细胞迅速接种至支架上的方法，该方法包括将细胞源材料施用于支架上和应用负压或正压的步骤，以使细胞源材料充分遍布整个支架。
依据本发明，本文提供适于从不同种类的细胞源材料中去除红细胞的方法。该方法基于这样的事实，即红细胞与不同种类的细胞源中的其它成分在尺寸上分别大，其中它们足够地小。这样大群的红细胞在低于至少5mb真空下，发现它们能够通过支架中的孔并且从其它侧面排出，反之其它的较大的成分被捕获而不能通过支架孔排出。
依据本发明，本文还提供多个部分组成的试剂盒，其包括压力产生装置、传递室、支架室、支架支持结构和接收室。试剂盒任选配备粗滤装置，例如，70微米滤器。试剂盒任选配备细胞源材料。
定义
除非另外指明，术语“包含”和“包括”和其语法上的变化，意欲表示“开放”或“包含”的语意，这样它们包括所叙述的成分，但也允许包括另外的未叙述的成分。
如在本文使用的，在涉及聚合物纤维成分的浓度的上下文中，术语“约”典型地意为+/-5％的设定的值，更典型地为+/-4％的设定的值，更典型地为+/-3％的设定的值，更典型地为+/-2％的设定的值，更典型地为+/-1％的设定的值和甚至更典型地为+/-0.5％的设定的值。
图的简述
本文仅通过举例、通过参图描述本发明：
图1：依据本发明的支架的扫描电子显微照片。
图2：用于检测细胞迁移通过依据本发明的支架的细胞迁移分析示意图。
图3：图表阐述了在依据本发明的支架上的细胞的生物学反应。
图4显示包含本发明支架的细胞捕获装置的实例。
图5：阐述从依据本发明的静电纺支架上的猪血标本中的细胞捕获速率。
图6：阐述从依据本发明的静电纺支架上的人血标本中的细胞捕获速率。
图7：用多种溶液预湿100μm厚的PGA静电纺支架，对从人血标本中的细胞捕获速率的作用。
图8：用多种溶液预湿300μm厚的PGA静电纺支架，对从人血标本中的细胞捕获速率的作用。
本发明的具体实施方案
现在将公开支架、制备支架的方法和支架的应用的示例性、非限制性实施方案。
采用静电纺制备具右适当的纤维直径的PGA支架的方法
将由Lakeshore Biomaterials供应的、具有1.24dL/g固有粘性的1.729g PGA溶解于由Apollo Scientific供应的18.200g六氟异丙醇(HFIP)中，以形成9.5％ w/w PGA溶液。使该聚合物溶液经10μm孔、50mm直径Whatman圆盘滤器过滤到安置在注射器泵中的设定为0.03ml/分钟分发的10ml注射器中。该注射器的出口与其另一端连接至水平切去其锥头的18-号针的柔性塑料管(内径1.5mm)连接。将该针垂直夹紧、高于盒子(内在尺寸：55cm宽 x 60高 x 60深)中的标靶15cm，用于最大限度地减少静电纺期间的空气运动。该标靶由连接至马达的铝心轴(5cm直径 x 10cm长)组成，以使该标靶以50rpm旋转，这样可形成纤维材料的均匀涂层。以可替代的烘焙纸(12.7 x 17.5cm)覆盖该标靶以帮助将纤维性支架与标靶分离。
为了启动静电纺程序，经由Glassman电压发生器向针施加电压，而将标靶接地。当施加足够的电压引起聚合物溶液小滴停止从针头滴出而离开变成如聚合物喷射时，启动静电纺程序。聚合物喷射分裂成许多微小的喷射，加速朝向接地的旋转中的标靶，在那里它们被沉积为纤维。使用启动静电纺程序和维持针头的稳定的小滴所需的最小电压。依据所需的支架深度调整运行时间。
于室温下真空干燥静电纺支架至少3天，以使残留的HFIP溶剂减到最少。
纤维直径的测定
通过剪切10mm支架圆周，将其粘附至10mm金属底座并于真空下用金/钯合金对剪切的支架进行溅射镀膜以减少表面充电，得到如在图1中阐明的支架的扫描电子显微照片(SEM′s)。使用设定5kV的加速电压、钨丝电流为210μA和工作距离15mm的扫描电子显微镜(JSM-6400)对镀膜的支架进行成像。
通过用尺子随机测量一桢SEM成像上的20根纤维样本的纤维直径，采用放大倍数标尺(scale bar)转换为实际纤维直径并计算平均值和标准离差，从SEM成像上手工测定纤维直径。
结果
平均纤维直径：2.42μm±0.35
空间稳定性测试
用剪刀自支架剪切正方形标本(3 x 3cm2)。然后将该标本置于用15mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)覆盖的聚苯乙烯培养皿中，并将其置于37℃培养箱中24小时。在用去离子水漂洗湿标本后，重新测量所有的标本并将它们的尺寸与初始的尺寸进行比较，用以下定义的“％收缩”表达：％收缩＝100 x(初始面积-最终面积)/初始面积。每种类型的支架测试3遍。结果示于表1中。
生物反应
使用3个独立的基于细胞的分析，评估具有一系列构造的一系列静电纺支架的生物效应。实施检测细胞粘附、增殖和迁移进入支架的分析。
粘附分析：
从导致一系列范围约200nm-约3μm的支架构造的浓度的一定的PGA溶液制备静电纺支架。平行评估具有直径约20μm纤维的PGA毡(对照样本)。用冲床(Samco SB-25)将支架/对照物剪切成13mm直径的圆盘，将其置于Minucell夹(Minutissue Vertriebs，GmbH)中并用Uvasol 400于紫外光下消毒20分钟。将人真皮成纤维细胞用于整个通过通路13并且通过DAPI染色(Vector Labs)被证实降低和避免支原体(Mycoplasma)感染。
将人真皮成纤维细胞接种到于100μl的DMEM+10％FCS(Sigma)中的密度为每个支架100,000细胞的样本和对照品上，并且于37℃、5％ CO2下培养1个小时。也通过直接将成纤维细胞接种至每孔(总容量400μL)最大密度1 x 105、最小密度0.3 x 104细胞的组织培养孔中，建立标准曲线。培养期过后，将所有支架浸入消毒过的PBS中，以去除未附着的细胞和转移至新的24-孔板中。将400μL DMEM+10％ FCS加至每一支架和40μL WST-1(Roche diagnostics)加至所有孔中(包括标准曲线中的那些)。将板于+37℃、+5％ CO2下再培养1小时。然后将从每一孔取出的100μl培养基(一式三份)转移至96-孔板中。于450nm(参比655nm)下的吸光度与存在于每一样本中的存活的细胞的数量成正比，并用Multiskan Ascent读板器读取吸光度。采用标准曲线和使用这些值表达的结果将吸光度值转换成细胞的数量。
按一式三份在三个独立的实验中实施该实验。
增殖分析：
从导致范围约200nm-约3μm的支架构造范围的浓度的一定范围的PGA溶液制备静电纺支架。平行评估具有直径约20μm纤维的PGA毡(对照样本)。用冲床(Samco SB-25)将支架/对照物剪切成13mm直径的圆盘，将其置于Minucell夹(Minutissue Vertriebs，GmbH)中并用Uvasol 400于紫外光下消毒20分钟。将人真皮成纤维细胞用于整通过通路13并且通过DAPI染色(Vector Labs)被证实降低和避免支原体(Mycoplasma)感染。
将人真皮成纤维细胞接种到于100μl的DMEM+10％FCS(Sigma)中的密度为每个支架40,000细胞的样本和对照组上，并且于37℃、5％ CO2下粘附1个小时。将样本于培养条件下孵育或者1小时(以提供基线附着检测(attachment measurement))或者48小时(以检测随时间变化的细胞增殖)。在每一时点通过将成纤维细胞直接接种在每孔最大密度1 x 105、最小密度0.3 x 104细胞的组织培养孔中并使其在细胞检测前附着1小时，建立标准曲线。在细胞附着至支架1小时后，将所有支架浸入消毒过的PBS中，以去除未附着的细胞和转移至新的24-孔板中。然后将用于检测1-小时(基线)检测的样本转移至400μLDMEM+10％FCS+40μL WST-1(Roche diagnostics)中。然后将板于37℃、5％ CO2下再孵育1小时。将用于检测48-小时时点的样本浸入PBS中并且转移至在400μL DMEM+10％FCS中的新的24-孔板中，并将该板再孵育48小时。48小时后，如上制备新鲜细胞标准曲线并且使用如上的WST检测细胞数量。在与WST-1一起孵育后，从每一孔取出的100μl培养基(一式三份)转移至96-孔板中。于450nm(参比655nm)下的吸光度与存在于每一样本中的存活的细胞数量成正比，并用Multiskan Ascent读板器读取吸光度。采用标准曲线和使用这些值表达的结果将吸光度值转换成细胞的数量。按一式三份在三个独立的实验中实施该实验。
迁移分析：
开发检测以评估细胞迁移进入和通过测试样本支架的能力。设立的实验于图2中阐明。
(a)细胞接种的尼龙圆盘—如示于图2的多层结构(sandwich)的底层。
将人真皮成纤维细胞(HDF)接种至13mm直径尼龙圆盘上。将7百万-1千二百万个细胞快速地加至含25个尼龙圆盘和50mLDMEM+10％ FCS(TCM)的硅化的Techne烧瓶中，然后于45rpm下每15分钟搅拌5分钟，持续24小时(于37℃、5％ CO2下)。将尼龙圆盘个别地转移入非组织培养塑料24孔板的每孔含2mL TCM的孔中，并于37℃、5％ CO2下再孵育3天直至实现细胞汇合。
(b)测试样本—如示于图2的多层结构的中间层。
从导致一系列范围约200nm-约3μm的支架构造的一定浓度的聚乙醇酸(PGA)溶液制备静电纺支架。平行评估具有直径约20μm纤维的PGA毡(对照样本)。用冲床(Samco SB-25)将支架/对照物剪切成13mm直径的圆盘，并用Uvasol 400于紫外光下消毒20分钟。
(c)饵层—如示于图2的多层结构的顶层
在无菌条件下用大鼠尾胶原涂布消毒的尼龙圆盘(直径13mm)并使之风干。将涂布在尼龙圆盘上的胶原用作如示于图2中的顶层。
检测方案：
将以上描述的三层于一个13mm Minucell夹(13mm Minusheet，ref1300，Minucell和Minutissue Vertriebs，GmbH)中夹在一起。将minucell集合(assemblies)转移至非组织培养塑料24孔板的每孔含2mLDMEM/10％ FCS(Sigma)的孔中。将所述板于37℃/5％ CO2下孵育2天。此后，将minucell集合拆除，分离各层并将其转移入含400μLDMEM/10％ FCS的24孔板的各孔中。将40μL WST-1试剂(Rochediagnostics)加至每一孔并于37℃、5％ CO2下将板孵育1小时。将一式三份100μL体积转移至96孔板中，于450nm(参比655nm)下用Multiskan Ascent读板器读取吸光度。依靠用于实施每一次检测的测试板，制备吸光度对细胞数量的标准校正曲线，用于评估存在于多层结构中的各层的细胞数量。计算每一多层结构的细胞总数(所有三层的细胞总数)和评估存在于中间层和顶层细胞数占细胞总数的百分率。
按一式三份在三个独立的实验中实施该实验。为了使数据表达为全面的生物反应，将得自每一次检测的数据转换成自通常对照物(在此情况下是PGA毡)的百分比变化。对于该毡的生物反应表示为0。联合的结果示于图3中。该图显示于约2.5μm纤维处有清晰的功效峰。该图也显示自每一批次支架获得的纤维直径(x轴误差条)的范围，其中图中的每一个点是平均值。
细胞捕获装置
参考图4，传递室20与支架室40相通，后者与接收室70相通。粗滤器30定位于传递室20中。支架支持结构50定位于支架室30中。支架60位于支架支持结构50的顶部。真空泵80可操作性地与接收室70连接。将细胞源材料10导入传递室20并且用真空通过粗滤器30抽吸进入支架室40，从此通过支架60，此处保留部分细胞源材料而部分通过进入接收室70。
实施例1—制备用干细胞捕获装置中的静电纺支架的方法
采用聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯共聚物)(PLGA)、聚乙交酯碳酸三甲酯(PGA-TMC共聚物)、聚己内酯(PCL)、聚(D-丙交酯)(PDLA)和聚(L-丙交酯)(PLLA)通过静电纺的方法生产静电纺支架。将聚合物溶液放入安置在设定以需要的速度分发聚合物的注射器泵中的10ml注射器中。然后将注射器头与另一端连接至水平切去其锥头的18-号针的管(1.5mm内径)连接。将该针垂直夹紧、高于盒子(内在尺寸：55cm宽 x 60高 x 60深)中的标靶10-20cm，用于最大限度地减少静电纺期间的空气运动。该标靶由连接至转速最高至2000rpm的马达的已知为心轴的金属滚筒组成，以产生纳米纤维材料的均匀涂层。以可替代的烘焙纸覆盖该心轴，以帮助将支架与金属表面分离。为了启动静电纺程序，向针施加电压，而将标靶接地。为了启动静电纺程序，向针施加电压，而将标靶接地。当电压足够，聚合物溶液停止从针头滴出而离开变成朝向旋转的接地标靶的微小的聚合物喷射，在那里它们被沉积为纳米纤维。
支架纤维直径：正常：2.41±0.25μm；2.41±0.22μm
              加厚：2.43±0.60μm；2.40±0.19μm
实施例2—骨髓细胞悬液的分离
取样当日，从屠宰场获得的精选的新鲜猪的两个股骨头上分离小梁骨。将股骨从膝盖处分开并去除所有肌肉、软骨、肌腱和可能污染骨髓标本的任何其它组织。用弓锯将股骨头锯开以暴露小梁骨，于无菌条件下用钻孔器去除。
实施例3—细胞悬液稀释和最佳浓度
从自股骨头的骨髓分离的细胞最初是固体部分，不能通过筛网，所以将细胞稀释成液体部分。用或者磷酸缓冲盐水(PBS)、血浆或者新鲜猪血稀释骨髓至浓度1 x 107个白细胞(WBC)/ml。取100μl等份的细胞悬液用于库尔特(Coulter)计数器(Beckman Coulter AcT 5 diff.Counter)计数。基于大小和粒度，用贝克曼库尔特计数器(BeckmanCoulter)对含在样本中的被分类的白细胞和红细胞计数，能够检测各种细胞的最初和最终细胞浓度，因而，允许计算在支架上捕获的单核细胞的百分率。
实施例4—研究不同细胞类型
已将细胞-接种装置与多种不同的细胞源材料，包括人骨髓、猪骨髓、猪骨髓基质细胞以及还有真皮成纤维细胞一起使用。直接获得如自捐赠人的骨髓抽出物的人骨髓。从组织培养延伸源取得猪骨髓基质细胞和人真皮成纤维细胞。获得如液体的这些细胞源和如在实施例3中描述的稀释为固体的骨髓部分。与在静电纺支架上捕获的单核细胞部分类似，不同细胞源材料间结果是可比较的和可重复的。
实施例5—将细胞接种至静电纺支架上的方法
真空下，将5ml所述细胞悬液加到于细胞-接种装置顶部的传递室中。在该室中有最初的70微米滤器以捕获任何大粒子，如，骨小块。大多数液体径直流过进入含被支撑在不锈钢Hollander筛网上的静电纺支架的支架室。大多数较大的单核细胞部分被捕获在静电纺支架上或其中，而小部分通过筛网流入接收室。将接种细胞的支架移去并除掉接收室中的废细胞。
静电纺支架(孔径为12+/-4μm)捕获超过90％的有核细胞和去除高百分比的红细胞。
 
保留在支架中的有核细胞％ 从细胞源材料去除的红细胞％ 从细胞源材料去除的血小板％
实验1 94.8+/-2.76 87.5 100
实验2 92.8+/-2.64 57.6 100
实验3 93.7+/-2.23 79.6 100
实施例6—孔径大小研究
在选择性捕获有核细胞时，孔径大小为7-15μm的静电纺支架最有效。
 
保留在支架中的有核细胞％             从细胞源材料去除的非有核细胞％      
7-15μm 98.9+/-2.4 60+/-14.1
15-20μm 84.9+/-4 98.8+/-5.3
实施例7—支架材料类型的研究
PGA和PLGA两者静电纺纤维得到相同的结果。
 
保留在支架中的有核细胞％             从细胞源材料去除的非有核细胞％      
PGA 93+/-10 72.6+/-15.1
PLGA 98.9+/-2.4 60+/-14.1
实施例8—静电纺支架和非纺织筛网之间的比较
也将静电纺支架与联合支持网的其它非纺织筛网进行比较，结果与数据显示，这些静电纺支架得到较好的结果，尤其涉及捕获单核细胞群体。
 
保留在支架中的有核细胞％     从细胞源材料去除的非有核细胞％      
静电纺支架 96.4+/-2.6 66.3+/-14.6
非纺织聚酯支架 61.5+/-11.4 98+/-4.1
实施例9：在静电纺支架上捕获血液细胞
PGA支架，100μm＝正常和300μm＝在深度上加厚。
 
物质和溶液浓度       流入速率(ml/min)  电压(kV) 累计时间(min)   
正常 PGA，8.5％ 0.03 7.5 60
加厚 PGA，8.5％ 0.03 7.5 180
方法
通过静脉穿刺将有确认书的志愿者的约17ml新鲜人血液收集在两支ACD-A真空采血管(vacutainers)中。或者以1:9(柠檬酸钠对血液)的比例将猪血收集于含4％(w/v)柠檬酸三钠溶液的瓶中。用BeckmanCoulter Ac.T 5 diff.Counter检测白细胞、血小板和红细胞计数。
将装置与设定为大气压下100mBar的真空泵(ILMVAC)连接。在适当的位置夹住30mm PGA静电纺支架，用也为30mm直径的250μm金属筛网支持。通过暴露于紫外光下使静电纺物PGA支架消毒20分钟。血液过滤之前，通过过滤5ml无菌PBS使每一个支架预湿润。
从三个捐赠人或供体猪，取三份重复的5ml血液，通过预湿润的支架过滤。用库尔特(Coulter)计数器对滤液进行计数并且与原来的血液细胞计数比较，以确定每一种细胞类型的捕获率。
结果：见图5和6
实施例10：用多种溶液进行的不同预湿润的支架对血液细胞捕获 率的作用
方法
如上描述，通过静电纺制备深度100μm(正常)和300μm(加厚)的PGA支架并且将其剪切成30mm圆盘。从三头不同的供体猪，取三份重复的5ml猪血，以1:9(柠檬酸钠对血液)的比例，于含4％(w/v)柠檬酸三钠溶液中，通过由250μm金属筛网支持的支架过滤，并且通过用或者(i)5ml水，(ii)5ml PBS，(iii)5ml DMEM+10％FCS过滤预湿润或(iv)放置干燥，使用该装置和大气压下100mBar真空。用BeckmanCoulter Ac.T 5 diff.Counter检测滤液中的白细胞、血小板和红细胞计数，并且与原来的血液样本中的细胞计数比较。
结果：见图7和8
参考文献
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Claims (41)

1.一种包含具有约1.2-4.0微米平均纤维直径的纤维的支架，且其中所述纤维包含乙交酯。
2.依据权利要求1的支架，其中所述平均纤维直径为约1.5-3.5微米。
3.依据权利要求1或2的支架，其中所述平均纤维直径为约1.9-2.6微米。
4.依据权利要求1-3中任一项的支架，其中所述纤维包含超过90％的聚合物。
5.依据权利要求4的支架，其中所述纤维包含超过95％的聚合物。
6.依据权利要求4或5的支架，其中所述纤维由100％的聚合物组成。
7.依据权利要求4-6中任一项的支架，其中所述聚合物包含超过85％的乙交酯。
8.依据权利要求7的支架，其中所述聚合物包含超过95％的乙交酯。
9.依据权利要求8的支架，其中所述聚合物由100％的乙交酯组成。
10.依据前述权利要求中任一项的支架，其中所述乙交酯是聚乙醇酸。
11.依据前述权利要求中任一项的支架，其中所述纤维包含乙交酯和羟基酸的共聚物。
12.依据权利要求11的支架，其中所述羟基酸是丙交酯。
13.依据权利要求12的支架，其中所述共聚物是聚(丙交酯-乙交酯共聚物)。
14.依据前述权利要求中任一项的支架，其中所述结构是非织造的。
15.依据前述权利要求中任一项的支架，其中所述纤维是静电纺织的。
16.一种制备支架的方法，该方法包括将包含乙交酯的纤维经静电纺织到标靶上，其中所述纤维的平均纤维直径为约1.2-4.0微米。
17.依据权利要求16的方法，其中所述平均纤维直径为约1.5-3.5微米。
18.依据权利要求16或17的方法，其中所述平均纤维直径为约1.9-2.6微米。
19.依据权利要求16-18中任一项的方法，其中所述纤维包含超过90％的聚合物。
20.依据权利要求16-19中任一项的方法，其中所述纤维包含超过95％的聚合物。
21.依据权利要求16-20中任一项的方法，其中所述纤维由100％的聚合物组成。
22.依据权利要求16-21中任一项的方法，其中所述聚合物包含超过85％的乙交酯。
23.依据权利要求22的方法，其中所述聚合物包含超过95％的乙交酯。
24.依据权利要求23的方法，其中所述聚合物由100％的乙交酯组成。
25.依据权利要求16-24中任一项的方法，其中所述乙交酯是聚乙醇酸。
26.依据权利要求16-25中任一项的方法，其中所述纤维包含乙交酯和羟基酸的共聚物。
27.依据权利要求26的方法，其中所述羟基酸是丙交酯。
28.依据权利要求27的方法，其中所述共聚物是聚(丙交酯-乙交酯共聚物)。
29.依据权利要求16-28中任一项的方法，其中所述纤维被静电纺织到底物上。
30.依据权利要求29的方法，其中所述底物是硅树脂基薄膜。
31.一种医用敷料，其包含依据权利要求1-15中任一项的支架。
32.依据权利要求31的医用敷料，其中所述敷料是创伤用敷料。
33.依据权利要求1-15中任一项的支架用于从细胞源材料中选择性捕获细胞群体的应用。
34.依据权利要求33的应用，其中所述支架包含平均纤维直径为约1.9-2.6微米的纤维。
35.依据权利要求33的应用，其中所述支架包含平均孔径约7-15微米的纤维。
36.依据权利要求33-35中任一项的应用，其中盐溶液用于在应用细胞源材料之前使支架湿润。
37.依据权利要求33-36中任一项的应用，其中所述细胞源材料是生物液体。
38.依据权利要求33-37中任一项的应用，其中所述捕获的细胞群体包含血小板和/或白细胞。
39.依据权利要求33-37中任一项的应用，其中所述包含捕获的细胞群体的支架被植入人体或动物体内的部位。
40.依据权利要求39的应用，其中所述部位是软组织缺损处。
41.基本如本文参考所附实施例所述的支架、方法或应用。
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WO2017148099A1 (zh) * 2016-02-29 2017-09-08 广州市电纺生物科技有限公司 一种伤口敷料及其制备方法

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