CN101477123A

CN101477123A - 检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒

Info

Publication number: CN101477123A
Application number: CN 200910036614
Authority: CN
Inventors: 沈玉栋; 孙远明; 王弘; 谢桂勉; 雷红涛; 徐振林; 杨金易
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2009-01-13
Filing date: 2009-01-13
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2029-01-13
Also published as: CN101477123B

Abstract

本发明公开了一种检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒，包括盒体、包被了二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原酶标板、抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的抗体溶液、二抗溶液、标准溶液、浓缩提取液、底物液、底物缓冲液、浓缩洗涤液和终止液。本发明所述有机磷农药指含有二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的有机磷农药，尤其是对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它们的混合物。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测蔬果、土壤和水体中有机磷农药残留，操作简便、灵敏度高、价格低廉，适合现场监控的高通量筛选。

Description

检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒及使用所述试剂盒检测农药残留的方法。

背景技术

有机磷类农药由于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但是有机磷农药，作为神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常等症状。在2002年中华人民共和国公布的第199号公告上明令禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用的农药共有19种，其中有机磷农药占了17种，而含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的农药就有8种。

目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药种类较多，单组分试剂盒很难实现快速高通量的检测，虽然仪器多残留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已经是国内外残留分析的一种新趋势。

目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国外仅有少量用多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的理论研究报道，未提供实际样品的检测方法和具有经济效益检测产品，现有的单组分试剂盒很难实现高通量快速的检测，为了实现农药的高通量、快速、灵敏检测要求，开发新的有机磷多残留检测试剂盒十分迫切。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，是一种多克隆抗体，具有广谱特异性，实际应用性强。

本发明的另一个目的是提供所述抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述抗体在有机磷农药多残留ELISA检测方法中的应用。

本发明的技术方案是：

提供一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫分析试剂盒，包括盒体、固体载体、特异性抗体溶液、二抗溶液、标准溶液、浓缩提取液、底物液、底物缓冲液、浓缩洗涤液和终止液，所述酶标板包被了二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原；所述特异性抗体溶液为抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的抗体溶液；所述二抗溶液为辣根过氧化酶标二抗溶液；所述标准溶液为有机磷农药标准溶液。

本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。

本发明所述的一类有机磷农药指含有二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的有机磷农药，尤其是对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它们的混合物。

所述固体载体是聚苯乙烯96孔或40孔酶标板。包被了二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原的酶标板在制作过程中，所用的包被原是将二乙氧基硫代磷酰氯与氨基己酸亲和取代后制得的半抗原，与卵清蛋白(OVA)偶联制备得到的包被原。所用的包被液是pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液，封闭液是3.0～5.0％脱脂奶粉。酶标板材质可以为聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯、纤维素、玻璃等。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原是用二乙氧基硫代磷酰氯与氨基己酸亲核取代合成半抗原，再采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白进行偶联制备得到。

所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体是单克隆抗体。具体指鼠单克隆抗体。制备过程中，免疫原是将二乙氧基硫代磷酰氯和对羟基肉桂酸亲核取代后得到的半抗原与牛血清蛋白(BSA)采用活泼酯法进行偶联得到的。所用的抗体稀释液是pH7.4，0.01～0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，所用抗体的浓度为0.06～0.24μg/mL。

所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)二乙氧基硫代磷酰氯与对羟基肉桂酸反应合成免疫半抗原；

(2)半抗原偶联载体蛋白得到免疫原；

(3)免疫原免疫Balb/c小鼠制备脾细胞，通过细胞融合，筛选分泌目标抗体的杂交瘤细胞，采用Balb/c小鼠体内诱生法制备腹水，纯化腹水得到抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单克隆抗体。

本发明所述试剂盒的底物液为过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为5～10％硫酸、盐酸或氢氧化钠溶液；所述浓缩洗涤液为含有0.5～1.0％吐温20的磷酸盐缓冲液，所述的辣根过氧化酶二抗是羊抗小鼠IgGHRP，所述的浓缩提取液为含有20％甲醇的磷酸盐缓冲液，底物显色液为含0.20～0.25mg/mL四甲基联苯胺(TMB)的柠檬酸缓冲液。

作为优选，所述底物液为5～7％过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为10％硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含有1.0％吐温20和0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

所述标准品溶液的浓度为0～6553.6ng/mL，可选择为0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、12.8ng/mL、204.8ng/mL、1638.4ng/mL和6553.6ng/mL。

本发明提供了一种使用所述试剂盒检测样品中二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法，包括下列步骤：

(1)样品前处理；

(2)向权利要求1所述试剂盒的酶标板微孔中加入标准品溶液或农药样品溶液；加入二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，温育后洗涤拍干，加入酶标二抗，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光值；

(3)检测结果分析。

步骤(1)所述样品包括水、土壤、蔬果、血液、洗胃液和呕吐液等，样品前处理的方法分别为：

a.水样：过滤后即可取样进行ELISA分析。

b.土壤：取10g土壤用20～40mL甲醇提取3次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，取样进行ELISA分析。

c.蔬果样品：取蔬果样品粉碎机绞碎后称取10g，用20～40mL甲醇提取3次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。

d.血液：取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。

e.洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)：取5mL洗胃液，用稀HCl调pH值到中性后即可用ELISA法进行分析。

f.呕吐液：取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。

步骤(2)以对硫磷为例，农药样品检测过程为：

对硫磷标准溶液或经前处理的样品溶液50μL加入酶标板微孔中，再加入50μL抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，温育后洗板拍干，再加入100μL辣根过氧化酶表二抗，温育后洗板拍干，显色、终止，用酶表仪测定吸光值。

以对硫磷为例，步骤(3)所述检测结果分析方法为：

以所获样品吸光值的平均值计算抑制率，抑制率计算公式为：

其中，A_max为不加农药时的吸光值，A_x为农药浓度为x时的吸光值，A_min为空白对照孔的吸光值。

以抑制率为纵坐标，对硫磷标准品浓度的半对数为横坐标，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样品的浓度。其它农药含量可根据交叉反应率计算实际含量。交叉反应率公式如下：

其中IC₅₀是抗体达到半抑制的药物中浓度。

本发明的酶联免疫试剂盒依据如下检测原理：首先将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药包被抗原包被于固体载体上，然后加入人工制备的抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体和待测农药，包被抗原和待测农药竞争抗体，待测农药含量高时，则结合在包被原的抗体就少，反之结合在包被原的抗体就多，反应后洗板拍干，加入酶标二抗反应一段时间，洗板拍干，再加入底物进行显色加以测定，当抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与包被原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率降低，因而根据已知量的对硫磷标准曲线和待检测样品的抑制率，再根据抑制率与对硫磷浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测对硫磷的浓度，其它农药及其混合物根据它们与对硫磷的交叉反应率推算实际浓度。

本发明的有益效果是：

(1)本发明试剂盒采用高效价并具有广谱特异性的抗体，提高了检测的灵敏度、精密度和准确度。

(2)本发明试剂盒能广泛应用于水、土壤、蔬果、血液、洗胃液和呕吐液等多种样品中有机磷农药的检测，样品前处理过程较简单，耗时少(检测过程只需1.5h左右)，能高通量检测样品，检测成本远比传统方法低。

(3)本发明试剂盒的保存期长，至少6个月以上；使用简单方便，适用于目前使用最为广泛的一类有机磷农药残留现场高通量快速筛选，具有重要的现实意义。

附图说明

图1对硫磷标准曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1试剂盒组分制备

1、包被抗原制备

包被半抗原合成：称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取1.00g(0.01moL)氨基丁酸，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝3：1)硅胶柱，得1.14g，产率56.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 254[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl₃and TMS)：δ 1.27(t，J＝7.0Hz，6H，CH₃)；1.77(p，J＝6.9Hz，2H，CH₂)；2.39(t，J＝7.3Hz，2H，CH₂)；2.98(td，J1＝6.8Hz，J₂＝6.8Hz，J₃＝6.8Hz，J₄＝11.1Hz，2H，CH₂)；4.01(ddd，J₁＝1.4Hz，J₂＝7.3Hz，J₃＝15.9Hz，4H，CH₂)。

包被原制备：取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC和NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；称取0.004molOVA，4℃下缓慢溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的包被原分装于0.5ml离心管中。冻存于-20℃冰箱中，供包被酶标板用。

2、包被酶标板制备

包被抗原用pH9.6，0.05M的碳酸盐缓冲液稀释成0.1～4μg/mL，在酶标板微孔中每孔加100μL，4℃包被过夜或37℃包被3h，倾去包被液，用PBST洗涤3～5次，拍干，每孔加入200μL3.0～5.0％脱脂奶粉，37℃温育1～3h，用PBST洗涤3～5次，拍干后干燥保存于铝箔袋中。

3、二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单克隆抗体制备

免疫半抗原合成：称取0.7(0.0125moL)KOH溶于无水甲醇中，称取0.821g(0.005moL)对羟基肉桂酸，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.415g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应过夜。反应结束，过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装蒸发浓缩，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌25min，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩析出结晶，用石油醚洗，得到产物0.75g，产率为11.9％。ESI-MS analysis(negative)m/z 315[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J₁＝7.0Hz，J₂＝7.0Hz，6H，CH₃)；4.23(qd，J₁＝7.1Hz，J₂＝7.1Hz，J₃＝7.1Hz，J₄＝9.6Hz，4H，CH₂)；6.37(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；7.21(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)；7.52(d，J＝8.5Hz，2H，ArH)；7.74(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)。

免疫原制备：取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC和NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；称取0.002molBSA，4℃下缓慢溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液。得到的免疫原以1mg/ml或2mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中。冻存于-20℃冰箱中，供免疫用。

动物免疫方案：采用5～6周龄Balb/c小鼠作为免疫动物，用上述免疫原进行免疫，剂量为每只100μg。首次免疫时将免疫原与等量弗氏完全佐剂混合乳化后，腹腔和足垫注射。以后每隔2周取相同剂量的免疫原与弗氏不完全佐剂混合乳化后，加强免疫一次。第二免后10天取尾部血清用ELISA检测抗血清效价。待效价稳定后，取200μg免疫原加强免疫，3天后取脾细胞融合。

细胞融合和克隆化：取上述脾细胞，按8：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用ELISA检测细胞培养液，筛选阳性细胞。采用有限稀释法对阳性细胞进行克隆化，直到得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

单克隆抗体的制备与纯化：单克隆抗体采用体内诱生法制备。取9周龄Balb/c小鼠腹腔注射石蜡，剂量为每只0.4～0.5mL，10天后腹腔注射上述杂交瘤细胞，剂量为每只1×10⁶个。10天后采集腹水，用辛酸-硫酸铵法进行纯化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析2天，用PEG浓缩后分装于小管，-20℃冻存。

实施例2试剂盒的建立

本实施例提供一种适用于二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药残留分析的酶联免疫分析试剂盒，它基于免疫反应和酶促反应，能检测水、土壤、蔬果样品中二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的残留。

试剂盒包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板，抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体；辣根过氧化酶标二抗；对硫磷标准品溶液和试剂，其特征在于，在酶标板微孔中，用包被液包被二乙氧基硫代磷酸酯有机磷农药抗原，并用3.0～5.0％脱脂奶粉进行封闭，烘干并保存于铝箔袋；盒内试剂包括抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，辣根过氧化酶标记羊抗小鼠抗体，对硫磷标准品溶液，浓缩洗涤液，底物液，底物显色液，反应终止液，其中：(1)二乙氧基硫代磷酸酯有机磷农药抗原是与卵清蛋白偶联的人工抗原，用pH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液稀释成0.1～4μg/mL；(2)抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体是高效价、广谱特异性单克隆抗体；(3)标准品溶液是20％甲醇PBST稀释一定梯度的溶液。(4)浓缩洗涤液，50mL/瓶，内含磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，氯化钠8.5g，土温-200.5mL，双蒸水，为正常使用浓度的20倍。(5)底物液为过氧化氢，1～5mL/瓶；(6)底物显色液，20mL/瓶，柠檬酸0.09g，磷酸氢二钠0.14g，3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)0.0045g；(7)反应终止液，10mL/瓶，10％硫酸。

本试剂盒广谱特异性好，能同时检测对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它们的混合物，最低检测限为1ng/g，线性检测范围为3ng/mL～1500ng/mL。试剂盒在4℃或保存期内至少可保存6个月以上。

实施例3使用本发明试剂盒进行农药检测

1、检测样品前处理

水样：过滤后即可取样进行ELISA分析。

土壤：取10g土壤用20～40mL甲醇提取3次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，取样进行ELISA分析。

蔬菜样品：取蔬菜样品粉碎机绞碎后称取10g，用20～40mL甲醇提取3次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。

血液：取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。

洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)：取5mL洗胃液，用稀HCl调pH值到中性后即可用ELISA法进行分析。

呕吐液：取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。

2、检测方法

操作过程如下：取出一块包被有二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原的酶标板，恢复到室温后备用；加入50μL一系列浓度的标准品和50μL二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，37℃温育45min，洗板，拍干，加入100μL辣根过氧化酶标记抗体，37℃温育30min，洗板，拍干，TMB37℃避光显色10min，硫酸终止，酶标仪450nm测定吸光值。

以抑制率为纵坐标，农药标准品浓度的半对数为横坐标，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，制作数据分析系统。此法便于样品的高通量快速筛选，整个检测过程只需1.5h，最低检测限为1ng/g。本实施例以对硫磷为例，标准曲线如附图1所示。

实施例3试剂盒特异性试验

本发明所述试剂盒特异性用药物之间的交叉反应率表示，是指检测其它农药时对比检测对硫磷的交叉反应率。本发明用蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷、治螟磷及它们的混合物(混合物1和混合物2)代替对硫磷，测定其标准曲线，计算抑制中浓度IC₅₀，并计算交叉反应率。

其中IC₅₀是抗体达到半抑制的药物中浓度。

表1 交叉反应率

其中，

混合物1为：对硫磷：蝇毒磷：喹硫磷：三唑磷：辛硫磷：除线磷＝1：1：32：32：4：4(质量比)；

混合物2为：对硫磷：蝇毒磷：喹硫磷：三唑磷：辛硫磷：除线磷：毒死蜱：乙基溴硫磷：氯唑磷：二嗪磷：治螟磷＝1：1：32：32：4：4：64：64：64：64：64(质量比)。

在实际样品检测时，由对硫磷标准曲线计算含有对硫磷当量，根据上表交叉反应率，计算其它农药的实际含量或可能含有农药混合物的总量。

实施例4试剂盒准确度和精密度试验

取3个浓度的对硫磷标准液，对样品进行添加回收试验，每个添加浓度设计4个平行，分别计算回收率。

表2 添加回收率

由表2可知，生菜样品中添加回收率为96.1～128.8％，变异系数为2.3～9.7％；水中添加回收率为87.6～115.7％，变异系数为1.5～3.9％，说明试剂盒的检测实际样品的准确度和精密度都比较好。

Claims

1、一种检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的酶联免疫试剂盒，包括盒体、固体载体、特异性抗体溶液、二抗溶液、标准溶液、浓缩提取液、底物液、底物缓冲液、浓缩洗涤液和终止液，其特征在于所述酶标板包被了二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原；所述特异性抗体溶液为抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的抗体溶液；所述二抗溶液为辣根过氧化酶标二抗溶液；所述标准溶液为有机磷农药标准溶液。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述有机磷农药含有二乙氧基硫代磷酸酯共有结构；优选对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷、三唑磷、辛硫磷、除线磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、氯唑磷、二嗪磷或治螟磷的任意一种或者两种以上的混合物。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述固体载体是聚苯乙烯96孔或40孔酶标板。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原是用二乙氧基硫代磷酰氯与氨基己酸亲核取代合成半抗原，再采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白进行偶联制备得到。

5、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体是单克隆抗体。

6、根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于所述抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的制备方法包括以下步骤：

(2)半抗原偶联载体蛋白得到免疫原；

7、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述底物液为过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为5～10％硫酸、盐酸或氢氧化钠溶液；所述浓缩洗涤液为含有0.5～1.0％吐温20的磷酸盐缓冲液。

8、根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述底物液为5～7％过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为10％硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为含有1.0％吐温20和0.1mol/L磷酸盐缓冲液。

9、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述标准品溶液的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、0.8ng/mL、12.8ng/mL、204.8ng/mL、1638.4ng/mL和6553.6ng/mL。

10、一种使用权利要求1所述试剂盒检测样品中二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药残留的方法，其特征在于包括下列步骤：

(1)样品前处理；

(2)向权利要求1所述试剂盒的酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液；加入二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，温育后洗涤拍干，加入酶标二抗，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光值；

(3)检测结果分析。