CN101475930A - 超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化红球菌生物脱硫工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化红球菌进行微生物催化脱硫的新工艺:首先制备油酸铵修饰的超顺磁性Fe3O4纳米颗粒水基磁流体,将少量的磁流体加入到脱硫微生物细胞(红平红球菌LSSE8-1)高密度培养发酵液中,充分混合后用外加磁场分离得到磁性固定化细胞,用于油品的微生物脱硫。红球菌是最具代表性的生物脱硫菌株,由于其代谢底物的多样性被广泛用于生物转化、生物降解等方面,具有广阔的工业应用前景。该方法能够从细菌高密度培养液中直接分离细胞,比常规离心分离法大大节省时间和功率;磁性固定化细胞具有与游离细胞相同的高脱硫活性,并且可以多次重复使用;该固定化细胞,具有超顺磁性,在外加磁场下,分离迅速、方便。磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞生物脱硫工艺简单,细胞分离回收快速,生产成本低,易于在工业上应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种利用超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞进行微生物油品脱硫的工艺。
背景技术
石油及其产品中的含硫化合物对石油加工及其产品应用带来了许多危害,如含硫燃料燃烧后产生的SOx等会严重污染环境并造成酸雨;造成石油炼制时催化剂中毒;腐蚀贮运设备等。国际上对燃料油的硫含量要求越来越严格。随着环保要求的日益严格,汽油、柴油质量总的发展趋势是低硫甚至是无硫(硫含量小于10~15μg·g-1),实现车用燃料清洁化。
正在兴起的生物催化脱硫技术(Biodesulfurization,BDS),以其具有的选择性高,副反应少,反应条件温和,投资少,对燃料热值影响小,能脱除加氢脱硫难以处理的二苯并噻吩(DBT)及其衍生物等优点(参见文献1:McFarland,B.L,Curr.Opin.Microbiol.,1999,2:257-264;文献2:Monticello,D.J.,Chemtech.,1998,28:38-45),逐渐成为令人瞩目的清洁燃料生产技术,有望成为传统加氢脱硫(Hydrodesulfurization,HDS)过程的辅助途径来进行含硫燃料的精加工(文献3:Kilbane,J.J.,Curr.Opin.Biotechnol.,2006,17:305-314)。其中,红球菌是最具代表性的生物脱硫菌株,由于其代谢底物的多样性被广泛用于生物转化、生物降解等方面,具有广阔的工业应用前景。
油品的微生物脱硫是一个复杂的生物反应过程,涉及水相、油相和生物催化剂固相组成的多相体系;从微生物脱除DBT中硫的代谢途径及代谢机理可知,生物脱硫是一个多酶反应过程,并且需要辅因子的参与(文献4:Gray,K.A.;etal,Nat.Biotechnol.,1996,14:1705-1709)。因此,脱硫反应存在两相混合、含硫化合物传递、反应后的两相分离、生物催化剂的分离回收等问题。Monot,F.等发表的美国专利USP 6,337,204 B1认为BDS包括五个操作单元:细菌发酵罐培养→脱硫生物催化剂的准备→生物脱硫→油水相分离→消除硫酸盐。其中,生物催化剂可以是细菌直接培养液或使用过滤、离心等方法分离收集菌体后,配制成静息细胞(resting cell)或固定化细胞。根据脱硫菌的游离状态可分为游离细胞生物脱硫工艺和固定化细胞生物脱硫工艺。
生物脱硫研究最多的是游离细胞生物脱硫,其特点是脱硫速率快,但存在严重缺点:油/水/生物催化剂乳化严重,并且游离细胞很难重复利用。而固定化细胞能够较好地避免这些缺点,细胞固定化是很有希望的措施之一。细胞固定化可以增加微生物对有机溶剂的耐受能力;简化油品及生物催化剂的回收;生物催化剂可重复使用,从而可降低生物催化剂的生产成本。目前,有关生物脱硫固定化的方法主要有:海藻酸盐、光交联树脂预聚体(ENT-4000)、聚乙烯醇(PVA)等包埋方法;或以硅藻土为吸附载体固定脱硫菌。包埋固定化方法细胞一般需要首先从发酵液中离心收集细胞,另外由于传质阻力的存在,脱硫活性较低;而吸附法由于结合力弱,往往容易流失细胞。本实验室单国彬等通过在载体中添加磁性Fe3O4纳米颗粒,使用液氮冷冻-解冻法制备了磁性PVA固定化德氏假单胞菌R-8细胞(单国彬等.CN1616604);该方法虽然结合了磁性载体和固定化技术的优势,但仍需要首先从发酵液中离心收集细胞,并且使用液氮多次冷冻解冻PVA载体,操作相对繁琐。因此,迫切需要开发一种能够直接从细菌发酵液中分离固定化细胞,且保持细胞高脱硫活性的方法,以实现生物脱硫技术工业化要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有生物脱硫“游离细胞重复利用困难,而固定化细胞步骤繁琐且存在传质阻力”的缺点,提出了“细胞表面自组装”实现细胞原位吸附-固定化生物脱硫的新设想,通过在细胞表面吸附超顺磁性Fe3O4纳米颗粒,脱硫微生物细胞能够从其发酵液中原位磁分离并固定化,大大简化了细胞分离和固定化的步骤;磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞的脱硫活性高,达到与游离细胞相近的脱硫速度,并具有重复使用的优点,克服了游离细胞生物脱硫过程中油/水/生物催化剂分离困难,且很难重复利用的弊端;在外加磁场的作用下,易于实现生物催化剂的回收、再生;该方法制备工艺简单,易于工业化。迄今为止,未发现有关超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离红球菌细胞并使之固定化的生物脱硫工艺的报道。
本发明提供的超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞生物脱硫工艺,其工艺步骤如下:
(1)水基磁流体的制备
采用共沉淀法制备,其反应原理为:2Fe3++Fe2++8OH-→Fe3O4+4H2O;在盛有400mL蒸馏水的1升搅拌式反应器中按Fe3+:Fe2+物质的量之比为2:1的比例加入三氯化铁(FeCl3·6H2O)和氯化亚铁(FeCl2·4H2O),在氮气保护下升温到85℃至90℃,倾入过量浓氨水溶液,并滴加油酸,继续恒温30min,冷却至室温;产物用磁铁分离后,经去离子水反复清洗,得到黑色团块状磁性Fe3O4凝胶体;加入去离子水,在搅拌下升温至50℃,加入浓氨水数滴,凝胶溶解形成磁性液体;其中油酸铵修饰的磁性Fe3O4纳米粒子稳定分散在水中,即水基磁流体;
(2)脱硫微生物细菌的高密度培养
取0.5mL甘油保存的红平红球菌LSSE8-1菌株(Rhodococcus erythropolisLSSE8-1,CGMCC No.0643),加入到体积为20~50mL的培养基中,在30℃,170r/min的条件下培养1~2天后;再将培养后的R.erythropolis LSSE8-1菌株接种至更大规模的培养基体系中,摇床或发酵罐培养2~3天,制得R.erythropolis LSSE8-1的发酵液;
同样的方法可以制备德氏假单胞菌R-8(Pseudomonas delafildii R-8,CGMCC No.0570)的细菌培养液;
所用培养基(BSM)的组成为每升水中含有2.44g KH2PO4,14.03gNa2HPO4·12H2O,0.4g MgCl2·6H2O,0.001g CaCl2·2H2O,0.001g FeCl3·6H2O,0.004g MnCl2·4H2O,10g甘油和2.00g NH4Cl。硫源为二苯并噻吩或二甲基亚砜,浓度为0.1~0.5mmol/L;
(3)超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化微生物细胞
取一定体积的细菌发酵培养液,加入少量磁流体,使磁颗粒与细菌干重之间的比值为1/20~1/400(g/g),充分混合均匀,通过外加磁场进行收集,并倾去上清液,实现了脱硫微生物细胞的原位吸附分离-固定化,得到赋磁性细胞;
(4)赋磁性细胞脱除油品中的含硫化合物
在磁性固定化细胞中,加入含硫油相和水相,进行脱硫反应。油水相体积之比为:10/90~95/5,最优值为:20/80~80/20;每隔一定时间取样,检测上层油相的含硫量;所述水相为生理盐水、pH=6~7的磷酸盐缓冲溶液或细菌培养基;所述油相为汽油、煤油、柴油、或模拟油相;
(5)赋磁性细胞的回收分离及重复利用
上述脱硫反应完成后,在外加磁场的作用下,分离收集赋磁性细胞;油水相采用常用的液液分离手段分离;在回收的赋磁性细胞中重新加入水相和油相,进行重复脱硫反应。
细胞表面自组装磁性纳米颗粒的机理为:在水溶液中新鲜沉淀的磁性Fe3O4颗粒表面携带羟基(-OH),以非离子形式引入的油酸分别通过化学和物理吸附,在Fe3O4颗粒表面形成一个具有双分子层结构的疏水外壳(文献5:Shen,L.;et al.Langmuir,1999,15:447-453;文献6:Liu,X.;et al.J.Magn.Magn.Mater.,2006,306:248-253);而细菌表面的细胞壁主要由肽聚糖(peptidoglycan)构成,肽聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接的杂多糖与不同组成的肽交叉连接形成的大分子;磁性Fe3O4纳米颗粒表面修饰的油酸分子层与细菌表面的肽聚糖之间的疏水相互作用是实现细胞原位吸附的主要原因。
本发明提供的超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞生物脱硫工艺,适用于从红平红球菌LSSE8-1、德氏假单胞菌R-8的发酵培养液中原位磁分离并固定化细胞,对汽油、煤油、柴油、或模拟油相进行生物脱硫;从细菌培养液中原位分离、固定化细胞,大大简化了细胞分离和固定化的步骤;超顺磁性Fe3O4纳米颗粒,制备工艺简单,生产成本低;赋磁性细胞具有脱硫活性高,稳定性好,能有效克服传质阻力,提高体积反应速率;在外加磁场的作用下,能够迅速回收分离赋磁性细胞,固定化细胞易于再生和重复使用,而且适用于磁稳定流化床中使用。
下面结合附图及实施例进一步描述本发明:
附图说明
图1.超顺磁性Fe3O4纳米颗粒的表征。
(a)透射电镜表征;(b)磁滞曲线表征。
图2.磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化细胞的数码照片。
(a)R.erythropolis LSSE8-1的发酵培养液;
(b)发酵液中加入磁性纳米颗粒;
(c)在外部磁场的作用下,原位吸附分离-固定化LSSE8-1细胞。
图3.赋磁性细胞与游离细胞脱硫活性比较。
图4.赋磁性吸附细胞的重复脱硫曲线。
图5.磁性固定化德氏假单胞菌R-8的柴油脱硫曲线。
具体实施方式
实施例1:超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化红平红球菌LSSE8-1。
(1)水基磁流体的制备
采用共沉淀法制备。在盛有400mL蒸馏水的1升搅拌式反应器中加入0.086mol氯化亚铁(FeCl2·4H2O)和0.173mol三氯化铁(FeCl3·6H2O),在N2保护下升温到85℃至90℃,倾入含0.956mol NH3·H2O水溶液,并滴加油酸约15mL,继续恒温30min,用磁铁分离后,经去离子水反复清洗,得到黑色团块状磁性Fe3O4凝胶体;加入去离子水,在搅拌下升温至50℃,加入25%的NH3·H2O数滴,凝胶溶解形成水基磁性Fe3O4流体。
图1a为Fe3O4纳米颗粒的TEM照片,可以看出,Fe3O4纳米颗粒的尺寸范围为10-20nm。从图1b可以看出油酸铵修饰Fe3O4颗粒的磁化曲线无磁滞现象,在外加磁场H=0时,剩余磁化强度Mr=0,矫顽力Hc=0,具有超顺磁性。比饱和磁化强度(σs)为50.88emu/g,使用普通的永磁铁即可快速的分离。
(2)脱硫微生物细菌的高密度培养
取0.5mL甘油保存的红平红球菌LSSE8-1菌株(Rhodococcus erythropolisLSSE8-1,CGMCC No.0643),加入到体积为20mL的BSM培养基中,在30℃,170r/min的条件下摇床培养1~2天后;再将培养后的R.erythropolis LSSE8-1菌株接种至150mL的培养基体系中,摇床或发酵罐培养2~3天,制得R.erythropolis LSSE8-1的发酵液。
所用培养基(BSM)的组成为每升水中含有2.44g KH2PO4,14.03gNa2HPO4·12H2O,0.4g MgCl2·6H2O,0.001g CaCl2·2H2O,0.001g FeCl3·6H2O,0.004gMnCl2·4H2O,10g甘油和2.00g NH4Cl。以0.2mmol/L二苯并噻吩为硫源。
(3)超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化微生物细胞
取40mL的细菌发酵培养液(细菌光密度OD600≈14),加入1.5mL 30g/L的磁流体,充分混合均匀,通过外加磁场收集固定化细胞,并倾去上清液,实现了脱硫微生物细胞的原位吸附分离-固定化,得到赋磁性细胞(见图2)。
实施例2:磁性纳米颗粒吸附分离-固定化红平红球菌LSSE8-1生物脱硫。
(1)按实施例1制得磁性纳米颗粒原位吸附-固定化红平红球菌LSSE8-1。
(2)赋磁性细胞脱除油品中的含硫化合物
在磁性固定化细胞中,加入20mL水相和5mL含硫模拟油相,水相为BSM培养基。模拟油相的组成为2.5mmol/L的二苯并噻吩(DBT)溶于正十二烷中。在30℃,170r/min的摇床反应条件下进行脱硫反应。每隔一定时间取样,离心后取上层油相,用高效液相色谱(HPLC)分析DBT的残留量及产物2-羟基联苯(2-HBP)的浓度。
(3)赋磁性细胞的回收分离及重复利用
上述脱硫反应完成后,在外加磁场的作用下,分离收集赋磁性细胞;油水相采用常用的液液分离手段分离。在回收的赋磁性细胞中重新加入水相和油相,进行重复脱硫反应。
图3比较了赋磁性细胞与游离细胞的脱硫活性,可以看出赋磁性细胞的脱硫活性很高,其脱硫曲线与游离细胞相似,在10h内,两者均能将2.5mmol/L的DBT模拟油完全脱除,生成2-HBP约2.36mmol/L;并且可以看出,油水脱硫反应主要发生在前4h,其平均脱硫速率达24.7μmol DBT/g干细胞/h。图4为赋磁性吸附细胞的重复脱硫曲线,可以看出赋磁性吸附细胞可以重复使用7次,仍然保持较高的脱硫速率。
实施例3:磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化基因工程菌Rhodococcus sp.LSSE8-1-vgb生物脱硫。
利用基因工程的手段,将血红蛋白基因vgb表达质粒导入专一性脱硫菌株R.erythropolis LSSE8-1,构建出在较低的溶氧条件仍然能保持较高脱硫速率的的基因工程菌Rhodococcus sp.LSSE8-1-vgb(文献7:Xiong,X.C.;et al.Appl.Environ.Microbiol.,2007,73:2394-2397)。按实施例1和实施例2的操作步骤,利用油酸铵修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒可以成功的吸附分离-固定化Rhodococcus sp.LSSE8-1-vgb菌,并进行生物脱硫实验(实验结果略)。
实施例4:磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化德氏假单胞菌R-8及其柴油生物脱硫。
按实施例1和实施例2的操作步骤,利用油酸铵修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒原位吸附分离-固定化德氏假单胞菌R-8。在磁性固定化细胞中,加入20mLBSM培养基和5mL加氢柴油。在30℃,170r/min的摇床反应条件下进行脱硫反应。每隔一定时间取样,离心后油相用RPA-200微库仑滴定仪(江苏江环分析仪器有限公司)测柴油中的硫含量。结果见图5。
由图5可见,利用本发明的原位磁分离-固定化细胞生物脱硫工艺,柴油硫含量从306ppm降到90ppm,脱硫率达到70.6%。该工艺方法,相比于常规游离细胞或固定化细胞脱硫工艺,节省操作流程,操作更简单,更易工业化应用。
Claims (7)
1.一种利用超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化红球菌生物脱硫工艺,包括如下的步骤:
(1)水基磁流体的制备
采用共沉淀法制备:在盛有400mL蒸馏水的1升搅拌式反应器中按Fe3+:Fe2+物质的量之比为2:1的比例加入三氯化铁和氯化亚铁,在氮气保护下升温到85℃至90℃,倾入过量浓氨水溶液,并滴加油酸,继续恒温30min;冷却至室温,产物用磁铁分离后,经去离子水反复清洗,得到黑色团块状磁性Fe3O4凝胶体;加入去离子水,在搅拌下升温至50℃,加入浓氨水数滴,凝胶溶解形成磁性液体;其中表面化学修饰的磁性Fe3O4纳米粒子稳定分散在水中,即水基磁流体;
(2)脱硫微生物细菌的高密度培养
取0.5mL甘油保存的红平红球菌LSSE8-1菌株(Rhodococcuserythropolis LSSE8-1,CGMCC No.0643),加入到体积为20~50mL的培养基中,在30℃,170r/min的条件下培养1~2天后;再将培养后的R.erythropolis LSSE8-1菌株接种至更大规模的培养基体系中,摇床或发酵罐培养2~3天,制得R.erythropolis LSSE8-1的发酵液;
所用培养基的组成为每升水中含有2.44g KH2PO4,14.03gNa2HPO4·12H2O,0.4gMgCl2·6H2O,0.001g CaCl2·2H2O,0.001gFeCl3·6H2O,0.004g MnCl2·4H2O,10g甘油和2.00g NH4Cl;硫源为二苯并噻吩或二甲基亚砜,浓度为0.1~0.5mmol/L;
(3)超顺磁性纳米颗粒原位吸附分离-固定化微生物细胞
取一定体积的细菌发酵培养液,加入少量磁流体,使磁颗粒与细胞干重之间的比值为1/20~1/400(g/g),充分混合均匀,通过外加磁场进行收集,并倾去上清液,实现了脱硫微生物细胞的原位吸附分离-固定化,得到赋磁性细胞;
(4)赋磁性细胞脱除油品中的含硫化合物
在磁性固定化细胞中,加入含硫油相和水相,进行脱硫反应。油水相体积之比为:10/90~95/5,最优值为:20/80~80/20;每隔一定时间取样,检测上层油相中的含硫量;所述水相为生理盐水、pH=6~7的磷酸盐缓冲溶液或细菌培养基;所述油相为汽油、煤油、柴油、或模拟油相;
(5)赋磁性细胞的回收分离及重复利用
上述脱硫反应完成后,在外加磁场的作用下,分离收集赋磁性细胞;油水相采用常用的液液分离手段分离;在回收的赋磁性细胞中重新加入水相和油相,进行重复脱硫反应。
2.按权利要求1所述的原位吸附分离-固定化细胞脱硫工艺,其特征是:所述的水基磁流体是由表面有油酸铵修饰的纳米尺度的Fe3O4颗粒组成的。
3.按权利要求1所述的原位吸附分离-固定化细胞脱硫工艺,其特征是:所述的纳米Fe3O4颗粒及赋磁性细胞,均具有超顺磁性特征,能在外加磁场作用下方便迅速的分离、收集。
4.按权利要求1所述的原位吸附分离-固定化细胞脱硫工艺,其特征是:利用油酸铵修饰的纳米Fe3O4颗粒,从微生物细胞直接培养液中原位吸附分离-固定化细胞,不需要高速离心等常规分离步骤。
5.按权利要求1所述的原位吸附分离-固定化细胞脱硫工艺,其特征是:所述的油品为含硫量为50~1000ppm的汽油、煤油、柴油、或模拟油相。模拟油相的组成为0.5~5mmol/L浓度的模型含硫化合物(如:二苯并噻吩、苯并噻吩、4,6-二甲基二苯并噻吩)溶于十二烷、十四烷或十六烷溶液中。
6.按权利要求1所述的脱硫微生物细菌,不仅包括红平红球菌LSSE8-1(革兰氏阳性菌),也适用于革兰氏阴性菌德氏假单胞菌R-8(Pseudomonasdelafildii R-8,CGMCC No.0570),以及以这些菌株为宿主菌的基因工程菌。
7.按权利要求1所述的外加磁场为:磁场强度为0~6000奥斯特的永磁场或电磁场。
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