CN101473034A - 具有核酸酶活性的幼虫多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可从昆虫幼虫(例如丝光绿蝇)获得的多肽，其具有核酸酶活性，能够降解、变性、消化、切割或剪切核酸，例如DNA。

Description

具有核酸酶活性的幼虫多肽

本发明涉及幼虫产品。更具体而言，本发明涉及从丝光绿蝇(Luciliasericata，也称作Phaenicia sericata)幼虫中分离出的一种或多种多肽，所述多肽能够降解、消化、切割(cut)或剪切(cleave)核酸。

在几个世纪前已经发现和认识到应用昆虫的幼虫或蛆可以治愈伤口，但是仅仅近来，尤其随着抗生素耐受微生物的增多，人们开始重新着手使用这种称为“生物外科”的方法，并且蛆治疗开始复兴¹⁰。目前在临床应用的幼虫是丝光绿蝇幼虫。

人们相信幼虫或蛆具有很强的清除和消毒伤口的能力。近来还确定其具有促进组织再生和伤口愈合的能力。幼虫可在临床使用以改善和促进许多慢性伤口的愈合率，而通常的治疗方法如抗生素、抗菌素、杀菌剂、外科清创术和伤口引流并不能减少或阻止进行性组织破坏¹¹。这种慢性伤口来源于各种疾病，包括：糖尿病足部溃疡、腿部静脉溃疡、外科伤口感染、整形外科伤口、骨髓炎和压疮。

使用整条幼虫或蛆会令一些患者感到不适，为了克服这种不适感，人们倾向于应用幼虫产品而不是幼虫本身。幼虫排泄/分泌(ES)产品或幼虫提取物的组分被认为与使用整条幼虫的疗效相当。幼虫产品的组分是蛆能够促进伤口愈合的关键，有几种机制来解释这种作用。清创被认为部分是通过ES或提取物中的组分胶原酶和丝氨酸蛋白酶的蛋白质水解作用实现的，它们可将坏死组织降解成幼虫可吸收形式，这样可将伤口表面的蜕皮清除^12，13。在ES中鉴定出的2种抗菌因子对革兰氏阴性菌和阳性菌具有抗菌活性，其中的一种因子具有显著的抗MRSA活性¹⁴。细胞外基质(ECM)重建或关闭(closure)的刺激也被认为是归功于ES中的一种或多种“糜蛋白酶样”的丝氨酸蛋白酶的作用，这种蛋白酶能够将纤维结合素降解为生物活性肽。这些生物活性肽能够促进成纤维细胞的粘附和迁移¹⁸并且可能加速伤口的愈合¹⁵。ES也可能具有促进成纤维细胞增殖的作用。

发明人确定幼虫的ES和提取物中均包含一种或多种能够降解、变性、消化、切割或剪切核酸的多肽。优选的情况下，每种多肽包含一种或多种下文所示的序列。

不希望被理论束缚的情况下，发明人假定这些多肽中至少一种是核酸酶(nuclease)或具有核酸酶的功能，其降解、变性、消化、切割或剪切核酸，尤其是DNA。尽管其中至少一些多肽与已知的昆虫核酸酶不具有同源性，但因为其可行使核酸酶的功能，因此被认为是核酸酶，下面将进一步的讨论。

发明人比较了ES或提取物中具有核酸酶功能的多肽序列与昆虫序列数据库中多肽的同源性，鉴定出的最接近的同源家族是昆虫铁蛋白的一些部分。铁蛋白是球状蛋白复合物，由24个蛋白亚基组成，是原核生物和真核生物中主要的细胞内铁储存蛋白，使铁保持为可溶的和非毒性的状态。尽管铁蛋白通常不被描述为核酸酶，但是已发现^21-22在反应介质中从铁蛋白中释放出来的铁原子可作用于核酸，尤其是DNA，得到可与DNase相比的结果。

发明人鉴定出的多肽符合核酸酶的定义，因其能够切开核酸特别是DNA的核苷酸亚单位间的磷酸二酯键，它们能够催化DNA主链中磷酸二酯键的水解分裂，因此是一种类型的核酸酶。因此，根据本申请的目的，基于多肽的活性，用术语核酸酶或DNase来描述本发明的多肽，而不管是否这种多肽通常被描述为核酸酶或DNase。

发明人确定丝光绿蝇幼虫的ES和提取物包含至少一种核酸酶。核酸酶可被用于治疗伤口、烧伤等，或者治疗或预防感染。核酸酶也可用于治疗囊性纤维化(cystic fibrosis)，尤其可作为当前DNAse疗法的替代疗法。

因此，本发明提供了一种从昆虫幼虫中分离出的核酸酶或其合成类似物或合成物。优选地，核酸酶包含一种或多种下列多肽序列：

LLEYLSMR                         (SEQ ID NO：1)

SFDDTLDMLK                       (SEQ ID NO：2)

SYEYLLLATHFNSYQK                 (SEQ ID NO：3)

SLGNPELPTEWLDLR                  (SEQ ID NO：4)

ELDASYQYLAMHK                    (SEQ ID NO：5)

VFVNSGTSLMDVR                    (SEQ ID NO：6)

ANFNVVHESS                       (SEQ ID NO：7)

有可能，由于获得上述多肽序列的方法(质谱法，其随机打断肽键)的问题，这些多肽是较长多肽或蛋白的断裂产物，尤其是考虑到在2维SDS-PAGE电泳中可见到这些多肽分离形成单个点。因此，本发明也包括含有2种或多种上述多肽序列的多肽序列。理想的是，本发明包括任选地在单一多肽链中含有所有上述序列的多肽序列。2种或多种多肽不需要依照给出的数字顺序排序。优选地，任何一种这样的多肽都具有上述核酸酶功能。

编码SEQ ID NOs 1-7多肽的核苷酸序列及它们在制备合成或重组多肽的用途也包括在本发明内。

优选地，核酸酶适用于治疗或预防感染，或治疗伤口。核酸酶可被用于药物组合物，或加入到敷料(dressing)中。

“伤口”这个词在此定义为任何皮肤、表皮或结缔组织的损伤，不论是因损害或是因疾病引起，包括但并不局限于：切割伤，刺伤，外科切口，溃疡，压疮，因热、冻、化学物、电和放射引起的灼伤，皮肤擦伤或冲击伤(assault)、骨髓炎和整形外科伤口。这些伤口可能发生感染。另外，这些伤口可以是慢性的，也可以是急性的。

优选地，幼虫是丝光绿蝇幼虫。

产品可以是核酸酶，可以是DNase、RNase或它们的混合物。

理想地，核酸酶降解原核和真核生物的核酸，尤其是，可降解细菌和哺乳动物的核酸。然而，本发明的核酸酶也被用于治疗或预防病毒复制。

核酸酶也被用作常规抗生素的辅助药物来治疗感染，不论是全身用药或局部用药。

核酸酶，例如DNase酶，已被推荐用于伤口清创术的辅助治疗，并已被掺入促进慢性伤口的清创的药物中。当用于伤口时，从牛胰脏提取的DNases能够降解慢性伤口坏死组织中的脱氧核糖核蛋白和脱氧核糖核酸¹⁶。来源于兰氏分群C群链球菌，似马链球菌(Streptococcusequisimilis)的精制细胞外产品构成了药物

的组分。

是一种用于化脓伤口清创的局部药物，包含一种称为链道酶(Streptodornase)的DNase组分。链道酶对胞外DNA的降解被认为是通过对脓液进行液化，以使白细胞可自由活动，并聚集于胞外的核蛋白而加强吞噬作用来促进伤口愈合²。然而，已有研究发现来自幼虫的核酸酶，尤其是那些来自丝光绿蝇幼虫的核酸酶，在有或无特定金属离子存在的情况下，其稳定性和温度相关的活性更强。

发明人在ES和幼虫提取物中发现了一种金属离子依赖性的脱氧核糖核酸酶(DNase)活性。这可能有利于通过对失活组织中游离DNA的降解而促进伤口的清创，以减少渗出液的粘度或焦痂。他们比较了ESDNase与市售DNase I制剂的DNase活性并且发现，在无DNase底物限制时，ES DNase的反应速率(V_max)比市售DNase为低，但是当底物受限时，其对DNA具有较高的亲合力(高K_m)。他们也发现在温度范围20-40℃之间，ES DNases的稳定性更强(more resistant)，该温度范围与伤口状态相关，其中存在温度梯度，当换敷料或血供减少(compromised)时，冷的坏死组织处于环境温度下，其他组织的温度被降低¹⁷。另外，发明人的研究结果显示，与市售DNase相比，ES较少受到乙二胺四乙酸(EDTA)的抑制，并对高Ca²⁺和Na⁺离子浓度的回复性更强(more resilient)。这些结果说明，与市售制剂相比，ES DNase活性对金属离子浓度变化更强(more robust)。

幼虫提取物中也检测到核酸酶活性，下文将会描述。

现在将仅用实施例来描述本发明，所述实施例参考并用附图来说明。

图1是显示高浓度(图1a)和低浓度(图1b)幼虫ES的情况下，DNA甲基绿测试结果的一对图表；

图2是显示ES对凝胶中DNA甲基绿组分降解的凝胶照片；

图3是在3、18和24小时的时间点，ES和市售DNase的剂量依赖性曲线；

图4是显示在EDTA存在，且使用大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)处理的情况下，DNase活性测定的凝胶照片；

图5显示在EDTA存在下，ES和DNase I中DNase活性的DNA甲基绿测试；

图6显示在Mg²⁺浓度为7.5mM(图6a)和Na⁺浓度为7.5mM(图6b)时，ES的DNA甲基绿测试结果；

图7显示在不同镁离子浓度下ES的活性；

图8显示在不同钠离子浓度下ES的活性；

图9显示在不同钙离子浓度下ES的活性；

图10是显示E.coli DNA的琼脂糖凝胶电泳的凝胶照片；

图11显示在37℃下，含或不含0.02μg/ml ES的一定pH值的缓冲液中孵育10m后，E.coli DNA(每泳道0.5ng)琼脂糖凝胶电泳；

图12显示在37℃下，预先暴露于给定温度30分钟后冷却的ES或市售DNase对DNA-甲基绿复合物作用24h后，其降解情况；

图13显示在37℃，有或无5mM EDTA的情况下，暴露于ES或DNase一定时间后，DNA-甲基绿复合物的降解情况；

图14显示在37℃下，与1μg/ml ES和一定浓度的镁离子孵育19小时后DNA甲基绿的降解情况；

图15显示丝光绿蝇提取物中DNase活性的DNA底物(图版A)和蛋白(图版B)分析；

图16显示DNA纤维素纯化过的丝光绿蝇提取物中DNase活性的DNA底物(图版A)和蛋白(图版B)分析；

图17是显示纯化的丝光绿蝇DNase对非治愈性伤口焦痂DNA的消化的凝胶照片；

图18是显示DNA纤维素纯化过并进行二维电泳的丝光绿蝇提取物中DNase活性的DNA底物(图版A)和蛋白(图版B)分析的凝胶照片；

实施例1

下述试验用来鉴定和表征核酸酶，尤其是ES的DNase。

收集丝光绿蝇幼虫排泄/分泌产物

得自英国卡迪夫市外科材料检测实验室LarvE^TM的大约300只新孵化的丝光绿蝇被多次清洗并收集分泌物(ES)，在无菌条件下执行上述操作。将1ml的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)加入到幼虫中并放置30分钟。在此之后，PBS和分泌物被移走，幼虫被留置恢复30分钟。这个过程重复进行4次，然后将收集的ES汇合备用。

丝光绿蝇排泄/分泌产物的表征

用Bio-Rad蛋白分析试剂盒(Hercules，CA，U.S.A)¹对PBS中的ES蛋白浓度进行检测。通过FITC酪蛋白分析来测定ES蛋白酶的活性。用含5.3％ FITC-酪蛋白结合物的0.1mol L^-1 Tris-HCl缓冲液将ES稀释20倍。然后在37℃下孵育2小时。随后加入5％的三氯乙酸以终止反应，并在室温下放置45分钟。通过离心形成蛋白沉淀，用0.5mol L^-1Tris-HCl(pH 8.8)的将上清稀释10倍。在485nm的激发波长和538nm的发射波长下检测荧光。从得到的荧光值中减去从ES空白样品检测到的荧光。

应用DNA和甲基绿对DNase活性进行分析

DNA与甲基绿的亲和力很强并能与此染料形成一种复合物。DNase的作用使DNA与甲基绿的亲和性消失，并使溶液发生颜色改变。对标准DNase I酶和ES的活性进行了比较。1mg/ml的DNase被稀释50倍后，向125μl的这种溶液中加入1875μl的0.2mg/ml的DNA甲基绿底物溶液。将162.3μg/ml的ES 125μl加入1875μl的DNA甲基绿底物溶液中。因此最后合成的浓度为1.28μg/ml DNase和10.14μg/ml的ES。

然后在37℃的水浴中孵育这些溶液。25分钟内每5分钟取100μl的测试量，5个小时内每小时取一次(每次取一式三份的样品)。在96空板中，将这些测试量加入150μl柠檬酸钠盐中。当所有样本加入后，96孔板放置过夜。然后应用Anthos Lucy1微孔光度计检测其在630nm的吸光率。

在不同ES浓度(5.09μg/ml、2.54μg/ml、1.27μg/ml、0.634μg/ml、0.317μg/ml、0.159μg/ml ES)和1.25μg/ml DNase作用下，每2分钟重复一次这种检测。由于时间延长和ES浓度的增高而导致的底物明显消耗使这种重复检测得以实现。

在含有DNA甲基绿的凝胶中进行电泳分析DNase活性

本方法的原理是DNase酶在凝胶中向下迁移形成条带，在此条带中DNA甲基绿复合物被酶降解了。制作2种凝胶，均为SDS聚丙烯酰胺凝胶，其中的DNA甲基绿的浓度均为0.067mg/ml。分别使用PBS和水连续稀释获得浓度递减的ES(10.14μg/ml、5.07μg/ml、2.54μg/ml、1.268μg/ml)和DNase(10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml)的样本20μl。20μl的非还原性样品缓冲液被加入这些样本中，随后在37℃孵育30分钟。DNase样本和ES样本加入凝胶中预先染色的标准对照和PBS/H₂O对照中。使用0.1％ SDS作为跑胶缓冲液并开通电源。跑胶结束后，将凝胶在2.5％ 

中孵育，随后用蒸馏水清洗30分钟，并在37℃，置于含7.5mM MgSO₄的0.5M TRIS缓冲液中过夜。之后，用溴乙锭(EB)将凝胶染色并在透射仪中显现结果。

剂量依赖性曲线

为了进一步表征ES，制作了能够测定EC₅₀值的剂量依赖性曲线。用PBS将ES的浓度稀释为13.40μg/ml，之后应用PBS进行10倍的稀释。将DNase稀释为在PBS中浓度为10μg/ml，然后再用PBS进行10倍的稀释。在96孔板中，每份20μl的稀释液中加入180μl 0.2mg/ml的甲基绿。3、18和24小时后，在Anthos Lucyl型微孔照度仪中检测其在630nm处的吸光率。应用统计分析程序GraphPad Prism^TM，以log10浓度(mcg/ml)对平均吸光率(630nm)数值来制作剂量依赖性曲线。

抑制剂存在下的DNase活性

在大豆胰蛋白酶抑制剂和EDTA存在的情况下样本的电泳

将分别加或不加入EDTA和大豆胰蛋白酶抑制剂的细菌基因组DNA以及ES或Dnase的样本加入琼脂糖凝胶中进行电泳，来观察这些抑制剂对DNase活性的影响。

大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)用PBS清洗4次，且每次清洗后进行离心并将PBS上清倒掉。在第5次清洗时，使用500μl的PBS悬浮胰蛋白酶抑制剂，以使其在要处理的样本中均匀分布。用大豆胰蛋白酶抑制剂对ES 162.3μg/ml和PBS(对照)样本进行预处理以除去其中的丝氨酸蛋白酶。这些样本进行3次STI处理，尽量除去丝氨酸蛋白酶，每次处理后离心溶液并将ES/PBS作为上清移除。随后进行清洗，这些溶液被移入新的Eppendorf管中。

15.34μl浓度为1.385mg/ml的细菌基因组DNA被184.6μl的无菌PBS或5mM EDTA稀释至浓度为0.1mg/ml。同样配制浓度为121.1μg/ml的DNase(72.6μl的PBS将10μl浓度为1mg/ml的样品稀释)。为了配制样本，50μl的这些DNA溶液中加入3.125μl的STI处理/未处理过的DNase/ES/PBS。将10μl加样缓冲液(Sigma)加入各样本中并在37℃孵育20分钟，然后加入含5μl EB的50ml的1.6％(w/v)琼脂糖凝胶中。

因此，在凝胶的泳道中大约含1μg的DNA，有效浓度为7.56μg/ml的DNase或10.14μg/ml的ES。在紫外透射仪中观察结果。

EDTA存在的情况下对ES和DNase活性的DNA甲基绿测试

将125μl浓度为81.15μg/ml的ES同时加入到1875μl DNA甲基绿溶液(0.2mg/ml)和含5mM EDTA的DNA甲基绿溶液中。因此最终的浓度为5.07μg/ml ES和4.7mM EDTA。DNase被稀释至浓度为121.1μg/ml，2倍稀释后加入1875μl的DNA甲基绿溶液和含EDTA的DNA甲基绿中。按相同的方法，在有或无EDTA的情况下，对STI处理过的ES的活性进行分析。然后这些样本在37℃的水浴中进行孵育。每2分钟吸取100μl的样品(一式三份)，在96孔板中将其加入到150μl浓度为0.083M的柠檬酸钠中。这些板子放置过夜并在Anthos Lucyl微孔照度仪中检测其在630nm处的吸光率。

不同金属离子存在时的ES的活性

用无菌PBS和EDTA将ES稀释10倍获得浓度为5mM的EDTA和16.23μg/ml的ES。将125μl的这种溶液加入到含7.5mM的一种特殊离子的(铜、锌、镁、钠、镍、钙)的1875μl浓度为0.2mg/ml的DNA甲基绿溶液中。因此最后的浓度为0.3125mM EDTA和1.014μg/mlES。每2分钟吸取100μl的样品(一式三份)，在96孔板中将其加入到150μl浓度为0.083M的柠檬酸钠中，剩余样本在37℃保存。这些板子在室温下放置过夜并在Anthos Lucyl微孔照度仪中检测其在630nm处的吸光率。

为了评估最适宜ES的Mg²⁺，Ca²⁺和Na⁺浓度，将含10mM Mg²⁺，10mM Ca²⁺和2mM Na⁺的三种0.2mg/ml DNA甲基绿溶液稀释以制备多种不同浓度的溶液(用不含离子的DNA甲基绿溶液稀释来获得不同的浓度)。10μl 0.2μg/ml的ES被加入到90μl的含离子的DNA甲基绿中(用pH 7.5的0.5M Tris来稀释纯的ES)。因此DNA甲基绿中ES的最终浓度为0.02μg/ml。每种浓度制备三份以获得平均的吸光率。因离子会改变DNA甲基绿的颜色并改变吸光率，同时也制备了空白对照。通过Anthos Lucy1微孔照度仪检测样本和空白在630nm处的吸光率。针对离子浓度对空白和样本之间的吸光率变化进行计算和绘图。

结果

幼虫排泄/分泌产物(ES)DNase活性的测定

在DNA甲基绿测试中，DNA甲基绿复合物显著降解证明了ES的DNase活性，如图1中所示随着时间吸光率下降。DNase和ES样本的吸光率均发生清晰的下降，说明ES确实具有DNase活性。产生的曲线发生明显的扁平，尤其是ES曲线，可能是由于ES的浓度太高或取样的时间太长而致底物耗尽。后来也认为可能是因为用来终止DNA甲基绿复合物降解的柠檬酸钠和DNase活性未能完全抑制反应。因此当放置平板过夜时，这种反应继续发生。图1a显示DNA甲基绿测试的结果：1.28μg/ml DNase和10.14μg/ml ES加入0.2mg/ml的DNA甲基绿底物溶液中。溶液孵育25分钟，然后在5分钟内取3份样本。将样本加入150μl的柠檬酸钠盐中(96孔板中)以终止反应并在随后一天测其吸光率，这些数值在图1a中列出。

随后，在2分钟的时间间隔内取样再次重复试验，并改变ES的浓度。在ES浓度低于5.09μg/ml时，产生的曲线显示了DNase的最小活性，但在浓度为5.09μg/ml时，线性曲线表明了此浓度下DNase的显著活性。DNA甲基绿测试结果在图1b中显示：5.09μg/ml ES在0.2mg/mlDNA甲基绿底物溶液中。溶液在37℃中孵育，且每3分钟取100μl的样本。将样本加入150μl的柠檬酸钠盐(在96孔板中)以终止反应，并在随后一天测其吸光值。数值在图1b中列出。

通过SDS-PAGE以确定DNase的活性，这种凝胶包含0.067mg/mlDNA甲基绿。使用了2种凝胶，一种加入浓度递减的DNase，另外一种加入浓度递减的ES。因凝胶中DNA甲基绿的降解，ES显示出明确的可见的DNase活性。同时也发现在ES浓度更低时，降解程度更大，但是需要重复试验来判定这种发现的可能性。结果如图2所示—ES对凝胶中DNA甲基绿组分的降解。泳道1-预染的标准对照，泳道2-PBS对照，泳道3-1.268μg/ml ES，泳道5-2.54μg/ml ES，泳道7-5.07μg/mlES，泳道9-10.14μg/ml ES，泳道4、6、8和10是空白。

剂量依赖性曲线

对ES(13.40μg/ml)和DNase(10μg/ml)溶液进行系列稀释，将每种上述20μl稀释液加入到96孔板中的180μl DNA甲基绿溶液中，并在37℃孵育这些板子以获得2种剂量依赖性曲线。在3、18和24小时检测其吸光值，并根据24小时的吸光值来构建曲线(见图3)。由剂量依赖性曲线，使用GraphPad Prism^TM也可计算EC₅₀值。ES和DNase的EC₅₀值在3小时分别是0.5885μg/ml和0.1921μg/ml，在18小时分别是0.0248μg/ml和0.0605μg/ml，在24小时分别是0.0151μg/ml和0.0571μg/ml，由此说明DNase的活性超过ES的3倍。结果如图3所示。

ES对离子的依赖性

将加入和不加入离子螯合剂EDTA、用胰蛋白酶抑制剂处理和不处理的细菌基因组DNA和ES或DNase，在琼脂糖凝胶中电泳。这么做的目的是想测定是否DNase酶的活性可被EDTA抑制，是否是离子依赖。对胰蛋白酶抑制剂进行处理，应该去除任何胰蛋白酶和糜蛋白酶，因此可鉴定是否DNase的活性不依赖于这些酶。如预期，这些包含PBS的对照样本没有显示发生DNA降解，这些未降解的DNA显示出同样清晰的条带(泳道2-5)。包含ES的样本中获得的结果表明，DNase的活性不是由于糜蛋白酶的存在(泳道8)，因为无这种酶时，DNA仍然发生降解。同样可见DNase活性被EDTA抑制，因为在第9泳道未发生DNA降解，因此表明ES的活性是离子依赖性的。分别加入和未加入EDTA的DNase样本(泳道11和12)均未显示DNase活性。这种DNase可能对细菌基因组DNA无活性，因为预期在不存在EDTA的情况下，其能够降解DNA。结果如图4所示，在EDTA存在和用大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)处理后，对DNase活性的测定。

泳道1-DNA阶梯(ladder)；泳道2-DNA+未处理的PBS；泳道3-DNA+STI处理的PBS；泳道4-DNA+未处理的PBS+EDTA；泳道5-DNA+STI处理的PBS+EDTA；泳道6-空白；泳道7-DNA+未处理的ES；泳道8-DNA+STI处理的ES；泳道9-DNA+未处理的ES+EDTA；泳道10-DNA+STI处理的ES+EDTA；泳道11-DNA+未处理的DNase；泳道12-DNA+未处理的DNase+EDTA。

在EDTA存在情况下ES和DNase I的DNase活性

显示DNase和ES的活性均被EDTA所抑制，但是DNase被抑制得更显著，在EDTA存在情况下，其活性几乎完全消失。图5所示为DNA甲基绿试验的结果，说明为何当DNA甲基绿复合物发生降解时，下降的吸光值就能表明DNase的活性。在不存在EDTA时，在这些浓度下(分别为5.07μg/ml和3.78μg/ml)，ES和DNase具有相似的活性。图5：在EDTA存在情况下，显示ES和DNase I的DNase活性的DNA甲基绿测试的结果。

不同金属离子对ES的DNase活性的影响

在7.5mM的铜、锌、镁、钠、镍和钙离子存在的情况下，对ES的活性进行了检测。结果显示镁离子对ES的DNase活性有正面影响，也可能存在钠的影响，尽管产生的线性曲线结果不像在镁离子试验中曲线那么让人信服(图6a和6b)。图6a显示的是在7.5mM Mg²⁺存在情况下的ES的DNA甲基绿试验。镁似乎可激活ES因为DNA甲基绿复合物的降解和吸光率的下降。图6b显示的是在7.5mM Na⁺存在情况下ES的DNA甲基绿试验。似乎Na⁺也能激活ES，但是作用不像Mg⁺那么显著。

随后，发现Mg²⁺、Ca²⁺和Na⁺都能刺激ES DNase的活性。增加Ca²⁺和Mg²⁺离子的浓度，可促进ES的活性增加至某个点，在此之后，活性就保持在一个相对恒定的水平。最适Mg²⁺浓度是3mM，最适Ca2⁺浓度是0.9mM。在Na⁺离子存在时，ES的活性快速增加，在浓度为0.2mM时活性最适，在此之后，ES活性稳定下降。在DNA甲基绿试验中，使用每种离子浓度的空白对照，来测定在不同阳离子存在时ES的活性，这些空白对照中不包含ES。孵育24小时后，从那些含ES的实际浓度下的吸光值中减去这些空白对照的吸光值，即可得出结果。结果如图7-9所示。

讨论

丝光绿蝇排泄/分泌产物显示出明确的，独立于先前鉴定的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的活性，由此在幼虫分泌物中鉴定出一种新的DNase成分。因此这就指示了蛆促进慢性伤口治愈的另一种方法。以前的研究已经表明受伤部位的胞外核蛋白会吸引白细胞在此聚集，导致伤口引流不良。通过DNA的降解、脓液液化以及由此增加的白细胞活动和吞噬作用，改善伤口的愈合²。

试验过程中允许比色测定，通过DNA-甲基绿底物来确定DNase I的活性³。与伤口部位高度相关的是，同样发现ES中的DNase能够降解细菌基因组DNA，因此DNase活性以及伤口清创中的辅助作用可能在蛆的抗菌效应中起作用，该效应以前被认为归因于蛋白酶活性⁴，以及蛆摄取和破坏细菌⁵。

幼虫DNase显示出与其他DNases类似的金属离子依赖性的催化作用。丝光绿蝇排泄/分泌的DNase的活性可被镁离子、钠离子和钙离子刺激。其中镁离子对活性的刺激作用最强，其次是Ca²⁺，再次是Na⁺。当与

(以前上市的一种促进伤口愈合的产品)中的链道酶的耐受性比较时，在阳离子存在情况下，链道酶的DNase活性较幼虫DNase活性弱得多。镁离子仅在低浓度下刺激DNase的活性(适宜的浓度为0.06mM，而幼虫DNase的为3mM)，在此之后活性快速下降。Ca²⁺和Na⁺在任何浓度下均为抑制性的，除非与Mg²⁺同时使用时。²对慢性伤口中的离子浓度尚未调查，但是可使幼虫DNase活性回复的离子浓度范围较广，且其持久的活性是其促进伤口愈合的一个明确优势。

当研究大范围的Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺浓度下的DNase活性时，所得的结果有一个问题存在，即用来计算吸光值变化的空白对照应该与实验样本孵育相同时间。在计算吸光值的变化时，快速读取空白对照的吸光值意味着如果DNA甲基绿复合物因离子存在而表现出任何不稳定性，它将不被考虑在内，从而可能导致误差。因此，本试验应该重复进行，保证空白对照和试验样本孵育相同时间以确定这些结果的准确性。

在EDTA存在时，幼虫ES的DNase活性较标准DNase的回复性更强；在离子螯合物存在时，标准DNase的活性几乎完全消失，而幼虫DNase仍保持显著的活性。

幼虫DNase的活性可辅助伤口清创，在伤口环境中增强蛆的抗菌效果，也有假说认为将细菌DNA降解为寡核苷酸可调节免疫系统。众所周之免疫系统的组分的确会对细菌细胞的成分发生应答反应。也有研究显示细菌DNA的序列对某种免疫细胞具有免疫激活效应，尤其是对树突状细胞和巨噬细胞，以及B细胞⁶。细菌CpG DNA是病原体相关的分子模式(pattern)(PAMP)。许多病原体都表达PAMP，但宿主不表达，因此，PAMP是天然免疫系统的重要刺激物。CpG DNA具有免疫激活作用，可以激活Toll 9受体，从而引发细胞应答⁷。被幼虫DNase降解的细菌DNA会产生这种具有免疫刺激性的细菌DNA寡核苷酸。CpG-ODN激活Toll样受体，产生保护反应，由此表达氮和氧中间分子、抗菌肽、粘附分子、细胞因子(TNFα、IL-12、p40和IL-6)和急性期蛋白^6，8。树突状细胞和巨噬细胞的Toll样受体激活后，可以刺激共刺激分子如CD40和CD86的表达，这些分子和T淋巴细胞的CD28反应，从而发挥完整的抗原提呈作用并激活适应性免疫系统^8，9。因此，如果幼虫DNase能把细菌基因组DNA降解为具有中央的、未甲基化的胞嘧啶核苷-鸟嘌呤核苷核心的寡核苷酸，则可能促进细胞因子的释放并激活免疫系统，这是蛆促进伤口愈合的又一个作用。

应当使用适当的对照重复离子实验，并采用不同组合的金属离子。Locke和Carpenter²发现，在存在同等浓度的硫酸镁和氯化钙时，

中链道酶组分的DNase活性最大，并且假设链道酶有两个结合位点，这也是研究幼虫DNase的一个领域。为了评估产生的寡核苷酸是否有调节作用，研究幼虫DNase降解的细菌DNA对不同类型细胞如树突状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的影响，也是有意义的。

总之，这些初步研究和经证实的幼虫排泄/分泌产物的DNase活性提出了更多的可能机制，它们有助于解释蛆为何能够如此成功地对慢性伤口清疮、清洁和促进愈合。这种DNase活性是阳离子依赖性的，在离子螯合剂EDTA存在下，较标准DNase具有更大的回复性并保持DNase活性，并且在离子浓度增加的情况下，比用于清洁化脓性伤口的

(链激酶-链道酶药物)中链道酶的DNase活性更强。因此，可以清楚看到，这种被鉴定的DNase活性，是ES促进伤口愈合众多作用中的又一种重要作用。

实施例2

丝光绿蝇ES的脱氧核糖核酸酶(DNase)活性

如图2和图10所示，发明人已经确定了ES的DNase活性。图2显示ES的非变性DNA/甲基绿底物聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶用溴乙锭复染，第3泳道的暗区就是DNA经蛆分泌物的核酸酶活性消化后的产物1.预染标准品(分子量用kDa表示)。2.缓冲液对照。3.ES(13ng)。图10是大肠杆菌(E.coli)DNA的琼脂糖凝胶电泳.用溴乙锭染色DNA带。1.100bp标准品(示出碱基对数目)。2.只有E.coli DNA(1μg)。3.E.coli DNA(1μg)和ES(7.5μg/ml)。4.E.coli DNA(1μg)+ES(7.5μg/ml)+5mM EDTA。

这是令人感兴趣的，因为DNase可以降解失活组织中的游离DNA，从而减少渗出液的粘性，有助于伤口清创。这种DNase活性在中性pH环境中最佳(图11)，可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制(图4)，表明这种活性是金属离子依赖性的。图11是在37℃，含或不含0.02μg/ml ES的一定pH值的缓冲液中孵育10m后，E.coli DNA(每泳道0.5ng)的琼脂糖凝胶电泳图。溴乙锭染色DNA带。对照：1.未经处理的DNA；2.、3.、4.无ES，缓冲液pH值分别为4.0、7.0、10环境下的DNA带。标准为100bp标准品(示出碱基对数目)。pH值为5.0-8.5时DNase均有活性，pH值为7.0时活性最佳。图4是E.coli DNA(每泳道1μg)的琼脂糖凝胶电泳，条件分别是：含或不含7.56μg/ml ES(ES未经处理或预先暴露于过量3倍的、固定在4％交联珠琼脂糖上大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)中)，含或不含与ES等体积的5mM EDTA或PBS(未经处理或预先暴露于3倍至过量的固化STI中)，37℃孵育20m。溴乙锭染色DNA带。标准为100bp标准品(示出碱基对数目)。经STI处理的ES DNase活性不受影响，还有可能提高(注意凝胶底部模糊带量减少，表明去除ES中丝氨酸蛋白酶活性导致小DNA片段降解增加)。ES DNase不是一种丝氨酸蛋白酶，因为将ES预先暴露于固化的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)并不能抑制其活性(图4)。事实上，STI处理会导致酶活性的轻微增加。接下来我们对比一下ES DNase活性和市售的DNase I制剂的活性。图12显示经预先暴露于指定温度30分钟后冷却的ES或市售DNase作用，37℃孵育24小时以上，DNA-甲基绿复合物的降解情况。对比预先经4℃孵育的ES或DNase活性，结果用平均DNase活性±1SD(n＝3)表示。如图12所示，温度为20-40℃时，ES DNase抵抗性更强，该温度范围与伤口的温度范围相当。此外，我们有结果显示，与市售的DNase相比，ES DNase不易被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制(图13)。图13显示在37℃，有无5mM EDTA条件下，经ES或DNase作用一段时间后，DNA-甲基绿复合物的降解情况。630nm吸光度减少表明复合物降解。结果以平均吸光度±1SD(n＝3)表示。通过比较有关出版物也表明，与Varidase相比，ES DNase不易被高浓度Mg²⁺抑制，Varidase是一种市售的链激酶-链道酶清创药(图14)。图14显示1μg/ml ES和图中所示的镁离子浓度下，37℃孵育19小时，DNA甲基绿的降解情况。在孵育时间(0小时-19小时)结束后，测量630nm波长吸光度的改变作为结果。吸光度的改变越大，DNA-甲基绿复合物的降解越多。如图14中的插图(低离子浓度区域的放大)所示，低Mg²⁺浓度轻微增加ES DNase活性。离子浓度高于0.1mM时，其影响很小，在离子浓度较高时，DNase活性仅有轻微减少。图1中把这些结果和Locke etal(2002)²的结果比较，可以看到当Mg²⁺浓度高于0.06mM时，Varidase的活性被强烈抑制。

发明人也有初步结果显示ES DNase对高浓度的Ca²⁺和Na⁺也有较高的回复性。这些结果表明，与市售制品相比，ES DNase活性对金属离子浓度的改变有更强的抵抗力。

实施例3

进行下面的实验以鉴定并表征核酸酶，尤其是来自幼虫提取物的DNase。

幼虫提取物的制备

制备丝光绿蝇3龄(3^rd instar)幼虫的组织匀浆。组织匀浆用缓冲液(如磷酸盐缓冲液)稀释，离心，提取可溶性蛋白。吸取上清，用作蛆的提取物。

检测DNase活性

采用SDS-PAGE底物凝胶方法检测DNase活性，在溶解的SDS-PAGE凝胶中加入小牛胸腺DNA，浓度为4mg/ml。按上述方法制备的3龄蛆提取物预先在非还原性标本缓冲液(0.1M Tris-HCl，10％甘油，4％ SDS，0.04％溴酚蓝，pH 6.8)中，37℃孵育30分钟，然后加载到底物凝胶中。电泳(20mA/胶)后的凝胶用2.5％ Triton洗(30分钟)，再水洗(30分钟)。

为消化DNA，将电泳后的凝胶置于含有7.5mM氯化镁的磷酸盐缓冲液(PBS)中，37℃孵育过夜。最后，用5μg/ml的溴乙锭染色，在紫外透射仪下观看(图15A)。

检测蛋白

用SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白，0.1％考马斯亮蓝R250染色，25％甲醇、10％醋酸脱色，直到蛋白条带显现(图15B)。

图15显示丝光绿蝇提取物DNase活性的DNA底物(图版A)和蛋白(图版B)分析结果。脱氧核糖核酸酶典型的降解产物大约在35-45kDa(图版A)。然而，在该区域很少看到相应的蛋白(图版B)。在丝光绿蝇分泌物中也存在类似的情况。

DNase活性的纯化。

Locke et al¹⁹尝试描述DNase的纯化。如上述制备方法，提取3.5克3龄蛆的组织匀浆，加入15ml低盐缓冲液(50mM NaCl，1mM EDTA，1Mm DTT，10％甘油，0.1mg/ml BSA，20mM Tris，pH 8.1)中，离心(13000g，10分钟)，22μM滤器过滤上清。先用低盐缓冲液平衡DNA纤维素柱(Amersham公司)，然后将蛆提取物过DNA纤维素柱。低盐缓冲液流洗DNA纤维素柱，至流出液280nm吸光度值小于零。高盐缓冲液(2M NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，10％甘油，0.1mg/ml BSA，20mM Tris，pH8.1)洗脱结合蛋白，每管收集1ml，测各管280nm吸光度值，并将洗脱的峰值蛋白用PBS透析。DNA底物凝胶电泳分析原材料和洗脱蛋白的脱氧核糖核酸酶活性(图16A)，SDS-PAGE电泳分析原材料和洗脱蛋白的蛋白质含量(图16B)。

图16显示经DNA纤维素柱纯化后，丝光绿蝇提取物DNase活性的DNA底物(图版A)和蛋白质(图版B)分析。经DNA纤维素柱洗脱后，DNase降解产物约在45kDa(图版A)，并且与考马斯亮蓝染色的相同分子量的蛋白条带相符(图版B)。

纯化的丝光绿蝇脱氧核糖核酸酶对伤口DNA的消化

用Sigma公司的基因组DNA提取试剂盒提取未愈合焦痂创面的基因组DNA。取丝光绿蝇提取物经DNA纤维素柱纯化后的DNA1和2μg，与大约0.5μg纯化的DNase 37℃共同孵育1小时。消化产物跑1％琼脂糖凝胶电泳(图17)，溴乙锭染色，如前所述。图17显示经纯化的丝光绿蝇DNase作用后，未愈合焦枷创面的DNA消化情况。

纯化的丝光绿蝇DNase的二维凝胶分析

经DNA纤维素柱洗脱的脱氧核糖核酸酶约100μg加于第一维等电聚焦带中，该等电聚焦带含有固定的pH梯度(3-10)。我们使用Biorad公司的蛋白等电聚焦试剂盒，按照厂家说明书进行蛋白条带的等电聚焦。对DNase活性进行等电聚焦后，用DNA底物凝胶电泳(图18A)和如前所述的非还原性SDS-PAGE电泳(图18B)分析条带的蛋白质谱。图18显示了丝光绿蝇提取物的DNase活性经DNA纤维素柱纯化和二维电泳后，其DNA底物(图版A)和蛋白(图版B)分析结果。同样，DNase活性与分子量约为45kDa的蛋白相关联(图版A)，并且与考马斯亮蓝染色的相同分子量的蛋白斑点相应(图版B)。对该斑点进行质谱分析测序，结果如下。

序列分析

质谱分析得到7个多肽序列：

LLEYLSMR                       (SEQ ID NO：1)

SFDDTLDMLK                     (SEQ ID NO：2)

SYEYLLLATHFNSYQK               (SEQ ID NO：3)

SLGNPELPTEWLDLR                (SEQ ID NO：4)

ELDASYQYLAMHK                  (SEQ ID NO：5)

VFVNSGTSLMDVR                  (SEQ ID NO：6)

ANFNVVHESS                     (SEQ ID NO：7)

LLEYLSMR(SEQ ID NO：1)和SLGNPELPTEWLDLR(SEQ IDNO：4)与舌蝇(刺舌蝇Glossina morsitans)的部分铁蛋白重链有高度同源性。

丝光绿蝇    ------------------------SLGNPELPTEWLDLR-----------

刺舌蝇      MMKLIVTLCILAVGSQIVHGEMKCSIGNPELPTEWIDLRGECLKAMRDQI

                                    *:*********:***

丝光绿蝇    --------------------------------------------LLEYLS

刺舌蝇      QKEIDASYTYLAMGAHFSRDTINRPGFAEHFFKAAKEERQHGAKLIEYLS

                                                        *:****

丝光绿蝇    MR------------------------------------------------

刺舌蝇      MRGQLTDDVTDLIMVPTVSKHEWSSGTEALEDALRLETDVTKSIRKLIQT

            **

丝光绿蝇    --------------------------------------------------

刺舌蝇      CERKHNYYHLVDWLTGVYLEEQLHGQRDLAGKISTLKKMMDNHGGLGEFL

丝光绿蝇    -----

刺舌蝇      FDKEL

SYEYLLLATHFNSYQK(SEQ ID NO：3)与刺舌蝇和果蝇(Drosophila)的部分铁蛋白轻链有非常高的同源性。

丝光绿蝇         ---------------------------------------------------

刺舌蝇           MKFLIFVALLASS--CVLLKAEEVCHNNVVRACSTSTLSGPSICNARYGG

果蝇             MKLLVAFALIASLGALAQA-EEEYCHNSVVTACSSSTFSGNSICNARFAG

丝光绿蝇         ------------------SYEYLLLATHFNSYQK----------------

刺舌蝇           ISHVEPELQAYINSHLTKSYEYLLLATHFNSYQKNRPGFQKLYQSLSDRS

果蝇             IEHVEPEVQAYINSQLTKSYEYLLLATHFNSYQKNRPGFQKLYQGLSDRS

                                   ****************

丝光绿蝇         --------------------------------------------------

刺舌蝇           FDDTIDMIKQLTRRGGKADFNTRHESPASVSTQQQRLEVDELHSLAMALD

果蝇             FDDSIALIKQITKRGGIVDFNTRHESPASVSTQRPTLEVDELHSLALALD

丝光绿蝇         --------------------------------------------------

刺舌蝇           NEKQLTTGAFHVHTQSLHAAR---DPETAQYIEEKFLGSQAETIRKLSGY

果蝇             NEKQLATGATHIHTRAIHATER--DPEMAHYMEEEYLGKQADSVRKLSGY

丝光绿蝇         ---------------------------

刺舌蝇           ANDLAKLMNQPDPSLAIYLFDEYLQKQ

果蝇             ANDLAKLMKVPDPSLSIYLFDEYLQKQ

目前，所用的数据库里没有与SFDDTLDMLK(SEQ ID NO：2)同源性强的序列²²，与其最接近的是DNA甲基化酶。

ELDASYQYLAMHK(SEQ ID NO：5)、VFVNSGTSLMDVR(SEQ IDNO：6)和ANFNVVHESS(SEQ ID NO：7)似乎和数据库里任何已知的蛋白都没有明确的同源性，包括已知的核酸酶序列，因此，这些序列似乎是一些新的核酸酶序列，有待于确定并列入昆虫蛋白序列数据库。

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14)Bexfield A，Nigam Y，Thomas S，Ratcliffe N A.Detection and partialcharacterisation of two antibacterial factors from the excretions/secretions ofthe medicinal maggot Lucilia sericata and their activity againstmethicillin-rESistant Staphylococcus aureus.2004，MicrobES and infection

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18)Horobin AJ，ShakESheff KM，Pritchard DI(2005)Maggots and woundhealing：an invEStigation of the effects of secretions from Lucili asericatalarvae upon the migration of human dermal fibroblasts over afibronectin-coated surface.Wound Repair and Regeneration 13(4)：422-433.

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Claims (17)

1.一种从昆虫幼虫分离的多肽或其合成的类似物，所述多肽或类似物具有降解、变性、切割或剪切核酸的能力。

2.根据权利要求1的多肽，其中幼虫是丝光绿蝇的幼虫。

3.根据权利要求1或2的多肽，其中多肽分离自昆虫幼虫的排泄/分泌物。

4.根据权利要求1-3中任一项的多肽，其中核酸是DNA。

5.根据权利要求1-4中任一项的多肽，其中多肽降解原核和真核核酸。

6.根据前述任一权利要求的多肽，其中多肽降解细菌和哺乳动物的核酸。

7.根据前述任一权利要求的多肽，其中多肽至少包含下列序列之一：

LLEYLSMR               (SEQ ID NO：1)

SFDDTLDMLK             (SEQ ID NO：2)

SYEYLLLATHFNSYQK       (SEQ ID NO：3)

SLGNPELPTEWLDLR        (SEQ ID NO：4)

ELDASYQYLAMHK          (SEQ ID NO：5)

VFVNSGTSLMDVR          (SEQ ID NO：6)

ANFNVVHESS             (SEQ ID NO：7)。

8.根据前述任一权利要求的多肽，其中多肽包含两个或两个以上的SEQ ID NO：1-7的序列。

9.根据权利要求8的多肽，其中多肽包含SEQ ID NO：1-7的所有序列。

10.根据权利要求9中的多肽，其中序列按数字顺序排列。

11.一种核酸酶，其由前述任一权利要求的多肽编码。

12.一种铁蛋白，其由前述任一权利要求的多肽编码。

13.根据前述任一权利要求的多肽，其用于治疗或预防感染或治疗伤口。

14.一种药物组合物，其包含前述任一权利要求的多肽。

15.一种敷料，其掺入前述任一权利要求的多肽。

16.前述任一权利要求的多肽在辅助常规抗生素治疗感染中的用途。

17.权利要求16的用途，其中感染是全身性的或局部的。

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