CN101466260A - 莴苣育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了为莴苣传粉和制备杂交莴苣种子的方法。所述方法包括提供莴苣植株和释放苜蓿切叶蜂或吸引传粉者的步骤。本发明还描述了使用本发明方法所制得的杂交莴苣种子和植株以及在本发明中所使用的雄性不育莴苣品系。

Description

莴苣育种方法

相关申请

本申请要求于2006年6月15日递交的美国临时申请No.60/814,641的优先权，并通过引用的方式并入本申请。

背景技术

莴苣是一种常见农作物。全世界的莴苣的消耗量持续增加。由于该需求，人们持续需要新型莴苣品种。

莴苣是一种专性自花传粉物种。这意味着花粉在柱头出现以前散落，保证了100％自体受精。每株莴苣花朵是约10-20个单独的小花的聚集体(典型的菊(Compositae)科)。

在异花传粉和自花传粉种类中产生杂合优势或杂种优势。莴苣的杂合优势的典型表现包括产量、头部尺寸和重量增加，品质提高，并且对不利的环境因素的抵抗力增强。杂合优势的另一个表现是成熟度均匀，这使得该品种更适于机械收割。

目前的莴苣杂交方法包括涉及大量劳动的方法。例如，人工从花朵去除花药管，这虽然是一种确保去除所有自花传粉可能性的有效途径，但是在要进行大量杂交时非常繁杂费时。还可以通过在受精之前对特定的雄花进行喷雾以洗除花粉来进行杂交。然后通过轻柔摩擦供方亲体的柱头和花柱来将另一品种或供方亲体的花粉引至母体中。然后将关于杂交和谱系的相关信息的标签固定至花朵上以保持追踪。在传粉之后约3周，当总苞成熟时收获种子。最后进行播种，并且在诸如叶色或叶缘之类的标志的存在下，对自体受精或母体幼苗活植株进行鉴定。通常情况下，没有可见的标志，种植者必须等到F₂代，这时期望的遗传特性的预期分离模式可以随后出现。这后一种形式要求漫长的等待以确定是否产生杂种。尽管这些方法有效，但是它们具有需要繁杂劳动的多个步骤。莴苣花朵的结构(具有由五个融合的花药包被的花柱)使得操作特别困难并且降低这些方法的效率。

另一种杂交方法涉及使用雄性不育体系。已经通过在绒毡层特异性启动子的调控下表达核糖核酸酶基因设计了莴苣中的雄性不育。Reynaerts等，Engineered genes for fertility control and their application in hybridseed production，Scientia Horticulturae(1993)55(1-2)：125-129。然而，这些品系通常并非完全不育，并且具有异常形状的叶子。其他雄性不育体系包括通过绒毡层特异性启动子表达β-葡聚糖酶。Curtis等，Genomicmale sterility in lettuce，a baseline for the production of F1 hybrids，植株Science Limerick(1996)113(1)：113-119。Edward Ryder博士描述了几种雄性不育系统，但每一种都有妨碍其商业用途的特性，其中包括可以预测的较小的分离率、部分能育的“不育植株”、能育植株和不育植株之间缺乏差异性。

通常还可以获得遗传工程法得到的不育性，但是其被认为是转基因生物(GMO)，因此非优选形式。

因此，现有技术中仍旧需要无需费力的人工干涉的莴苣杂种的制备方法。

发明内容

一方面，本发明提供了给去雄的莴苣栽培植株传粉的方法，该方法通过下列步骤来进行：提供具有花粉的第一莴苣植株；提供至少一株去雄的莴苣植株；以及释放切叶蜂(Megachile bee)，其中，所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以给所述去雄的莴苣植株传粉。所述去雄的植株可以是不产生花粉的植株或是其中去除了花粉的植株。在优选的实施方案中，去雄的植株是不产生花粉的植株，最优选地，是雄性不育品系。在其他实施方案中，去雄的植株是其中去除了花粉(例如通过花药去除法或喷雾法来去除)的植株。

另一方面，本发明提供了使用吸引切叶蜂的附加步骤来如上所述给去雄的莴苣植株传粉的方法。

这些切叶蜂可以被莴苣植株周围的定位的一个或多个吸引子吸引，其中切叶蜂将花粉从第一莴苣植株转移至去雄的莴苣植株。可选地，切叶蜂可以被莴苣植株周围的吸引切叶蜂的定位的植株活植株产物吸引。吸引子优选为苜蓿。

又一方面，本发明提供了制备杂交莴苣种子的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：提供具有花粉的第一莴苣植株；提供至少一株去雄的莴苣植株；以及释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及种植传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。在又一优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：提供具有花粉的第一莴苣植株；提供至少一株去雄的莴苣植株；以及将切叶蜂吸引至所述第一莴苣植株，其中所述切叶蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及种植传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。

又一方面，本发明提供了给去雄的莴苣植株传粉的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有花粉的第一莴苣植株；提供至少一株去雄的莴苣植株；以及将切叶蜂吸引至所述第一莴苣植株，其中所述切叶蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣。

在本发明方法的优选实施方案中，所述切叶蜂为苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)、Megachile relativa或Megachile pugnata。所述莴苣植株可以是近交品系或F1品系。在优选的实施方案中，所述去雄的植株是雄性不育育种品系(也称为雌性品系)。所述莴苣植株优选为卷心莴苣、直立莴苣、红叶莴苣、黄油莴苣、毒莴苣或绿叶莴苣栽培种。

所述切叶蜂的释放可以在开放田地或封闭区域中进行。可以每周释放一批蜂，例如50,000只或100,000只/批。在优选的实施方案中，释放步骤在莴苣开花期是在达到至少约74℉的气候中进行的。

另一些方面，本发明提供了杂交莴苣种子。在一个优选的实施方案中，杂交莴苣种子产生于具有花粉的第一莴苣植株和去雄的莴苣植株之间的杂交，其中所述杂交(传粉)是通过包括以下步骤的方法进行的：释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。在另一个优选实施方案中，杂交莴苣种子产生于具有花粉的第一莴苣植株和去雄的植株之间的杂交，其中所述杂交是通过包括以下步骤的方法进行的：吸引切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。

可以通过以下方法提供去雄的莴苣植株：移植去雄的莴苣植株；移植莴苣植株并将它们去雄；或对萌芽并生长成去雄的莴苣植株或可被去雄的植株的种子进行种植。可以通过以下方法提供具有花粉的植株：移植具有花粉的莴苣植株；对生长而产生花粉的莴苣植株进行移植；或对萌芽成去雄的莴苣植株的种子进行种植。

具体实施方式

定义

如本文所使用，术语“莴苣”是指莴苣属的任何栽培成员，包括结球莴苣(Lactuca sativa L.)和毒莴苣(Lactuca serriola)种。莴苣不是指野生莴苣，加拿大莴苣(Lactuca Canadensis)。

如本文所使用，术语“释放”是指需要导致蜂从缺少莴苣栽培植株的地方移动至具有莴苣栽培植株存在的地方的人工干涉的任何动作。

如本文所使用，术语“定位”是指自在距离莴苣植株某一距离处布置植株和/或植株衍生产物，所述距离足够短以吸引切叶蜂并增加莴苣植株的传粉频率。

如本文所使用，术语“周围”是指在自莴苣的足够小的距离内，以吸引切叶蜂并增加莴苣植株的传粉频率。

如本文所使用，术语“吸引”是指为增加接近莴苣植株的莴苣传粉昆虫的数量和/或浓度的目的或结果而实施的任何动作。

术语“去雄的”是指其中去除了或未产生花粉的栽培莴苣植株。可以通过本领域已知的方法对莴苣进行去雄，所述方法包括产生雄性不育植株的经典育种法、基因工程雄性不育法、花药管去除法、以及花粉洗除法。这样的去雄的植株也称为雄性不育植株或雌性植株。据了解栽培的雄性不育莴苣植株可以产生小量花粉。这样的植株可以通过自花传粉来产生少量种子。

传粉和制备杂交莴苣种子的方法

本发明提供了给去雄的栽培莴苣植株传粉和制备杂交莴苣种子的方法。

莴苣

本发明的莴苣植株可以是能够通过本文所述方法被传粉的结球莴苣或毒莴苣种的任何成员。优选的莴苣种类包括卷心莴苣、直立莴苣、绿叶莴苣、红叶莴苣、黄油莴苣以及毒莴苣。

在本文所述方法的优选实施方案中，在相互之间临近处种植能够产生花粉的莴苣栽培植株的种子和不能产生花粉的莴苣植株或在传粉前要去除花粉的植株(去雄的或待去雄的莴苣植株)，以能通过使用本文所述的传粉方法来制备杂交莴苣植株。能够产生花粉和用于贡献花粉的莴苣植株可以是近交品系或F1品系，并且可以是结球莴苣或毒莴苣的任何种类，所述种类具有杂交植株所需的特性或具有预期产生具有所需特性的杂交植株的基因型。

所述去雄的莴苣植株是其中去除了或未产生花粉的莴苣植株。可以通过去除花药法或对花药进行喷雾来以洗除花粉的方法来去除花粉。这种喷雾方法是一种确保杂交的已被证实且有效的花粉去除方法。日落之后约60-90分钟，筛选用于杂交的花朵。筛选的基础是开放的花朵，出现柱头且可见花粉附着于单个的柱头上(约10-20个柱头)。从常规的喷雾瓶使用3-4泵的水，在足以移去花粉粒但不足以破坏花柱的压力的条件下洗除花粉。使用干净的纸巾弄干多余的水。约30分钟后，花柱应弹回且柱头的两个裂片可见打开成“V”形。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来去除花药。一种方法是使用镊子捏住未开放的花朵的花药球果边并将花药直直拉出。

不产生花粉(或产生微量花粉)的莴苣品系也可用于制备杂交莴苣种子和植株。这样的去雄的植株可以是雄性不育莴苣植株。雄性不育可以是细胞质的、遗传的、细胞质-遗传的、功能性的，或者产生于自交不亲和性。这样的去雄植株也被称为雌性莴苣植株活雄性不育植株。产生花粉的植株也被称为雄性植株。还可以获得雄性不育莴苣品系。例如，雄性不育品系MS7 X Salinas 88，BC4获得自USDA SalinasCalifornia research facility的Edward Ryder博士。MS7首次描述于Ryder，Genetic Studies in Lettuce(Lactuca sativa L.)，J.Amer.Soc.Hort.Sci.(1971)96(6)：826-828。

MS7 X Salinas 88，BC4可用于经与莴苣栽培品种杂交而制备另外的雄性不育系。例如，卷心莴苣、直立莴苣、红叶莴苣、毒莴苣或绿叶莴苣栽培莴苣种类可以与MS7X Salinas 88，BC4杂交而产生F1种子。在一个实施方案中，种植F1种子，收取插枝并以组织培养形式维持。在开花期鉴定不育植株。组织培养形式增加不育植株。将组织培养植株转移至土壤，在土壤中将植株繁殖至开花期，然后与产生花粉的花朵杂交以产生种子。收获种子。种植所收获的种子，进一步筛选和去劣所产生的植株的均匀性和所需性状。可以再进行回交以增加雄性不育母体品系的纯合性。可以重复该过程。一旦这样的雄性不育品系稳定且均匀，则它们可用作雄性不育植株，来通过使用本文所述方法与产生花粉的近交莴苣植株杂交而产生杂交莴苣种子。

栽培莴苣植株种子的种植

在优选的实施方案中，在足够远离其他开花作物处种植栽培莴苣植株种子，以使得切叶蜂有利于开花作物种类超过有利于莴苣的可能性降至最小。如果切叶蜂有利于开花作物种类而不利于莴苣，则莴苣植株的传粉率会降低。

在优选的实施方案中，种植莴苣栽培植株的种子，使得雌性(去雄的活雄性不育的)植株与雄性(产生花粉的)植株的比例较高。莴苣植株通常按行种植。在某些实施方案中，雄性与雌性行的比例在交替行中为1：1或行中为1：2。

传粉者

如本文所详细描述，通过使用某些蜂来促进雄性不育(雌性)莴苣植株的传粉。本文所述方法包括释放切叶蜂的步骤。优选地，所述蜂为苜蓿切叶蜂、Megachile pugnata或Megachile relativa。尽管不希望受理论约束，但认为所述切叶蜂种类尤其可用于本发明的方法，这是因为其行为状况允许对莴苣有效传粉。例如，在优选的温度下，切叶蜂属亚种蜂(Megachile spp.)在莴苣花朵开放并能够被传粉的短暂的清晨期间活跃。另外，切叶蜂属亚种蜂是一种小且敏捷的蜂，其表现为不受开花的莴苣植株的茎和枝上存在的重粘性乳液妨碍。这种小尺寸还允许深入小的莴苣花朵内觅食，由此发生传粉。已观察到切叶蜂属亚种蜂在莴苣花朵上觅食且表现出在雄性不育或雄性能育花朵之间没有优先性。另外切叶蜂属亚种每晚返回它们的巢穴，使得它们一旦被释放不会飞离至其他地方。另外，它们相互之间不沟通，这样它们不太可能大量飞离而寻找其他更有利的花粉/花蜜源。

切叶蜂是独居的蜂，意思是各个雌性下卵并给其自身的巢房供给食物。尽管切叶蜂独居，但它们也是群居的蜂，意思是其偏爱近相同种类的其他蜂而居住。

切叶蜂通常在约74-80℉或以上的温度下传粉，这是因为它们偏爱阳光充足的干燥气候，这些蜂不在冷凉的多云或多雨气候中传粉。切叶蜂的培育得以良好建立，蛹的购买价格较低。

切叶蜂可获得自International Pollination Systems Inc.，该公司从加拿大和美国西部例如爱达荷州的商业供应商处获得这种蜂。切叶蜂通常作为包裹在叶房中的晚龄虫幼虫而递送。叶房通常按加仑量出售，约每加仑含有10,000个叶房。高质量的叶房通常导致约80％的蜂羽化。切叶蜂的蜂房通常于40℉(4℃)下储存在网格盘(screen trays)或通气品脱玻璃罐中。蜂房应保持在约3.8cm或以下的层中，以使蜂羽化减少最小化，较大的蜂房深度允许过热，所述过热杀死蜂房底层中的幼虫。如关于传粉的USDA网站所述，在所有蜂羽化之前，蜂房需要约30天的加温处理。所述加温阶段通常在保温箱中进行。

定时释放蜂，以使得蜂将花粉由一株莴苣植株转移至另一株莴苣植株的效果最佳。优选地，在莴苣植株成熟和处于初始开花期时释放蜂。由于对于蜂适应环境且变成有效的传粉昆虫需要一段时间，应在传粉的最佳时间段开始之前轻柔释放蜂。

在所提供的莴苣植株周围释放蜂。可以自具有花粉的莴苣植株的任何距离释放蜂，蜂将到达莴苣处并从一株莴苣植株转移花粉至另一株莴苣植株。该距离可以是从蜂房至植株的约0-约200英尺。在某些实施方案中，该距离为约10英尺、约11英尺、约12英尺、约13英尺、约14英尺、约15英尺、约16英尺、约17英尺、约18英尺、约19英尺、约20英尺、约21英尺、约22英尺、约23英尺、约24英尺、约25英尺、约26英尺、约27英尺、约28英尺、约29英尺、约30英尺、约31英尺、约32英尺、约33英尺、约34英尺、约35英尺、约36英尺、约37英尺、约38英尺、约39英尺、约40英尺、约41英尺、约42英尺、约43英尺、约44英尺、约45英尺、约46英尺、约47英尺、约48英尺、约49英尺、约50英尺、约51英尺、约52英尺、约53英尺、约54英尺、约55英尺、约56英尺、约57英尺、约58英尺、约59英尺、约60英尺、约61英尺、约62英尺、约63英尺、约64英尺、约65英尺、约66英尺、约67英尺、约68英尺、约69英尺、约70英尺、约71英尺、约72英尺、约73英尺、约74英尺、约75英尺、约76英尺、约77英尺、约78英尺、约79英尺、约80英尺、约81英尺、约82英尺、约83英尺、约84英尺、约85英尺、约86英尺、约87英尺、约88英尺、约89英尺、约90英尺、约91英尺、约92英尺、约93英尺、约94英尺、约95英尺、约96英尺、约97英尺、约98英尺、约99英尺、约100英尺、约101英尺、约102英尺、约103英尺、约104英尺、约105英尺、约106英尺、约107英尺、约108英尺、约109英尺、约110英尺、约111英尺、约112英尺、约113英尺、约114英尺、约115英尺、约116英尺、约117英尺、约118英尺、约119英尺、约120英尺、约121英尺、约122英尺、约123英尺、约124英尺、约125英尺、约126英尺、约127英尺、约128英尺、约129英尺、约130英尺、约131英尺、约132英尺、约133英尺、约134英尺、约135英尺、约136英尺、约137英尺、约138英尺、约139英尺、约140英尺、约141英尺、约142英尺、约143英尺、约144英尺、约145英尺、约146英尺、约147英尺、约148英尺、约149英尺、约150英尺、约151英尺、约152英尺、约153英尺、约154英尺、约155英尺、约156英尺、约157英尺、约158英尺、约159英尺、约160英尺、约161英尺、约162英尺、约163英尺、约164英尺、约165英尺、约166英尺、约167英尺、约168英尺、约169英尺、约170英尺、约171英尺、约172英尺、约173英尺、约174英尺、约175英尺、约176英尺、约177英尺、约178英尺、约179英尺、约180英尺、约181英尺、约182英尺、约183英尺、约184英尺、约185英尺、约186英尺、约187英尺、约188英尺、约189英尺、约190英尺、约191英尺、约192英尺、约193英尺、约194英尺、约195英尺、约196英尺、约197英尺、约198英尺、约199英尺以及约200英尺。优选地，将蜂房板置于向南方向以使得整个白天都面对阳光。

可以在支持莴苣植株生长和蜂的移动的任何类型的环境中释放蜂持续足以转移花粉的时间。典型的释放环境包括开放田地或封住的空间，例如网笼(screened cage)或温室。在莴苣花朵开放的过程中，环境的温度达到至少约74℉。

在所有环境中，条件应使得蜂可能将花粉从一株莴苣植株转移至另一株莴苣植株而非在其他种类的其他植株之间转移花粉。优选地，蜂释放的地点远离吸引蜂的其他植株，和/或释放的地点是具有较小比例吸引蜂的其他植株的地方。

蜂的释放数量和频率应使得蜂的浓度高至足以确保足够传粉以实现受精。优选地，所述密度高至足以产生足够的F1莴苣种子。优选地，蜂的密度为约100,000只蜂/英亩。如果蜂的密度降低至低于所需水平，则可释放另外的蜂。

优选的释放频率根据特定的环境而不同。例如，在网笼和田地条件中，优选每周一次分批释放蜂。所释放的蜂的数量还根据特定的环境而不同。例如，当在大致2亩的开放田地中释放蜂时，应在整个开花周期中保持至少约200,000只切叶蜂的蜂群。

杂交莴苣种子

雄性不育品系可用于杂交莴苣品种的开发和育种。雌性亲体的雄性不育(缺少花粉)使得自身和外源花粉之间的竞争降至最小，由此增加F1杂交种子的产率。当来自雄性亲体(产生花粉的植株)的花粉经切叶蜂而被转移至雌性(雄性不育)亲体的无花粉的柱头时，产生F1种子。

在一个实施方案中，以交替行的雌性不育和雄性不育莴苣植株种植田地。培育莴苣植株，使得抽苔(bolt)并开花。在开花的初始阶段，对雄性不育行进行去劣，并从含有雄性不育品系的行中去除分离的雄性不育植株。通过聚合花中花粉的存在来鉴定雄性不育植株。在一种形式中，将切叶蜂蜂房盒子放置于从田地边缘土地高架的柱子上，蜂房管开口面向南。在一种形式中，沿田地的北侧约每100英尺放置一个蜂房盒子。通常切叶蜂的首次释放被设计成获得相当于每亩100,000只切叶蜂的蜂群。可释放另外的切叶蜂以在雄性不育植株的整个开花期维持该蜂群。一旦雄性不育植株中的开花显著下降，便从田地移除雄性不育植株以防止种子污染。一旦结种子且植株已经足够干燥，便从雄性不育莴苣花朵收获所述产生的F1种子。

雄性不育品系的使用消除了对于亲体之一去雄以减少自花传粉的需要。例如，代替从柱头洗除花粉和人工将花粉转移至非传粉的母体，可以在单个步骤中通过人工或通过使用切叶蜂将花粉转移至雄性不育亲体而实现杂交种子的产生。在一个实施方案中，通过下述步骤产生杂交莴苣植株：提供如本文所述的近交雄性不育品系和另一种近交产生花粉的品系，并且释放切叶蜂以将花粉从近交的产生花粉的雄性亲体转移至雄性不育雌性品系。

在一个实施方案中，本发明使用了本文所述方法所产生的杂交莴苣种子和植株。本发明提供了具有花粉的莴苣植株和去雄的植株，并释放切叶蜂。通过蜂将花粉从具有花粉的莴苣植株转移至去雄的植株。受精产生了F1杂交种子。从这些F1种子培育杂交莴苣植株。

F1杂交莴苣植株是在来自2种遗传上不同的亲体品系的花朵杂交传粉之后从第一杂交后代产生的那些莴苣植株。在优选的实施方案中，杂交莴苣植株是与亲体植株相比具有改进的生长参数或具有杂合优势的那些。最优选地，杂交莴苣植株是与亲体品系相比具有增加的平均头部重量的那些。头部重量的增加可以是约110％、约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在其他实施方案中，植株为具有改善的每亩头部产量或增加的新鲜重量(全部以磅或吨来计)的那些。

吸引切叶蜂以产生杂交植株

本发明还提供了对莴苣进行传粉和产生杂交莴苣的方法，其包括吸引切叶蜂的步骤。吸引切叶蜂的步骤可以是所述方法中的唯一步骤，或者可以是对栽培的莴苣传粉的方法中几个步骤中的一个。例如，用于对莴苣进行传粉的方法可包括释放切叶蜂，吸引切叶蜂或其组合。

可通过本领域技术人员使用的吸引切叶蜂至特定区域的任何方法将切叶蜂吸引至莴苣。例如，可以接近莴苣种植已知可吸引切叶蜂的植株(例如苜蓿)。可选地，可以将含有吸引切叶蜂的植株组分的植株衍生产物接近莴苣植株放置或与其接触。当莴苣植株开花时，可以将苜蓿植株耙入(disked down)或去除植株产物，使得切叶蜂集中于莴苣植株。还可以将这些产物喷洒在莴苣植株上。还可以通过制造吸引野生切叶蜂的环境(例如筑巢板或用于筑巢的管)来吸引它们。

在一个实施方案中，以交替行的雄性不育和雌性能育莴苣植株种子以及包围行的苜蓿来种植田地，以吸引切叶蜂。培育莴苣植株，使得抽苔并开花。在开花的初始阶段，对雄性不育行进行去劣，并从含有雄性不育品系的行中去除分离的雄性不育植株。通过复合花中存在花粉来鉴定雄性不育植株。一旦雄性不育植株中的开花显著下降，便从田地移除雄性不育植株以防止种子污染。一旦结种子且植株已经足够干燥，便从雄性不育莴苣花朵收获所述产生的F1种子。清洁并处理F1种子，并种植以产生F1杂交莴苣植株。

通过参考下述实施例可以更好地理解具体实施方式。本文所引用的所有参数由此通过引用而并入。

实施例

实施例1：潜在的莴苣传粉者的比较研究

检测下述昆虫种类在莴苣花朵上觅食和对莴苣花朵进行传粉中

的潜在有效性：

观察了下述家养的蜂的种类在莴苣花朵上觅食的情况：

属/种                      描述

Anthophora urbana    (大、灰白、快速飞行的蜂)

Melissodes sp.       (小、黑色蜂)

Agapostemon sp.      (金属绿色蜂-种类名称待定)

对于笼中和开放田地条件中的开花的雄性不育和雌性能育莴苣植株进行昆虫传粉实验。这些实验通常被限制于含有50株或更少开花的植株的样地或网笼。在每一块样地中，释放一系列昆虫种类并在清晨观察。昆虫的清晨活跃性是重要的，这是因为莴苣花朵通常仅在每日清晨上午7点和下午12:30之间的某时段开放约1-2小时。开花时段和花朵保持开放的持续时间取决于气候条件和特定的莴苣品种。

所释放和观察的昆虫是Megachile relative切叶蜂、商业上称为Macho Pol的Bombas impatiens雄性熊蜂、Apis mellifera普通蜜蜂、以及丽蝇的Calliphora vomitoria种。观察了网笼环境以及开放田地中昆虫的活跃性。在这些夏季的实验中，没有注意到所观察的任何种类的昆虫对于莴苣花朵的持续传粉、觅食或甚至远距离的兴趣。在开放田地的观察中，没有观察到昆虫造访莴苣花朵。在网笼实验中，我们观察到相似的结果，并且观察到大多数昆虫试图从笼子逃离。一年的所有两个夏季昆虫传粉实验在加利福尼亚州的萨利纳谷的隔离的研究实验室中进行。

实施例2：潜在的莴苣传粉昆虫的较大规模比较研究

较大规模重复实施例1的这些相同的实验。在加利福尼亚州圣克鲁斯县的偏远研究实验室中种植约1/2亩莴苣并使得开花。所释放和观察的昆虫是Megachile relative切叶蜂、Bombas impatiens雄性熊蜂、Apismellifera蜜蜂、以及丽蝇的Calliphora vomitoria种。也在网笼情形中观察了相同的昆虫。也基于我们的田地和笼子的观察，所释放的昆虫种类没有显示对于莴苣花朵进行觅食或传粉的兴趣。因为苜蓿切叶蜂没有从其管笼中出现，没有观察到它们的飞行。

实施例3：在较温暖的气候中潜在的莴苣传粉昆虫的比较研究：笼子和田地研究

尽管加利福尼亚州中心海岸地区的气候对于商业莴苣生产来说理想，但对于理想的莴苣种子的制备来说太冷。当进一步研究时，确定理想的昆虫活跃性需要较高的温度，这对于切叶蜂尤其明显。

这样，将传粉研究迁至圣约魁谷的较温暖气候。使用雄性能育和雄性不育开花的莴苣植株以较大规模再次进行开放田地和网笼传粉实验。在第四年的春天和夏天移植2.5亩毗连的莴苣植株。一开始的1.5亩在五月早期移植，接下来的1亩在六月中旬移植。交错种植对于延长具有待观察的开花植株的时间是重要的。各种植在雄性不育植株的交替床具有样地。这些样地每块含有大致100株植株，任意位于整个田地。每块样地的雄性不育植株在两边都有一行雄性能育植株。实验中的雄性不育品系50/50分离，这样在初始开花时每天对样地的花粉的存在与否进行去劣。去除含有花粉的雄性不育样地内的任何植株。

在该相同的制备区域，直立两只10ft X 10ft X 8ft笼子，并且每只笼子装有大致50株盆栽的莴苣植株。每只笼子含有25株雄性不育植株的和25株雄性能育植株。

在制备区进行下述观察并记录：

网笼研究

苜蓿切叶蜂：于6月13日在蜂房木板中开始5,000只苜蓿切叶蜂的培育。在同一年的6月28日开始第二批5,000只苜蓿切叶蜂(ALB)的培育。于7月12日释放西笼中的第一批苜蓿切叶蜂。于7月20日释放东笼中的第二批苜蓿切叶蜂。培育温度为62-98℉。第一板在376个度日(degree day)(基本温度60℉)之后开始羽化，第二板在384个度日之后开始羽化。

观察到雄性和雌性苜蓿切叶蜂造访花朵。雌性苜蓿切叶蜂使用它们的舌(tongue)探刺花朵，并且在花朵周围旋转。在造访几朵花之后，雌性苜蓿切叶蜂通常停下来疏理自己几分钟，这可能是因为植株渗出的乳液的缘故。

在7月16日观察到两只雌性苜蓿切叶蜂造访花朵。它们各自平均在每朵花上耗费11.5秒(n＝9)，耗费在花朵上的时间为4.2至25.0秒。在7月23日，每间隔2分钟观察苜蓿切叶蜂一次，平均每分钟4.6朵花朵被造访(n＝10)。

在8月24日，检查在被苜蓿切叶蜂(ALB)造访之后标记的雄性不育花朵的结实。ALB雌性蜂造访的花朵平均5.6颗种子(n＝16，范围为0-18)，ALB雄性蜂造访的花朵平均10.0颗种子(n＝4，范围为0-17)。

在7月21日左右结束西笼开花，7月30日左右结束东笼开花。东笼用另外的遮布修饰一半(西侧)，添加盆栽的薰衣草植株以提供另外的开花，来用于该天中晚些时候的传粉。这些努力似乎增加了笼中切叶蜂的寿命。

石巢蜂：石巢蜂是一种造访多种复合花朵的家养的种类。含有滞育成年蜂的芦苇得自犹他州的来源。5根芦苇的培育试验表明培育2后雄性蜂开始羽化。6天后雌性蜂开始羽化。在这5根芦苇中，总共有36只蜂(7.2只蜂/每根芦苇)。这些蜂中有19羽化(52％)。对于这种蜂来说，部分羽化是正常的，其中一些蜂在第一年羽化，剩余的蜂在下一年羽化。

在第四年的7月12日在西笼中释放20根芦苇(约144只蜂)的石巢蜂。在第四年的7月16日在东笼中安置40根芦苇(约288只蜂)。在第四年的7月14日观察到一只石巢蜂造访花朵。发现笼中石巢蜂死亡，尽管一些蜂羽化，但是活着的蜂也很虚弱。

丽蝇：丽蝇(Calliphora vomitoria)蛹得自爱达荷州。在第四年的7月23日，将3杯蛹(5100只蝇)置于东笼中，将1杯蛹(1700只蝇)置于西笼中。在第四年的7月25日观察笼中的蝇，但仅仅很少的蝇造访花朵。当在花朵上看到它们时，它们似乎没有在探刺花蜜。它们似乎不像大笼中的传粉者那样感兴趣和有效。

熊蜂：在7月23日得到一组C熊蜂群(Bombus impatiens；Natupol)，并系在东笼中的栅栏柱上。观察到熊蜂围绕笼飞行，并且在试验期间存活下来，这可能是依靠蜂群所提供的食物。有时，可观察到熊蜂造访花朵，并且观察到一些熊蜂的后腿上载有花粉。在第四年的7月30日，观察到一只后腿上载有花粉的熊蜂在2分钟内造访27朵花朵(13.5朵花朵/分钟)。然而，其只造访雄性能育花朵。发现大部分熊蜂试图中笼中逃出。

田地研究

A.urbana：在圣华金河的田地上观察到A.urbana。在9月29日，观察到一只A.urbana在40秒内造访9朵花朵(13.5朵花朵/分钟)。

Melissodes sp：在圣华金河处发现Mellisodes个体。在6月24日，观察到一只Melissodes sp在2分钟内造访9朵花朵(4.5朵花朵/分钟)。蜜蜂：在圣华金河附近(3英亩)有60个蜜蜂群。尽管数目众多，但是在莴苣田地中觅食的却不多。在9月29日，观察到蜜蜂平均每分钟造访15.6朵花朵(n＝3，10.3-19.5朵花朵/分钟)。

苜蓿切叶蜂：沿着朝南的田地的北缘将ALB引入到3个遮蔽物中。在8月31日、9月7日、9月10日和9月22日释放5,000只蜂。这批ALB分别被培育20、20、16和21天。观察到ALB在莴苣花朵上觅食，并且雌性ALB带着切下的叶子和花粉返回到筑巢的遮蔽物中。然而，发现田地中的密度很低。在9月29日，发现ALB平均每分钟造访3.7朵花朵(n＝4(2雄和2雌)，3.0-4.7朵花朵/分钟)。雄性能育植株的花期往往早于雄性不育植株的花期。在雄性能育植株闭合后，不难发现雄性和雌性ALB在开放的雄性不育花朵上觅食。

石巢蜂：在第四年的8月31日、9月7日、9月10日和9月22日将约75根芦苇(280只蜂)置于田地中。没有观察到石巢蜂筑巢或觅食。

丽蝇：在释放ALB的相同日期将丽蝇的蛹释放到ALB遮蔽物中。没有发现丽蝇在田地中觅食。

其他野生种类：发现几种食蚜蝇在田地中觅食。此外苜蓿粉蝶(Colias euytheme)数目很多，并且造访莴苣花朵。

概述

苜蓿切叶蜂表明它们将在网笼和田地情况下在莴苣花朵(包括雄性不育花朵)上精力充沛地觅食。为了获得最佳结果，应该每星期分批地引入ALB。在田地中，应该使用更多的数量(例如50,000或更多只蜂/英亩)，并且优选使田地其他吸引性植株。

实施例4：雄性不育品系的制备

250个品系MS7 X Salinas 88，BC4的种子得自USDA SalinasCalifornia research facility的Edward Ryder博士。MS7首次描述于Ryder，Genetic Studies in Lettuce(Lactuca sativa L.)，J.Amer.Soc.Hort.Sci.(1971)96(6)：826-828。

Monument、Sun Devil和Icon Lettuce的种子购自ProgenyAdvanced Genetics。将Monument、Sun Devil、Icon和其他ProgenyAdvanced Genetics莴苣品种的种子种植至开花期，并与MS7 X Salinas88，BC4植株杂交以制得Monument、Sun Devil、Icon和其他雄性不育F1种子。

种植Monument、Sun Devil和Icon的F1雄性不育种子。将Monument、Sun Devil和Icon雄性不育植株繁殖，收取插枝并以组织培养形式维持。在开花期鉴定不育植株。然后组织培养形式增加不育植株。将组织培养植株转移至土壤，在土壤中将植株繁殖至开花期，然后与来自产生Monument、Sun Devil、Icon和其他相应的产花粉的植株的花粉中的花粉回交，从而产生种子。收获种子。

种植所收获的种子，进一步筛选和去劣所产生的植株的均匀性和所需性状。可以再对Monument、Sun Devil、Icon和其他品系进行回交以增加雄性不育母体品系的纯合性，从而制得BC1、BC2、BC3、BC4、BC5(BC＝回交)种子。

实施例5：莴苣植株的Megachile传粉的另外研究

如实施例3中所述，切叶蜂能够在网笼中对莴苣种子传粉。并不清楚切叶蜂是否可以在开放田地中有效地使用。这样，进行试验以确定切叶蜂是否会在开放田地中对杂交莴苣种子传粉，以及需要什么水平的蜂来提供良好地结种子。

开发实施例4中所列出的雄性不育品系。种植雄性不育和雄性能育品系的种子并繁殖至开花期。在加利福尼亚的圣华金河和加利福尼亚的圣胡安波蒂斯塔的田地中移植雄性不育和雄性能育幼苗。该种植覆盖从东至西雄性不育行和雄性能育行交替的8行。北边2行种植雄性能育植株，然后种植1行雄性不育植株。第4和5行由雄性能育植株构成，第6和7为雄性不育植株。最南边的第8行种植雄性能育莴苣植株。为了雄性能育性，再次将雄性不育品系隔离为50/50。在开花期早期，对不育行进行去劣，并除去产生植株的花粉。

研究位置位于加利福尼亚的圣华金河和加利福尼亚的圣胡安波蒂斯塔。圣华金河田地处为一英亩8行、每行间隔30英寸的条带状田地。该田地上100英尺的部分造笼(2000平方英寸或0.046英亩)。圣胡安波蒂斯塔处为两个144平方英尺的笼(0.0066英亩)。由爱达荷州的International Pollination Systems Inc.提供500,000只切叶蜂，该公司从加拿大的来源购买这种蜂。它们中的270,000位于松散的蜂房中，230,000位于木制巢穴板中。

蜂的准备

在田地的一部分上构建30ft X 100ft X 7ft的笼，以容纳测试昆虫。该笼覆盖100英寸的全部8行种植区域。引入另外的切叶蜂，并进行下述观察。

蜂在4月19日到达加利福尼亚。木制板在环境温度下储存于车库中，而松散的蜂房存储在冰箱中。

切叶蜂(苜蓿切叶蜂)的发育临界为60℉。换言之，如果茧保持在60℉下的条件下，则蜂保持休眠，在60℉上时，蜂开始发育。苜蓿切叶蜂初始发育的最佳温度为86℉。在86℃下一整天提供蜂26个度日。对于苜蓿切叶蜂(ALB)而言，度日是它们在60℉的培育温度或更高的温度下的天数。在86℉下，雄性ALB需要平均19.4天(504度日)来羽化，而雌性ALB需要平均21.5天(559度日)羽化。

在5月6日将木制板送至蜂培育房之前，使它们进行约160个度日或6.2天的培育。蜂培育房需要两个小型空调，所述空调能够在外部温度经常达到105℉时，在7月将室温保持在66℉下。据认为，在需要蜂之前，蜂能够在这些温度下保持，逐渐积累度日直到大约一周，然后可以将蜂加热以结束此时的培育。

Pteromalus寄生物在5月20日开始羽化(其指示为在86℉下培育约7天)，切叶蜂在6月2日开始羽化(其指示为培育12天)。在7月6日发现第一批雄性苜蓿切叶蜂(ALB)(其指示为培育16天)。在8月29日将第一批蜂从培育器中移走(对于圣胡安波蒂斯塔而言，为4600只蜂)。

蜂在田地和笼中的释放

在8月31日，在圣华金河处的8个遮蔽物中释放成百上千只蜂，其中2个遮蔽物位于网笼中。在9月2日，将另外100,000蜂递送至圣华金河处。此时，对保留的木制板取样，发现很少有活着的蜂。大部分已经羽化，并死在洞内或培育器的底上。

在9月3日，将松散的蜂房中的135,100只蜂送至圣华金河。101,300只蜂在田地中释放，33,800只蜂在笼中释放。这早期这些蜂所计划的时间，但此时期望很少蜂从木制板孵化。将这些蜂在比其他蜂较晚的日期由爱达荷州的International Pollination Systems Inc.运送，并且它们已经在爱达荷州进行加热使其早熟，据估计它们中的20至30％会丧失。它们很快开始羽化，不久很容易发现雄性和雌性蜂在田地中、在花朵上，并且返回遮蔽物中的巢穴中。

然而，到9月7为止，很少的蜂是活跃的。此时决定修剪笼外的两大批莴苣和笼内的全部面积的莴苣，以阻碍植株使得它们在一至二个星期后开花。

在9月14日，释放113,700只蜂(田地中释放96,300只蜂，笼中释放17,400只蜂)。此外，在圣胡安波蒂斯塔的每个笼中均释放5400只蜂。

在9月19日，在圣华金河，在田地中增加10,700只蜂，在笼中增加4,000只蜂。在9月14日和9月19日释放的蜂具有最佳的预培育和培育条件，因此期望从这些释放中获得最佳的飞行活动和传粉活动。在9月28日观察到优异的飞行活动，观察到多只ALB离开巢穴、飞行、在莴苣花朵上觅食、并带着花粉返回到它们的巢穴中，并且可以观察到许多雄性和雌性蜂造访莴苣花朵。ALB对于雄性不育或能育花朵并没有表现出任何的优先性。在9月21日左右观察雄性不育植株，其花朵上有许多苜蓿切叶蜂。

在10月5日，ALB的传粉活动仍很优异。每2分钟观察到13只不同的雌性ALB，并发现平均每分钟造访7.1朵花朵(低的花朵数＝4，高的花朵数＝14/分钟)。

在田地中总共释放了约177,900只蜂(187,000只蜂/英亩)，在笼中释放了45,100只蜂(902,000只蜂/英亩)。表1中提供了概述。

表1.苜蓿切叶蜂，V＝圣华金河，SJB＝圣胡安波蒂斯塔。

 

日期	V-田地	V-笼	SJB
				9月3	70,900	23,700	0
9月14	96,300	17,400	10,800
				9月19	10,700	4,000	0
总数	177,900	45,100	10,800
				蜂/英亩	187,000	902,000	1,636,000

结果概述

观察植株来对结种子进行评价。在所有位置对于所有测试的雄性不育品系来说，在笼中和在开放田地中所观察到的杂家种子的制备都是优异的。

ALB似乎非常有效地为莴苣传粉，并且不受雄性不育花朵上缺少花粉的阻碍。

ALB可以用于在开放田中为莴苣传粉。

在开花期每周释放ALB是提高传粉效果的有效策略。

每星期100,000只蜂/英亩的存储率对于有效的传粉来说似乎是远远足够的。

在夏季、特别是需要在晚夏释放的情况下，ALB必须保持在60℉下以停止发育。

实施例6：通过本发明的方法制得的莴苣杂种的比较试验

通过将雄性不育品系杂交至近交系A005 X PM5004、A006 XPM5004、A009 X PM5023中来制备杂交种子。PM5023、A009和A005是如实施例4所述而制备的Progeny Advanced Genetics iceberg莴苣雄性不育研究品系。A006是如实施例4所述而制备的Monument雄性不育品系。PM5004是得自Seminis Vegetable Sees的Cannery Row雄性能育(产花粉的)品系。

杂交种子在圣华金河的开放田地的种子制备农作物中来制备。田地种植雄性能育和雄性不育莴苣植株的交替的行。在1月长的开花期期间在3个不同的场合释放切叶蜂。蜂的遮蔽物置于田地以及木头和聚苯乙烯泡沫塑料板的组合中的多个区域中，并且含有切叶蜂的松散的蜂房置于遮蔽物中。在开花期间在3个不同的时间加入另外的板和松散的蜂房，从而维持较高的活的切叶蜂的数量。切叶蜂在上午在温度已经达到约74度后从它们的巢穴中羽化，莴苣花朵已经开放了约1小时。然后观察到切叶蜂从它们的巢穴和遮蔽物飞出，然后在雄性不育和雄性能育莴苣花朵上觅食。在这种觅食过程中，切叶蜂将花粉由雄性能育(产花粉的)植株的花朵转移至雄性不育植株的花朵。通过这种机理发生传粉，并且制得杂交莴苣种子。在从初始释放切叶蜂约3周的时间内，在雄性不育植株中观察到结种子。在第一次释放切叶蜂约1月后，莴苣开花期结束，种子成熟。手工收获成熟的种子。

繁殖杂交种子A005 X PM5004、A006 X PM5004、A009 X PM5023和它们各自的母体以用于比较分析。在加利福尼亚的圣华金河将重复试验种植两次。

在每个试验中将杂交品种和母体品种重复3次，每次重复使用40个40植株。垄作上的每个样地的长度为20英寸，中线为40英尺，2个种子品系/垄作。使植株变薄至12英寸。所有的样地都同样处理。

从每个样地中切下10个连续的植株(每个种子品系5个)，将每株植株称重(精确至克)并且测定它们的头部周长(精确至1/4英寸)。研究结果提供在下表2-7中。

表2示出了与PM 5004母体相比，A005 X PM5004杂种的比较性的头部重量和头部周长。结果表明，与PM 5004母体相比，A005 XPM5004杂种的头部重量增加了33.2％、35.8％和37.7％。

表3示出了与A005母体相比，A005 X PM5004杂种的比较性的头部重量和头部周长。结果表明，与A005母体相比，A005 X PM5004杂种的头部重量增加了31.4％、29.0％和20.1％。

表4示出了与A006母体相比，A006 X PM5004杂种的比较性的头部重量和头部周长。结果表明，与A006母体相比，A006 X PM5004杂种的头部重量增加了55.6％、52.3％和27.0％。

表5示出了与PM5004母体相比，A006 X PM5004杂种的比较性的头部重量、头部周长和芯长。结果表明，与PM5004母体相比，A006X PM5004杂种的头部重量增加了36.4％、28.5％和19.2％，芯长增加了26.2％、28.3％和10.9％。

表6示出了与PM5023母体相比，A009 X PM5023杂种的比较性的头部重量和头部周长。结果表明，与PM5023母体相比，A009 XPM5023杂种的头部重增加了34.1％、37.4％和46.1％。

表7示出了与A009母体相比，A009 X PM5023杂种的比较性的头部重量和头部周长。结果表明，与A009母体相比，A009 X PM5023杂种的头部重增加了22.9％、31.9％和55.7％。

表2

表3

表4

表5

表6

表7

Claims (29)

1.一种给去雄的莴苣植株传粉的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供包含花粉的第一莴苣植株；

b)提供至少一株去雄的莴苣植株；以及

c)释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以给所述去雄的莴苣植株传粉。

2.权利要求1所述的方法，其中所述切叶蜂选自苜蓿切叶蜂、Megachile relativa和Megachile pugnata。

3.权利要求1所述的方法，其中所述切叶蜂为苜蓿切叶蜂。

4.权利要求1所述的方法，其中所述第一莴苣植株为近交或F1莴苣植株，以及所述提供步骤包括种植所述近交或F1莴苣植株的种子，其中所述种子萌芽并生长成所述近交或F1莴苣植株。

5.权利要求1所述的方法，其中所述去雄的莴苣植株为不产生花粉的莴苣植株，以及所述提供步骤包括种植所述去雄的莴苣植株的种子，其中所述种子萌芽并生长成所述去雄的莴苣植株。

6.权利要求5所述的方法，其中所述不产生花粉的植株为雄性不育莴苣植株。

7.权利要求1所述的方法，其中所述去雄的莴苣植株为包含带有花药的花朵的植株，其中所述植株是通过去除花药法或通过喷雾法来去雄的。

8.权利要求1所述的方法，其中所述释放步骤是在开放田地中进行的。

9.权利要求1所述的方法，其中所述释放步骤是在封闭或笼闭的区域中进行的。

10.权利要求1所述的方法，其中所述第一莴苣植株和所述去雄的植株在开花期开花，其中所述释放步骤是通过在所述开花期每周释放一批蜂而进行的。

11.权利要求1所述的方法，其中所述释放步骤是在至少约74℉的温度下进行的。

12.权利要求1所述的方法，其中所述莴苣植株为结球莴苣或毒莴苣种。

13.一种制备杂交莴苣种子的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供包含花粉的第一莴苣植株；

b)提供至少一株去雄的莴苣植株；以及

c)释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及

d)种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。

14.权利要求13所述的方法，其中所述切叶蜂选自苜蓿切叶蜂、Megachile relativa和Megachile pugnata。

15.权利要求13所述的方法，其中所述切叶蜂为苜蓿切叶蜂。

16.权利要求13所述的方法，其中所述第一莴苣植株为近交或F1莴苣植株，以及所述提供步骤包括种植所述近交或F1莴苣植株的种子，其中所述种子萌芽并生长成所述近交或F1莴苣植株。

17.权利要求13所述的方法，其中所述去雄的莴苣植株为不产生花粉的莴苣植株，以及所述提供步骤包括种植所述去雄的莴苣植株的种子，其中所述种子萌芽并生长成所述去雄的莴苣植株。

18.权利要求13所述的方法，其中所述释放步骤是在封闭区域或开放田地中进行的。

19.权利要求13所述的方法，其中所述第一莴苣植株和所述去雄的植株在开花期开花，其中所述释放步骤是通过在所述开花期每周释放一批蜂而进行的。

20.权利要求13所述的方法，其中所述释放步骤是在至少约74℉的温度下进行的。

21.权利要求13所述的方法，其中所述莴苣植株为结球莴苣或毒莴苣种。

22.一种杂交莴苣种子，其产生于包含花粉的第一莴苣植株和去雄的莴苣植株之间的杂交，其中所述杂交是通过包括以下步骤的方法进行的：

a)释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及

b)种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。

23.权利要求22所述的杂交莴苣种子，其中所述种子产生平均头部重量大于所述第一莴苣植株的平均头部重量的植株。

24.一种给去雄的莴苣植株传粉的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供包含花粉的第一莴苣植株；

b)提供至少一株去雄的莴苣植株；以及

c)将切叶蜂吸引至所述第一莴苣植株，其中所述切叶蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株并形成传粉的莴苣植株。

25.权利要求24所述的方法，其中所述切叶蜂被定位吸引子吸引，所述吸引子在所述莴苣植株的周围吸引所述切叶蜂。

26.权利要求24所述的方法，其中所述切叶蜂被所述莴苣植株的周围的定位植株产物所吸引。

27.权利要求24所述的方法，其中所述切叶蜂通过将苜蓿植株定位在所述莴苣植株的周围而被吸引。

28.一种制备杂家莴苣种子的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供包含花粉的第一莴苣植株；

b)提供至少一株去雄的莴苣植株；以及

c)将切叶蜂吸引至所述第一莴苣植株，其中所述切叶蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及

d)种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。

29.一种杂交莴苣种子，其产生于包含花粉的第一莴苣植株和去雄的植株之间的杂交，其中所述杂交是通过包括以下步骤的方法进行的：

a)释放切叶蜂，其中所述蜂将花粉从所述第一莴苣植株转移至所述去雄的莴苣植株以形成传粉的莴苣植株；以及

b)种植所述传粉的莴苣植株以制备杂交莴苣种子。