CN101463086A - 二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体及其制备方法和应用。本发明所述抗体是通过在二乙氧基硫代磷酸酯结构上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原，半抗原偶联牛血清蛋白制备免疫抗原，免疫原免疫新西兰大白兔制备得到，并与包被原建立二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药多残留ELISA检测方法。基于本发明所述抗体建立的检测方法可以同时检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药12种以上，检测限为0.0002～3.938μg/ml，适合农残的现场监控和高通量快速筛选。

Description

二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药广谱特异性多克隆抗体及其制备方法和在有机磷农药多残留ELISA检测方法中的应用。

背景技术

农药残留问题严重危害着人民群众的身体健康。有机磷类农药由于高效，廉价而在农业和种植业上广泛使用，但是有机磷农药，作为神经毒物，会引起神经功能紊乱、震颤、精神错乱、语言失常等症状。在2002年中华人民共和国公布的第199号公告上明令禁止在蔬菜、果树、茶叶、中草药材上不得使用和限制使用的有机磷农药有17种，而含二乙氧基硫代磷酸酯共有结构的农药就有8种。加强农残检测、提高分析检测水平是控制农药残留的重要手段之一。

目前国内外的农药残留免疫检测研究，基本上都集中于单组分特异性检测及相应试剂盒的研制，但是实际生产中，食物中残留的农药种类较多，单组分试剂盒很难实现高通量快速的检测，虽然仪器多残留检测已经可以实现越来越多组分的多残留检测，但所需仪器复杂昂贵，而且样品前处理繁琐费时，操作需专业人员、检测费用高，很难适应许多场合快速检测的需要。因此，实现农药多残留快速检测，已经是国内外残留分析的一种新趋势。

目前农药多残留免疫检测国内研究成果比较少，国内外仅有少量用多克隆抗体和单克隆抗体进行有机磷农药多残留免疫检测的研究报道，Suedi，Johnson，Banks，Alcocer等相继研究了有机磷农药的共有结构，设计出能够识别相似结构的“簇抗原”，利用交叉反应，制备出“簇多克隆抗体”，并研究了该抗体对几种有机磷农药的选择性和亲和力，其中有的“簇多克隆抗体”已经应用于有机磷农药多残留的检测中，但有的抗体检测限较高，亲和力不够。2002年，Mi Soon Jang报道了用其设计的两种半抗原免疫动物后制备的单克隆抗体实现了一类有机磷农药的多残留检测。2005年，刘贤金等公开了“用于检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用”，以二乙基膦酸乙酸为半抗原，不需要进行结构改造即可与蛋白质偶联用于免疫动物，从而制备的抗体可以检测多种有机磷农药，但可以检测的农药没有针对性，检测限差异很大。可见作为广谱特异性抗体制备这个关键课题还没有很好解决。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，是一种多克隆抗体，具有广谱特异性，实际应用性强。

本发明的另一个目的是提供所述抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述抗体在有机磷农药多残留ELISA检测方法中的应用。

本发明所指的一类有机磷农药共有结构是二乙氧基硫代磷酸酯。

本发明的技术方案是：

提供二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，通过在二乙氧基硫代磷酸酯结构上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原，半抗原偶联牛血清蛋白(BSA)制备免疫原，免疫原免疫新西兰大白兔制备得到。

所述抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原配合弗氏佐剂免疫实验动物；

(2)免疫4次后动脉取血，分离抗血清；

(3)抗血清经过抗体纯化步骤得到目标抗体。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原与DCC，NHS反应形成活泼酯；

(2)将活泼酯滴加入一定浓度的蛋白溶液中，反应过夜；

(3)偶联有二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原的蛋白用生理盐水透析3天得到目标抗原。

所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原，所述半抗原优选乙氧基硫代磷酰氯与羟基肉桂酸或氨基酸在0℃下于甲醇中进行亲核取代反应的产物，其制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酰氯与羟基肉桂酸或氨基酸在0℃下于甲醇中进行亲核取代反应；

(2)反应结束，旋转蒸干，复溶于碱性溶液，酸化即可生成目标半抗原。

本发明同时提供了所述抗体在有机磷农药多残留ELISA检测方法中的应用，通过二乙氧基硫代磷酸酯结构上引入合适的活性手臂，制备包被半抗原，偶联卵清蛋白(OVA)制备包被原；用免疫原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，并与包被原建立多残留ELISA检测方法，方法的建立具体包括以下步骤：

(1)制备免疫半抗原和包被半抗原；

(2)制备免疫抗原和包被抗原；

(3)制备多克隆抗体；

(4)以包被抗原包被酶标板，每孔100μl，置于4℃下过夜，取出酶标板恢复至室温，弃去包被液，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干，用5％脱脂奶粉封闭，每孔200μl，于37℃水浴温育3h，洗涤3次后拍干，放置37℃烘箱烘干备用；

(2)加入用PBST稀释至10⁴-10⁶倍的抗体，每孔50μL加入酶标板微孔中，同时加入一系列浓度的二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药标准品，每孔50μl，37℃水浴温育45min，洗涤3次后拍干；

(3)加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(羊抗兔IgG HRP)，稀释倍数为5000-10000倍，每孔100μl，37℃水浴中温育30min，洗涤3次后拍干；

(4)加入TMB底物溶液，每孔100μl，37℃水浴显色15min，向每孔中加入50μl、10％的硫酸溶液终止反应，于450nm波长下测各孔的吸光值。

(5)以所获吸光值的平均值计算抑制率，并OriginPro软件制作各个药物的标准曲线，计算药物抑制中浓度(IC₅₀)，最低检测限和线性范围。

所述包被半抗原具有式(II)所示的结构：

其中n为3～6的自然数。

所述包被抗原具有式(IV)所示的结构：

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明制备了具有广谱特异性的多克隆抗体，并基于抗体建立了多残留ELISA检测方法，能同时检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药12种以上，检测限为0.0002～3.938μg/mL，实现了高通量快速筛选样品，检测成本远比传统方法低。ELISA检测由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且方法的稳定性和重复性较好。本发明方法简单方便，适用于目前使用最为广泛的二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药残留现场高通量快速筛选，具有重要的现实意义。

附图说明

图1检测对硫磷的标准曲线图

图2检测蝇毒磷的标准曲线图

图3检测辛硫磷的标准曲线图

图4检测除线磷的标准曲线图

图5检测甲拌磷的标准曲线图

图6检测喹硫磷的标准曲线图

图7检测三唑磷的标准曲线图

图8检测毒死蜱的标准曲线图

图9检测乙基溴硫磷的标准曲线图

图10检测氯唑磷的标准曲线图

图11检测二嗪磷的标准曲线图

图12检测治螟磷的标准曲线图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1  二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫半抗原OPH1的制备

取4.88g(0.04moL)对羟基苯甲醛溶于吡啶中，用干燥管保护，85℃水浴，搅拌。往上述溶液滴加3.75(0.036moL)丙二酸，反应3h。反应结束，混合液倾入饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌15min，用乙酸乙酯萃取，水层用4M盐酸调pH至3，析出白色固体2.32g，产率为78.6％。ESI-MS analysis(negative)m/z 163[M-H]-；1H-NMR(400MHz，d6-Acetone and TMS)：δ 6.33(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；6.89(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)；7.54(d，J＝8.6Hz，2H，ArH)；7.60(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；8.86(s，1H，OH)；10.77(s，1H，COOH).

称取0.7(0.0125moL)KOH溶于无水甲醇中，称取0.821g(0.005moL)上述固体，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.415g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应过夜。反应结束，过滤，上清液旋转蒸发浓缩，用乙酸乙酯溶解，过滤，滤液选装蒸发浓缩，加入适量饱和碳酸氢钠溶液，搅拌25min，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩析出结晶，用石油醚洗，得到产物0.75g，产率为11.9％。ESI-MS analysis(negative)m/z 315[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl3 and TMS)：δ 1.36(t，J₁＝7.0Hz，J₂＝7.0Hz，6H，CH₃)；4.23(qd，J₁＝7.1Hz，J₂＝7.1Hz，J₃＝7.1Hz，J₄＝9.6Hz，4H，CH₂)；6.37(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)；7.21(d，J＝8.4Hz，2H，ArH)；7.52(d，J＝8.5Hz，2H，ArH)；7.74(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CH)。

制备的免疫半抗原(OPH1)结构如式(I)所示：

实施例2  二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药包被半抗原OPH2的制备

称取1.68g(0.018moL)KOH溶于无水甲醇中，称取1.00g(0.01moL)氨基丁酸，0℃搅拌下溶于上述溶液中，搅拌30min。滴加1.5g(0.008moL)二乙氧基硫代磷酰氯，0℃反应12h。反应结束旋干，用氯仿洗，过滤，上清浓缩后过(氯仿：甲醇＝3：1)硅胶柱，得1.14g，产率56.0％。ESI-MS analysis(negative)m/z 254[M-H]-；1H-NMR(400MHz，CDCl₃and TMS)：δ 1.27(t，J＝7.0Hz，6H，CH₃)；1.77(p，J＝6.9Hz，2H，CH₂)；2.39(t，J＝7.3Hz，2H，CH₂)；2.98(td，J₁＝6.8Hz，J₂＝6.8Hz，J₃＝6.8Hz，J₄＝11.1Hz，2H，CH₂)；4.01(ddd，J₁＝1.4Hz，J₂＝7.3Hz，J₃＝15.9Hz，4H，CH₂).

制备的包被半抗原(OPH2)结构如式(II)所示：

实施例3  二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫抗原OPH1-BSA的制备

(1)取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC和NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；

(2)称取0.002molBSA，4℃下缓慢溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液；

(3)磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3天，以1mg/mL或2mg/mL的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中，备用。

免疫原鉴定：对载体蛋白BSA，半抗原和免疫原进行紫外扫描测定(200～400nm)，发现免疫原OPH1-BSA与BSA和OPH1相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OPH1与BSA偶连成功。三硝基苯黄酸法(TNBS)测得半抗原OPH1与BSA的偶连比为16:1。

制备的免疫原(OPH1-BSA)结构如式(III)所示：

实施例4  二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药包被抗原OPH2-OVA制备方法

(1)取半抗原0.12mmol溶于2mlDMF中，搅拌加入DCC和NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；

(2)称取0.004molOVA，4℃下缓慢溶于10ml浓度为0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，搅拌溶解制备B液；

(3)磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3天，以1mg/mL或2mg/mL的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中，备用。

制备的包被原(OPH2-OVA)结构如式(IV)所示：

包被原鉴定：对载体蛋白OVA，半抗原和免疫原进行紫外扫描测定(200～400nm)，发现免疫原OPH2-OVA与OVA和OPH2相比，吸收曲线有明显改变，说明半抗原OPH2与OVA偶连成功。三硝基苯黄酸法(TNBS)测得半抗原OPH2与OVA的偶连比为12:1。

实施例5  二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药广谱特异性多克隆抗体的制备

多克隆抗体的制备：将免疫原缓慢解冻，然后加入等量的佐剂(第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫2只体重为2～2.5kg的健康新西兰大白兔，注射剂量为1g/只。第4次加强免疫后1周耳缘静脉采血，并利用间接ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉免疫兔子。10天后心脏采血，室温静置0.5～1h，于4℃冰箱过夜后吸取上层析出的血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化得到多克隆抗体，透析后冷冻干燥成粉末，于-20℃下保存备用。

抗体效价的检测：间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血清的测定值为准，测得抗体的阳性滴度为1:512000。

实施例6  多残留间接竞争ELISA检测方法的建立

(1)以一定浓度的包被抗原包被酶标板，每孔100μl，置于4℃下过夜。取出酶标板恢复至室温，弃去包被液，用PBST洗涤液洗涤3次，拍干，用5％脱脂奶粉封闭，每孔200μl，于37℃水浴温育3h，洗涤3次后拍干，放置37℃烘箱烘干备用；

(2)加入用PBST稀释至10⁴～10⁶倍的抗体，每孔50μL加入酶标板微孔中，同时加入一系列浓度的二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药标准品，每孔50μl，37℃水浴温育45min，洗涤3次后拍干；

(3)加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(羊抗兔IgG HRP)，稀释倍数为5000～10000倍，每孔100μL，37℃水浴中温育30min，洗涤3次后拍干；

(4)加入TMB底物溶液，每孔100μL，37℃水浴显色15min，向每孔中加入50μL、10％的硫酸溶液终止反应，于450nm波长下测各孔的吸光值；

(5)以所获吸光值的平均值计算抑制率，并OriginPro软件制作各个药物的标准曲线，计算药物抑制中浓度(IC₅₀)，最低检测限和线性范围，结果如表1所示。

抑制率计算公式为：

其中，A_max为不加农药时的吸光值，A_x为农药浓度为x时的吸光值，A_min为空白对照孔的吸光值。

表1 应用本发明E1ISA方法的检测结果

Claims (10)

1、一种二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体，其特征在于通过在二乙氧基硫代磷酸酯结构上引入合适的活性手臂，制备免疫半抗原，半抗原偶联牛血清蛋白制备免疫抗原，免疫原免疫新西兰大白兔制备得到。

2、一种权利要求1所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫半抗原；

(2)制备二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫抗原；

(3)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫抗原配合弗氏佐剂免疫实验动物；

(4)免疫4次后动脉取血，分离抗血清；

(5)抗血清经过抗体纯化步骤得到目标抗体。

3、根据权利要求2所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的制备方法，其特征在于步骤(1)所述半抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酰氯与羟基肉桂酸或氨基酸在0℃下于甲醇中进行亲核取代反应；

(2)反应结束，旋转蒸干，复溶于碱性溶液，酸化即可生成目标半抗原。

4、一种权利要求3所述制备方法制备得到的半抗原，其特征在于所述半抗原具有式(I)所示的结构：

5、根据权利要求2所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药免疫抗原的制备方法，其特征在于步骤(2)所述免疫抗原的制备方法包括以下步骤：

(1)将二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原与DCC，NHS反应形成活泼酯；

(2)将活泼酯滴加入一定浓度的蛋白溶液中，反应过夜；

(3)偶联有二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药半抗原的蛋白用生理盐水透析3天得到目标抗原。

6、一种权利要求5所述制备方法制备得到的免疫抗原，其特征在于所述免疫抗原具有式(III)所示的结构：

7、一种权利要求1所述抗体的应用，其特征在于应用于建立有机磷农药多残留ELISA检测方法。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的ELISA检测方法的建立包括以下步骤：

(1)制备免疫半抗原和包被半抗原；

(2)制备免疫抗原和包被抗原；

(3)制备多克隆抗体；

(4)以包被抗原包被酶标板；

(5)抗体用PBST稀释至10⁴～10⁶倍，以每孔50μL的量加入酶标板微孔中，同时加入二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药标准品，每孔50μl，37℃水浴温育45min，洗涤3次后拍干；

(6)加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗，稀释倍数为5000～10000倍，每孔100μl，37℃水浴中温育30min，洗涤3次后拍干；

(7)加入TMB底物溶液，每孔100μl，37℃水浴显色15min，向每孔中加入50μl、10％的硫酸溶液终止反应，于450nm波长下测各孔的吸光值；

(8)以所获吸光值的平均值计算抑制率，根据各个药物的标准曲线，计算药物抑制中浓度、最低检测限和线性范围。

9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述包被半抗原具有式(II)所示的结构：

其中n为3～6的自然数。

10、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述包被抗原具有式(IV)所示的结构：

Images