CN101457227A - 沙冬青cbl1基因启动子的鉴定及其功能研究 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)CBL1基因1683bp启动子序列，命名为AmCBL1P，公开了AmCBL1 cDNA 124bp的5’非翻译区(UTR)。将1683bp AmCBL1启动子序列与其cDNA的5’UTR序列进行比对，在基因组上发现AmCBL1基因的5’非翻译区插入了一个长度为690bp的内含子。PLACE数据库对AmCBL1P进行分析预测，发现该序列含有多处与干旱，高盐和激素诱导相关的顺式作用元件的同源序列。因此，推测AmCBL1P是一个诱导型启动子，受多种逆境因子和激素的诱导。为了鉴定AmCBL1P的功能区域，构建了启动子片段全部或部分序列植物表达载体。为了检测5’非翻译区的内含子是否发挥增强子作用，改变内含子的位置和方向，构建了植物表达载体。本研究对阐明沙明清CBL1基因的上游调控机制奠定了基础，对提高植物抗逆性具有重要的科学意义。
Description
技术领域
本发明涉及沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)CBL1基因启动子AmCBL1P的鉴定，数据库分析，其缺失片断植物表达载体的构建及该启动子的应用。
背景技术
钙离子作为第二信使，在植物多种非生物胁迫(干旱，低温，盐碱)信号转导过程中有非常重要的作用。从钙离子到基因表达，许多信号因子在这个工程中起重要作用。Ca2+通过与钙结合蛋白的特应性结合把信号传递到下游。钙结合蛋白主要有三类：CaM，CDPK和CBL。CBL蛋白是最新发现的钙结合蛋白。1999年，kudla等首次在拟南芥中发现了三种CBL蛋白，它们和哺乳动物中的钙调磷酸酶B亚基和神经元钙结合元件相似。在拟南芥基因组中共发现10个CBL家族成员，即AtCBL1-10，该组蛋白皆包含4个EF-hand结构，本身没有酶活性，通过与目的蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)特异性结合而起作用。CBL家族中对CBL1基因的研究最为详尽。在拟南芥的研究中发现，CBL1可以受多种胁迫如干旱、高盐等诱导，超量表达CBL1基因能促进一系列逆境诱导基因的表达，并能提高拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性，但却降低其耐冻性，推测CBL1可能是干旱响应的正调节因子和低温响应的负调控因子。2006年，Xu和Li首次在拟南介中发现：CBL1和CBL9通过与CIPK23相结从而合激活CIPK23，激活的CIPK23直接磷酸化一种钾离子通道蛋白AKT1，在植物缺钾的情况下，提高钾离子的吸收。由此看来，CBL1是植物逆境信号传导途径中的传递元件和重要组分，很可能是信号途径上游一个重要交叉节点。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是我国沙漠地区唯一的生常绿灌木，在长期的恶劣环境中形成了极强的抗旱，耐寒性。因此，以沙冬青为材料，分离其CBL1基因的启动子，研究其功能，以期阐明强抗逆性植物沙冬青CBL1基因的上游调控机制，为提高植物抗逆性基因工程提供新的思路。
发明内容
本发明以强抗逆性植物沙冬青为材料，克隆了受多种胁迫诱导的CBL1基因的上游启动子序列，PLACE数据库分析其序列，发现该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box，包含多处与干旱，高盐和激素诱导相关的顺式作用元件的同源序列。并构建了相应得缺失表达载体。本研究对揭示沙冬青CBL1基因的上游调控机制，提升植物抗逆性，具有重要的科学意义。
本文在已知沙冬青CBL1 cDNA序列(GenBank的注册号位AY902246)的基础上，借鉴5’RACE策略，利用锚定PCR步移的方法克隆了沙冬青CBL1基因1683bp的5’侧翼序列，命名为AmCBL1P。采用5’RACE技术，得到了AmCBL1基因上游124bp的5’非翻译区(UTR)。将1683bp AmCBL15’侧翼序列与其5’UTR序列进行比对，重叠的部分相似率达100％。有趣地是，经过序列比对，我们在基因组上发现AmCBL1基因的5’非翻译区插入了一个长度为690bp的内含子。这与在拟南芥中得到的结果相似。在拟南芥基因组中，AtCBL1基因5’端也存在一个内含子，位于起始子ATG前123bp处，长度为411bp。5’端内含子究竟起什么作用，还需要实验进行进一步验证。
启动子上通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合，从而抑制或激活基因的转录。经实验证明，AmCBL1基因表达受水分胁迫(干旱、盐等)和脱落酸的诱导。受水分胁迫和ABA诱导表达的基因的启动子序列中，常有一些起关键作用的功能元件，大多数受干旱诱导的基因上游存在干旱诱导元件DRE(dehydration-responsive element)，受ABA诱导的基因的启动子中常含有ABRE(ABA-responsitive element)元件等。
本文利用PLACE数据库分析AmCBL1启动子序列，预测其顺式作用元件(如表1所示)。根据数据库预测，发现AmCBL1启动子序列上主要存在一些环境因子应答元件和激素应答元件。受干旱，ABA诱导的基因的表达可能受不同元件的调控，如上所述，很多干旱和ABA诱导的基因的启动子中分别含有DRE和ABRE元件，但有些受干旱和ABA诱导的基因的启动子中并不含有该元件，如rd22基因的表达虽受ABA的诱导，但其上游启动子序列却不含有DRE和ABRE元件，该基因的表达受MYB和MYC识别的作用元件的调控。AmCBL1基因的启动子序列中也未发现DRE和ABRE元件，却含有众多MYB和MYC识别的作用元件的同源序列，因此，AmCBL1基因的表达调控系统可能类似于rd22基因。此外，还发现与病菌，盐诱导相关的元件GT1GMSCAM4(GAA AAA)，这个元件存在于大豆CaM4基因启动子中，介导病菌，盐信号。SUSIBA2蛋白在大麦中与WBOXHVISO1位点结合，参与糖信号传导。ABRERATCAL是响应钙离子的顺式元件，在162个钙离子上调基因上游皆存在ABRERATCAL元件。实验证明，AmCBL1基因的表达受氯化钙的诱导(实验室未发表数据)，因此ABRERATCAL元件很可能是AmCBL1基因响应钙离子的顺式元件。在启动子序列中还发现一些和激素诱导相关的同源元件，CPBCSPOR和ARR1因子结合位点NGATT介导细胞分裂素CTK信号。GAREAT和WRKY71OS与GA诱导相关。WBOX在拟南芥NPR1启动子中发现，能被受SA诱导的WRKY蛋白特异性识别。在启动子中还存在许多于光信号相关的同源元件，如I-BOX，GT1，GATABOX等。
综上所述，我们推测该启动子为诱导型启动子，受钙离子、多种逆境因素和激素的调控。
在载体pBI121中，GUS基因是由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子驱动的，本文将该启动子替换为AmCBL1的启动子片段，以检测其功能。用DNAMAN对启动子序列酶切位点进行分析，发现其中存在BamHI和XbaI位点，所以3’端只能利用SmaI位点。因为在NPTII基因上也存在SphI和PstI酶切位点，所以只有HindIII是35S启动子5’端可用酶切位点。因此，本文利用HindIII和SmaI位点来切除35S启动子，替换成AmCBL1启动子片段。利用PCR技术进行缺失，扩增了4个不同长度的启动子缺失片断，嵌入PBI121载体，代替35S启动子，与GUS报告基因融合，成功构建植物表达载体分别命名为(S1-GUS，S2-GUS S3-GUS，B1S3-GUS)。此外，为了检测5’编码区的内含子是否发挥增强子作用，将内含子分别以正反向插入到B1S3—GUS载体之前，成功构建载体，分别命名为Qin-GUS和Rqin-GUS。
根据本发明的这一实施方案，该植物表达载体可以通过农杆菌介导的方法转化植物，也可通过基因枪方法转化植物。
可使用包括本发明的AmCBL1P启动子融合抗逆性基因构建植物表达载体转化植物宿主(既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物)，培育抗寒、抗旱、耐盐的植物品种。
下面结合具体实例对本发明作进一步说明。
表格1.PLACE数据库分析预测AmCBL1启动子序列中的顺式元件
| 元件 | 元件的核心序列 | 元件个数 | 相关功能 |
| ABRERATCAL | MACGYGBM＝C/A；Y＝T/C；B＝T/C/G | 1 | 响应钙离子的顺式元件 |
| CGCGBOXAT | VCGCGB V＝A/C/G；B＝G/T/C | 2 | 参与多种信号传导 |
| CTRMCAMV35S | TCTCTCTCT | 4 | 增强子 |
| CPBCSPOR | TATTAG | 1 | 响应细胞分裂素CTK信号 |
| ARR1因子结合位点 | NGATT | 21 | 响应细胞分裂素CTK信号 |
| GATABOX | GATA | 8 | 响应光信号 |
| GT1CONSENSUS | GRWAAW | 18 | 响应光信号 |
| IBOXCORE | GATAA | 3 | 响应光信号 |
| INRNTPSADB | YTCANTYY | 7 | 响应光信号 |
| GT1GMSCAM4 | GAAAAA | 9 | 与病程和盐诱导相关 |
| MYB | CNGTTR/WAACCA/YAACKG | 13 | 响应干旱，ABA信号 |
| MYC | CANNTG | 4 | 响应干旱，ABA，低温信号 |
| NTBBF1ARROLB | ACTTTA | 2 | 植物激素诱导 |
| TAAAGSTKST1 | TAAAG | 8 | 调节保卫细胞特异性基因表达 |
| GAREAT | TAACAAR | 1 | 响应GA的顺式元件 |
| WRKY71OS | TGAC | 7 | 与GA响应相关 |
| WBOXNTERF3 | TGACY | 3 | 响应创伤诱导 |
| WBOXATNPR1 | TTGAC | 4 | 响应SA |
| WBOXHVISO1 | TGAC | 2 | 响应糖信号 |
附图说明
图1是AmCBL1基因全长启动子扩增结果
M：为marker，从上之下大小为2000，1000，750，500，250，100。1为AmCBL1全长启动子扩增产物。
图2是5’RACE扩增结果
M：为marker，从上之下大小为2000，1000，750，500，250，100。1为全5’RACE扩增扩增产物
图3是植物表达载体S1-GUS构建流程示意图(S2-GUS，S3-GUS，B1S3-GUS，B2S3构建过程与此同)
图4是植物表达载体Qin-GUS构建流程示意图(Rqin-GUS构建过程与此同)
具体实施方式
实施例1、沙冬青CBL1启动子的克隆
沙冬青总DNA的提取采用CTAB法，其步骤如下：
(1)在2mL的离心管中加入800μL的2×CTAB提取缓冲液[2g/100ml CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris·Cl(pH8.0)]，8μL巯基乙醇(1％，v/v)，65℃预热。
(2)取约0.15g子叶，在液氮中研磨成冻粉。
(3)将冻粉转入离心管中，65℃保温约30min，其间轻柔摇动两次。
(4)取出离心管，冷至室温。加入等体积氯仿/异戊醇，轻柔混匀10min。
(5)10000r/min离心10min。
(6)转移上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10min。
(7)将DNA絮状沉淀用枪头挑出，或10000rpm/min离心10min，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀3次，37℃烤至微干。
(8)将沉淀溶于25μL TE缓冲液中，加入0.75μL(终浓度50μg/mL)RNase，37℃保温1h。
启动子的克隆利用锚定PCR(anchored PCR)：一种新的染色体步行方法(陈柏军等，2004)。以沙冬青DNA为模板，经过三次染色体步移，获得了1683bp的启动子序列。根据步移所得序列设计上游引物S1：AAA TGG ATT TAA TTG GTA TAA ATT ATT AGT GT，以AmCBL1已知序列区的GSP2：GTC TGT GAT GCA AGA ATT ACT G作为下游引物，沙冬青DNA为模板进行扩增，PCR反应体系(25μL)为：10×buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物(20μmol/L)各0.5μL，Extaq聚合酶(2.5U/μL)0.12μl，总DNA(1μg/μL)1μL，ddH20 18.38μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，退火温度分别为57℃，时间均为1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。启动子全长扩增结果如图1所示，然后进行PCR产物的回收。
PCR产物的回收采用天为时代公司的离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：
(1)用干净的刀片将DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，并放入2mL离心管中。
(2)加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴中放置10min，不断温和翻转离心管，确保胶块充分溶解。
(3)将上一步所得溶液冷却至室温后加入一个吸附柱中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(4)加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(5)加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。
(6)将离心吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。并在37℃温箱中烘干10min。
(7)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中间位置加入40μL 70℃预热的洗脱缓冲液，室温放置3min，12000rpm离心1min。
(8)再将离心得到的溶液重新加回离心柱中，12000rpm离心1min。产物备用PCR产物与T载体的连接
连接载体采用Takara公司的pMD18-T，连接反应的体系为：T载体1μL、目的DNA片段4μL、连接液5μL。16℃反应过夜。
质粒DNA转化大肠杆菌
(1)大肠杆菌Top10感受态细胞购于天根公司，将感受态细胞置于1.5mL预冷的无菌离心管中，加入全部连接产物，轻轻摇匀，立即置冰上30min。
(2)将离心管置42℃恒温水浴中热激90s，立即放回冰上放置3min。
(3)加入500μL无附加抗生素的LB培养基，混匀，37℃预表达45min。重组质粒的抗生素及α-互补筛选
(1)制备LB附加抗生素(50mg/L Amp)的固体平板。
(2)取150μL菌液与4μL IPTG及40μL X-gal(20mg/mL)混匀。
(3)用无菌吸头将混合液移至LB平板，用涂布器将菌液涂满整个平板表面。
(4)将平板倒置，于37℃培养16h。
质粒DNA的提取
质粒的提取采用赛百盛公司的UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒进行。
(1)取含中间载体质粒的菌液各4mL，含pCAMBIA1305.2质粒的菌液8mL，13000rpm离心30s收集菌体。
(2)倒掉上清，将菌体完全悬浮于100μL悬浮液中。
(3)加入150μL裂解液，轻柔颠倒混匀，溶液逐渐变得粘稠、清亮。裂解时间不得超过5min，否则会造成DNA污染。
(4)加入150μL中和液，轻柔颠倒混匀。此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。13000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5mL离心管中，加入400μL纯化树脂(使用前充分混匀)，颠倒混匀3min。
(5)将纯化树脂及上清液的混合物吸入离心纯化柱中，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(6)将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μL 80％乙醇，13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)重复第7步2次，尽可能除去杂质。
(8)取出纯化柱，将其套入干净的1.5mL离心管中，开盖放置3min，将残留的乙醇挥发干。加入35μL TE缓冲液于纯化树脂上。室温放置5min，13000rpm离心1min。再将洗脱下来的DNA溶液放回纯化树脂上，再次离心，以获得更高产量的质粒DNA。
DNA序列测定由奥科生物技术有限公司完成。
实施例2、5’RACE
沙冬青RNA的提取
使用前，所有的水，试剂和玻璃器皿均用0.1％DEPC(焦炭磷酸二乙酯)处理。CTAB RNA提取缓冲液的配制：25mmol/L EDTA，100mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，CYTAB 2％，NaCl 2％，2％巯基乙醇(现加)。LiCl 10mM，70％乙醇(DEPC水配制)。DEPC处理水。
沙冬青RNA的提取流程
(1)取0.2g干旱处理的沙冬青子叶放入-20℃预冷的研钵中，于液氮中研磨成冻粉，加入事先预热(65℃)的RNA提取缓冲液800ul。漩涡震荡30s。65℃温浴2-5min，其间震荡1-2次。
(2)将离心管从水浴中取出，冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，震荡10min。4℃，12000rpm离心10min。
(3)转移上清，氯仿/异戊醇重复抽提一次。
(4)转移上清，加入1/5体积10mM的LiCl，-20℃放置1h。
(5)4℃，12000rpm离心20min。
(6)弃上清，吸干净底部残留的液体。
(7)400μL DEPC处理的水溶解沉淀，再加入1/5体积10mM的LiCl，-20℃放置1h。
(8)4℃，12000rpm离心15min，弃上清，70％乙醇漂洗沉淀2-3次，4℃，12000rpm离心10min，除去乙醇，于室温通风橱中自然风干，约15min。
(9)将溶液转至1.5mL的离心管中，加入2体积预冷的无水乙醇，-20℃放置3h。
(10)4℃，12000rpm离心20min。
(11)20μL DEPC处理的水溶解沉淀。
(12)1％琼脂糖凝胶，120V电压检测。-70℃贮藏备用
5’RACE方法参见5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0(Invitrogen)的说明书，设计的三个特异性引物为GSPO：GTG CTT CAA CCT CGC TGA CAG，GSP2：GTC TGT GAT GCA AGA ATT ACT G，和GSP3：GTC TCC TAA CCT TAG AGT TGA AGC AC。5’RACE扩增结果如图2所示，回收该片段，连接，转化，PCR菌落检测后，阳性克隆由奥科公司测序。
实施例3、植物表达载体的构建
1)启动子缺失片段表达载体的构建
表达载体的构建所用的引物设计如下，加下划线的部分为HindIII酶切位点序列，之前的两个碱基CT作为为保护碱基。
正向引物：
HS1：CTA AGC TTA AAT GGA TTT AAT TGG TAT AAA TTA TTA GTG T
S1：AAA TGG ATT TAA TTG GTA TAA ATT ATT AGT GT
HS2：CTA GCT TGG AGA ATG CTA ATT AGT ATC CTT TGA ACA T
S2：GGA GAA TGC TAA TTA GTA TCC TTT GAA CAT
HS3：CTA AGC TTC TTT ACT TTC AGT TCA GGA ACT TTC TG
S3：CTT TAC TTT CAG TTC AGG AAC TTT CTG
反向引物：
RS：ATG GAG GAA ATC CAG GCA AAG
Bin1：CCA GTT GAA AAA GTA AAG AAC TTT GTC C
Ins：CTA AGC TTT ACT TTT TCA ACT GGG TGA GTC TT
Inr：CTA AGC TTT GCT CAG GCT TCA CCA CTT C
启动子S1表达载体的构建流程如图3所示，其他片段表达载体的构建与之相同。在AmCBL1启动子上游，距ATG 1657bp，1412bp，1046bp处，分别设计加HindIII接头的上游引物HS1，和HS2，HS3，这三个正向引物均以距起始子ATG 2bp处的RS为反向引物，保存AmCBL1启动子片段全长的菌液为模板，进行PCR扩增，反应体系(25μL)为：上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL、10×buffer2.5μL、dNTP(2.5mmol/L)2μL、Extaq聚合酶(2.5U/μL)0.12μL、模板菌液1μL、ddH2O18.38μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，均为57℃退火50s，72℃延伸1min30s，30个循环后，72℃延伸10min。以HS3为正向引物，内含子之前的Bin1为反向引物进行PCR，条件同上，72℃延伸30s。将回收的PCR产物再次与克隆载体pMD18-T连接，构建中间载体。
将中间载体质粒和pBI121分别用SmaI和HindIII进行酶切，因为SmaI酶切温度为30℃，HindIII酶切温度为37℃，所以分开进行酶切，酶切体系如下：
SmaI 1μL
10×T Buffer 2μL
0.1％BSA 2μL
质粒DNA 10μL
灭菌水 5μL
30℃酶切2h时后，再加入1μL HindIII 37℃酶切2h。后用琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段并进行连接。连接。反应采用Takara公司pMD18-T载体试剂盒中的连接液(Ligation Mix)进行。反应体系如下，16℃反应4h。
载体DNA片段 2μL
插入DNA片段 3μL
连接液 5μL
2)检测内含子功能表达载体的构建
为了检测内含子是否起增强子的作用，构建了载体Qin-GUS和Rqin-GUS。Qin-GUS的构建流程如图4所示，Rqin-GUS的构建过程与其相同。以Ins和Inr为特异性引物，保存AmCBL1启动子全长片段的菌液为模板，反应体系和程序同实施案例3中的1)，扩增出加HindIII接头的内含子序列，与pMD18-T载体连接，转化，检测得到pMD18-T-intron载体。将pMD18-T-intron载体和pBI121用HindIII在37℃酶切2h，酶切体系如下：
HindIII 1ul
10×T Buffer 2ul
质粒DNA 10ul
灭菌水 7ul
琼脂糖凝胶电泳，回收pMD18-T-intron载体酶切的小片段和S3-GUS酶切的开环大片段，将目的片断连接。
3)表达载体的鉴定
将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。挑取单菌落摇菌后进行PCR检测，分别用引物S1/RS，S2/RS，S3/RS，S3/Bin1，反应体系(25μL)为：上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL、10×buffer 2.5μL、dNTP(2.5mmol/L)2μL、Extaq聚合酶(2.5U/μL)0.12μL、模板菌液1μL、ddH2018.38μL。反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，均为57℃退火50s，72℃延伸1min 30s，30个循环后，72℃延伸10min。选三个扩增出特异性条带的样品，进行测序鉴定。测序由奥科公司完成。Qin-GUS，Rqin-GUS只用测序进行检测，检测内含子插入的正反方向。测序所用引物为根据pBI121载体序列设计的特异性引物PBIS：GCACGA CAG GTT TCC CGA CT，PBIR：GCA CGA TAC GCT GGC CTG C，测序由奥科公司完成。
沙冬青CBL1启动子核苷酸酸序列表
<110>夏新莉、尹伟伦、于艳华
<120>沙冬青CBL1启动子的鉴定及其功能研究
<141>2007-5-28
<160>1
<210>1
<211>1683
<212>DNA
<213>沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)
<220>
<221>启动子
<222>(1)...(1683)
<223>
<220>
<221>内含子
<222>(931)...(1620)
<223>
<400>1
ttatttattt taaaatattt attttaaaat ggatttaatt ggtataaatt attagtgtaa 60
aaaatttttt atactgtcaa tcaatcataa attatcacat taattaaaat gtttgattct 120
tatgctaact attttaaaaa tcacccaaat catgaatata tattatattt atatttgaca 180
acattgtaca taatattata ttcaaattta ctcattttca acttcattgt tattataaaa 240
aaaacttcat tgttattgag ctataactaa aggagaatgc taattagtat cctttgaaca 300
ttggttaaga aaacaagaaa aaaaattttg tattgaaaga tatatattta atattttaaa 360
aaatgtaaca cttaattttt tagggaaaca tttcttttta ttgatttatt aatcaatatt 420
cttaatgaga tcagttacta aattagagct gatgtaaata aataaataat tatcaataag 480
aacgatatat tttttattat tgaatgaatt ttagaggtaa ctactctctt aataagtggg 540
tctcaagaat ctgtttaacg agttaataaa gagtggggac ccgttttcta cggccacctt 600
caccaaacca aacacaattc gccgttaacg tttcaaactt tactttcagt tcaggaactt 660
tctgacaaca acagcgtgag tctaatctct ctctctttca ccctgatgta ctatgtgtgt 720
atgtatatat aagagagaga gagagggatg gttctaaata aataaaactc atacctcagt 780
tctactctct cagctcaacc cactttccct tttctcgagt actccgcgtt ttctttgttt 840
ttctctctcc tcttttttct ctcatttctt atagcccaac tcactcaaat gccatttttc 900
taggacaaag ttctttactt tttcaactgg gtgagtcttt ttccatcatc accgttcttt 960
tttcgtttga tttacatctt atgttgaggt tcttttccgt ggggtttatg ggaggagggg 1020
tagaaaaaaa ataatagaat gtgggtttca tttttttctg attaattatg tgatgtttat 1080
gtattttttt tgttacaccg atcttcttga cgtcttttga tttctagatg atgtttataa 1140
agttatgaat ttgcgcttct tttgatagga tccatggatt tcatcttggt attggttggt 1200
ctttaatttt tgtaagatta ttattattat tattatttca tcttggtaat ggggtaaaga 1260
aattttagtc aagatcaaat ttttatttat taatcactca atttgtttat tatttgtttt 1320
cttgaattat tatgtaagtt gtgtcttttt gtgtccctaa gctcatggtc atagccatct 1380
tttcataatg atcaattatt gttctgagtc acatacagtg ttggaacact acatactaca 1440
gttattcttt tttaagattc ttctgcttta tcttttattt tttttaattc aatgtttagc 1500
acagctaaca tgtaccaaaa cttcacaagg ttgatttgtt tatttattat tttgcgttgt 1560
tggtgtttca atttgggatt aaaattgcaa ggttaagatg attttggtga tatattttag 1620
tgaagtggtg aagcctgagc actgctccgg taccttgctg ctttgcctgg atttcctcca 1680
taa
<210>2
<211>124
<212>cDNA的5’UTR
<213>沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)
<400>2
tatagcccaa ctcactcaaa tgccattttt ctaggacaaa gttctttact ttttcaactg 60
gtgaagtggt gaagcctgag cactgctccg gtaccttgct gctttgcctg gatttcctcc 120
ataa
Claims (8)
1.从沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中鉴定的CBL1基因的启动子序列，它具有与序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
2.沙冬青CBL1基因cDNA序列中124bp的5’非翻译区(UTR)，它具有如序列表SEQ ID No：2所示核苷酸序列。
3.将权力要求1所述的序列与权力要求2所述序列相比对，发现的沙冬青基因组上CBL1基因5’非翻译区插入了一个690bp的内含子序列，内含子是如序列表SEQ ID No：1特征所标注的(931)...(1620)之间的序列。
4.权力要求1所述的序列，其特征是：根据预测它是诱导型启动子，受多种环境因子和激素的诱导。
5.权力要求1所述的序列，其特征是：含有多处与干旱，高盐和激素诱导相关的顺式作用元件的同源序列，如MYB和MYC识别的作用元件，此元件和水分胁迫和ABA诱导相关；与病菌，盐诱导相关的元件GT1GMSCAM4；响应钙离子的顺式元件ABRERATCAL；参与糖信号传导的WBOXHVISO1；赤霉素，水杨酸，细胞分裂素有到元件。
6.根据权力要求1所述的启动子片段全部或部分序列构建的植物表达载体。
7.为了检测权力要求3所述内含子是否发挥增强子作用，构建的植物表达载体。
8.权力要求6和7所述的植物表达载体在改良植物抗旱，抗寒，耐盐性中的应用。
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| CN102382826A (zh) * | 2010-09-06 | 2012-03-21 | 尹伟伦 | 黑杨erecta基因启动子的序列及其应用 |
| CN108588070A (zh) * | 2018-03-23 | 2018-09-28 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种蒙古沙冬青保卫细胞特异表达启动子及其应用 |
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| CN111321146A (zh) * | 2020-03-19 | 2020-06-23 | 内蒙古自治区农牧业科学院 | 蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用 |
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-
2007
- 2007-12-11 CN CNA2007101950586A patent/CN101457227A/zh active Pending
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