CN101453961B - 胶原酶处理的并且基本上不含血细胞的松质骨 - Google Patents

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Abstract

骨植入体，包含基本上不含血细胞的松质骨，该松质骨已经用至少一种疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶，以使松质骨基质中的成骨细胞疏松的浓度和时间处理。在该基质中的成骨细胞为活细胞。采用至少一种疏松剂对松质骨进行处理，可使该成骨细胞更可用于实现它们的成骨功能和提供增加的骨形成速度。

Description

胶原酶处理的并且基本上不含血细胞的松质骨
本申请要求基于2006年7月18日递交的临时申请系列60/831,723号和2006年5月8日递交的临时申请系列60/798,474号的优先权，上述申请的内容通过全文引用在此结合进来。
本发明涉及包括松质骨的骨植入体。更特别地，本发明涉及包括用至少一种疏松剂(loosening agent)，例如胶原酶和/或消化酶，处理过的松质骨的骨植入体，所述处理是为了使骨基质(bone matrix)中的成骨细胞疏松。所述松质骨也基本上不含血细胞。
包括松质骨的骨植入体已经用于各种手术和治疗，包括骨融合术，例如脊柱融合术，脊柱上的椎间盘增强，和在包括但不限于缺血性骨坏死、骨肉瘤、急性骨折和骨折不愈合的疾病、障碍或损伤中用作骨填充，以及用于矫形植入物用于骨再生。所述骨一般可以来自各种来源的松质骨，包括椎骨，髂嵴，股骨，胫骨或肋骨。
松质骨植入体除骨细胞和成骨细胞外，一般含有包括血细胞包括造血细胞。在一些植入体中，为了保留植入体中的所有细胞的活性，该植入体已经进行处理，而在其它一些植入体中，骨细胞包括成骨细胞活性已经被破坏。
本发明提供骨植入体，它包括含有活的成骨细胞的松质骨，所述成骨细胞被处理以更可用于实现它们的成骨功能。
根据本发明某一方面，提供了包括松质骨的骨植入体。所述松质骨基本上不含血细胞，并且已经用至少一种疏松剂以使松质骨基质中的成骨细胞疏松的浓度和时间处理。在该骨基质中的成骨细胞为活细胞。
本文使用的术语＂疏松剂＂，表示疏松松质骨基质中的成骨细胞但并不从松质骨基质中释放成骨细胞的试剂。
可以使用的疏松剂包括但不限于胶原酶和消化酶，包括但不限于胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶或其组合。
在一个实施方案中，所述至少一种疏松剂为胶原酶。在另一个实施方案中，所述至少一种疏松剂为消化酶。在一个实施方案中，所述消化酶为胰蛋白酶。
本文使用的术语＂成骨细胞＂，表示具有成骨潜力的任何类型的细胞，也就是说，能够分化为骨细胞的任何类型的细胞。
虽然本发明的范围不限于任何理论性推理，但所述骨植入体基本上不含血细胞并用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶处理，从而使在松质骨基质中的成骨细胞疏松，上述成骨细胞变得更可利用以或更倾向于实现它们的成骨功能，并且提供更快的骨形成速度。因此，上述骨植入体能直接形成或“生长”为骨并提供相对现有技术中的植入体改进的植入体，现有技术中的植入体包括先前生产的松质骨植入体和陶瓷植入体。
松质骨用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶，以使松质骨基质中的成骨细胞疏松的浓度处理一段时间。在一个实施方案中，松质骨用例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂，以约0.1mg/ml—约3.0mg/ml的浓度进行处理，并且在另一个实施方案中，浓度为约1.0mg/ml—约3.0mg/ml。松质骨用例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂处理一段时间以疏松松质骨基质中的成骨细胞，但并不从松质骨基质中释放成骨细胞。在一个实施方案中，松质骨用例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂处理约5分钟—约3个小时的时间，并且在另一个实施方案中，时间为约5分钟—约30分钟。还另一实施方案中，松质骨用例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂以1.0mg/ml的浓度处理10分钟。
虽然申请人并没有打算限于任何理论性推理，但是相信通过使用上文所述例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂处理骨，所述处理提供骨基质组分(例如胶原)的部分但不完全的消化。这种骨基质组分的部分消化疏松但不从基质中释放成骨细胞，如前文所述，由此使这些细胞更可利用以或更倾向于实现它们的成骨功能。
一般而言，松质骨来自任何具有松质骨的源。所述来源包括但不限于脊柱上的椎体、髂嵴、股骨、胫骨和肋骨。去除骨的表壳，并且随后将骨切割或碾磨成想要的片段或形状。例如，骨可以切割和/或碾磨为骨碎片，或者切割为楔形物或塞子，或者可以形成丸粒。
随后冲洗骨以除去血细胞，例如红细胞和造血细胞。在清洗骨之后，骨用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶进行处理。如前文所述，骨用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶，以使骨基质中所含的成骨细胞疏松但并不从骨基质中释放出来的浓度和时间处理。在一个实施方案中，骨用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶，以约0.1mg/ml—约3.0mg/ml的浓度进行处理，在另一个实施方案中，浓度为约1.0mg/ml—约3.0mg/ml。骨处理约5分钟—约3个小时的时间，在另一个实施方案中，时间为约5分钟—约30分钟。在另外一个实施方案中，骨用疏松剂，例如胶原酶和/或消化酶，以1.0mg/ml的浓度处理10分钟。
在用疏松剂例如胶原酶和/或消化酶处理之后，骨用一种或多种抗生素和/或一种或多种抗真菌剂进行处理，以降低所述骨中的生物负荷(bioburden)的水平。可能使用的抗生素包括但不限于庆大霉素；万古霉素；青霉素类；大环内酯类抗生素，例如红霉素；基于磺胺的抗生素；及其组合。可能使用的抗真菌剂包括但不限于两性霉素、氟康唑及其组合。
在抗生素和/或抗真菌剂处理之后，当切削过或碾磨过的骨被使用时，如果需要，所述切削过或碾磨过的骨可以通过滤网进行滤过以保留具有所需尺寸的骨片段。
在清洗、用例如胶原酶和/或消化酶的疏松剂处理、和用抗生素和/或抗真菌剂处理骨之后，所述骨随后可以加入到合适的保存介质中，例如冷冻保存或玻璃化介质(vitrification medium)，在上述介质中骨可以被保存和储藏，并且其中含有的成骨细胞保持活性。在一个实施方案中，保存介质可以包括甘油和/或二甲基亚砜，或DMSO。在一个实施方案中，保存介质能够使处理过的骨在低至-140℃和高至-20℃的温度进行冷冻，同时能保持成骨细胞的活性。在本发明的范围之内同样考虑了，用疏松剂例如胶原酶和/或消化酶处理过的松质骨可以与没有用疏松剂处理过的骨相组合，然后包装成最终产物。例如，用疏松剂处理过的松质骨可以与没有用疏松剂处理过的骨相混合，后者例如同种异体移植骨碎片、片段或粉末、或髓核。例如，在一个实施方案中，用疏松剂处理过的骨可以在配制成最终产物前同去除矿物质的骨相混合。在另一个实施方案中，最终产物包括50体积％处理过的骨和50体积％未处理过的骨。
疏松剂处理过的骨植入体可以以治疗动物骨疾病、障碍、缺陷或损伤有效的量给予动物。所述动物可以是哺乳动物，包括人类和非人类的灵长类。在一个实施方案中，所述动物是人类。
通过疏松剂处理过的骨植入体可以治疗的骨病、障碍、缺陷或损伤包括但不限于退化性椎间盘疾病、缺血性骨坏死、骨肉瘤骨折和骨折不愈合。疏松剂处理过的骨植入体也可以用于骨融合术，例如脊柱融合术，以及椎间盘增强，和用于矫形植入物中的骨再生。
疏松剂处理过的骨植入体可以直接用于骨疾病、障碍、缺陷或损伤的部位。根据植入体的形式和/或形状，该植入体可以直接注入骨疾病、障碍、缺陷或损伤所影响的部位，或者该植入体可以直接填充入骨疾病、障碍、缺陷或损伤所影响的部位。所述植入体具有足够的粘度，这样植入体在植入部位保持足够长的时间来发生初始骨形成、骨诱导性信号传导和宿主细胞粘附。在本发明范围内同样考虑了，骨植入体可以同骨疾病、缺陷、障碍和损伤的治疗中所用的器械相结合使用，所述器械例如可以用于脊柱或骨中以促进骨生长和融合的矫形外科套笼器械(orthopedic cage device)、陶瓷或平板。此外，骨植入体可以同自体骨移植相结合使用。骨植入体也可以同抗生素(例如那些前文所述的)、抗真菌剂或抗炎药一起给予。在另一个实施方案中，骨植入体可以同骨诱导因子，比如例如骨形态形成性蛋白(bone morphogenic protein)或BMP，如BMP-2和BMP-7，和血小板衍生生长因子(PDGF)联合给予，其增强了骨植入体的成骨潜力。然而，应该理解的是，本发明的范围并不打算限于任何特殊的骨剂病、缺陷、障碍或损伤的治疗，或者限于骨植入体给予的任何特殊形式或任何特殊方法。
本发明现在将参考下列实施例进行描述。然而，应该理解的是本发明的范围并不打算限于以下实施例。
实施例1
骨样品在清除软组织之后，从含盐保存溶液中移出，并用拭巾擦拭。将骨置于切割区，并且面朝上。随后骨用往复锯切割以除去表壳。剩余的骨随后置于500ml洗袋中，该洗袋部分地装有盐水(0.9％)和抗絮凝柠檬酸盐右旋糖溶液(配方A(ACD-A))，比例为9份0.9％盐水比1份ACD-A。随后关上袋子的盖并剧烈摇晃。然后将骨样品从洗液中取出并且随后置于骨碾磨室中。然后，骨被碾磨，将碾磨的骨舀出，置于含有至多300ml的体积比为9份盐水比1份ACD-A的0.9％盐水和ACD-A的500ml接收瓶中。
碾磨了的骨随后被清洗。首先，洗液从接收瓶中倾入废液烧杯中。洗液用新的0.9％盐水和ACD-A的溶液(9份盐水比1份ACD-A的体积比)替代，拧紧接收瓶上的瓶盖，并且剧烈摇晃瓶子。重复上述清洗直至洗液变透明，碾磨的骨碎片颜色为白到米黄。倒出最后一次洗液，用取样汤匙将骨碎片从接收瓶中移出。使用培养皿和镊子随后将骨样品从大血块和组织中分离。然后将骨装入50ml锥形管中，并且记录总体积。全部体积的骨碎片被成两半，一半用于胶原酶处理和一半用于新鲜碎片。将指定用于胶原酶处理的碎片置于500ml无菌接收瓶中，新鲜碎片置于500ml接收瓶中并用9份盐水比1份ACD-A体积比的0.9％盐水和ACD-A覆盖。
然后，以每毫升PBS使用1mg胶原酶的量将胶原酶粉末同PBS混合，制备胶原酶溶液。胶原酶溶液以每cc待处理的骨使用2ml胶原酶溶液的量加入到指定用于胶原酶处理的经碾磨的骨中。然后，含有碾磨过的骨和胶原酶溶液的瓶子在37℃孵育器中的摇座上放置10分钟±1分钟，同时瓶盖松开。随后将瓶子移出孵育器，并将胶原酶溶液倒入一(多)个瓶子中。随后通过加入相同体积的体积比为9份PBS比1份ACD-A的PBS和ACD-A来冲洗胶原酶处理过的碾磨骨。该冲洗液随后倒入含有该胶原酶溶液的瓶子中。然后重复冲洗，冲洗液再次倒出，并且将胶原酶处理过的骨样品加入到新鲜骨样品的瓶子中。所得组合的(胶原酶处理过的加上新鲜的)骨样品随后倾倒通过1mm滤网并置于干净的瓶子中。然后，组合的骨样品用Dulbecco极限必需培养基(DMEM)(低葡萄糖)、用酚冲洗，然后用抗生素处理。去除矿物质的骨样品也在抗生素处理前用DMEM冲洗。
然后制备1×抗生素溶液。对于每1ml的溶液，将0.9ml的DMEM与0.005ml的10mg/ml硫酸庆大霉素、0.05ml的50mg/ml盐酸万古霉素和0.01ml的250μg/ml两性霉素B混合。因此，所述抗生素溶液含有50μg/ml浓度的硫酸庆大霉素、50μg/ml浓度的盐酸万古霉素和2.5μg/ml浓度的两性霉素B。
然后，抗生素溶液以每1cc骨样品2ml的量加入到组合的骨样品与去除矿物质的骨样品的每一中。随后瓶子在37℃孵育器中的摇座上放置不少于18个小时，同时瓶盖松开。然后将瓶子移出孵育器，置于生物安全容器中，并且将抗生素溶液从组合的骨样品和去除矿物质的骨样品的每一中倒出，并且每一所述骨样品随后用同样体积的PBS清洗。然后剧烈摇动该样品。来自PBS清洗的冲洗液被保留，并且测定每一溶液的pH。用PBS清洗样品直到冲洗液的pH为5.0至7.5的范围。在PBS清洗完成后，PBS从每一骨样品倒出，并且将相同体积的Plasma Lyte-A(Baxter)溶液加入到每一骨样品，所述Plasma Lyte-A溶液含有140meq/l Na+、5meq/l K+、98meq Cl-、3meq Mg2+，和27meq/l乙酸盐。剧烈摇动骨样品，并且每一样品重复Plasma Lyte-A清洗两次。
使用取样汤匙，将50ml锥形管用所述组合的(胶原酶处理过的和新鲜的)骨样品轻柔填充，并将去除矿物质的骨样品轻柔装入15ml锥形管中。5ml冷冻保存溶液加入到该15ml锥形管中并剧烈摇动。每ml冷冻保存溶液含有0.7ml的1×PlasmaLyte-A、0.2ml的25％人血清白蛋白和0.1ml的1×二甲亚砜(DMSO)(CryoServ.)。因此，人血清白蛋白的最终浓度为5％，并且二甲亚砜的最终浓度为10％。在振摇之后，去除矿物质的骨样品转移到存有松质骨的所述50ml锥形管中，并且随后往该50ml锥形管中加入10ml冷冻保存溶液并剧烈振摇。然后，全部样品置于产物剂量广口瓶(product dose jar)中。5ml冷冻保存溶液随后加入到该产物剂量广口瓶中。如果骨制品没有被溶液覆盖，就再次加入5ml的冷冻保存溶液。然后密封该剂量瓶。在该剂量瓶被密封后，该产物剂量瓶置于包装袋中。然后将该包装袋密封。第二个包装袋和包装插入物随后放入第三个邮件包装(mailer package)中，并将其热密封。然后将邮件包装放入-80℃检疫冷冻器(quarantine freezer)中直到准备使用骨制品。
实施例2
除了将50ml样品于-80℃保存替换为将十四份5cc剂量进行标记并于-50℃±5℃保存和将六份5cc剂量进行标记并于-80℃±5℃保存外，来自单个供体的骨制品如实施例1所述制备。在冷冻之后十七天，三份于-50℃保存的剂量和三份于-80℃保存的剂量被解冻。
含有冷冻骨样品的广口瓶置于37℃水浴中直到全部冷冻制品解冻。解冻后马上将广口瓶从水浴移出，并且喷射70％异丙醇。广口瓶的外部随后被干燥。然后将广口瓶转移至生物学安全工作橱，移开瓶盖，并且将解冻的冷冻保存溶液直接从广口瓶中吸出。然后将25ml的Dulbeccom极限必需培养基-低葡萄糖(DMEM-lg)加入每个广口瓶，并且转动容器以使DMEM-lg完全覆盖全部的骨样品。然后从每个广口瓶中吸出DMEM-lg，全部骨样品转移到50ml锥形管。随后将另外25ml的DMEM-lg加入到每份含有骨样品的锥形管。
1mg/ml胶原酶溶液(1mg/1ml PBS)在250ml接收瓶中配制。每1cc骨样品制备2ml的胶原酶溶液。
从含有骨样品的该50ml锥形管中吸出DMEM-lg，并且随后将25ml的PBS加入到每个锥形管，并转动锥形管以清洗掉任何残留的DMEM-lg。如需重复采用PBS的清洗，以去除骨样品中仍然可见的任何DMEM-lg。
在最后一次PBS清洗之后，PBS被吸出，骨样品被转移到250ml含有胶原酶溶液的接收瓶中。随后瓶子在37℃孵育器中的摇座上放置15分钟±1分钟。然后将瓶子从孵育器中拿出，并且通过70μm孔筛网将胶原酶溶液通过移液管转移至250ml锥形管中。然后用与最初胶原酶处理时相同体积的PBS冲洗胶原酶处理过的骨样品。通过70μm孔筛网将PBS洗液通过移液管转移至250ml锥形管中。重复PBS冲洗两次，将锥形管置于离心机中(Beckman#GS-6R)，以1960rpm旋转8分钟(约878g)。锥形管随后转移到生物学安全工作橱，吸去上清液。然后通过轻轻拖曳所述管跨过试管架使所述丸粒轻柔松散。然后使丸粒在适当体积(1至4ml)的PBS/ACD-A(每500ml PBS含有59ml ACD-A)中再悬浮。
然后，检测三份于-50℃冷冻的样品和三份于-80℃冷冻的样品的细胞活性。
通过使用2-20μl的Pipetman移液管(Gilson，P20号)，将20μl等份的最终得到的细胞悬液加入到微离心管。随后将20μl等份的0.4％Trypan Blue加入到所述微离心管的每个中，并且通过指轻叩使内含物混合。10μl的细胞悬液随后转移至血细胞计数器(Hausser Scientific，型号Steri-Cult 200)的每一侧中并有盖玻片就位。然后在开始活的和非活的细胞计数之前允许细胞在计数室中沉降。将细胞暴露于Trypan Blue不超过10分钟，以避免活细胞吸收该染料。
用显微镜的10×物镜对在每个室中心1mm×1mm平方的网格线进行对焦。放上载玻片，以看见网格的中心区域。随后将显微镜的物镜更换为20×物镜。然后将显微镜聚焦，对活细胞和非活细胞进行计数。针对每一细胞悬液对两个室中的活的和非活的细胞进行计数。活的和非活的细胞计数随后被测定，从中计算活细胞的浓度、所有细胞的浓度以及细胞的％活性。
为了使其适于体内给予，样品必须有至少70％的生存力和至少1×103细胞/cc的细胞密度。
下表1给出了每一样品的生存力结果。
表1
贮存温度         ％生存力            细胞/cc
50±5℃          78.6                8.80×105
50±5℃          77.8                7.00×105
50±5℃          79.3                5.84×105
80±5℃          76.1                5.60×105
80±5℃          77.0                5.36×105
80±5℃          81.1                6.16×105
上述数据表明对每个测试样品均获得了可接受的生存力数据，并且根据本发明制备的松质骨可以在-80±5℃条件下储存至少十七天。
关于一些应用，外科医生可能需要将松质骨以高于-80℃的温度保存，例如-50℃。上述数据表明松质骨可以在-50℃保存并仍保持可接受的生存力。
实施例3
如实施例1中所述制备胶原酶处理过的骨的23个样品，所不同的是骨样品用胶原酶以如下表2中所给的0.167mg/ml—3mg/ml的浓度处理5分钟—24小时的时间，所述时间也在下表2中列出，并且骨样品没有被冷冻。每份骨样品的体积和用于处理每份骨样品的胶原酶的总体积同样在下表2中给出。
如实施例2中所述测试了新鲜骨样品的％生存力和细胞密度。结果在下表2中给出。
Figure G2007800164955D00091
上述数据表明根据本发明用胶原酶以各种浓度和持续时间处理的松质骨保持了可接受的生存力。
实施例4
在这一实施例中，测试从胶原酶处理过的松质骨样品中获得的两份细胞样品分化为成骨细胞的能力。
通过移液管移取111ml的FBS和11ml的抗生素-抗真菌剂(Invitrogen分类号15240-062)到1000ml的DMEM-低葡萄糖糖(DMEM-lg)中以提供终浓度为10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂的培养基，来制备标准培养基的原液。
通过将246ml的标准培养基同25μl的1mM地塞米松溶液、2.5ml的1M β-甘油磷酸(βGP)溶液以及1.25ml的10mM抗坏血酸-2-磷酸盐(AsAP)溶液在500ml无菌瓶中混合，制备含有成骨补充剂的培养基(OS培养基)的原液。通过轻轻转动瓶子30秒将所述材料混合。随后将培养基倒入带有贮藏系统的500ml的0.2μ过滤器的储器中。然后将真空管线连接到该500ml的0.2μ过滤器上，将该培养基过滤灭菌。然后移去该储器并用盖子替代。将OS培养基于2℃—8℃贮藏。
通过将Sigma
Figure G2007800164955D00101
 Fast Violet B盐胶囊放入48ml的蒸馏水中制备得到FastViolet B溶液。所得溶液随后被等分到两个50ml锥形管中，其中每个锥形管中加入12ml的溶液。然后将该管于4℃贮藏。
通过将2ml的
Figure G2007800164955D00102
柠檬酸盐浓缩溶液用蒸馏水稀释至100ml，制备得到柠檬酸盐溶液。将该柠檬酸溶液于4℃贮藏。
如实施例1中所述制备两份胶原酶处理过的松质骨样品，并如实施例2中所述从上述样品中得到胶原酶被释放的(CR)细胞。
使用3ml前文所述的标准培养基，以每孔0.5—5.0×106细胞的密度将CR细胞置于6-孔板中。将该板标为＂PO＂，盖上盖子并且转移到设定为5％CO2和90％±5％湿度的37℃孵育器。以每孔3ml体积的培养基进行每周两次的培养基更换。
从第7天开始，检查板内的细胞生长。在第14天和第21天之间针对细胞对铺满培养(confluent culture)进行胰蛋白酶消化处理(trypsinize)。
在水浴中将适当体积的胰蛋白酶加热至20℃-37℃。将准备进行胰蛋白酶消化处理的板从孵育器中移出。吸出培养基，将1.5ml的胰蛋白酶加入到每个准备用胰蛋白酶消化处理的孔内。将板放回该37℃孵育器中5分钟。该板随后从该孵育器中移出，并轻敲板的侧面和底部以除去附着的细胞。然后将3ml的标准培养基加入到孔内，然后混合细胞悬液，并且将来自孔内的全部体积转移到5.0ml锥形管中。然后用3ml的标准培养基冲洗所述孔，并将所述冲洗培养基加入该管中。该管的总体积随后到达45ml。
然后将管置于离心机中，并以1,960rpm旋转8分钟(约878g)。然后吸去上清液，并通过拖曳所述管跨过试管架使丸粒轻柔松散。然后使丸粒在适当体积的标准培养基(约1至3ml)中再悬浮以用于细胞计数。
然后如实施例2中所述测试20μl等份所述细胞悬液的％生存力和细胞密度。
然后使用3ml标准培养基以每孔30×103细胞(±15×103细胞)的密度将细胞置于6-孔板中。然后将该板标为＂OS＂，盖上盖子，并转移到设定为5％CO2和90％±5％湿度的37℃孵育器。将该板孵育24—48小时。
在水浴中将OS培养基加热至20℃—37℃。然后从该板的每个孔内吸去标准培养基，并且然后将3ml的OS培养基加入到每个孔。OS培养基每三天或四天更换一次，并且在7天和14天之间测定该培养物的碱性磷酸酶表达。
然后进行碱性磷酸酶染色。每个孔用1ml的PBS冲洗两次。然后通过混合两体积的柠檬酸盐操作溶液与三体积的丙酮制备固定溶液。然后用1ml的固定溶液对每个孔固定1分钟。
将0.5ml的
Figure G2007800164955D0011100945QIETU
碱性溶液萘酚AS-MX磷酸盐加入到12ml的Fast Violet B溶液中。然后用铝箔覆盖该溶液以避免光照。然后将1ml的Fast Violet B/萘酚溶液加入到每个孔。
板然后在黑暗中于室温孵育一个小时。将孔吸净，并用1ml的蒸馏水冲洗两次。在一些或所有的细胞中呈现出清楚的粉红染色的细胞培养物为阳性的。来自这两个细胞样品的细胞培养物都呈现阳性结果。
所有专利、出版物(包括公开的专利申请)、保藏编号和数据库编号的公开内容在此通过引用结合进来，引用程度如同特意地和独立地通过引用结合每个专利、出版物、保藏编号和数据库编号一样。
然而，应该理解的是，本发明的范围并不限于上述的特定实施方案。本发明除了特定描述之外也可以实施，并且仍然在所附权利要求的范围之内。

Claims (6)

1.骨植入体，包含：
松质骨，所述松质骨基本上不含血细胞，所述骨已经用至少一种使该松质骨基质中的成骨细胞疏松的疏松剂以约0.1mg/ml-约3.0mg/ml的浓度处理约5分钟到约30分钟，在所述骨基质中的所述成骨细胞为活细胞。
2.权利要求1的植入体，其中所述至少一种疏松剂选自胶原酶和消化酶组成的组。
3.权利要求2的植入体，其中所述至少一种疏松剂为胶原酶。
4.权利要求3的植入体，其中所述骨用所述胶原酶以约1.0mg/ml-约3.0mg/ml的浓度处理。
5.权利要求3的植入体，其中所述骨用所述胶原酶以1.0mg/ml的浓度处理10分钟。
6.权利要求1的植入体，其中所述的松质骨进一步用抗生素和/或抗真菌剂进行处理。
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